Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der am 12. Juni 2000 eingereichten provisorischen US-Patenanmeldung Nr. 60/210,913 mit dem Titel "CRYOGENIC PRESERVATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE MATERIAL USING HIGH TEMPERATURE FREEZING".

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein eine kryogene Konservierung, und insbesondere eine kryogene Konservierung von biologisch aktivem Material mittels Vitrifikationstechniken.

Die kryogene Konservierung (Kryokonservierung) kann definiert werden als das Absenken der Temperatur von lebenden Strukturen und biochemischen Molekülen auf den Gefrierpunkt und darunter zu den Zwecken der Lagerung und zukünftigen Wiedergewinnung des Materials in seinem lebensfähigen Zustand vor dem Einfrieren. Experimente mit Hundesperma in den 1700ern zeigten zuerst, dass einzelne Zellen eingefroren und später aufgetaut werden können und dass eine kleine Prozentzahl der Zellen zu ihrer normalen physiologischen Funktion zurückkehrt. Später wurde in den 1900ern herausgefunden, dass die Zellenwiedergewinnungsraten verbessert werden können, falls die Zellen unter Verwendung von Verbindungen, die insgesamt als Kryoprotektoren bezeichnet werden, chemisch präpariert werden, um dem Einfrierprozess standzuhalten. Selbst mit der Verwendung von Kryoprotektoren betragen jedoch die Wiedergewinnungsraten aus der Kryokonservierung routinemäßig 50% oder weniger.

Bisherige Versuche zum Verbessern der Kryokonservierungs-Wiedergewinnungsraten haben sich im Allgemeinen auf neue Kryoprotektoren zum Behandeln des biologischen Materials vor dem Einfrieren und auf extrem langsame oder schnelle Einfriertechniken fokussiert. Beide Techniken sind allgemein auf das Reduzieren einer Zellschädigung gerichtet, die verursacht wird, wenn sich das Wasser in den Zellen während des Gefrierprozesses aufgrund der Bildung von Eiskristallen ausdehnt. In der Theorie reduziert oder beseitigt ein extrem langsames oder schnelles Einfrieren die Bildung von Eiskristallen in einer Zelle. Mechanismen für extrem langsame Einfrierraten enthielten das kontrollierte Absenken durch Stickstoffdämpfe in flüssigem Stickstoff oder das Bewegen der Proben durch unterkühlte Alkoholverbindungen gefolgt von einem Eintauchen in flüssigen Stickstoff. Das Einfrieren in dieser Weise erlaubt kein weiteres Wachstum der Eiskristallgröße während des Einfrierprozesses, aber erlaubt nach wie vor die Eiskristallbildung.

Eine weitere Technik, die häufig als Vitrifikation bezeichnet wird, taucht Proben direkt in flüssigen Stickstoff ein in einem Versuch, das Wasser in der Zelle so schnell einzufrieren, dass eine Eiskristallbildung verhindert wird. Die Vitrifikation nimmt Zellen schnell von Raumtemperatur auf –196°C, der Temperatur von flüssigem Stickstoff. Ein derart extremer Temperaturabfall in einer derart kurzen Zeit verursacht häufig Spannungsbrüche in der Zellmembran. Kryoprotektoren werden in Verbindung mit der Vitrifikation und verschiedenen weiteren Einfriertechniken verwendet.

Deshalb wird ein verbesserter Weg zum kryogenen Konservieren von lebensfähigen einzelnen Zellen, Geweben, Organen, Nukleinsäuren oder anderen biologisch aktiven Molekülen benötigt, der wenigstens einige der Probleme bei den derzeit verfügbaren Verfahren vermeidet. Demgemäß sieht wenigstens ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren der Kryokonservierung mit dem Eintauchen von biologisch aktivem Material in ein Kühlfluid und dem Zirkulieren des Kühlfluids entlang dem Material vor. Das Material kann in Abhängigkeit von der Art des kryogen zu konservierenden Materials vor dem Eintauchen einer chemischen Präparation unterzogen werden oder nicht. Das Kühlfluid wird entlang dem Material mit einer im Wesentlichen konstanten vorbestimmten Geschwindigkeit und Temperatur zirkuliert, um das Material so einzufrieren, dass das Material vitrifiziert wird und die Bildung von Spannungsbrüchen in Zellmembranen minimiert wird. In wenigstens einem Ausführungsbeispiel wird das Kühlfluid auf einer Temperatur zwischen etwa –20°C und -30°C gehalten, und die Geschwindigkeit des Kühlfluids entlang dem Material beträgt etwa 115 Liter pro Minute pro Meter (35 Liter pro Minute pro Fuß) des Kühlfluids durch einen Bereich nicht größer als etwa 0,61 Meter (24 Inch) breit und 1,22 m (48 Inch) tief. Außerdem friert wenigstens ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung das Material direkt auf eine Temperatur höher als etwa –30°C ein. Ein noch weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung sieht ein biologisches Material vor, das einem solchen Kryokonservierungsprozess unterzogen worden ist.

Es ist eine Aufgabe wenigstens eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung, ein biologisches Material so einzufrieren, dass die Bildung von Eiskristallen und Spannungsbrüchen vermieden wird.

Ein Vorteil wenigstens eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die Kryokonservierungs-Wiedergewinnungsraten deutlich erhöht sind, weil das biologische Material während des Einfrierens vitrifiziert wird.

Ein weiterer Vorteil wenigstens eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die Kryokonservierungs-Wiedergewinnungsraten verbessert sind, weil das biologische Material bei einer Temperatur vitrifiziert wird, die hoch genug ist, um die Bildung von Spannungsbrüchen in den Zellmembranen zu verhindern.

Ein weiterer Vorteil wenigstens eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung ist, dass derzeitige Kryokonservierungs-Lageranlagen und -mechanismen verwendet werden können, um das gefrorene biologische Material zu lagern, wenn es einmal eingefroren ist.

Weitere Aufgaben, Vorteile, Merkmale und Eigenschaften der vorliegenden Erfindung sowie Verfahren, Funktionsweisen und Funktionen zugehöriger Bauelemente und die Kombination von Teilen und Einsparungen bei der Herstellung werden bei Betrachtung der folgenden Beschreibung und Ansprüche unter Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen offensichtlich, die alle einen Teil dieser Beschreibung bilden, wobei gleiche Bezugsziffern entsprechende Teile in den verschiedenen Figuren bezeichnen. Es zeigen:

1 eine Seitenansicht einer Kühlvorrichtung, die zum Ausüben eines Verfahrens gemäß wenigstens einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung geeignet ist;

2 eine Endansicht eines Querschnitts der in 1 dargestellten Kühlvorrichtung;

3 ein Flussdiagramm eines Verfahrens gemäß wenigstens einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;

4 ein Balkendiagramm der Ergebnisse von experimentellen Vergleichen einer Zellschädigung in Schnitten von ganzen kernlosen Trauben, die ohne chemische Präparation eingefroren wurden, zwischen verschiedenen herkömmlichen Gefriervorrichtungen (von denen nicht alle zur Kryokonservierung und Lagerung benutzt werden) und einem Einfrierverfahren gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;

5 ein Balkendiagramm der Ergebnisse von experimentellen Vergleichen des Überlebens von Zellen und der Funktion nach dem Auftauen von menschlichen Spermien zwischen einem Einfrierverfahren des Standes der Technik und einem Einfrierverfahren gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;

6 ein Balkendiagramm der Ergebnisse von experimentellen Vergleichen des Überlebens von Zellen nach dem Auftauen von schweineähnlichen Muskelzellen zwischen einem Einfrierverfahren des Standes der Technik und einem Einfrierverfahren gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung; und

7 ein Balkendiagramm der Ergebnisse von experimentellen Vergleichen des Überlebens von Zellen von Mäuseembryos zwischen einem Einfrierverfahren des Standes der Technik und einem Einfrierverfahren gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.

Bezug nehmend zuerst auf 1 und 2 wird eine Kühlvorrichtung erläutert, die zum Ausüben eines Verfahrens gemäß wenigstens einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung geeignet ist und allgemein als Kühleinheit 100 bezeichnet wird. Die Kühleinheit 100 weist vorzugsweise einen Behälter 110 auf, der ein Kühlfluid 140 enthält. Untergetaucht in das Kühlfluid 140 sind Zirkulatoren 134 wie beispielsweise Motoren 130 mit Flügelrädern 132, eine Wärmetauschspule 120 und ein Gestell 150, das in einem Ausführungsbeispiel Fächer 155 zum Tragen von einzufrierendem biologischen Material aufweist. Das biologische Material kann, ohne darauf beschränkt zu sein, lebensfähige einzelne Zellen, Gewebe und Organe, Nukleinsäuren und andere biologisch aktive Moleküle enthalten. Außerhalb des Behälters 110 und verbunden mit der Wärmetauschspule 120 ist eine Kälteeinheit 190.

Der Behälter 110 kann von beliebigen Dimensionen sein, die zum Eintauchen des einzufrierenden biologischen Materials in ein Volumen des Kühlfluids 140 notwendig sind, wobei die Abmessungen gestaffelte Vielfache von 0,31 m × 0,61 m × 1,22 m (12 Inch × 24 Inch × 48 Inch) sind. Behälter anderer Größen können im Einklang mit den hier erläuterten Lehren eingesetzt werden. Zum Beispiel ist in einem Ausführungsbeispiel (nicht dargestellt) der Behälter 110 so bemessen, um gerade genug Kühlfluid 140 zu halten, sodass Behälter wie beispielsweise Fläschchen, Teströhren, Becher, Messzylinder oder dergleichen in den Behälter 110 zum schnellen Einfrieren von Suspensionen mit biologischen Materialien und Kryoprotektoren gesetzt werden können. In weiteren Ausführungsbeispielen ist der Behälter 110 groß genug, um ganze Organe und/oder Organismen zum schnellen Einfrieren vollständig einzutauchen. Es ist selbstverständlich, dass der Behälter 110 gegebenenfalls größer oder kleiner gemacht werden kann, um effizient verschiedene Größen und Mengen von einzufrierendem biologischem Material aufzunehmen. Wie nachfolgend erläutert, wird das biologische Material vor dem Eintauchen in den Behälter 110 mit einem Kryoprotektor behandelt.

Der Behälter 110 hält das Kühlfluid 140. In einem Ausführungsbeispiel ist das Kühlfluid eine lebensmittelverträgliche gelöste Substanz. Gute Beispiele von lebensmittelverträglichen Fluiden sind jene, die auf Propylenglykol, Natriumchloridlösungen oder dergleichen basieren. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das Kühlfluid selbst ein Kryoprotektor, wie beispielsweise Dimethylsulfoxid (DMSO), Ethylenglykol, Propylenglykol, Polyethylenglykol oder dergleichen. Man beachte, dass in manchen Fällen der Kryoprotektor selbst ein lebensmittelverträgliches Fluid ist. In weiteren Ausführungsbeispielen werden weitere Fluide und bevorzugt gelöste Substanzen als Kühlfluide verwendet. Während verschiedene Behälter benutzt werden können, um das biologische Material zu halten, sehen einige Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung vor, das biologische Material zum schnellen und effektiven Einfrieren direkt in das Kühlfluid einzutauchen. Ein solches direktes Eintauchen kann die Kryokonservierung mancher Gewebe und Organe vereinfachen.

Um das biologische Material unter Vermeidung der Bildung von Eiskristallen einzufrieren, zirkuliert ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung das Kühlfluid 140 entlang dem einzufrierenden biologischen Material mit einer relativ konstanten Rate von 115 Litern pro Minute pro Meter (35 Liter pro Minute pro Fuß) des Kühlfluids, das in einem Bereich von nicht mehr als 0,61 m (24 Inch) breit auf 1,22 m (48 Inch) tief enthalten ist. Die notwendige Zirkulation wird durch einen oder mehrere Zirkulatoren 134 wie beispielsweise Motoren 130 bereitgestellt. In wenigstens einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung treiben die untergetauchten Motoren 130 Flügelräder 132 an, um das Kühlfluid 140 entlang dem einzufrierenden biologischen Material zu zirkulieren. Weitere Zirkulatoren 134, einschließlich verschiedener Pumpen (nicht dargestellt), können im Einklang mit den Aufgaben der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Wenigstens ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung erhöht den Bereich und das Volumen, durch den das Kühlfluid zirkuliert wird, indem wenigstens ein Zirkulator 134 zusätzlich zu den Motoren 130 eingesetzt wird. In Ausführungsbeispielen mit mehreren Zirkulatoren 134 werden die Fläche und das Volumen der Kühlfluidzirkulation in direktem Verhältnis zu jedem zusätzlich eingesetzten Zirkulator erhöht. Zum Beispiel werden in einem bevorzugten Ausführungsbeispiel drei zusätzliche Zirkulatoren für jeden Meter des Kühlfluids (ein zusätzlicher Zirkulator pro Fuß) verwendet, das durch eine Fläche von nicht mehr als 0,61 m (24 Inch) Breite auf 1,22 m (48 Inch) Tiefe zirkuliert werden soll.

Vorzugsweise können die Motoren 130 gesteuert werden, um eine konstante vorbestimmte Geschwindigkeit des Kühlfluidstroms entlang dem zu konservierenden biologischen Material beizubehalten, während gleichzeitig eine gleichmäßige Verteilung der Kühlfluidtemperatur innerhalb ±5°C an allen Punkten in dem Behälter 110 gehalten wird. Die im Wesentlichen konstante vorbestimmte Geschwindigkeit des entlang dem biologischen Material zirkulierenden Fluids sieht ein konstantes, gleichmäßiges Entziehen von Wärme vor, was die Vitrifikation des biologischen Materials während des Einfrierens erlaubt. In einem Ausführungsbeispiel werden die Kühlfluideigenschaften, wie beispielsweise Viskosität, Temperatur usw., gemessen und verarbeitet, und Steuersignale werden zu den Motoren 130 geschickt, um die Drehzahl oder das Drehmoment der Flügelräder 132 zu erhöhen oder zu verringern, falls erforderlich. In anderen Ausführungsbeispielen sind die Motoren 130 so konstruiert, dass sie eine gegebene Drehgeschwindigkeit über einen Bereich von Fluidzuständen halten. In einem solchen Fall wird das Drehmoment oder die Drehzahl der Flügelräder 132, die durch die Motoren 130 vermittelt werden, nicht extern gesteuert. Zu beachten ist die Tatsache, dass keine externen Pumpen, Wellen oder Riemenscheiben benötigt werden, um ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung zu realisieren. Motoren 130 oder weitere Zirkulatoren 134 sind direkt in das Kühlfluid 140 eingetaucht. Als Ergebnis friert das Kühlfluid 140 nicht nur das in den Tank 110 gesetzte biologische Material ein, sondern das Kühlfluid 140 sieht auch eine Kühlung für die Motoren 130 vor.

Die Wärmetauschspule 120 ist vorzugsweise eine „Mehrpfad-Spule", die es im Gegensatz zu herkömmlichen Kältespulen, in denen das Kältemittel im Allgemeinen auf einen oder zwei kontinuierliche Pfade beschränkt ist, dem Kältemittel erlaubt, durch mehrere Pfade (d.h. drei oder mehr Pfade) zu strömen. Außerdem ist die Spulengröße in direkter Beziehung zur Querschnittsfläche, die die gemessene Menge des Kühlfluids 140 enthält. Zum Beispiel ist in einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Behälter 110 0,31 m (1 Fuß) lang, 0,61 m (2 Fuß) tief und 1,22 m (4 Fuß) breit und verwendet eine Wärmetauschspule 120, die 0,31 m (1 Fuß) auf 0,61 m (2 Fuß) ist. Falls die Länge des Behälters 110 auf 6,10 m (20 Fuß) erhöht ist, dann wird auch die Länge der Wärmetauschspule 120 auf 6,10 m (20 Fuß) erhöht. Als Ergebnis kann die Wärmetauschspule 120 zu etwa 50% der Größe einer herkömmlichen Spule gemacht werden, die zum Bewältigen der gleichen Wärmelast erforderlich ist. Die Zirkulatoren 134 wie beispielsweise Motoren 130 zirkulieren das abgekühlte Kühlfluid 140 über das einzufrierende biologische Material und transportieren dann das wärmere Kühlfluid zur Wärmetauschspule 120, die in das Kühlfluid 140 untergetaucht ist. In wenigstens einem Ausführungsbeispiel ist die Wärmetauschspule 120 so konstruiert, dass sie nicht weniger als die gleiche Wärmemenge von dem Kühlfluid 140 entfernt, wie dieses dem einfrierenden biologischen Material entzieht, wodurch die Temperatur des Kühlfluids 140 in einem vorbestimmten Bereich gehalten wird. Die Wärmetauschspule 120 ist mit der Kälteeinheit 190 verbunden, die die Wärme aus der Wärmetauschspule 120 und dem System entfernt.

In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die Kälteeinheit 190 so konstruiert, dass sie zu der Lastanforderung der Wärmetauschspule 120 passt, sodass die Wärme dem System in einer ausgeglichenen und effizienten Weise entzogen wird, was in einem kontrollierten, schnellen Einfrieren eines Materials resultiert. Die Effizienz der Kälteeinheit 190 steht direkt mit dem Verfahren in Zusammenhang, das zum Steuern von Saugdrücken durch das effiziente Versorgen der Wärmetauschspule 120 und die effiziente Ausgabe der in der Kälteeinheit 190 verwendeten Kompressoren eingesetzt wird.

Diese Methodik erfordert die Einhaltung sehr enger Toleranzen zwischen den Temperaturen des Kältemittels und des Kühlfluids 140 und zwischen der Kondensationstemperatur und der Umgebungstemperatur. Diese Temperaturkriterien erlauben zusammen mit der Konstruktion der Wärmetauschspule 120 ein effizienteres Beschicken der Wärmetauschspule 120, was seinerseits ein Beschicken des Kompressors in einer ausgeglichenen und eng gesteuerten Weise erlaubt, um über 25% mehr Leistung aus den Kompressoren zu erzielen, als jene, die als Standardauslegung der Kompressorhersteller akzeptiert wird.

Man beachte, dass in dem in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel die Kälteeinheit 190 ein externes, entfernt positioniertes Kältesystem ist. In einem weiteren Ausführungsbeispiel (nicht dargestellt) ist jedoch die Kälteeinheit 190 in einem weiteren Abschnitt des Behälters 110 integriert. Es ist selbstverständlich, dass verschiedene Konfigurationen für die Kälteeinheit 190 für gewisse Konfigurationen der Kühleinheit 100 mehr oder weniger geeignet sein können. Falls zum Beispiel der Behälter 110 extrem groß ist, ist eine separate Kälteeinheit 190 erwünscht, während ein tragbares Ausführungsbeispiel von einer integrierten Kälteeinheit 190 profitieren kann. Eine solche Integration ist nur durch die Wirksamkeiten möglich gemacht, die durch Realisieren der hier erläuterten Grundsätze und insbesondere die Verwendung einer kleineren Wärmetauschspule erzielt werden.

Aufgrund der Kälteeinheit 190 und der Wärmetauschspule 120 wird in einem bevorzugten Ausführungsbeispiel das Kühlfluid auf eine Temperatur zwischen –20°C und -30°C gekühlt, mit einer Temperaturdifferenz im Kühlfluid von weniger als etwa ±5°C. In weiteren Ausführungsbeispielen wird das Kühlfluid auf Temperaturen außerhalb des Bereichs von –20°C bis –30°C gekühlt, um die Rate zu steuern, mit welcher eine Substanz eingefroren werden soll. Weitere Ausführungsbeispiele steuern die Zirkulationsrate des Kühlfluids, um gewünschte Einfrierraten zu erzielen. Alternativ kann das Volumen des Kühlfluids verändert werden, um eine spezielle Einfrierrate zu erleichtern. Es ist selbstverständlich, dass verschiedene Kombinationen der Kühlfluid-Zirkulationsrate, des Kühlfluidvolumens und der Kühlfluidtemperatur benutzt werden können, um gewünschte Einfrierraten zu erzielen.

Bezug nehmend nun auf 2 wird ein Ausführungsbeispiel des Kühlsystems 100 erläutert, das zum Einfrieren relativ großer Mengen von biologischem Material geeignet ist. Die Bezugsziffern in 2, die gleich, ähnlich oder identisch zu den Bezugsziffern in 1 sind, geben gleiche, ähnliche oder identische Merkmale an. Der Behälter 110 enthält das Kühlfluid 140, in das das Gestell 150 abgesenkt werden kann. Das Gestell 150 ist mit einem Gestellträger 210 bewegbar verbunden, sodass das Gestell 150 angehoben oder abgesenkt werden kann, um die Platzierung der Substanzen in den Behälter 110 zu erleichtern.

In Gebrauch wird das einzufrierende biologische Material in Fächer 155 des Gestells 150 gesetzt. Vorzugsweise sind die Fächer 155 aus Draht, Maschen oder dergleichen konstruiert, sodass das Kühlfluid 140 frei über, unter und/oder um darauf gesetzte Gegenstände zirkulieren kann. Vorzugsweise senkt der Gestellträger 210 das Gestell 150 in den Behälter 110 ab, wenn das Kühlfluid einmal auf eine gewünschte Temperatur abgekühlt ist, um die Fächer in das Kühlfluid 140 unterzutauchen. Das Absenken des Gestells 150 kann manuell oder unter Verwendung verschiedener, dem Fachmann bekannter Zahnrad-, Ketten- und/oder Riemenscheibenkonstruktionen erreicht werden. Die Zirkulatoren 134 zirkulieren das Kühlfluid 140 über die in den Fächern 155 gesetzten Substanzen, um ein schnelles und kontrolliertes Einfrieren vorzusehen. Es ist selbstverständlich, dass weitere Anordnungen zum Eintauchen des biologischen Materials in den Behälter 110 eingesetzt werden können, und dass die Verwendung eines automatischen Absenksystems nicht notwendigerweise zum Gebrauch in allen Fällen bevorzugt ist.

Bezug nehmend nun auf 3 ist ein Verfahren gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung veranschaulicht und allgemein durch die Bezugsziffer 300 bezeichnet. Das dargestellte Verfahren beginnt bei Schritt 310, wo das Kühlfluid entlang einer Wärmetauschspule zirkuliert wird. Die Wärmetauschspule ist wie oben erläutert mit einem Kältesystem wirkverbunden und wird benutzt, um die Temperatur des Kühlfluids zu verringern, wenn das Kühlfluid entlang der Wärmetauschspule zirkuliert wird. In Schritt 320 wird die Temperatur des Kühlfluids gemessen, und das Verfahren geht weiter zu Schritt 330, wo bestimmt wird, ob die Temperatur des Kühlfluids in einem optimalen Temperaturbereich liegt. Dieser optimale Kühlfluid-Temperaturbereich kann für verschiedene Anwendungen unterschiedlich sein, jedoch liegt ein bevorzugter optimaler Temperaturbereich für viele Anwendungen zwischen –20°C und –30°C.

Falls bestimmt wird, dass die Kühlfluidtemperatur nicht in einem optimalen vorbestimmten Temperaturbereich liegt, wird Schritt 335 durchgeführt. In Schritt 335 wird die Wärmetauschspule durch eine Kälteeinheit gekühlt, und das Verfahren kehrt zu Schritt 310 zurück, in dem das Kühlfluid entlang der Wärmetauschspule zirkuliert wird, um die Temperatur des Kühlfluids zu verringern. Vorzugsweise werden die Schritte 310, 320, 330 und 335 fortlaufend durchgeführt, bis das Kühlfluid den optimalen Temperaturbereich erreicht.

Die Temperatur des zum Einfrieren des biologischen Materials benutzten Kühlfluids ist ein wichtiges Element wenigstens eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung. Um eine Vitrifikation mittels herkömmlicher Prozesse zu erreichen, wird das biologische Material im Allgemeinen in flüssigem Stickstoff mit einer Temperatur von –196°C abgeschreckt. Eine derart drastische Temperaturänderung über eine sehr kurze Zeitdauer gefriert das Wasser in den Zellstrukturen so schnell, dass Eiskristalle keine Chance haben, sich zu bilden. Jedoch kann das Einfrieren von biologischem Material durch Abschrecken in flüssigem Stickstoff Spannungsbrüche in Zellmembranen verursachen, wodurch die Brauchbarkeit des Abschreckens in flüssigem Stickstoff zur Kryokonservierung beschränkt ist. Da die in einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung benutzten Temperaturen zwischen –20°C und –30°C liegen, werden Spannungsbrüche aufgrund Temperaturveränderung minimiert und die Vitrifikation kann mit viel weniger Schädigung der Zellmembranen erreicht werden.

Während das Kühlfluid auf die geeignete Temperatur gekühlt wird, werden die einzufrierenden biologischen Materialien in Schritt 305 zum Einfrieren präpariert. Wie oben erwähnt, enthält das biologische Material, ohne darauf beschränkt zu sein, lebensfähige einzelne Zellen, Gewebe und Organe, Nukleinsäuren und andere biologisch aktive Moleküle. Gegebenenfalls werden die Materialien einer chemischen Präparation vor dem Einfrieren unterzogen. Das chemische Präparieren des biologischen Materials kann eine Vorbehandlung des biologischen Materials mit Mitteln (Stabilisatoren) enthalten, die die Lebensfähigkeit der Zellen erhöhen, indem schädliche Substanzen entfernt werden, die von den Zellen während des Wachstums oder Zellensterbens abgeschieden werden. Brauchbare Stabilisatoren enthalten solche Chemikalien und chemischen Verbindungen, von denen viele dem Fachmann bekannt sind, die hochreaktive und schädliche Moleküle wie beispielsweise Sauerstoffradikale maskieren.

Das chemische Präparieren des biologischen Materials kann auch einen Akklimatisierungsschritt enthalten (nicht dargestellt). Während der oder eine gewisse Zeit nach der Vorbehandlung kann das zu konservierende biologische Material auf eine Temperatur akklimatisiert werden, die gegenüber Kultivierungstemperaturen reduziert ist, aber noch über dem Einfrieren liegt. Dies kann helfen, das biologische Material für den Kryokonservierungsprozess zu reduzieren, indem der zellulare Stoffwechsel verlangsamt und der Schock des schnellen Temperaturübergangs reduziert werden. Man beachte jedoch, dass ein Akklimatisierungsschritt nicht immer erforderlich ist, um die vorliegende Erfindung auszuüben.

In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel enthält das chemische Präparieren des biologischen Materials zum Einfrieren ein Füllen des biologischen Materials mit einem Kryoprotektor. Das Füllen beinhaltet im Allgemeinen die Gleichgewichtseinstellung des biologischen Materials in einer Lösung eines oder mehrerer Kryoprotektoren. Während des Füllens verwendete Substanzen können als Sättigungsmittel bezeichnet werden. Brauchbare Sättigungsmittel können ein oder mehrere Dehydratisierungsmittel, Imprägnierungs- und Nichtimprägnierungsmittel sowie osmotische Mittel enthalten. Sowohl Imprägnierungsmittel wie beispielsweise DMSO und Ethylenglykol als auch eine Kombination von imprägnierenden und nicht-imprägnierenden osmotischen Mitteln wie beispielsweise Fruktose, Sukrose oder Glukose und Sorbitol, Manitol oder Glycerol können verwendet werden. Es ist selbstverständlich, dass weitere geeignete Kryoprotektoren im Einklang mit den Aufgaben der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können.

Nachdem das Kühlfluid eine geeignete Temperatur erreicht, wird Schritt 315 durchgeführt, in dem das chemisch präparierte biologische Material in das Kühlfluid eingetaucht wird. Wie früher erwähnt, kann das biologische Material in einem Behälter gehalten oder direkt in das Kühlfluid gesetzt werden. Das Verfahren geht dann weiter zu Schritt 337, in dem ein Zirkulator wie beispielsweise eine untergetauchte Motor/Flügelradanordnung oder Pumpe verwendet wird, um das Kühlfluid mit der zuvor erläuterten Geschwindigkeit entlang dem eingetauchten biologischen Material zu zirkulieren. Da das Kühlfluid durch das biologische Material strömt, wird Wärme aus dem Material entfernt, das auf einer höheren Temperatur als der Temperatur des Kühlfluids liegt, und auf das Kühlfluid übertragen, welches die Wärme von dem einzufrierenden biologischen Material wegtransportiert. Gemäß wenigstens einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung sollte eine im Wesentlichen konstante Zirkulation des Kühlfluids entlang dem einzufrierenden biologischen Material beibehalten werden, um das präparierte biologische Material so einzufrieren, dass das präparierte Material vitrifiziert wird.

Nachdem das Kühlfluid entlang dem einzufrierenden biologischen Material zirkuliert ist, wird Schritt 339 durchgeführt. Schritt 339 stellt die Geschwindigkeit des Kühlfluids notwendigenfalls ein, um Veränderungen der Viskosität, Temperatur und dergleichen des Kühlfluids zu berücksichtigen. Vorzugsweise wird die Geschwindigkeit des Kühlfluids durch Einstellen der durch einen oder mehrere Zirkulatoren bereitgestellten Kraft konstant gehalten.

Die in 3 veranschaulichten Schritte sind in einer fortlaufenden Reihenfolge gezeigt und erläutert. Das dargestellte Verfahren ist jedoch von einer Natur, bei welcher einige oder alle Schritte fortlaufend durchgeführt werden und in einer anderen Reihenfolge durchgeführt werden können. Zum Beispiel verwendet wenigstens ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung einen einzelnen Umlaufmotor, um das Kühlfluid zu zirkulieren. In einem solchen Ausführungsbeispiel wird das Kühlfluid in Schritt 310 entlang einer Wärmetauschspule zirkuliert und in Schritt 337 gleichzeitig entlang dem zu konservierenden biologischen Material. Außerdem misst ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung die Temperaturen, Viskositäten des Kühlfluids und weitere Fluideigenschaften kontinuierlich und an mehreren Stellen in dem System.

In einem noch weiteren Ausführungsbeispiel werden einige Eigenschaften des Kühlfluids nicht direkt gemessen. Stattdessen wird die Veränderung der Kühlfluideigenschaften indirekt aus der Drehzahl eines Zirkulationsmotors bestimmt. Falls der Motor langsamer dreht, dann kann dem Motor zusätzliche Energie zugeführt werden, um den Motor mit der gewünschten Drehzahl zu drehen, wodurch die Veränderung der Kühlfluideigenschaften kompensiert wird. In wenigstens einem Ausführungsbeispiel ist ein Motor so konstruiert, dass er eine im Wesentlichen konstante Drehzahl beibehält. Diese im Wesentlichen konstante Motordrehzahl resultiert in einer im Wesentlichen konstanten Zirkulationsrate des Kühlfluids.

Ein Test eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung wurde durchgeführt, in dem 5 ml Wasser in einem Messbehälter eingefroren wurden. Beim Einfrieren gab es weniger als 1 % Anstieg des Gesamtvolumens, viel weniger als beim herkömmlichen Einfrieren erwartet. In einem weiteren Test wurde Eis in einer herkömmlichen Gefriervorrichtung sowie in einem Kühlsystem gemäß einem bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung eingefroren. Nach dem Einfrieren wurde das Eis unter einem Dunkelfeldmikroskop untersucht. Wie erwartet, zeigte das herkömmliche Eis ein kristallines Muster, wohingegen das gemäß den Grundsätzen der vorliegenden Erfindung eingefrorene Eis keine leichte Verschiebung zeigte, was wenig bis keine Eiskristallbildung anzeigt.

Siehe nun 4, in welcher Versuchsergebnisse gezeigt sind, die eine Zellschädigung nach einem Einfrieren von nicht präpariertem Pflanzengewebe (ganze, kernlose Trauben) unter Verwendung einer Anzahl von Einfrierverfahren vergleichen. Das Balkendiagramm 400 vergleicht die Anzahl der einzelnen Zellen, die mittels der Verfahren B, C, D und E geschädigt wurden, gegenüber einer Kontrollgruppe A. Das Verfahren A war eine frische, niemals eingefrorene Kontrolle, das Verfahren B benutzte eine herkömmliche Gefriervorrichtung, um auf eine Temperatur von –20°C einzufrieren, das Verfahren C verwendete eine ultralangsame Gefriervorrichtung, um Zellen auf eine Temperatur von –80°C einzufrieren, Verfahren D benutze flüssigen Stickstoff, um Zellen auf eine Temperatur von –196°C einzufrieren, und Verfahren E benutzte ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung, um Zellen auf eine Temperatur von –25°C einzufrieren.

Das Experiment, dessen Ergebnisse in dem Balkendiagramm 400 gezeigt sind, verwendete Daten von nicht-präpariertem, nicht mit Kryoprotektoren behandeltem Pflanzengewebe. Die Ergebnisse zeigen klar, wie in 4 veranschaulicht, die Überlegenheit des gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung durchgeführten Verfahrens. Keine der aus der Kontrolle untersuchten Zellen, Verfahren A, zeigte eine Schädigung, sodass die in den anderen Verfahren zu sehende Schädigung allein auf der Einfriermethodik beruhte. Gemäß dem Test wurden 40% der mittels Verfahren B (herkömmliches Einfrieren) eingefrorenen Zellen nach dem Auftauen geschädigt, etwa 50% der Zellen waren nach dem Einfrieren und Auftauen mit dem Verfahren C (ultralangsame Gefriervorrichtung) geschädigt, und etwa 60% der Zellen waren nach dem Einfrieren und Auftauen mit dem Verfahren D (flüssiger Stickstoff) geschädigt. Signifikant waren nur 20% der mit dem Verfahren E (ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung) eingefrorenen Zellen beim Auftauen geschädigt. Man beachte, dass die Schädigung durch Prüfen der Pflanzenzellwand unter Vergrößerung beurteilt wurde.

Siehe nun 5, in der Versuchsergebnisse des Überlebens von Zellen (Lebensfähigkeit) und der Zellfunktion, gemessen als Zellbeweglichkeit, nach einem Einfrieren von chemisch präparierten, menschlichen Spermazellen als Vergleich eines herkömmlichen Einfrierverfahrens und eines Einfrierverfahrens gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung gezeigt sind. Zellen für beide Verfahren wurden zum Einfrieren mittels einer Standard-Industrietechnik chemisch präpariert. Das Balkendiagramm 500 vergleicht die Zellenlebensfähigkeit und -beweglichkeit nach dem Einfrieren unter Verwendung der zwei Verfahren. Das Verfahren A benutzte ein herkömmliches Verfahren des Aufhängens der Zellen in Stickstoffnebel für 30 Minuten und dann Eintauchen der Zellen in flüssigen Stickstoff. Das Verfahren B benutzte ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung, um die Zellen auf eine Temperatur von –25°C einzufrieren.

Das Experiment, dessen Ergebnisse in dem Balkendiagramm 500 gezeigt sind, benutzte chemisch präparierte menschliche Spermien. Die durch das Balkendiagramm 500 veranschaulichten Ergebnisse zeigen klar die Überlegenheit des gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung durchgeführten Verfahrens. Gemäß dem Test blieben nur 40 Prozent der mit dem Verfahren A (herkömmliches Verfahren) eingefrorenen Zellen beim Auftauen lebensfähig und nur etwa 20 Prozent der Zellen behielten ihre Beweglichkeit. Jedoch waren 75 Prozent der mit dem Verfahren B eingefrorenen Zellen beim Auftauen lebensfähig, und etwa 45 Prozent der Zellen waren noch beweglich. Man beachte, dass die Lebensfähigkeit der Zellen mittels eines Lebend/Tot-Färbens beim Auftauen beurteilt und die Beweglichkeit durch direkte Beobachtung der Zellen unter Vergrößerung bestimmt wurde.

Siehe nun 6, in der Versuchsergebnisse des Überlebens von Zellen (Lebensfähigkeit) nach dem Einfrieren von chemisch präparierten schweineähnlichen Muskelzellen als Vergleich eines herkömmlichen Einfrierverfahrens und eines Einfrierverfahrens gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung gezeigt sind. Zellen für beide Verfahren wurden zum Einfrieren mit zwei Konzentrationen von Kryoprotektoren chemisch präpariert. Das Balkendiagramm 600 vergleicht die Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Einfrieren für jedes der Verfahren. Das Verfahren A verwendet eine 10-prozentige Konzentration des Kryoprotektors, verbunden mit dem herkömmlichen Verfahren des Eintauchens der Zellen in flüssigen Stickstoffs, das Verfahren B verwendet eine 1-prozentige Konzentration des Kryoprotektors, verbunden mit dem herkömmlichen Verfahren des Eintauchens der Zellen in flüssigen Stickstoff. Das Verfahren C verwendet eine 10-prozentige Konzentration des Kryoprotektors, verbunden mit einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung, um die Zellen auf eine Temperatur von –25°C einzufrieren, und das Verfahren D verwendet eine 1-prozentige Konzentration des Kryoprotektors, verbunden mit einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung, um die Zellen auf eine Temperatur von –25°C einzufrieren.

Das Experiment, dessen Ergebnisse in dem Balkendiagramm 600 gezeigt sind, benutzte chemisch präparierte schweineähnliche Muskelzellen. Die Ergebnisse des Experiments zeigen klar, wie in 6 veranschaulicht, die Überlegenheit des gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung durchgeführten Verfahrens. Gemäß dem Test blieben etwa 40% der Zellen, die mittels entweder der Verfahren A (herkömmliches Verfahren mit 10 Prozent Kryoprotektor) oder B (herkömmliches Verfahren mit 1 Prozent Kryoprotektor) eingefroren wurden, beim Auftauen lebensfähig blieben. Jedoch blieben über 80% der mit beiden Verfahren C (ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung mit 10 Prozent Kryoprotektor) oder D (ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung mit 1 Prozent Kryoprotektor) eingefrorenen Zellen beim Auftauen lebensfähig. Man beachte, dass die Lebensfähigkeit der Zellen mittels eines Lebend/Tot-Einfärbens beim Auftauen beurteilt wurde.

Siehe nun 7, in welcher Versuchsergebnisse des Überlebens von Zellen (Lebensfähigkeit) nach dem Einfrieren chemisch präparierter Mäuseembryos als Vergleich eines Einfrierverfahrens des Standes der Technik und eines Einfrierverfahrens gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung gezeigt sind.

Zellen für beide Verfahren wurden zum Einfrieren unter Verwendung einer Standard-Industrietechnik chemisch präpariert. Das Balkendiagramm 700 vergleicht die Embryo-Lebensfähigkeit nach dem Einfrieren mittels der zwei Verfahren. Das Verfahren A benutzte ein herkömmliches Verfahren einer kontrollierten Einfrierrate in Stickstoffnebel gefolgt durch das Eintauchen der Embryos in flüssigen Stickstoff. Das Verfahren B benutzte ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung, um die Zellen auf eine Temperatur von –25°C einzufrieren, gefolgt von dem Eintauchen in flüssigen Stickstoff.

Das Experiment, dessen Ergebnisse in dem Balkendiagramm 700 gezeigt sind, benutzte Daten von chemisch präparierten Mäuseembryos. Die Ergebnisse, wie sie in 7 veranschaulicht sind, zeigen klar die Überlegenheit des gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung durchgeführten Verfahrens. Gemäß dem Test blieben nur etwa 50% der mit Verfahren A (herkömmliches Verfahren) eingefrorenen Embryos beim Auftauen lebensfähig. Jedoch blieben über 90% der mit Verfahren B eingefrorenen Embryos beim Auftauen lebensfähig. Man beachte, dass die Lebensfähigkeit der Embryos beim Auftauen mittels Lebend/Tot-Einfärbens beurteilt wurde.

Weil die vorliegende Erfindung biologisches Material so einfrieren kann, dass das Material vitrifiziert wird und die Bildung von Spannungsbrüchen in den Zellmembranen minimiert ist, können verschiedene Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung in medizinischen Bereichen wie beispielsweise Hauttransplantation, Hornhautlagerung, Kreislaufgefäßeinlagerung, Einfrieren von Transplantationsgeweben, Unfruchtbarkeitsbehandlung sowie die Untersuchung einer molekularen Regenerationskrankheit (Krebs) Anwendung finden. Alternativ kann die vorliegende Erfindung in der Viehwirtschaft zur Kryokonservierung von Samen, Oozyten und Embryos Verwendung finden.

In der vorherigen detaillierten Beschreibung wurde Bezug genommen auf die beiliegenden Zeichnungen, die einen Teil hiervon bilden und in denen beispielhaft spezielle Ausführungsbeispiele gezeigt sind, in denen die Erfindung ausgeübt werden kann.