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Dokumentenidentifikation DE60303127T2 14.09.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001499708
Titel L-ARABINOSE VERBRAUCHENDE MODIFIZIERTE HEFE
Anmelder Forskarpatent i Syd AB, Lund, SE
Erfinder BOLES, Eckhard, 63303 Dreieich, DE;
BECKER, Jessica, 40591 Düsseldorf, DE
Vertreter derzeit kein Vertreter bestellt
DE-Aktenzeichen 60303127
Vertragsstaaten AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HU, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, RO, SE, SI, SK, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 07.05.2003
EP-Aktenzeichen 037259470
WO-Anmeldetag 07.05.2003
PCT-Aktenzeichen PCT/SE03/00749
WO-Veröffentlichungsnummer 2003095627
WO-Veröffentlichungsdatum 20.11.2003
EP-Offenlegungsdatum 26.01.2005
EP date of grant 04.01.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 14.09.2006
IPC-Hauptklasse C12N 1/19(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12P 7/06(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   
IPC additional class C12R 1/85  (2006.01)  A,  L,  N,  20051017,  B,  H,  EP

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft einen modifizierten Hefestamm, vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae, der L-Arabinose verbraucht, während er Ethanol herstellt, sowie ein Verfahren für die Herstellung von Ethanol.

Der Erfindung zugrunde liegender allgemeiner Stand der Technik

Brennstoff-Ethanol wird als eine geeignete Alternative für fossile Brennstoffe betrachtet, und es kann aus Pflanzen-Biomasse hergestellt werden, die eine billige und erneuerbare Ressource darstellt, welche in großen Mengen verfügbar ist. Aus diesem Grunde ist Zellulose-Biomasse, welche landwirtschaftliche Rückstände, Papierabfälle, Holzspäne usw. einschließt, eine ideale, in großen Mengen verfügbare Quelle von Zuckern für die Fermentation zu Ethanol. Zum Beispiel werden, wenn Glukose aus Getreide hergestellt wird, hemicellulosehaltige Nebenprodukte, die hauptsächlich aus den Pentose-Zuckern Arabinose und Xylose (Arabinoxylan) bestehen, erzeugt. Diese werden gegenwärtig als billiges Rinderfutter verwendet. Diese Ressource könnte jedoch in gewinnbringenderer Weise genutzt werden, wenn sie in die bestehende Stärkeverarbeitung integriert würde, die Ethanol und Stärkederivate ergibt.

Im Kontext der Umwandlung von Hemicellulosezuckern gewinnt die Fermentierbarkeit von L-Arabinose an Bedeutung. Häufig erfolgt die Approximation, dass Hydrolysate, die durch Dünnsäurevorbehandlung erzeugt werden, lediglich D-Xylose enthalten, da dies der am häufigsten vorkommende Hemicellulosezucker ist. Als Ergebnis dessen konzentrieren sich die meisten Untersuchungen zur Umwandlung von Hemicellulose-Hydrolysaten auf die Umwandlung von D-Xylose. Hemicellulose als ein Heteropolysaccharid enthält jedoch Pentosane und Hexosane. Obwohl Xylan das dominante Pentosan und Glucomannan das dominante Hexosan ist, sind die Anteile von Arabinan bei einigen Biomassematerialien beträchtlich. Besonders sind Arabinan-Anteile in beträchtlicher Menge in krautigen Spezies enthalten, wo diese bis zu 10–20% des gesamten Nicht-Glucan-Kohlenhydrats ausmachen. Mikrobielle Biokatalysatoren, die ausgewählt werden, um Hydrolysate, abgeleitet aus Materialien mit hohem Arabinangehalt, zu entwickeln oder zu fermentieren, müssen daher die Fähigkeit aufweisen, L-Arabinose sowie Xylose und vorzugsweise ebenfalls andere Zucker zu Ethanol zu fermentieren.

Viele Hefearten, besonders Saccharomyces cerevisiae und verwandte Arten werden traditionell für die Fermentation von Futtermitteln auf Glucosebasis zu Ethanol durch anaerobe Fermentation genutzt, da sie die sichersten und wirksamsten Mikroorganismen für die Fermentation von Zuckern zu Ethanol darstellen. Diese höheren glucosefermentierenden Hefen sind jedoch nicht in der Lage, Xylose und L-Arabinose zu fermentieren, und sie sind ebenfalls nicht in der Lage, diese Pentosezucker für Wachstum zu nutzen. Einige wenige andere Hefearten, wie zum Beispiel Pichia stipitis und Candida shehatae können Xylose zu Ethanol fermentieren; sie sind jedoch nicht so effektiv wie Saccharomyces für die Fermentation von Glucose, und sie haben eine relativ niedrige Ethanol-Toleranz. Somit sind sie für die industrielle Großproduktion von Ethanol aus Biomasse nicht geeignet. Einige Hefen können L-Arabinose für Wachstum nutzen, jedoch kann keine Hefe diese zu kommerziellen Mengen Ethanol fermentieren. Im Gegensatz zu Hefen und Pilzen können die meisten Bakterien, einschließlich von E. coli und Bacillus subtilis, L-Arabinose für aerobes Wachstum nutzen, und sie sind ebenfalls in der Lage, diese zu verschiedenen Produkten, einschließlich von Ethanol zu fermentieren.

Sedlak & Ho, Enzyme Microb Technol 28, (2001) Seiten 16–24 offenbart eine Expression von E. coli ara-BAD-Operon-codierenden Enzymen für die Metabolisierung von L-Arabinose in Saccharomyces cerevisiae. Der Stamm nimmt hierdurch die Expression von araA, araB und araD vor, ist jedoch nicht in der Lage, Ethanol zu erzeugen.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist jetzt möglich gewesen, dieses Problem zu lösen, wobei ein neuer Saccharomyces cerevisiae Hefestamm, der in der Lage ist, L-Arabinose zu verbrauchen und Ethanol herzustellen, erzeugt worden ist.

Detaillierte Beschreibung der vorliegenden Erfindung

Es ist jetzt erstaunlicherweise festgestellt worden, dass es möglich ist, mit Hilfe der vorliegenden Erfindung das Problem zu lösen, eine Hefe zu haben, die L-Arabinose verbraucht, indem ein Verfahren für die Erzeugung eines Hefestamms, der L-Arabinose nutzt, um Ethanol zu produzieren, entwickelt worden ist, wobei dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet wird, dass ein Hefestamm modifiziert wird durch Einführung und Expression eines B. subtilis araA-Gens (L-Arabinose-Isomerase), eines E. coli araB-Gens (L-Ribulokinase) und eines E. coli araD-Gens (L-Ribulose-5-P 4-Epimerase) und das Tragen zusätzlicher Mutationen in seinem Genom oder Überexpression des S. cerevisiae TAL1(Transaldolase)-Gens, wobei er in die Lage versetzt wird, L-Arabinose zu verbrauchen und Ethanol herzustellen.

Die Erfindung wird nachstehend detaillierter durch Bezugnahme auf eine Reihe von beschriebenen Experimenten beschrieben werden, welche die Art der Erfindung erläutern.

Die Anmeldung umfasst weiterhin den Saccharomyces cerevisiae-Stamm JBY25-4M (DSM 15560) und den Saccharomyces cerevisiae-Stamm JBY24-3T (DSM 15559), die bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen am 4. April 2003 im Rahmen der Budapester Konvention hinterlegt wurden.

Zunächst wurden die E. coli Gene araA (L-Arabinose-Isomerase), araB (L-Ribulokinase) und araD (L-Ribulose-5-P 4-Epimerase) hinter dem starken HXT7-Promotorfragment an Multicopy-Vektoren in S. cerevisiae CEN.PK-Stämmen geklont und der Überexpression unterzogen. Während araA keine L-Arabinose-Isomerase-Aktivität in den Hefetransformanten erzeugte, erzeugte araB Überexpression bis zu 0,7 U/mg Protein L-Ribulokinaseaktivität, und araD erzeugte bis zu 0,13 U/mg Protein L-Ribulose-5-P 4-Epimeraseaktivität. Die Transformation von CEN.PK2-1C mit allen drei Konstrukten zusammen ließen kein Wachstum der Transformanten auf L-Arabinose-Medium zu. Es ist gezeigt worden, dass die Hefegalactosepermease (Gal2) in der Lage ist, L-Arabinose zu transportieren [J. Bacteriol. 103, 671–678 (1970)]. Die gleichzeitige Überexpression von GAL2 hinter dem ADH1 Promotor zusammen mit den bakteriellen L-Arabinose-metabolisierenden Genen ließen ebenfalls kein Wachstum der Transformanten auf L-Arabinose-Medium zu.

Zweitens führte Klonen und Überexpression des Bacillus subtilis araA-Gens hinter dem starken HXT7-Promotorfragment an Multicopy-Vektoren im S. cerevisiae CEN.PK2-1C-Stamm zu einem aktiven Protein in Hefe, welche L-Arabinose-Isomeraseaktivität in der Größenordnung von zumindest einigen mU/mg Protein erzeugte. In ähnlicher Weise erzeugte Überexpression des Mycobacterium smegmatis araA-Gens hinter dem starken HXT7-Promotorfragment an einem Multicopy-Vektor im S. cerevisiae CEN.PK2-1 C-Stamm L-Arabinose-Isomeraseaktivität.

Dann wurden die Transformanten mit Expression des B. subtilis araA-Gens zusammen mit den E. coli-Genen araB und araD sowie dem Hefe-GAL2-Gen in flüssigen Medien (synthetisch komplettes oder synthetisch komplettes/0,1% Hefeextrakt/0,2% Pepton) mit L-Arabinose als der alleinigen Kohlenstoffquelle mehrere Wochen lang inkubiert. Nach 4 bis 5 Tagen der Inkubation begannen die Transformanten langsam in diesen Medien zu wachsen, im Gegensatz zu einem Stamm, der lediglich vier leere Vektoren enthielt. Immer wenn die Zellen eine OD600 von 3–4 erreichten, wurden sie in einem frischen Medium bei einer OD600 von 0,3 inokuliert und weiterem Wachstum unterzogen. Das Wachstum beschleunigte sich nach 10 Tagen. Diese Beobachtungen sind ein Anzeichen für das Auftreten von spontanen Suppressormutationen, welche die Zellen dazu befähigen, L-Arabinose effektiver zu nutzen. Ansonsten könnten sich die Zellen irgendwie an die Nutzung von L-Arabinose anpassen.

Um zwischen Suppressormutationen oder einem Adaptationsprozess zu unterscheiden, wurden die Mutationstransformanten auf einem Glucosemedium gezüchtet und dann wieder auf Arabinosemedium verbracht. Sie begannen, auf Arabinosemedium mit lediglich einer kurzen Verzögerungsphase zu wachsen, was in der Tat darauf hinweist, dass sie spezielle Mutationen enthalten, welche es den Zellen ermöglichen, auf Arabinose zu wachsen. Die Aktivitäten aller drei heterologen Enzyme wurden in groben Extrakten der ursprünglichen Transformanten und der Mutationstransformanten gemessen. Während die Aktivitäten der L-Ribulose-5-P-4-Epimerase und der L-Arabinose-Isomerase bei beiden Stämmen ähnlich waren, war die L-Ribulokinaseaktivität in den Mutationstransformanten stark reduziert.

Als die Mutationstransformanten wegen des Verlusts ihrer Plasmide ausgewählt wurden, waren sie nicht länger in der Lage, auf Arabinose zu wachsen. Die Plasmide wurden erneut isoliert und in E. coli verstärkt. Die erneut isolierten Plasmide wurden in einen CEN.PK2-1C Wildtypstamm umgewandelt. Als das Wachstum auf Arabinose dieser neuen Transformanten mit den ursprünglichen Mutationstransformanten verglichen wurde, verlängerte sich die Verzögerungsphase auf dem Arabinosemedium erheblich, was darauf hin wies, dass zusätzliche Genommutationen in den Mutationstransformanten aufgetreten waren, welche sie in die Lage versetzten, auf Arabinose effektiv zu wachsen. Unterschiedliche Kombinationen der ursprünglichen und der erneut isolierten Plasmide wurden zu dem Mutationsstamm JBY25 umgewandelt. Es stellte sich heraus, dass das Ersetzen der erneut isolierten GAL2, araD und araA Plasmide durch die entsprechenden ursprünglichen Plasmide sich nur leicht auf die Fähigkeit zum Wachsen auf Arabinose auswirkte. Das Ersetzen des erneut isolierten araB (L-Ribulokinase) Plasmids durch das entsprechende ursprüngliche Plasmid führte jedoch zu einem stark reduzierten Wachstum auf Arabinose.

Als das vollständige erneut isolierte L-Ribulo-knase-Gen der Sequenzierung unterzogen wurde, zeigte es eine Mutation, welche zu einem Austausch von Aminosäure 121 Asp gegen ein Asn im konservierten Zuckerkinasebereich der Kinase führt. Die Bestimmung der Kinetik des Mutationsenzyms zeigte, dass sein Km Wert für L-Ribulose erhöht und der Vmax verringert war.

Es wurden ebenfalls Wachstumsexperimente mit den Wildtyp- und Mutationskinasen nach Expression aus Zentromer-Plasmiden im Stamm JBY25 zusammen mit den erneut isolierten Isomerase- und Epimeraseplasmiden vorgenommen. Im Falle der Mutationskinase hat dieses Zentromer-Plasmid den Transformanten kein gutes Wachstum auf L-Arabinose verliehen. Die Transformanten, welche die Wildtyp-Kinase auf einem Zentromer-Plasmid tragen, zeigten jedoch ein besseres Wachstum als diejenigen, die mit der Überexpressions-Kinase umgewandelt wurden. Dies ist ein weiterer Hinweis darauf, dass die verringerte Aktivität der Kinase wichtig für ein besseres Wachstum auf L-Arabinose ist.

Für die Feststellung, ob alle vier Plasmide, welche die Bacillus subtilis L-Arabinose-Isomerase, die E. coli L-Ribulokinase und L-Ribulose 5-P 4-Epimerase bzw. die Hefe-Gal2-Galactosepermease tragen, für das Wachstum auf L-Arabinose erforderlich sind, wurde der Mutationsstamm mit unterschiedlichen Kombinationen von erneut isolierten und leeren Plasmiden (ohne ein Gen für den L-Arabinose-Metabolismus) umgewandelt. Transformanten, denen die L-Arabinose-Isomerase, die L-Ribulokinase oder die L-Ribulose 5-P 4-Epimerase fehlen, die jedoch mit den anderen drei erneut isolierten Plasmiden umgewandelt wurden, zeigten keinerlei Wachstum auf L-Arabinose, was darauf hinweist, dass diese Gene für die Nutzung von L-Arabinose absolut erforderlich sind. Transformanten, welchen die Überexpressions-Galactosepermease fehlt, sind in der Lage, auf einem L-Arabinose-Medium zu wachsen, jedoch mit leicht verringerten Wachstumsgeschwindigkeiten im Vergleich zum Mutationsstamm, der alle vier erneut isolierten Plasmide enthält, was darauf hindeutet, dass Überexpression eines Transporteurs für das Wachstum auf L-Arabinose nicht erforderlich ist, dieses jedoch verbessern kann.

Um zu testen, ob lediglich eine Mutation oder mehr Mutationen im Genom des CEN.PK2-1C Wildtypstamms es den Transformanten ermöglichen, auf L-Arabinose zu wachsen, und ob diese Mutation/Mutationen rezessiv oder dominant sind, wurden der Mutationsstamm und ebenfalls der Wildtypstamm, jeweils mit den vier Plasmiden für L-Arabinose-Metabolismus, umgewandelt, mit einem haploiden Wildtypstamm gekreuzt. Danach wurde das Wachstum auf L-Arabinose untersucht. Der diploide Mutationsstamm zeigte ein schnelleres Wachstum auf L-Arabinose als der diploide Kontrollstamm. Der diploide Mutationsstamm wuchs jedoch nicht so gut wie der mit den vier Plasmiden umgewandelte haploide Mutationsstamm. Der diploide Mutationsstamm wurde zur Sporenbildung angeregt, und eine Tetradeanalyse wurde vorgenommen. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass es mehr als eine Mutation im Genom des Stamms gibt, wobei zumindest eine dominant und eine andere rezessiv ist.

Darüber hinaus führte die Überexpression von S. cerevisiae TAL1(Transaldolase) zusammen mit B. subtilis araA (L-Arabinose-Isomerase), der Mutation E. coli araB (L-Ribulokinase) und E. coli araD (L-Ribulose-5-P 4-Epime-rase) zum Wachstum auf L-Arabinose schon im CEN.PK2-1C Wildtypstamm.

Ethanolherstellung wurde bestimmt mit dem JBY25 Mutationsstamm, umgewandelt mit den vier erneut isolierten Plasmiden und inkubiert in einem Wachstumsmedium mit 20 g/L L-Arabinose. Unter sauerstoffeinschränkenden Bedingungen bei einer Kultur von OD600nm = 15–20 erreichten die Ethanolherstellungsgeschwindigkeiten bis zu 0,06 g Ethanol/g Trockengewicht und Stunde.

Wir haben jetzt demonstriert, dass es möglich ist, das Verfahren für die Herstellung eines L-Arabinose nutzenden Hefestamms auf andere Saccharomyces cerevisiae Stämme zu übertragen, die sich von den CEN.PK Stämmen unterscheiden.

Wir haben den W303 S. cerevisiae Stamm benutzt, der nicht mit den CEN.PK Stämmen verwandt ist und haben diesen Stamm mit den Plasmiden mit Expression des B. subtilis araA-Gens (L-Arabinose-Isomerase), des Mutanten E. coli araB-Gens mit verringerter Aktivität (L-Ribulokinase), des E. coli araD-Gens (L-Ribulose-5-P 4-Epimerase) und des S. cerevisiae TAL1(Transaldolase)-Gens umgewandelt.

Die Transformanten konnten auf einem definierten Medium mit L-Arabinose als alleiniger Kohlenstoffquelle wachsen, jedoch sehr langsam. Danach wurden die Zellen in einem flüssigen Medium (synthetisch komplettes/0,1% Hefeextrakt/0,2% Pepton) mit L-Arabinose als der alleinigen Kohlenstoffquelle über mehrere Tage inkubiert. Nach 4 bis 5 Tagen der Inkubation begannen die Transformanten in diesem Medium schneller zu wachsen, im Gegensatz zu einem W303-Stamm, der lediglich vier leere Vektoren enthielt. Immer wenn die Zellen eine OD600 von 3–4 erreichten, wurden sie in einem frischen Medium bei einer OD600 von 0,3 inokuliert und weiterem Wachstum unterzogen. Schließlich führte dies nach 20 Tagen zu einem Stamm, der in der Lage ist, auf einem L-Arabinose-Medium viel schneller zu wachsen, und der in der Lage ist, L-Arabinose zu Ethanol zu fermentieren.

Die Erfindung ist ein modifizierter Hefestamm mit Expression des bakteriellen B. subtilis araA-Gens (L-Arabinose-Isomerase), des Mutanten E. coli araB-Gens (L-Ribulokinase D121-N), und des E. coli araD-Gens (L-Ribu-lose-5-P 4-Epimerase) und zusätzliche Mutationen in seinem Genom trägt oder mit Überexpression des S. cerevisiae TAL1(Transaldolase)-Gens, wodurch dieser in die Lage versetzt wird, L-Arabinose zu verbrauchen, diese als einzige Kohlenstoffquelle zu benutzen und Ethanol herzustellen.

Normalerweise wird das Wachstumsmedium zirka 20 g L-Arabinose/L enthalten. Das Wachstum und die Herstellung von Ethanol werden jedoch zwischen 2 und 200 g/L eintreten. Es besteht keine Notwendigkeit weiterer Zucker, und somit kann L-Arabinose allein benutzt werden. Es ist möglich, dass der Mitverbrauch von Xylose und Arabinose funktionieren könnte, aber dies ist bis jetzt noch nicht festgestellt worden.


Anspruch[de]
  1. Ein Verfahren zur Erzeugung eines L-Arabinose nutzenden Saccharomyces cerevisiae-Hefestamms für die Herstellung von Ethanol, dadurch gekennzeichnet, dass ein Hefestamm modifiziert wird durch Einführung und Expression eines araA-Gens (L-Arabinose-Isomerase), eines araB-Gens (L-Ribulokinase) und eines araD-Gens (L-Ribulose-5-P 4-Epimerase) und das Tragen zusätzlicher Mutationen in seinem Genom oder Überexpression eines TAL1(Transaldolase)-Gens, wodurch dieses in die Lage versetzt wird, L-Arabinose zu verbrauchen und dadurch Ethanol aus einem Medium herzustellen, das L-Arabinose aufweist, wobei der Hefestamm weiterhin modifiziert wird durch Expression einer Mutationsform des E. coli-L-Ribulokinase-Enzyms mit reduzierter Aktivität.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das araA-Gen ein B. subtilis-araA-Gen ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das araA-Gen ein M. smegmatis-araA-Gen ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das araB-Gen ein E. coli-araB-Gen ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das araD-Gen ein E. coli-araD-Gen ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das TAL1-Gen ein S. cerevisiae-TAL1-Gen ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Saccharomyces cerevisiae-Stamm ein CEN.PK-Stamm ist, vorzugsweise ein CEN.PK2-1C.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Saccharomyces cerevisiae-Stamm ein Saccharomyces cerevisiae-W303-Stamm ist.
  9. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1–8, wobei der Hefestamm weiterhin modifiziert wird durch Überexpression des GAL2-Gens der Hefe.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das araB-Gen hinter einem schwachen Promotor angeordnet wird.
  11. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1–10, wobei die Modifizierungen hinter dem starken HXT7-Promotorfragment an Multicopy-Vektoren in S. cerevisiae-CEN.PK-Stämmen durchgeführt werden.
  12. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1–10, wobei die Modifikationen hinter dem starken HXT7-Promotorfragment an Multicopy-Vektoren in Saccharomyces cerevisiae-W303-Stämmen durchgeführt werden.
  13. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1–12, wobei die Menge an L-Arabinose des Wachstumsmediums 2 bis 200 g/L beträgt.
  14. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1–13, wobei der Stamm Saccharomyces cerevisiae-Stamm JBY25-4M mit DSM-Zugangsnummer 15560 ist.
  15. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1–13, wobei der Stamm Saccharomyces cerevisiae-Stamm JBY24-3T mit DSM-Zugangsnummer 15559.
  16. Verfahren zur Herstellung von Ethanol durch Hefefermentation, dadurch gekennzeichnet, dass eine modifizierte Hefe nach Ansprüchen 1–15 ein Wachstumsmedium fermentiert, das L-Arabinose enthält.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Menge an L-Arabinose des Wachstumsmediums 2 bis 200 g/L beträgt.
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