QUERBEZUG ZU VERWANDTEN ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der am 12. Juni 2000 eingereichten
provisorischen US-Patenanmeldung Nr. 60/210,913 mit dem Titel "CRYOGENIC PRESERVATION
OF BIOLOGICALLY ACTIVE MATERIAL USING HIGH TEMPERATURE FREEZING".
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein eine kryogene Konservierung,
und insbesondere eine kryogene Konservierung von biologisch aktivem Material mittels
Vitrifikationstechniken.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die kryogene Konservierung (Kryokonservierung) kann definiert werden
als das Absenken der Temperatur von lebenden Strukturen und biochemischen Molekülen
auf den Gefrierpunkt und darunter zu den Zwecken der Lagerung und zukünftigen Wiedergewinnung
des Materials in seinem lebensfähigen Zustand vor dem Einfrieren. Experimente mit
Hundesperma in den 1700ern zeigten zuerst, dass einzelne Zellen eingefroren und
später aufgetaut werden können und dass eine kleine Prozentzahl der Zellen zu ihrer
normalen physiologischen Funktion zurückkehrt. Später wurde in den 1900ern herausgefunden,
dass die Zellenwiedergewinnungsraten verbessert werden können, falls die Zellen
unter Verwendung von Verbindungen, die insgesamt als Kryoprotektoren bezeichnet
werden, chemisch präpariert werden, um dem Einfrierprozess standzuhalten. Selbst
mit der Verwendung von Kryoprotektoren betragen jedoch die Wiedergewinnungsraten
aus der Kryokonservierung routinemäßig 50% oder weniger.
Bisherige Versuche zum Verbessern der Kryokonservierungs-Wiedergewinnungsraten
haben sich im Allgemeinen auf neue Kryoprotektoren zum Behandeln des biologischen
Materials vor dem Einfrieren und auf extrem langsame oder schnelle Einfriertechniken
fokussiert. Beide Techniken sind allgemein auf das Reduzieren einer Zellschädigung
gerichtet, die verursacht wird, wenn sich das Wasser in den Zellen während des Gefrierprozesses
aufgrund der Bildung von Eiskristallen ausdehnt. In der Theorie reduziert oder beseitigt
ein extrem langsames oder schnelles Einfrieren die Bildung von Eiskristallen in
einer Zelle. Mechanismen für extrem langsame Einfrierraten enthielten das kontrollierte
Absenken durch Stickstoffdämpfe in flüssigem Stickstoff oder das Bewegen der Proben
durch unterkühlte Alkoholverbindungen gefolgt von einem Eintauchen in flüssigen
Stickstoff. Das Einfrieren in dieser Weise erlaubt kein weiteres Wachstum der Eiskristallgröße
während des Einfrierprozesses, aber erlaubt nach wie vor die Eiskristallbildung.
Eine weitere Technik, die häufig als Vitrifikation bezeichnet wird,
taucht Proben direkt in flüssigen Stickstoff ein in einem Versuch, das Wasser in
der Zelle so schnell einzufrieren, dass eine Eiskristallbildung verhindert wird.
Die Vitrifikation nimmt Zellen schnell von Raumtemperatur auf –196°C,
der Temperatur von flüssigem Stickstoff. Ein derart extremer Temperaturabfall in
einer derart kurzen Zeit verursacht häufig Spannungsbrüche in der Zellmembran. Kryoprotektoren
werden in Verbindung mit der Vitrifikation und verschiedenen weiteren Einfriertechniken
verwendet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Deshalb wird ein verbesserter Weg zum kryogenen Konservieren von lebensfähigen
einzelnen Zellen, Geweben, Organen, Nukleinsäuren oder anderen biologisch aktiven
Molekülen benötigt, der wenigstens einige der Probleme bei den derzeit verfügbaren
Verfahren vermeidet. Demgemäß sieht wenigstens ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung ein Verfahren der Kryokonservierung mit dem Eintauchen von biologisch
aktivem Material in ein Kühlfluid und dem Zirkulieren des Kühlfluids entlang dem
Material vor. Das Material kann in Abhängigkeit von der Art des kryogen zu konservierenden
Materials vor dem Eintauchen einer chemischen Präparation unterzogen werden oder
nicht. Das Kühlfluid wird entlang dem Material mit einer im Wesentlichen konstanten
vorbestimmten Geschwindigkeit und Temperatur zirkuliert, um das Material so einzufrieren,
dass das Material vitrifiziert wird und die Bildung von Spannungsbrüchen in Zellmembranen
minimiert wird. In wenigstens einem Ausführungsbeispiel wird das Kühlfluid auf einer
Temperatur zwischen etwa –20°C und -30°C gehalten, und die Geschwindigkeit
des Kühlfluids entlang dem Material beträgt etwa 115 Liter pro Minute pro Meter
(35 Liter pro Minute pro Fuß) des Kühlfluids durch einen Bereich nicht größer als
etwa 0,61 Meter (24 Inch) breit und 1,22 m (48 Inch) tief. Außerdem friert wenigstens
ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung das Material direkt auf eine
Temperatur höher als etwa –30°C ein. Ein noch weiteres Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung sieht ein biologisches Material vor, das einem solchen
Kryokonservierungsprozess unterzogen worden ist.
Es ist eine Aufgabe wenigstens eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden
Erfindung, ein biologisches Material so einzufrieren, dass die Bildung von Eiskristallen
und Spannungsbrüchen vermieden wird.
Ein Vorteil wenigstens eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden
Erfindung besteht darin, dass die Kryokonservierungs-Wiedergewinnungsraten
deutlich erhöht sind, weil das biologische Material während des Einfrierens vitrifiziert
wird.
Ein weiterer Vorteil wenigstens eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden
Erfindung besteht darin, dass die Kryokonservierungs-Wiedergewinnungsraten verbessert
sind, weil das biologische Material bei einer Temperatur vitrifiziert wird, die
hoch genug ist, um die Bildung von Spannungsbrüchen in den Zellmembranen zu verhindern.
Ein weiterer Vorteil wenigstens eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden
Erfindung ist, dass derzeitige Kryokonservierungs-Lageranlagen und -mechanismen
verwendet werden können, um das gefrorene biologische Material zu lagern, wenn es
einmal eingefroren ist.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Weitere Aufgaben, Vorteile, Merkmale und Eigenschaften der vorliegenden
Erfindung sowie Verfahren, Funktionsweisen und Funktionen zugehöriger Bauelemente
und die Kombination von Teilen und Einsparungen bei der Herstellung werden bei Betrachtung
der folgenden Beschreibung und Ansprüche unter Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen
offensichtlich, die alle einen Teil dieser Beschreibung bilden, wobei gleiche Bezugsziffern
entsprechende Teile in den verschiedenen Figuren bezeichnen. Es zeigen:
1 eine Seitenansicht einer Kühlvorrichtung,
die zum Ausüben eines Verfahrens gemäß wenigstens einem Ausführungsbeispiel der
vorliegenden Erfindung geeignet ist;
2 eine Endansicht eines Querschnitts
der in 1 dargestellten Kühlvorrichtung;
3 ein Flussdiagramm eines Verfahrens
gemäß wenigstens einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;
4 ein Balkendiagramm der Ergebnisse von
experimentellen Vergleichen einer Zellschädigung in Schnitten von ganzen kernlosen
Trauben, die ohne chemische Präparation eingefroren wurden, zwischen verschiedenen
herkömmlichen Gefriervorrichtungen (von denen nicht alle zur Kryokonservierung und
Lagerung benutzt werden) und einem Einfrierverfahren gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung;
5 ein Balkendiagramm der Ergebnisse von
experimentellen Vergleichen des Überlebens von Zellen und der Funktion nach dem
Auftauen von menschlichen Spermien zwischen einem Einfrierverfahren des Standes
der Technik und einem Einfrierverfahren gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung;
6 ein Balkendiagramm der Ergebnisse von
experimentellen Vergleichen des Überlebens von Zellen nach dem Auftauen von schweineähnlichen
Muskelzellen zwischen einem Einfrierverfahren des Standes der Technik und einem
Einfrierverfahren gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;
und
7 ein Balkendiagramm der Ergebnisse von
experimentellen Vergleichen des Überlebens von Zellen von Mäuseembryos zwischen
einem Einfrierverfahren des Standes der Technik und einem Einfrierverfahren gemäß
einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG EINES BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELS
DER ERFINDUNG
Bezug nehmend zuerst auf 1 und
2 wird eine Kühlvorrichtung erläutert, die
zum Ausüben eines Verfahrens gemäß wenigstens einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung geeignet ist und allgemein als Kühleinheit 100 bezeichnet wird.
Die Kühleinheit 100 weist vorzugsweise einen Behälter 110 auf,
der ein Kühlfluid 140 enthält. Untergetaucht in das Kühlfluid
140 sind Zirkulatoren 134 wie beispielsweise Motoren
130 mit Flügelrädern 132, eine Wärmetauschspule 120 und
ein Gestell 150, das in einem Ausführungsbeispiel Fächer 155 zum
Tragen von einzufrierendem biologischen Material aufweist. Das biologische Material
kann, ohne darauf beschränkt zu sein, lebensfähige einzelne Zellen, Gewebe und Organe,
Nukleinsäuren und andere biologisch aktive Moleküle enthalten. Außerhalb des Behälters
110 und verbunden mit der Wärmetauschspule 120 ist eine Kälteeinheit
190.
Der Behälter 110 kann von beliebigen Dimensionen sein, die
zum Eintauchen des einzufrierenden biologischen Materials in ein Volumen des Kühlfluids
140 notwendig sind, wobei die Abmessungen gestaffelte Vielfache von 0,31
m × 0,61 m × 1,22 m (12 Inch × 24 Inch × 48 Inch) sind.
Behälter anderer Größen können im Einklang mit den hier erläuterten Lehren eingesetzt
werden. Zum Beispiel ist in einem Ausführungsbeispiel (nicht dargestellt) der Behälter
110 so bemessen, um gerade genug Kühlfluid 140 zu halten, sodass
Behälter wie beispielsweise Fläschchen, Teströhren, Becher, Messzylinder oder dergleichen
in den Behälter 110 zum schnellen Einfrieren von Suspensionen mit biologischen
Materialien und Kryoprotektoren gesetzt werden können. In weiteren Ausführungsbeispielen
ist der Behälter 110 groß genug, um ganze Organe und/oder Organismen zum
schnellen Einfrieren vollständig einzutauchen. Es ist selbstverständlich, dass der
Behälter 110 gegebenenfalls größer oder kleiner gemacht
werden kann, um effizient verschiedene Größen und Mengen von einzufrierendem biologischem
Material aufzunehmen. Wie nachfolgend erläutert, wird das biologische Material vor
dem Eintauchen in den Behälter 110 mit einem Kryoprotektor behandelt.
Der Behälter 110 hält das Kühlfluid 140. In einem
Ausführungsbeispiel ist das Kühlfluid eine lebensmittelverträgliche gelöste Substanz.
Gute Beispiele von lebensmittelverträglichen Fluiden sind jene, die auf Propylenglykol,
Natriumchloridlösungen oder dergleichen basieren. In einem weiteren Ausführungsbeispiel
ist das Kühlfluid selbst ein Kryoprotektor, wie beispielsweise Dimethylsulfoxid
(DMSO), Ethylenglykol, Propylenglykol, Polyethylenglykol oder dergleichen. Man beachte,
dass in manchen Fällen der Kryoprotektor selbst ein lebensmittelverträgliches Fluid
ist. In weiteren Ausführungsbeispielen werden weitere Fluide und bevorzugt gelöste
Substanzen als Kühlfluide verwendet. Während verschiedene Behälter benutzt werden
können, um das biologische Material zu halten, sehen einige Ausführungsbeispiele
der vorliegenden Erfindung vor, das biologische Material zum schnellen und effektiven
Einfrieren direkt in das Kühlfluid einzutauchen. Ein solches direktes Eintauchen
kann die Kryokonservierung mancher Gewebe und Organe vereinfachen.
Um das biologische Material unter Vermeidung der Bildung von Eiskristallen
einzufrieren, zirkuliert ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung das
Kühlfluid 140 entlang dem einzufrierenden biologischen Material mit einer
relativ konstanten Rate von 115 Litern pro Minute pro Meter (35 Liter pro Minute
pro Fuß) des Kühlfluids, das in einem Bereich von nicht mehr als 0,61 m (24 Inch)
breit auf 1,22 m (48 Inch) tief enthalten ist. Die notwendige Zirkulation wird durch
einen oder mehrere Zirkulatoren 134 wie beispielsweise Motoren
130 bereitgestellt. In wenigstens einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung treiben die untergetauchten Motoren 130 Flügelräder
132 an, um das Kühlfluid 140 entlang dem einzufrierenden biologischen
Material zu zirkulieren. Weitere Zirkulatoren 134, einschließlich verschiedener
Pumpen (nicht dargestellt), können im Einklang mit den Aufgaben der vorliegenden
Erfindung eingesetzt werden. Wenigstens ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung erhöht den Bereich und das Volumen, durch den das Kühlfluid zirkuliert
wird, indem wenigstens ein Zirkulator 134 zusätzlich zu den Motoren
130 eingesetzt wird. In Ausführungsbeispielen mit mehreren Zirkulatoren
134 werden die Fläche und das Volumen der Kühlfluidzirkulation in direktem
Verhältnis zu jedem zusätzlich eingesetzten Zirkulator erhöht. Zum Beispiel werden
in einem bevorzugten Ausführungsbeispiel drei zusätzliche Zirkulatoren für jeden
Meter des Kühlfluids (ein zusätzlicher Zirkulator pro Fuß) verwendet, das durch
eine Fläche von nicht mehr als 0,61 m (24 Inch) Breite auf 1,22 m (48 Inch) Tiefe
zirkuliert werden soll.
Vorzugsweise können die Motoren 130 gesteuert werden, um
eine konstante vorbestimmte Geschwindigkeit des Kühlfluidstroms entlang dem zu konservierenden
biologischen Material beizubehalten, während gleichzeitig eine gleichmäßige Verteilung
der Kühlfluidtemperatur innerhalb ±5°C an allen Punkten in dem Behälter
110 gehalten wird. Die im Wesentlichen konstante vorbestimmte Geschwindigkeit
des entlang dem biologischen Material zirkulierenden Fluids sieht ein konstantes,
gleichmäßiges Entziehen von Wärme vor, was die Vitrifikation des biologischen Materials
während des Einfrierens erlaubt. In einem Ausführungsbeispiel werden die Kühlfluideigenschaften,
wie beispielsweise Viskosität, Temperatur usw., gemessen und verarbeitet, und Steuersignale
werden zu den Motoren 130 geschickt, um die Drehzahl oder das Drehmoment
der Flügelräder 132 zu erhöhen oder zu verringern, falls erforderlich.
In anderen Ausführungsbeispielen sind die Motoren 130 so konstruiert, dass
sie eine gegebene Drehgeschwindigkeit über einen Bereich von Fluidzuständen halten.
In einem solchen Fall wird das Drehmoment oder die Drehzahl der Flügelräder
132, die durch die Motoren 130 vermittelt werden, nicht extern
gesteuert. Zu beachten ist die Tatsache, dass keine externen Pumpen, Wellen oder
Riemenscheiben benötigt werden, um ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung zu realisieren. Motoren 130 oder weitere Zirkulatoren
134 sind direkt in das Kühlfluid 140 eingetaucht. Als Ergebnis
friert das Kühlfluid 140 nicht nur das in den Tank 110 gesetzte
biologische Material ein, sondern das Kühlfluid 140 sieht auch eine Kühlung
für die Motoren 130 vor.
Die Wärmetauschspule 120 ist vorzugsweise eine „Mehrpfad-Spule",
die es im Gegensatz zu herkömmlichen Kältespulen, in denen das Kältemittel im Allgemeinen
auf einen oder zwei kontinuierliche Pfade beschränkt ist, dem Kältemittel erlaubt,
durch mehrere Pfade (d.h. drei oder mehr Pfade) zu strömen. Außerdem ist die Spulengröße
in direkter Beziehung zur Querschnittsfläche, die die gemessene Menge des Kühlfluids
140 enthält. Zum Beispiel ist in einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
der Behälter 110 0,31 m (1 Fuß) lang, 0,61 m (2 Fuß) tief und 1,22 m (4
Fuß) breit und verwendet eine Wärmetauschspule 120, die 0,31 m (1 Fuß)
auf 0,61 m (2 Fuß) ist. Falls die Länge des Behälters 110 auf 6,10 m (20
Fuß) erhöht ist, dann wird auch die Länge der Wärmetauschspule 120 auf
6,10 m (20 Fuß) erhöht. Als Ergebnis kann die Wärmetauschspule 120 zu etwa
50% der Größe einer herkömmlichen Spule gemacht werden, die zum Bewältigen der gleichen
Wärmelast erforderlich ist. Die Zirkulatoren 134 wie beispielsweise Motoren
130 zirkulieren das abgekühlte Kühlfluid 140 über das einzufrierende
biologische Material und transportieren dann das wärmere Kühlfluid zur Wärmetauschspule
120, die in das Kühlfluid 140 untergetaucht ist. In wenigstens
einem Ausführungsbeispiel ist die Wärmetauschspule 120 so konstruiert,
dass sie nicht weniger als die gleiche Wärmemenge von dem Kühlfluid 140
entfernt, wie dieses dem einfrierenden biologischen Material entzieht, wodurch die
Temperatur des Kühlfluids 140 in einem vorbestimmten Bereich gehalten wird.
Die Wärmetauschspule 120 ist mit der Kälteeinheit 190 verbunden,
die die Wärme aus der Wärmetauschspule 120 und dem System entfernt.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die Kälteeinheit
190 so konstruiert, dass sie zu der Lastanforderung der Wärmetauschspule
120 passt, sodass die Wärme dem System in einer ausgeglichenen und effizienten
Weise entzogen wird, was in einem kontrollierten, schnellen Einfrieren eines Materials
resultiert. Die Effizienz der Kälteeinheit 190 steht direkt mit dem Verfahren
in Zusammenhang, das zum Steuern von Saugdrücken durch das effiziente Versorgen
der Wärmetauschspule 120 und die effiziente Ausgabe der in der Kälteeinheit
190 verwendeten Kompressoren eingesetzt wird.
Diese Methodik erfordert die Einhaltung sehr enger Toleranzen zwischen
den Temperaturen des Kältemittels und des Kühlfluids 140 und zwischen der
Kondensationstemperatur und der Umgebungstemperatur. Diese Temperaturkriterien erlauben
zusammen mit der Konstruktion der Wärmetauschspule 120 ein effizienteres
Beschicken der Wärmetauschspule 120, was seinerseits ein Beschicken des
Kompressors in einer ausgeglichenen und eng gesteuerten Weise erlaubt, um über 25%
mehr Leistung aus den Kompressoren zu erzielen, als jene, die als Standardauslegung
der Kompressorhersteller akzeptiert wird.
Man beachte, dass in dem in 1 gezeigten
Ausführungsbeispiel die Kälteeinheit 190 ein externes, entfernt positioniertes
Kältesystem ist. In einem weiteren Ausführungsbeispiel (nicht dargestellt) ist jedoch
die Kälteeinheit 190 in einem weiteren Abschnitt des Behälters
110 integriert. Es ist selbstverständlich, dass verschiedene Konfigurationen
für die Kälteeinheit 190 für gewisse Konfigurationen der Kühleinheit
100 mehr oder weniger geeignet sein können. Falls zum Beispiel der Behälter
110 extrem groß ist, ist eine separate Kälteeinheit 190 erwünscht,
während ein tragbares Ausführungsbeispiel von einer integrierten Kälteeinheit
190 profitieren kann. Eine solche Integration ist nur durch die Wirksamkeiten
möglich gemacht, die durch Realisieren der hier erläuterten Grundsätze und insbesondere
die Verwendung einer kleineren Wärmetauschspule erzielt werden.
Aufgrund der Kälteeinheit 190 und der Wärmetauschspule
120 wird in einem bevorzugten Ausführungsbeispiel das Kühlfluid auf eine
Temperatur zwischen –20°C und -30°C gekühlt, mit einer Temperaturdifferenz
im Kühlfluid von weniger als etwa ±5°C. In weiteren Ausführungsbeispielen
wird das Kühlfluid auf Temperaturen außerhalb des Bereichs von –20°C bis
–30°C gekühlt, um die Rate zu steuern, mit welcher eine Substanz eingefroren
werden soll. Weitere Ausführungsbeispiele steuern die Zirkulationsrate des Kühlfluids,
um gewünschte Einfrierraten zu erzielen. Alternativ kann das Volumen des Kühlfluids
verändert werden, um eine spezielle Einfrierrate zu erleichtern. Es ist selbstverständlich,
dass verschiedene Kombinationen der Kühlfluid-Zirkulationsrate, des Kühlfluidvolumens
und der Kühlfluidtemperatur benutzt werden können, um gewünschte Einfrierraten zu
erzielen.
Bezug nehmend nun auf 2 wird ein Ausführungsbeispiel
des Kühlsystems 100 erläutert, das zum Einfrieren relativ großer Mengen
von biologischem Material geeignet ist. Die Bezugsziffern in 2,
die gleich, ähnlich oder identisch zu den Bezugsziffern in 1
sind, geben gleiche, ähnliche oder identische Merkmale an. Der Behälter
110 enthält das Kühlfluid 140, in das das Gestell 150
abgesenkt werden kann. Das Gestell 150 ist mit einem Gestellträger
210 bewegbar verbunden, sodass das Gestell 150 angehoben oder
abgesenkt werden kann, um die Platzierung der Substanzen in den Behälter
110 zu erleichtern.
In Gebrauch wird das einzufrierende biologische Material in Fächer
155 des Gestells 150 gesetzt. Vorzugsweise sind die Fächer
155 aus Draht, Maschen oder dergleichen konstruiert, sodass das Kühlfluid
140 frei über, unter und/oder um darauf gesetzte Gegenstände zirkulieren
kann. Vorzugsweise senkt der Gestellträger 210 das Gestell 150
in den Behälter 110 ab, wenn das Kühlfluid einmal auf eine gewünschte Temperatur
abgekühlt ist, um die Fächer in das Kühlfluid 140 unterzutauchen. Das Absenken
des Gestells 150 kann manuell oder unter Verwendung verschiedener, dem
Fachmann bekannter Zahnrad-, Ketten- und/oder Riemenscheibenkonstruktionen erreicht
werden. Die Zirkulatoren 134 zirkulieren das Kühlfluid 140 über
die in den Fächern 155 gesetzten Substanzen, um ein schnelles und kontrolliertes
Einfrieren vorzusehen. Es ist selbstverständlich, dass weitere Anordnungen zum Eintauchen
des biologischen Materials in den Behälter 110 eingesetzt werden können,
und dass die Verwendung eines automatischen Absenksystems nicht notwendigerweise
zum Gebrauch in allen Fällen bevorzugt ist.
Bezug nehmend nun auf 3 ist ein Verfahren
gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung veranschaulicht und allgemein
durch die Bezugsziffer 300 bezeichnet. Das dargestellte Verfahren beginnt
bei Schritt 310, wo das Kühlfluid entlang einer Wärmetauschspule
zirkuliert wird. Die Wärmetauschspule ist wie oben erläutert mit einem Kältesystem
wirkverbunden und wird benutzt, um die Temperatur des Kühlfluids zu verringern,
wenn das Kühlfluid entlang der Wärmetauschspule zirkuliert wird. In Schritt
320 wird die Temperatur des Kühlfluids gemessen, und das Verfahren geht
weiter zu Schritt 330, wo bestimmt wird, ob die Temperatur des Kühlfluids
in einem optimalen Temperaturbereich liegt. Dieser optimale Kühlfluid-Temperaturbereich
kann für verschiedene Anwendungen unterschiedlich sein, jedoch liegt ein bevorzugter
optimaler Temperaturbereich für viele Anwendungen zwischen –20°C und –30°C.
Falls bestimmt wird, dass die Kühlfluidtemperatur nicht in einem optimalen
vorbestimmten Temperaturbereich liegt, wird Schritt 335 durchgeführt. In
Schritt 335 wird die Wärmetauschspule durch eine Kälteeinheit gekühlt,
und das Verfahren kehrt zu Schritt 310 zurück, in dem das Kühlfluid entlang
der Wärmetauschspule zirkuliert wird, um die Temperatur des Kühlfluids zu verringern.
Vorzugsweise werden die Schritte 310, 320, 330 und
335 fortlaufend durchgeführt, bis das Kühlfluid den optimalen Temperaturbereich
erreicht.
Die Temperatur des zum Einfrieren des biologischen Materials benutzten
Kühlfluids ist ein wichtiges Element wenigstens eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden
Erfindung. Um eine Vitrifikation mittels herkömmlicher Prozesse zu erreichen, wird
das biologische Material im Allgemeinen in flüssigem Stickstoff mit einer Temperatur
von –196°C abgeschreckt. Eine derart drastische Temperaturänderung über
eine sehr kurze Zeitdauer gefriert das Wasser in den Zellstrukturen so schnell,
dass Eiskristalle keine Chance haben, sich zu bilden. Jedoch kann das Einfrieren
von biologischem Material durch Abschrecken in flüssigem Stickstoff Spannungsbrüche
in Zellmembranen verursachen, wodurch die Brauchbarkeit des Abschreckens in flüssigem
Stickstoff zur Kryokonservierung beschränkt ist. Da die in einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung benutzten Temperaturen zwischen –20°C und –30°C
liegen, werden Spannungsbrüche aufgrund Temperaturveränderung minimiert und die
Vitrifikation kann mit viel weniger Schädigung der Zellmembranen erreicht werden.
Während das Kühlfluid auf die geeignete Temperatur gekühlt wird, werden
die einzufrierenden biologischen Materialien in Schritt 305 zum Einfrieren
präpariert. Wie oben erwähnt, enthält das biologische Material, ohne darauf beschränkt
zu sein, lebensfähige einzelne Zellen, Gewebe und Organe, Nukleinsäuren und andere
biologisch aktive Moleküle. Gegebenenfalls werden die Materialien einer chemischen
Präparation vor dem Einfrieren unterzogen. Das chemische Präparieren des biologischen
Materials kann eine Vorbehandlung des biologischen Materials mit Mitteln (Stabilisatoren)
enthalten, die die Lebensfähigkeit der Zellen erhöhen, indem schädliche Substanzen
entfernt werden, die von den Zellen während des Wachstums oder Zellensterbens abgeschieden
werden. Brauchbare Stabilisatoren enthalten solche Chemikalien und chemischen Verbindungen,
von denen viele dem Fachmann bekannt sind, die hochreaktive und schädliche Moleküle
wie beispielsweise Sauerstoffradikale maskieren.
Das chemische Präparieren des biologischen Materials kann auch einen
Akklimatisierungsschritt enthalten (nicht dargestellt). Während der oder eine gewisse
Zeit nach der Vorbehandlung kann das zu konservierende biologische Material auf
eine Temperatur akklimatisiert werden, die gegenüber Kultivierungstemperaturen reduziert
ist, aber noch über dem Einfrieren liegt. Dies kann helfen, das biologische Material
für den Kryokonservierungsprozess zu reduzieren, indem der zellulare Stoffwechsel
verlangsamt und der Schock des schnellen Temperaturübergangs reduziert werden. Man
beachte jedoch, dass ein Akklimatisierungsschritt nicht immer erforderlich ist,
um die vorliegende Erfindung auszuüben.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel enthält das chemische Präparieren
des biologischen Materials zum Einfrieren ein Füllen des biologischen Materials
mit einem Kryoprotektor. Das Füllen beinhaltet im Allgemeinen die Gleichgewichtseinstellung
des biologischen Materials in einer Lösung eines oder mehrerer Kryoprotektoren.
Während des Füllens verwendete Substanzen können als Sättigungsmittel bezeichnet
werden. Brauchbare Sättigungsmittel können ein oder mehrere Dehydratisierungsmittel,
Imprägnierungs- und Nichtimprägnierungsmittel sowie osmotische Mittel enthalten.
Sowohl Imprägnierungsmittel wie beispielsweise DMSO und Ethylenglykol als auch eine
Kombination von imprägnierenden und nicht-imprägnierenden osmotischen Mitteln wie
beispielsweise Fruktose, Sukrose oder Glukose und Sorbitol, Manitol oder Glycerol
können verwendet werden. Es ist selbstverständlich, dass weitere geeignete Kryoprotektoren
im Einklang mit den Aufgaben der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können.
Nachdem das Kühlfluid eine geeignete Temperatur erreicht, wird Schritt
315 durchgeführt, in dem das chemisch präparierte biologische Material
in das Kühlfluid eingetaucht wird. Wie früher erwähnt, kann das biologische Material
in einem Behälter gehalten oder direkt in das Kühlfluid gesetzt werden. Das Verfahren
geht dann weiter zu Schritt 337, in dem ein Zirkulator wie beispielsweise
eine untergetauchte Motor/Flügelradanordnung oder Pumpe verwendet wird, um das Kühlfluid
mit der zuvor erläuterten Geschwindigkeit entlang dem eingetauchten biologischen
Material zu zirkulieren. Da das Kühlfluid durch das biologische
Material strömt, wird Wärme aus dem Material entfernt, das auf einer höheren Temperatur
als der Temperatur des Kühlfluids liegt, und auf das Kühlfluid übertragen, welches
die Wärme von dem einzufrierenden biologischen Material wegtransportiert. Gemäß
wenigstens einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung sollte eine im Wesentlichen
konstante Zirkulation des Kühlfluids entlang dem einzufrierenden biologischen Material
beibehalten werden, um das präparierte biologische Material so einzufrieren, dass
das präparierte Material vitrifiziert wird.
Nachdem das Kühlfluid entlang dem einzufrierenden biologischen Material
zirkuliert ist, wird Schritt 339 durchgeführt. Schritt 339 stellt
die Geschwindigkeit des Kühlfluids notwendigenfalls ein, um Veränderungen der Viskosität,
Temperatur und dergleichen des Kühlfluids zu berücksichtigen. Vorzugsweise wird
die Geschwindigkeit des Kühlfluids durch Einstellen der durch einen oder mehrere
Zirkulatoren bereitgestellten Kraft konstant gehalten.
Die in 3 veranschaulichten Schritte sind
in einer fortlaufenden Reihenfolge gezeigt und erläutert. Das dargestellte Verfahren
ist jedoch von einer Natur, bei welcher einige oder alle Schritte fortlaufend durchgeführt
werden und in einer anderen Reihenfolge durchgeführt werden können. Zum Beispiel
verwendet wenigstens ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung einen einzelnen
Umlaufmotor, um das Kühlfluid zu zirkulieren. In einem solchen Ausführungsbeispiel
wird das Kühlfluid in Schritt 310 entlang einer Wärmetauschspule zirkuliert
und in Schritt 337 gleichzeitig entlang dem zu konservierenden biologischen
Material. Außerdem misst ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung die
Temperaturen, Viskositäten des Kühlfluids und weitere Fluideigenschaften kontinuierlich
und an mehreren Stellen in dem System.
In einem noch weiteren Ausführungsbeispiel werden einige Eigenschaften
des Kühlfluids nicht direkt gemessen. Stattdessen wird die Veränderung der Kühlfluideigenschaften
indirekt aus der Drehzahl eines Zirkulationsmotors bestimmt. Falls der Motor langsamer
dreht, dann kann dem Motor zusätzliche Energie zugeführt werden, um den Motor mit
der gewünschten Drehzahl zu drehen, wodurch die Veränderung der Kühlfluideigenschaften
kompensiert wird. In wenigstens einem Ausführungsbeispiel ist ein Motor so konstruiert,
dass er eine im Wesentlichen konstante Drehzahl beibehält. Diese im Wesentlichen
konstante Motordrehzahl resultiert in einer im Wesentlichen konstanten Zirkulationsrate
des Kühlfluids.
Ein Test eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung wurde
durchgeführt, in dem 5 ml Wasser in einem Messbehälter eingefroren wurden. Beim
Einfrieren gab es weniger als 1 % Anstieg des Gesamtvolumens, viel weniger als beim
herkömmlichen Einfrieren erwartet. In einem weiteren Test wurde Eis in einer herkömmlichen
Gefriervorrichtung sowie in einem Kühlsystem gemäß einem bevorzugten Verfahren der
vorliegenden Erfindung eingefroren. Nach dem Einfrieren wurde das Eis unter einem
Dunkelfeldmikroskop untersucht. Wie erwartet, zeigte das herkömmliche Eis ein kristallines
Muster, wohingegen das gemäß den Grundsätzen der vorliegenden Erfindung eingefrorene
Eis keine leichte Verschiebung zeigte, was wenig bis keine Eiskristallbildung anzeigt.
Siehe nun 4, in welcher Versuchsergebnisse
gezeigt sind, die eine Zellschädigung nach einem Einfrieren von nicht präpariertem
Pflanzengewebe (ganze, kernlose Trauben) unter Verwendung einer Anzahl von Einfrierverfahren
vergleichen. Das Balkendiagramm 400 vergleicht die Anzahl der einzelnen
Zellen, die mittels der Verfahren B, C, D und E geschädigt wurden, gegenüber einer
Kontrollgruppe A. Das Verfahren A war eine frische, niemals eingefrorene Kontrolle,
das Verfahren B benutzte eine herkömmliche Gefriervorrichtung, um auf eine Temperatur
von –20°C einzufrieren, das Verfahren C verwendete eine ultralangsame
Gefriervorrichtung, um Zellen auf eine Temperatur von –80°C einzufrieren,
Verfahren D benutze flüssigen Stickstoff, um Zellen auf eine Temperatur von –196°C
einzufrieren, und Verfahren E benutzte ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung, um Zellen auf eine Temperatur von –25°C einzufrieren.
Das Experiment, dessen Ergebnisse in dem Balkendiagramm
400 gezeigt sind, verwendete Daten von nicht-präpariertem, nicht mit Kryoprotektoren
behandeltem Pflanzengewebe. Die Ergebnisse zeigen klar, wie in 4
veranschaulicht, die Überlegenheit des gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung durchgeführten Verfahrens. Keine der aus der Kontrolle
untersuchten Zellen, Verfahren A, zeigte eine Schädigung, sodass die in den anderen
Verfahren zu sehende Schädigung allein auf der Einfriermethodik beruhte. Gemäß dem
Test wurden 40% der mittels Verfahren B (herkömmliches Einfrieren) eingefrorenen
Zellen nach dem Auftauen geschädigt, etwa 50% der Zellen waren nach dem Einfrieren
und Auftauen mit dem Verfahren C (ultralangsame Gefriervorrichtung) geschädigt,
und etwa 60% der Zellen waren nach dem Einfrieren und Auftauen mit dem Verfahren
D (flüssiger Stickstoff) geschädigt. Signifikant waren nur 20% der mit dem Verfahren
E (ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung) eingefrorenen
Zellen beim Auftauen geschädigt. Man beachte, dass die Schädigung durch Prüfen der
Pflanzenzellwand unter Vergrößerung beurteilt wurde.
Siehe nun 5, in der Versuchsergebnisse
des Überlebens von Zellen (Lebensfähigkeit) und der Zellfunktion,
gemessen als Zellbeweglichkeit, nach einem Einfrieren von chemisch präparierten,
menschlichen Spermazellen als Vergleich eines herkömmlichen Einfrierverfahrens und
eines Einfrierverfahrens gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung gezeigt sind. Zellen für beide Verfahren wurden zum Einfrieren mittels
einer Standard-Industrietechnik chemisch präpariert. Das Balkendiagramm
500 vergleicht die Zellenlebensfähigkeit und -beweglichkeit nach dem Einfrieren
unter Verwendung der zwei Verfahren. Das Verfahren A benutzte ein herkömmliches
Verfahren des Aufhängens der Zellen in Stickstoffnebel für 30 Minuten und dann Eintauchen
der Zellen in flüssigen Stickstoff. Das Verfahren B benutzte ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung, um die Zellen auf eine Temperatur von –25°C
einzufrieren.
Das Experiment, dessen Ergebnisse in dem Balkendiagramm
500 gezeigt sind, benutzte chemisch präparierte menschliche Spermien. Die
durch das Balkendiagramm 500 veranschaulichten Ergebnisse zeigen klar die
Überlegenheit des gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung
durchgeführten Verfahrens. Gemäß dem Test blieben nur 40 Prozent der mit dem Verfahren
A (herkömmliches Verfahren) eingefrorenen Zellen beim Auftauen lebensfähig und nur
etwa 20 Prozent der Zellen behielten ihre Beweglichkeit. Jedoch waren 75 Prozent
der mit dem Verfahren B eingefrorenen Zellen beim Auftauen lebensfähig, und etwa
45 Prozent der Zellen waren noch beweglich. Man beachte, dass die Lebensfähigkeit
der Zellen mittels eines Lebend/Tot-Färbens beim Auftauen beurteilt und die Beweglichkeit
durch direkte Beobachtung der Zellen unter Vergrößerung bestimmt wurde.
Siehe nun 6, in der Versuchsergebnisse
des Überlebens von Zellen (Lebensfähigkeit) nach dem Einfrieren von chemisch präparierten
schweineähnlichen Muskelzellen als Vergleich eines herkömmlichen Einfrierverfahrens
und eines Einfrierverfahrens gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung gezeigt sind. Zellen für beide Verfahren wurden zum Einfrieren mit zwei
Konzentrationen von Kryoprotektoren chemisch präpariert. Das Balkendiagramm
600 vergleicht die Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Einfrieren für jedes
der Verfahren. Das Verfahren A verwendet eine 10-prozentige Konzentration des Kryoprotektors,
verbunden mit dem herkömmlichen Verfahren des Eintauchens der Zellen in flüssigen
Stickstoffs, das Verfahren B verwendet eine 1-prozentige Konzentration des Kryoprotektors,
verbunden mit dem herkömmlichen Verfahren des Eintauchens der Zellen in flüssigen
Stickstoff. Das Verfahren C verwendet eine 10-prozentige Konzentration des Kryoprotektors,
verbunden mit einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung,
um die Zellen auf eine Temperatur von –25°C einzufrieren, und das Verfahren
D verwendet eine 1-prozentige Konzentration des Kryoprotektors, verbunden mit einem
bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung, um die Zellen auf eine
Temperatur von –25°C einzufrieren.
Das Experiment, dessen Ergebnisse in dem Balkendiagramm
600 gezeigt sind, benutzte chemisch präparierte schweineähnliche Muskelzellen.
Die Ergebnisse des Experiments zeigen klar, wie in 6
veranschaulicht, die Überlegenheit des gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung durchgeführten Verfahrens. Gemäß dem Test blieben etwa
40% der Zellen, die mittels entweder der Verfahren A (herkömmliches Verfahren mit
10 Prozent Kryoprotektor) oder B (herkömmliches Verfahren mit 1 Prozent Kryoprotektor)
eingefroren wurden, beim Auftauen lebensfähig blieben. Jedoch blieben über 80% der
mit beiden Verfahren C (ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung
mit 10 Prozent Kryoprotektor) oder D (ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung mit 1 Prozent Kryoprotektor) eingefrorenen Zellen beim Auftauen lebensfähig.
Man beachte, dass die Lebensfähigkeit der Zellen mittels eines Lebend/Tot-Einfärbens
beim Auftauen beurteilt wurde.
Siehe nun 7, in welcher Versuchsergebnisse
des Überlebens von Zellen (Lebensfähigkeit) nach dem Einfrieren chemisch präparierter
Mäuseembryos als Vergleich eines Einfrierverfahrens des Standes der Technik und
eines Einfrierverfahrens gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung gezeigt sind.
Zellen für beide Verfahren wurden zum Einfrieren unter Verwendung
einer Standard-Industrietechnik chemisch präpariert. Das Balkendiagramm
700 vergleicht die Embryo-Lebensfähigkeit nach dem Einfrieren mittels der
zwei Verfahren. Das Verfahren A benutzte ein herkömmliches Verfahren einer kontrollierten
Einfrierrate in Stickstoffnebel gefolgt durch das Eintauchen der Embryos in flüssigen
Stickstoff. Das Verfahren B benutzte ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung, um die Zellen auf eine Temperatur von –25°C einzufrieren, gefolgt
von dem Eintauchen in flüssigen Stickstoff.
Das Experiment, dessen Ergebnisse in dem Balkendiagramm
700 gezeigt sind, benutzte Daten von chemisch präparierten Mäuseembryos.
Die Ergebnisse, wie sie in 7 veranschaulicht sind,
zeigen klar die Überlegenheit des gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der
vorliegenden Erfindung durchgeführten Verfahrens. Gemäß dem Test blieben nur etwa
50% der mit Verfahren A (herkömmliches Verfahren) eingefrorenen Embryos beim Auftauen
lebensfähig. Jedoch blieben über 90% der mit Verfahren B eingefrorenen
Embryos beim Auftauen lebensfähig. Man beachte, dass die Lebensfähigkeit der Embryos
beim Auftauen mittels Lebend/Tot-Einfärbens beurteilt wurde.
Weil die vorliegende Erfindung biologisches Material so einfrieren
kann, dass das Material vitrifiziert wird und die Bildung von Spannungsbrüchen in
den Zellmembranen minimiert ist, können verschiedene Ausführungsbeispiele der vorliegenden
Erfindung in medizinischen Bereichen wie beispielsweise Hauttransplantation, Hornhautlagerung,
Kreislaufgefäßeinlagerung, Einfrieren von Transplantationsgeweben, Unfruchtbarkeitsbehandlung
sowie die Untersuchung einer molekularen Regenerationskrankheit (Krebs) Anwendung
finden. Alternativ kann die vorliegende Erfindung in der Viehwirtschaft zur Kryokonservierung
von Samen, Oozyten und Embryos Verwendung finden.
In der vorherigen detaillierten Beschreibung wurde Bezug genommen
auf die beiliegenden Zeichnungen, die einen Teil hiervon bilden und in denen beispielhaft
spezielle Ausführungsbeispiele gezeigt sind, in denen die Erfindung ausgeübt werden
kann.