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Dokumentenidentifikation DE60025380T2 07.09.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001222469
Titel EIN-SCHRITTTEST ZUM NACHWEIS VON ANTIMIKROBIELLEN RÜCKSTÄNDEN IN EIERN
Anmelder DSM IP Assets B.V., TE Heerlen, NL
Erfinder LANGEVELD, Cornelis, Pieter, NL-2622 BP Delft, NL;
STARK, Jacobus, NL-3069 ZM Rotterdam, NL
Vertreter Müller-Boré & Partner, Patentanwälte, European Patent Attorneys, 81671 München
DE-Aktenzeichen 60025380
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 03.10.2000
EP-Aktenzeichen 009694589
WO-Anmeldetag 03.10.2000
PCT-Aktenzeichen PCT/EP00/09872
WO-Veröffentlichungsnummer 2001025795
WO-Veröffentlichungsdatum 12.04.2001
EP-Offenlegungsdatum 17.07.2002
EP date of grant 04.01.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 07.09.2006
IPC-Hauptklasse G01N 33/94(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12Q 1/18(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zum schnellen Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von antimikrobiellen Resten in Eiern.

Hintergrund der Erfindung

Die Anwesenheit von antimikrobiellen Resten in Nahrungsmitteln und Futtermitteln ist wegen gesundheitsbezogener Probleme und dem Anstieg von Arzneimittel-resistenten Bakterien eine wachsende Sorge unter den Konsumenten. Antibiotika werden nicht nur als Arzneistoff angewandt, sondern im Fall von Geflügel sicherlich auch weit verbreitet als antimikrobielle, wachstumsfördernde Substanzen. Es ist gut bekannt, dass Konzentrationen von antimikrobiellen Resten in Eiern hoch sein können. In den meisten Ländern, wie den Ländern der Europäischen Gemeinschaft, Kanada und den Vereinigten Staaten sind Rest-Höchstwerte (engl.: „Maximum Residue Levels") (MRL) durch Gesetz geregelt.

Testverfahren, um antimikrobielle Reste in Körperflüssigkeiten, wie Milch oder Urin, nachzuweisen, wie mikrobielle Inhibitionstests (z.B. Agardiffusionstests) oder Verfahren, die selektive Bindermoleküle (z.B. Antikörper oder Indikatorsubstanzen) nutzen, sind gut bekannt. Beispiele für mikrobielle Testverfahren sind in der GB-A-1467439, EP 0005891, DE 3613794, CA 2056581, EP 0285792 und US 5494805 beschrieben worden. Diese Dokumente handeln alle von gebrauchsfertigen Tests, die einen Testorganismus nutzen. Der Testorganismus ist meist in ein Agarmedium, das einen Indikator, eine Pufferlösung, Nährstoffe und Substanzen, um die Sensitivität für bestimmte antimikrobielle Verbindungen in einer positiven oder negativen Art zu ändern, enthalten kann, eingebettet.

Beispiele für geeignete Testorganismen sind Stämme von Bacillus, Streptococcus oder E. coli. Im Allgemeinen besteht das Prinzip dieser Tests darin, dass wenn antibakterielle Verbindungen in einer Probe in Konzentrationen vorhanden sind, die ausreichend sind, das Wachstum des Testorganismus zu hemmen, die Farbe eines Säure/Basen- oder Redoxindikators gleich bleibt. Wenn jedoch keine Inhibition erfolgt, wird das Wachstum des Testorganismus von der Bildung von sauren oder reduzierten Stoffwechselprodukten begleitet, was zu einem Farbwechsel des Indikators führt.

Diese Testverfahren sind für den Nachweis von antimikrobiellen Resten in Körperflüssigkeiten geeignet. Bis jetzt war jedoch, wegen der Anwesenheit von antimikrobiellen Substanzen, wie Lysozym, die in Eiern natürlicherweise in hohen Konzentrationen vorhanden sind, kein Nachweis von antimikrobiellen Resten in Eiern möglich. Diese inhibierenden Substanzen zeigen eine inhibierende Aktivität gegen die Testmikroorganismen, was zu falschpositiven Ergebnissen führt.

Im Fall von z.B. einer Milch- oder Urinprobe können inhibierende Substanzen wie Lysozym oder Lactoferrin durch Erwärmen der Probe z.B. auf 80 °C für 10 Minuten (Vermunt et. al., Niederländisches Milch und Milchprodukt Journal 47:(1) 31–40 (1993)), oder unter Verwendung von gut bekannten Dialyseverfahren (van Wall, Archiv für Lebensmittelhygiene 29:(6)235 (1978)) inaktiviert werden. Nach dieser Vorbehandlung kann die flüssige Probe für weiteres Testen einfach durch Befolgen der Arbeitsvorgänge des Tests verwendet werden. Im Fall einer Delvotest® -Art von Test (EP 0005891) kann die flüssige Probe direkt zum Test zugefügt werden, wonach der Test inkubiert wird.

Erwärmen einer Ei-Probe auf Temperaturen, die ausreichend sind, um inhibierende Substanzen des Eies, wie Lysozym, zu inaktivieren, führt immer zu einer Gerinnung der Probe. Es wurde angenommen, dass solche Proben für eine weitere Verarbeitung nicht mehr geeignet wären.

Bis jetzt müssen, nach dem Erwärmen auf eine Temperatur, die ausreichend ist, um andere antimikrobielle Substanzen als antimikrobielle Reste, zu inaktivieren, die nachzuweisenden antimikrobiellen Reste aus der geronnenen Ei-Probe extrahiert werden. Diese Extraktionsverfahren kosten nicht nur viel Zeit und zusätzliche Handhabung sondern, schlimmer noch, führen immer zu Verlust von mindestens einem Teil der antimikrobiellen Reste, wenn sie in der Probe vorhanden sind (Inglis et. al., Journal for the Association of Official Analytical Chemists 61: (5) 1098–1102 (1978); Katz et. al., Journal of the Association of Official Analytical Chemists 61: (5) 1103–1106 (1978); Janetschke et. al., Monatshefe für Veterinaermedizin 34: (21) 824–826 (1979); Steiner, Monatshefe für Veterinarmedizin 45: (11) 382–386 (1990)). Dies kann zu falschnegativen Ergebnissen und deshalb zu Antibiotika in Konsumenten-Eiern führen, was natürlich aus einem Gesundheitsaspekt nicht akzeptabel ist. Außerdem sind Labore, die Studien ausführen, welche die Anwesenheit oder Abwesenheit von antimikrobiellen Resten in Nahrungsmitteln betreffen, durch die Zeit begrenzt, die zur Durchführung dieser Studien zur Verfügung steht. Mit den gegenwärtigen, zeitraubenden Verfahren kann nur eine sehr begrenzte Menge an Ei-Proben untersucht werden. Weiterhin können diese Assays nur in gut ausgestatteten Laboren und von gut ausgebildeten Personen durchgeführt werden, was ebenfalls ein begrenzender Faktor ist.

Man kann daraus folgern, dass bis heute kein geeignetes Testverfahren für den Nachweis von antimikrobiellen Resten in Ei-Proben erhältlich ist. Die gegenwärtigen Verfahren sind unzuverlässig, können sowohl zu falschpositiven als auch falschnegativen Ergebnissen führen, was wiederum zu nicht akzeptablen Mengen Antibiotika in der Nahrungskette und zu wirtschaftlichen Verlusten führt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt einen verlässlichen und einfach durchzuführen Ein-Schritt-Test zum Nachweis von antimikrobiellen Resten in Eiern bereit.

Unerwarteterweise wurde herausgefunden, dass wenn eine Ei-Probe einem Test, der zum Nachweis von antimikrobiellen Resten geeignet ist, zugefügt wird und dann für eine ausreichende Zeit bei einer ausreichenden Temperatur, um natürliche, inhibierende Verbindungen des Eies zu inaktivieren, inkubiert wird, der Test direkt nach dem Erwärmen inkubiert werden kann, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von antimikrobiellen Resten zu bestimmen.

Es wurde überraschenderweise herausgefunden, dass antimikrobielle Reste direkt aus der geronnenen Ei-Probe in das Testsystem diffundieren. Deshalb werden zusätzliche Extraktionsverfahren, um die antimikrobielle Reste aus der geronnenen Ei-Probe zu gewinnen, nicht benötigt.

Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit eines antimikrobiellen Restes in einem Ei bereitgestellt, wobei das Verfahren:

  • (i) das Kontaktieren der Probe mit einem mikrobiellen Inhibitionstest, der zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines antimikrobiellen Restes in der Probe geeignet ist,
  • (ii) das Erwärmen der kontaktierten Probe und des Tests für ein ausreichendes Zeitintervall, um eine natürliche, inhibierende Verbindung, z.B. Lysozym, die in der Probe vorhanden ist, zu inaktivieren, und
  • (iii) das Inkubieren der kontaktierten Probe und des Tests
umfasst.

Mit natürlichen, inhibierenden Verbindungen sind Verbindungen gemeint, welche den Test stören könnten und die natürlicherweise in der Probe vorhanden sind, wie natürliche, inhibierende Verbindungen beispielsweise Lysozym. Daher ist mit Stören oder Inhibieren das Verhalten der Verbindung auf Teilen des Tests, beispielsweise dem Testmikroorganismus gemeint.

Die genauen Zeit/Temperatur-Erfordernisse hängen vom z.B. Zustand der Probe (z.B. der Starttemperatur, dem Volumen der Probe, Gesamtei, Eiweib oder Eidotter); der Art des Tests oder des im Test verwendeten Mikroorganismus ab (z.B. thermophile Bacillus- oder Streptomycesarten). Natürlich muss darauf geachtet werden, dass die Wärmebehandlung die nachzuweisenden, antimikrobiellen Reste nicht inaktiviert. Die Wärmebehandlung kann unter Verwendung jedes im Stand der Technik bekannten Verfahrens, z.B. durch Erwärmen in einem Wasserbad oder durch Verwendung eines Inkubators, wie unten beschrieben, ausgeführt werden.

Beispielsweise kann der Test in der folgenden Weise durchgeführt werden:

  • 1. Eine Probe des Eies wird erhalten, indem man ein Loch von z.B. ungefähr 1–2 Quadratzentimetern in das Ei macht, den Eidotter ansticht, das Ei mit dem Loch nach unten auf eine Flasche setzt, nachdem das Ei leer ist, wird die Flasche geschlossen und die Probe durch Schütteln homogenisiert. Als Alternative kann natürlich jedes andere im Stand der Technik bekannte Verfahren, um eine Probe des Gesamteies, Eiweißes oder Eidotters zu erhalten, verwendet werden;
  • 2. Füge eine ausreichende Menge der zu testenden Ei-Probe unter Verwendung von gut bekannten Verfahren einem Test zu;
  • 3. Erwärme den Test, z.B, für ungefähr 10 Minuten bei 80 °C, um die natürlichen, inhibierenden Substanzen (z.B. Lysozym) zu inaktivieren, die Ei-Probe gerinnen lassen;
  • 4. Inkubiere den Test unter Befolgung der Standard-Arbeitsvorgänge des Tests und lese das Ergebnis ab.

Jeder mikrobielle Inhibitionstest, der zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines antimikrobiellen Restes in der Probe geeignet ist, kann in einem Verfahren der Testkits der Erfindung verwendet werden. Beispiele werden in GB-A-1467439, EP-0005891, DE-3613794, CA-2056581, EP-028579 und US 5,494,805 beschrieben. Geeignete Tests sind solche, in denen ausgewählte, sensitive Mikroorganismen verwendet werden, z.B. mikrobielle Agardiffusionstests.

Beispiele für geeignete, mikrobielle Agardiffusionstests sind Tests, in denen Arten von Bacillus, Streptococcus oder E.coli verwendet werden. Vorzugsweise werden thermophile Arten, z.B. Bacillus stearothermophilus und Streptococcus thermophilus verwendet. Beispiele für bevorzugte Stämme sind Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C953 (1974 hinterlegt beim Labor für Mikrobiologie der Technischen Universität von Delft unter der Zugangsnummer LMD 74.1 und 1983 beim zentralen Büro für Schimmelkulturen (CBS), Baarn unter der Zugangsnummer CBS 760.83, wo der Stamm der Öffentlichkeit zur Verfügung steht) und Streptococcus thermophilus T101 (DSM 4022, hinterlegt am 3. März 1987). Beide Stämme sind sehr sensitiv für antimikrobielle Verbindungen, insbesondere Chemotherapeutika wie Sulfonamidverbindungen und Antibiotika, wie Penicilline und Tetracycline. E.coli Stämme oder andere geeignete, gram-negative Bakterien können zum Nachweis von z.B. Quinolonen verwendet werden.

Bacillus stearothermophilus var. calidolactis 0953 und Streptococcus thermophilus T101 sind schnell wachsend und haben den Vorteil, dass sie thermophil sind. Beispielsweise ist die optimale Wachstumstemperatur des Bacillus Stammes von 50° bis 70 °C. Der Testorganismus ist deswegen für einen erfindungsgemäßen Test sehr geeignet, da er durch das Erwärmen, um die natürlichen, inhibierenden Verbindungen, welche in der Ei-Probe vorhanden sein können, zu inaktivieren, nicht abgetötet wird.

Wenn der Testorganismus ein Bacillus Stamm ist, wird er vorzugsweise in der Form einer Sporensuspension in das Agarmedium eingebaut, welche vor dem Erstarren durch bekannte Verfahren (siehe beispielsweise GB-A-1467439) hergestellt und in das Agarmedium eingebaut werden kann. Wenn der Testorganismus ein Streptococcus Stamm ist, werden die Bakterien vorzugsweise in der Form von bakteriellen Zellen in das Agarmedium eingebaut, welche gemäß bekannter Verfahren (siehe beispielsweise EP 0285792) hergestellt werden können. Die Konzentration des Testorganismus im Agarmedium beträgt vorzugsweise zwischen 105 und 1010 Kolonie-bildende Einheiten pro ml Agarmedium.

Geeignete Nährstoffe, um eine Vermehrung des Testorganismus in der Abwesenheit von antimikrobiellen Resten zu ermöglichen, sind beispielsweise assimilierbare Kohlenstoffquellen (z.B. Lactose, Glucose oder Dextrose), assimilierbare Stickstoffquellen (z.B. Pepton) und Quellen von Wachstumsfaktoren, Vitaminen und Mineralien (z.B. Hefe-Extrakt).

Das Wachstum des Testmikroorganismus kann unter Verwendung gut bekannter Verfahren nachgewiesen werden, vorzugsweise durch Farbwechsel des Agarmediums der Testprobe. Typischerweise wird ein Farbindikator, vorzugsweise ein Säure-Basen- oder ein Redoxindikator, verwendet. Beispiele für geeignete Säure-Basenindikatoren schließen Bromcresolpurpur und Phenolrot ein. Beispiele für geeignete Redoxindikatoren schließen Brilliantschwarz, Methylenblau, Toluidinblau und Nilblau ein. Außerdem können Kombinationen von zwei oder mehreren Indikatoren verwendet werden.

Wahlweise kann die Sensitivität des Tests durch Zugabe von bestimmten Substanzen verändert werden, durch Ändern der Testbedingungen, wie pH oder Konzentrationen von Puffersubstanzen oder Agar oder durch Variieren der Volumenverhältnisse von Agar und Ei-Probe. Beispiele für Substanzen, die dem Testsystem zugefügt werden können, um die Sensitivität zu ändern, sind Nukleoside wie Adenosin, oder Antifolate, wie Trimethoprim, Ormethoprim oder Tetroxoprim, welche die Sensitivität des Testorganismus gegenüber Sulfonamidverbindungen verbessern. Salze der Oxalsäure oder Flußsäure können zugefügt werden, um die Sensitivität gegenüber Tetracyclinen zu verbessern. Cystein kann zugefügt werden, um die Sensitivität gegenüber Penicillinen zu vermindern.

Die Menge an Ei-Probe (Gesamt-Ei, Eiweiß oder Eidotter von jeder Art, vorzugsweise Geflügel), die zum Test hinzugefügt werden muss, hängt vom Testsystem ab. Für mikrobielle Diffusionstests werden dem Test typischerweise von 0,01 bis 1,0 ml, vorzugsweise von 0,05 bis 0,5 ml unter Verwendung gut bekannter Verfahren zugefügt. Nach Zugabe der Ei-Probe wird der Test erwärmt, um die natürlichen, antimikrobiellen Verbindungen, die in der Probe vorhanden sind, z.B. Lysozym der Ei-Probe, zu inaktivieren. Vorzugsweise wird der Test für von 2 bis 20 Minuten bei von 70 °C bis 100 °C erwärmt, weiter bevorzugt wird der Test für von 10 bis 15 Minuten bei von 75 °C bis 85 °C oder für von 2 bis 6 Minuten bei ungefähr 100 °C erwärmt. Jede andere Zeit/Temperatur-Behandlung, die ausreichend ist, um die natürlichen, inhibierenden Verbindungen des Eies zu inaktivieren ohne die nachzuweisenden antimikrobielle Reste zu inaktivieren, kann verwendet werden.

Nach der Wärmebehandlung wird der Test unter Befolgung der Anweisungen des Testherstellers inkubiert. Die Inkubationszeit des Tests ist von den Umständen abhängig. Im Falle eines Agardiffusionstests unter Verwendung von Bacillus stearothermophilus wird der Test in einem Wasserbad oder einem Heizblock bei von 60 °C bis 70 °C, vorzugsweise bei von 62 °C bis 65 °C inkubiert. Typischerweise können Ergebnisse nach 1,5 bis 4 Stunden, vorzugsweise von 2,5 bis 3,5 Stunden erhalten werden.

Herkömmliche, mikrobielle Inhibitionstests, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen die kommerziellen Produkte Delvotest®, Premi®test und BR-test® (erhältlich von DSM N.V. Holland) den ADM Copan®test (Copan, Italien) und den Charm®AIM test (Charm, USA) ein. Inaktivierung der natürlichen, inhibierenden Verbindungen, die in der Ei-Probe vorhanden sind, z.B. Lysozym, wird vorzugsweise durch Erwärmen, beispielsweise für von 5 bis 15 Minuten bei beispielsweise von 75 °C bis 85 °C erzielt. Als Alternative kann jede andere Temperatur/Zeit-Behandlung, die ausreichend ist, um die Wirkungen zu erzielen, verwendet werden.

Inkubatoren, die geeignet sind die Wärmebehandlungen, wie in dieser Erfindung beschrieben, durchzuführen können in solch einer Weise gebaut werden, dass nachdem die Testeinheiten in den Inkubator gestellt wurden, Wärme- und Inkubationsbehandlungen wie oben beschrieben durchgeführt werden können. Die erste Wärmebehandlung, um die inhibierenden Verbindungen zu inaktivieren und wahlweise, um eine feste Matrix zu bilden und/oder die Sporen zu aktivieren, wird bei einer höheren Temperatur durchgeführt, wonach die Inkubation des Tests bei einer niedrigeren Temperatur fortgesetzt werden kann. Wahlweise kann der Inkubator nach der Inkubation des Tests auf eine Temperatur herunterkühlen, die ausreichend ist, um den Test zu stoppen.

Ein Beispiel für solch einen Inkubator ist ein Heizblock, in welchen Testeinheiten (z.B. Ampullen) gestellt werden können. Beispielsweise im Falle eines herkömmlichen, mikrobiellen Agardiffusionstests unter Verwendung eines Bacillus stearothermophilus Stamms kann der Inkubator/Heizblock eine Anzahl von für das darin Hineinstellen von Testampullen oder Testplatten (z.B. Delvotest® oder Premi®Test) geeigneten Löchern enthalten. Nach dem Hineinstellen der Ampullen oder Platten erwärmt der Inkubator den Test auf eine Temperatur von z.B. von 75 °C bis 85 °C für z.B. von 10 bis 20 Minuten, wonach der Inkubator auf eine niedrigere Temperatur von 62 °C bis 65 °C für von 1,5 bis 4 Stunden (Inkubation des Tests) schaltet. Natürlich hängen die genauen Zeit/Temperaturintervalle von vielen Faktoren ab und werden sich je nach Art des Tests unterscheiden. Diese Erfindung schließt alle Inkubatoren ein, die in der Lage sind, eine Vor-Inkubation bei einer bestimmten Temperatur für eine bestimmte Zeit, direkt gefolgt von einer Inkubation bei geringerer Temperatur für einen bestimmten Zeitraum durchzuführen. Wahlweise kann der Inkubator nach der Inkubation des Tests auf eine Temperatur herunterkühlen, die ausreichend ist, um den Test zu stoppen.

Das in dieser Erfindung beschriebene Verfahren ist sehr einfach durchzuführen, so dass Personen, die diesen Test ausführen, nicht besonders ausgebildet oder geschult werden müssen.

Beispiel 1 Herstellung einer Gesamtei-Probe

Um eine Ei-Probe zur Untersuchung auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von antimikrobiellen Resten zu erhalten, wurde ein Loch von ungefähr 1–2 cm2 in das Ei gemacht, der Eidotter wurde angestochen und das Ei wurde mit dem Loch nach unten auf eine Flasche gesetzt, wobei das Eiweiß und der Eidotter in die Flasche tropfen konnten. Nachdem das Ei geleert war, wurde die Flasche verschlossen und die Probe durch Schütteln homogenisiert.

Beispiel 2

Inaktivierung von natürlichen, inhibierenden Verbindungen des Eies und Untersuchung der Probe auf Delvotest® Proben von 5 Eiern (doppelt), die keine antimikrobiellen Reste enthielten, wurden gemäß des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens erhalten. Um die natürlichen, inhibierenden Verbindungen, die in der Ei-Probe vorhanden sind, zu inaktivieren, wurden 100 &mgr;l von jeder der 5 Proben auf Delvotest® Ampullen zugefügt. Der Test wurde gemäß der Verfahren hergestellt, die in der EP 0005891 beschrieben sind, wobei die Nährstoffe im Agar vorhanden waren. Nach Erwärmen für 10 Minuten bei 80 °C in einem Wasserbad, wurden die Ampullen sofort in ein Wasserbad bei 64 °C gestellt und unter Befolgung der Herstelleranweisungen inkubiert. Nach 140 Minuten änderte sich die Farbe aller Tests von Purpur nach gelb, was anzeigt, dass keine antimikrobielle Reste vorhanden waren.

Kontrollproben wurden nicht auf 80 °C für 10 Minuten erwärmt, sondern direkt auf die Ampulle gesetzt. Diese Tests blieben für mindestens 4 Stunden pupur.

Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass natürliche, inhibierende Verbindungen in der Ei-Probe den Test inhibierten, was zu falschpositiven Ergebnissen führte. Wenn die Probe wie oben beschrieben erwärmt wurde, war die Aktivität der natürlichen, inhibierenden Verbindungen beseitigt und falschpositive Ergebnisse wurden nicht mehr beobachtet.

Beispiel 3 Bestimmung der Sensitivität des Delvotests® gemäß des in dieser Erfindung beschriebenen Verfahrens unter Verwendung von versetzten Proben

Ei-Proben wurden unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens erhalten. Die Proben wurden durch Zugabe von Penicillin G (0 und 4 ppb) oder Sulphadiazin (0 und 100 ppb) versetzt. Die Ei-Proben wurden Delvotest® Ampullen (siehe Beispiel 2) gemäß des in dieser Erfindung beschriebenen Verfahrens zugefügt: für 10 Minuten bei 80 °C erwärmt und dann unmittelbar in ein Wasserbad bei 64 °C gestellt und unter Befolgung der Herstellerinstruktionen inkubiert. Die Ergebnisse wurden ausgelesen, sobald die Farbe zu Gelb wechselte (nach 140 Minuten). Die Proben, die kein Penicillin G (0 ppb) oder Sulphadiazin (0 ppb) enthielten, waren negativ, während die Proben, die mit 4 ppb Penicillin G und 100 ppb Sulphadiazin versetzt waren, Purpur (positiv) blieben.

Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass das in dieser Erfindung beschriebene Verfahren zum Nachweis von antimikrobiellen Resten in Ei-Proben geeignet ist.


Anspruch[de]
  1. Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines antimikrobiellen Restes in einer Ei-Probe, wobei das Verfahren:

    (i) das Kontaktieren der Probe mit einem mikrobiellen Inhibitionstest, der zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines antimikrobiellen Restes in der Probe geeignet ist,

    (ii) das Erwärmen der kontaktierten Probe und des Tests für ein ausreichendes Zeitintervall, um eine natürliche inhibierende Verbindung, beispielsweise Lysozym, die in der Probe vorhanden ist, zu inaktivieren, und

    (iii) das Inkubieren der kontaktierten Probe und des Tests

    umfasst.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die kontaktierte Probe und der Test auf eine Temperatur von 70°C bis 100°C erwärmt werden.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die kontaktierte Probe und der Test auf eine Temperatur von 75°C bis 85°C erwärmt werden.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Probe und der Test für 2 bis 20 Minuten erwärmt werden.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Probe und der Test für 10 bis 15 Minuten erwärmt werden.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Test einen Testorganismus, Nährstoffe und einen oder mehrere Indikatoren, die in einem Agarmedium vorhanden sind, umfaßt.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wodurch das Ausmaß des Wachstums oder der Inhibierung des Wachstums eines Testorganismus bestimmt wird, was die Abwesenheit oder Anwesenheit des antimikrobiellen Rests anzeigt.
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