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Dokumentenidentifikation DE69534746T2 14.09.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000766569
Titel AAV-CAPSIDVEHIKEL FÜR DEN MOLEKULAREN TRANSPORT
Anmelder University of Pittsburgh, Pittsburgh, Pa., US
Erfinder SAMULSKI, Richard J., Chapel Hill, NC 27514, US;
FERRARI, Forrest K., Carrboro, NC 27510, US
Vertreter derzeit kein Vertreter bestellt
DE-Aktenzeichen 69534746
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 28.06.1995
EP-Aktenzeichen 959247511
WO-Anmeldetag 28.06.1995
PCT-Aktenzeichen PCT/US95/08205
WO-Veröffentlichungsnummer 1996000587
WO-Veröffentlichungsdatum 11.01.1996
EP-Offenlegungsdatum 09.04.1997
EP date of grant 11.01.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 14.09.2006
IPC-Hauptklasse C12N 7/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 7/01(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 48/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/35(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/86(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
1. EINFÜHRUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von AAV-Capsiden (adenoassoziierte Virus-Capside) in vivo oder in vitro, welche verwendet werden können, um native oder heterologe Moleküle in geeignete Wirtszellen zu transferieren. Die Erfindung betrifft weiterhin die Herstellung von Rekombinanten AAV-Capsiden, gentechnisch behandelt, um heterologe Antigene für die Stimulation einer Immunantwort zu tragen.

2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Das gegenwärtige Interesse an molekularer Ersatztherapie als Modalität für klinische Behandlung hat die Entwicklung von Verfahren zur sicheren und wirksamen Abgabe von genetischem Material oder anderen Molekülen an Zellen benötigt. Dies wurde unter Verwendung physikalischer Mittel der Zellpermeation oder durch Anwenden biologischer Mittel, die eine Wirtszelle in natürlicher Weise infizieren, versucht.

2.1. VERFAHREN MIT PHYSIKALISCHEM TRANSFER

Zu Verfahren zum Transferieren von DNA in eine Empfängerzelle gehören standardmäßige Transfektionstechniken, vermittelt durch Calciumphosphat oder DEAE-Dextran, Elektroporation von zugänglichen Zellen und Liposom-vermittelter Transfer. Diese Techniken werden auf dem Forschungsschauplatz benutzt, aber erfordern in-vitro-Handhabung der Empfängerzellen und haben so begrenztes klinisches Potential.

2.2. VIRALE VEKTORSYSTEME

Virale Vektorsysteme nutzen die Wirksamkeit natürlicher Infektion und die Verwendung von DNA-Technologie aus, um rekombinante Viren gentechnisch zu behandeln, die heterologe Gene in die Zelle tragen. Die meisten klinischen Versuche haben bisher diese Herangehensweise genommen (Morgan, R. A. und W. F. Anderson, Annu. Rev. Biochem. 62: 191–217, 1993).

Retrovirale Vektoren sind am häufigsten verwendet worden, hauptsächlich, weil sie die Integration der in das Wirtszellgenom getragenen DNA erleichtern können, wobei stabile Integranten etabliert werden, welche während der Replikation zellulärer DNA amplifiziert werden. Jedoch kann diese Fähigkeit, wenn sie auch die Begrenzungen transienter Genexpression umgeht, zu der unabsichtlichen Aktivierung von Wirtsgenen oder der Unterbrechung zellulärer Kodierungssequenzen aufgrund zufälliger Integration führen.

Adenovirale Vektoren können DNA in eine Zelle einführen, aber unterstützen nicht die Integration des genetischen Materials, welches in episomaler Form in dem Kern bleibt und nicht mit der zellulären DNA corepliziert. Wenn auch Adenoviren nebensächlichere Pathogene sind, kann ihre Optimierung als klinisch relevante Transfervehikel auf diejenigen Gewebe begrenzt sein, die natürliche Wirte für diese Viren sind, d.h. die Lungen (Berkner, K., Curr. Topics. Micro. Immunol. 158: 39–66, 1992).

Es gibt einen klaren Bedarf für sicherere Abgabesysteme, die die Wirksamkeit viraler Infektion mit dem Potential vereinigen, genetisches Material an eine als Ziel genommene Integrationsstelle in dem Wirtszellgenom abzugeben. Es gibt auch den Bedarf, imstande zu sein, molekulare Abgabevehikel in vitro zu konstruieren, welche dann in einem zellfreien System verpackt werden können und welche imstande sind, einen weiten Bereich von molekularen Bestandteilen zu enkapsidieren.

2.3. ADENOASSOZIIERTES VIRUS

AAV ist ein Parvovirus, das bei der Infektion einer Wirtszelle zwei Wege annehmen kann. In Anwesenheit von Helfervirus tritt AAV in den lytischen Weg ein, wo das virale Genom transkribiert, repliziert und in neu erzeugte virale Teilchen enkapsidiert wird. In Abwesenheit von Helfervirusfunktion wird das AAV-Genom durch Rekombination zwischen den AAV-Termini und Wirtszellsequenzen als Provirus in eine spezielle Region des Wirtszellgenoms integriert. Charakterisierung der proviralen Integrationsstelle und Analyse der flankierenden zellulären Sequenzen zeigen spezielle Zielsteuerung von AAV-viraler DNA in den langen Arm von humanem Chromosom 19 an (Kotin, R. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2211–2215, 1990; Samulski, R. J., et al., EMBO J. 10: 3941–3950, 1991). Dieses besondere Merkmal von AAV verringer die Wahrscheinlichkeit insertionaler Mutagenese, die aus statistischer Integration von viraler Vektor-DNA in die Kodierungsregion eines Wirtsgens resultiert. Weiterhin scheinen im Gegensatz zu den retroviralen LTR-Sequenzen die AAV-ITR-Sequenzen frei von transkriptionalen Regulierungselementen zu sein, was das Risiko von Insertionsaktivierung von Protoonkogenen verringert.

Das AAV-Genom besteht aus einem linearen einzelsträngigen DNA-Molekül mit 4680 Nucleotiden, welches größere offene Leserahmen, kodierend für die Rep-(Replikations)- und Cap-(Capsid)-Proteine, enthält. Flankierend die AAV-Kodierungsregionen sind zwei Wiederholungssequenzen mit invertierten Termini (ITR) aus 145 Nucleotiden, die Palindromsequenzen enthalten, die sich zurückfalten können, wobei Haarnadelstrukturen erzeugt werden, die während der Initiierung von DNA-Replikation als Primer funktionieren. Es wurde demonstriert, dass die ITR-Sequenzen zusätzlich zu ihrer Rolle in der DNA-Replikation für virale Integration, Gewinnung aus dem Wirtsgenom und Enkapsidierung von viraler Nucleinsäure in reife Virionen notwendig sind (Muzyczka, N., Curr. Top. Micro. Immunol. 158: 97–129, 1992).

Die Capside haben ikosaedrische Symmetrie und sind etwa 20–24 nm im Durchmesser. Sie bestehen aus drei Proteinen (VP1, VP2 und VP3, die ungefähr 87, 73 bzw. 61 Kd haben) (Muzyczka, N., Curr. Top. Micro. Immunol. 158: 97–129, 1992). VP3 stellt 90% des gesamten Virionenproteins dar; VP2 und VP1 machen jeweils ungefähr 5% aus. Alle Capsidproteine sind N-acetyliert.

Flotte, T. R. et al. (PNAS, 90, S. 10613–10617, 1993) beschreiben die stabile in-vivo-Expression des Regulators für transmembrane Leitfähigkeit bei cystischer Fibrose mit einem adenoassoziierten Virus-Vektor.

Muzyczka, N., (Curr. Topics in Microbiol. and Immunol., 158, 1992, S. 97–129) beschreibt die Verwendung von adenoassoziiertem Virus als allgemeinem Transduktionsvektor für Säugerzellen.

Ruffing, M. et al. (J. Virol. 1992, S. 6922930, 66 (12)) beschreiben die Assemblierung von virusartigen Teilchen durch rekombinante strukturelle Proteine von adenoassoziiertem Virus Typ 2 in Insektenzellen.

2.4 REKOMBINANTE HERSTELLUNG VON VIRALEN CAPSIDEN

Rekombinante DNA-Technologie wurde verwendet, um die Gene für strukturelle Proteine von vielen Viren zu isolieren. Zum Beispiel wurde Vaccinia-Virus verwendet, um die strukturellen Gene für das menschliche Papilloma-Virus 1 (Hagensee, M. E., et al., J. Virol. 67: 315–322, 1993); Affenimmundefektvirus (Gonzalec, S. A., et al., Virology 194: 548–556, 1993); und das Parvovirus der Aleutenkrankheit bei Nerzen (Clemens, D. L., et al., J. Virol. 66: 3077–3085, 1992) zu tragen; Capsidbildung ist in allen Systemen nachgewiesen worden. Baculovirus-Vektoren sind für die Expression der strukturellen Proteine von menschlichem Papilloma-Virus (Kirnbauer, R., et al., J. Virol. 67: 6929–6936, 1993) und B19-Parvovirus (Kajigaya, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 4646–4650, 1991) verwendet worden; diese Proteine haben sich innerhalb der infizierten Zellen in Capside assembliert. Baculovirus-vermittelte Expression der Capsidproteine von adenoassoziiertem Virus-2 (Ruffing, M., et al., J. Virol. 66: 6922–6930, 1992) führte zu der Bildung von Capsiden mit einer geänderten Stöchiometrie aus Wildtypcapsiden, und denen gelang es nicht, sich in die nuclearen Cluster, beobachtet in einer Wildtypinfektion, zu lokalisieren.

Diese Anstrengungen wurden aufgewendet, um Virus-Lebenszyklen zu untersuchen und verwenden keines dieser Systeme, um fremde Genome oder andere Materialien zur Abgabe in vivo zu enkapsidieren.

3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft die Herstellung von AAV-Capsiden, welche verwendet werden können, um native oder heterologe Moleküle in geeignete Wirtszellen zu transferieren. Die Capsidproteine können von einem rekombinanten Virus, einem Expressionsvektor oder von einer Zelllinie, die die AAV-Capsidgene oder -kodierungssequenzen stabil integriert hat, exprimiert werden. Die Erfindung stellt weiterhin die Herstellung von AAV-Capsiden in vitro aus den AAV-Capsidproteinen und die Konstruktion von verpackten Capsiden in vitro bereit. Die Erfindung stellt weiterhin die Herstellung von AAV-Capsiden bereit, die genetisch verändert worden sind, um heterologe Epitope von klinisch wichtigen Antigenen zu exprimieren, um eine Immunantwort auszulösen.

Zu Molekülen, welche mit Capsiden assoziiert oder in sie enkapsidiert werden können, gehören RNA, Proteine, Peptide oder Kombinationen derselben. Die AAV-Capside können Nucleinsäuren unterbringen, die ziemlich groß sind, z.B. 5000 bp, und daher vorteilhaft für den Transfer und die Abgabe von großen Genen und genomischen Sequenzen verwendet werden können. Weil die invertierten terminalen Wiederholungen (ITRs) von AAV verantwortlich für die Fähigkeit des AAV-Genoms sind, in das Wirtszellgenom zu integrieren (Samulski, R. J., et al., EMBO 10: 3941 X950, 1991), können diese Sequenzen mit der heterologen DNA verwendet werden, um Integration der heterologen DNA in das Wirtszellgenom bereitzustellen, und können weiterhin das Verpacken in ein AAV-Capsid erleichtern.

Die Erfindung wird durch Beispiele demonstriert, in welchen das AAV-Capsid aus einem rekombinanten Adenovirus, gentechnisch behandelt, um die Capsidgene zu tragen, hergestellt wird. Dieses System kann in AAV-Genabgabesystemen besonders vorteilhaft sein, weil Adenovirus als natürlicher Helfer für AAV-Infektion dient. Bei Infektion der Wirtszelle folgt der Expression der Capsidproteine die Assemblierung des AAV-Capsids.

4. KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

1. Darstellung der d1324/CMV/Cap-Konstruktion.

2. Immunoblot von Produkten der d1324/CMV/Cap-Expression in 293-Zellen. Die Bahnen 1–5 wurden mit anti-AAV2 untersucht, die Bahnen 6–10 wurden mit anti-Rep untersucht. Bahnen 1 und 6: pCAD/Cap; Bahnen 2 und 7: d1324/CMV/Cap; Bahnen 7 und 8: Ad + AAV2; Bahnen 4 und 9: Ad; Bahnen 5 und 10: Mock.

3. Ergebnisse einer einstufigen Wachstumskurve von d1324/CMV/Cap und Ad-&bgr;gal. Zu den Zeiten, angezeigt auf der X-Achse, wurde der Virus von infizierten 293-Zellen gesammelt und ein Assay der Plaque wurde durchgeführt, um den auf der Y-Achse angegebenen Titer (pfu/ml) zu bestimmen. Dies ist das mittlere Ergebnis von zwei Experimenten.

4. d1324/CMV/Cap, Verlauf der Capsid-Expressionszeit. 293-Zellen wurden mit gleichen Mengen von d1324/CMV/Cap infiziert und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion gesammelt. Die Capsidexpression wurde durch Immunoblot nachgewiesen. Bahnen 1 und 7: 0 h nach der Infektion; Bahnen 2 und 8: 6 h nach der Infektion; Bahnen 3 und 9: 12 h nach der Infektion; Bahnen 4 und 10: 24 h nach der Infektion; Bahnen 6 und 11: 36 h nach der Infektion; Bahnen 7 und 12: 48 h nach der Infektion. Die rechte Seite des Blot zeigt die Ergebnisse aus einer parallelen Ad + AAV2 Infektion.

5. Spleißen von AAV2-Capsid-Botschaften, exprimiert von d1324/CMV/Cap. mRNA von infizierten 293-Zellen wurde isoliert und in cDNA synthetisiert. Diese cDNA wurde dann in Anwesenheit von &agr;-32P-dCTP unter Verwendung der Primer CAPL und CAPR1 amplifiziert. Die Produkte wurden auf 10%-Polyacrylamid-Gelen getrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Bahn 1: Ad + AAV2; Bahn 2: d1324/CMV/Cap.

6. Immunofluoreszenz von AAV2-Capsid und Rep-Proteinen. HeLa-Zellen, infiziert mit d1324/CMV/Cap in Abwesenheit (linkes Photo) oder Anwesenheit (rechtes Photo) von Rep-Protein-Expression.

7. Capsid-Immunoblot von CsCl-Dichtegradient-Fraktionen.

8 elektronenmikroskopische Aufnahme von leeren Capsiden, exprimiert von d1324/CMV/Cap. Vergr. 250000.

9 293-Zellen wurden transfiziert/infiziert (Tafel 1A, Tafel 1B) mit 10 &mgr;g/pro 10 cm Platte, pAB11-Plasmid-DNA und 5 pfu Wildtyp-Adenovirus. 293-Zellen wurden mit 200 &mgr;l viralem Lysat von ad/CMV/CAP-Komplementationssystem (mittlere Tafel A und B) oder von pAD/AAV-Helfersystem (dritte Tafel A und B) infiziert. LacZ-histochemische Analyse von infizierten Zellen wurde nach 24 Stunden (EMBO 5: 3133, 1986) bewertet. Photographien wurden mit einer Vergrößerung von 10× für Tafel 1A oder 20× für den Rest der Tafeln aufgenommen. Jede Tafel stellt ein individuelles Feld von einer infizierten Platte von Zellen dar.

5. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft Verfahren zum Herstellen von AAV-Capsiden, welche verwendet werden können, um Moleküle für molekulare Ersatztherapie zu transferieren. Zu bereitgestellten Verfahren für die intrazelluläre Herstellung von AAV-Capsiden gehören vektorvermittelte Expressionssysteme und Zelllinienexpressionssysteme für die Erzeugung von Capsiden. Verfahren für die in-vitro-Konstruktion von AAV-Capsiden und für das in-vitro-Verpacken dieser Capside werden ebenfalls bereitgestellt. Die Erfindung ist auch auf die Herstellung von AAV-Capsiden gerichtet, welche gentechnisch behandelt werden, um heterologe Epitope zu tragen, die in vivo eine Immunantwort auslösen können.

5.1. AAV-CAPSIDPROTEINE

Die AAV-Capside der vorliegenden Erfindung werden durch die Expression der drei Capsidgene, VP1, VP2 und VP3, und die nachfolgende Assemblierung dieser Proteine in das AAV-Capsidteilchen hergestellt.

Die AAV-Capsidgene werden am rechten Ende des AAV-Genoms gefunden und werden durch überlappende Sequenzen des gleichen offenen Leserahmens mittels der Verwendung alternativer Initiationscodons kodiert. Eine 2,6-kb-Vorläufer-mRNA wird alternativ in zwei 2,3-kb-Transkripts gespleißt. Sowohl VP2 als auch VP3 können mit der Verwendung unterschiedlicher Translationsinitiationssignale aus jedem Transkript hergestellt werden, während VP1 nur von einem der Transkripte translatiert werden kann. Die Tatsache, dass überlappende Leserahmen für die drei AAV-Capsidproteine kodieren, führt in einer Wildtypinfektion zu der obligatorischen Expression aller Capsidproteine.

Gemäß der Erfindung kann der offene Leserahmen, der die VP1-, VP2- und VP3-Capsidproteine des gesamten AAV kodiert, gentechnisch zu Expressionsvektoren verändert werden. Die Verwendung einer Gensequenz, die die drei überlappenden Leserahmen kodiert, kann zu einem Niveau und Muster der Expression der Capsidproteine führen, das die Wildtypinfektion nachahmt und Wildtyp-AAV-Capside hervorbringt. Der Nachteil dieser Herangehensweise ist, dass die Capsidzusammensetzung nicht reguliert oder verändert werden kann.

Alternativ können multiple Vektoren verwendet werden, um gesondert jedes von den Capsidgenen in die Expressionswirtszelle einzuführen. Die Verwendung von AAV-Capsid-cDNA-Gensequenzen erlaubt die Konstruktion gesonderter Expressionsvektoren, welche allein oder zusammen in die Zelle eingeführt werden können und auch quantitativ kontrolliert werden können. Eine derartige Kontrolle kann durch die Menge eines Vektors, eingeführt in eine Zelle, erreicht werden, oder alternativ können individuelle Vektoren spezielle Promotoren anwenden, die für die Stärke der Expression eines verknüpfen Capsidgens ausgewählt werden. So kann die Stöchiometrie und Zusammensetzung der AAV-Capside reguliert werden. Ein Nachteil dieser Herangehensweise ist, dass die natürliche Stöchiometrie der Capsidproteine in einer Wildtypinfektion für optimale Assemblierung in Capside nicht erreicht werden kann.

Die Sequenzen der Capsidgene werden bei Srivastava, A., et al., 1983, J. Virol. 45: 555–564; Muzyczka, N., 1992, Curr. Top. Micro Immunol. 158: 97–129, und Ruffing, M., et al., 1992, J. Virol. 66: 6922930, 1992, berichtet. Zu Ausgangsstoffen für die AAV-Capsidgene können die Säuger-Virus-Serotypen AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4 und AAV-5 ebenso wie Rinder-AAV und Vogel-AAV gehören. Die Erfindung überdenkt zusätzlich zu den darin offenbarten Capsid-DNA-Sequenzen (1) eine beliebige DNA-Sequenz, die die gleiche Aminosäuresequenz für Capsid-VP1, -VP2 und -VP3 kodiert, angegeben bei Srivastava, A., et al., vorstehend; Muzyczka, N., vorstehend und Ruffing, M., et al., vorstehend; (2) eine beliebige DNA-Sequenz, die mit dem Komplement der darin offenbarten Kodierungssequenzen unter höchst stringenten Bedingungen, z.B. Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C, hybridisiert (Ausubel, F. M. et al., Hrsg., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., New York, auf S. 2.10.3) und ein funktional äquivalentes Genprodukt kodiert; und/oder 3) eine beliebige DNA-Sequenz, die mit dem Komplement der darin offenbarten Kodierungssequenzen unter weniger stringenten Bedingungen, wie beispielsweise mäßig stringente Bedingungen, z.B. Waschen in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C, hybridisiert (Ausubel et al., 1989, vorstehend), doch welche noch ein funktional äquivalentes Genprodukt kodiert.

Die Erfindung umfasst auch 1) DNA-Vektoren, die eine der hier offenbarten Kodierungssequenzen und/oder ihre Komplemente (d.h. antisense) enthalten; 2) DNA-Expressionsvektoren, die eine der hier offenbarten Kodierungssequenzen und/oder ihre Komplemente (d.h. antisense), operativ assoziiert mit einem Regulierungselement, das die Expression der Kodierungs- und/oder antisense-Sequenzen richtet, enthalten; und (3) genetisch veränderte Wirtszellen, die eine der hier offenbarten Kodierungssequenzen und/oder ihre Komplemente (d.h. antisense), operativ assoziiert mit einem Regulierungselement, das die Expression der Kodierungs- und/oder antisense-Sequenzen in der Wirtszelle richtet, enthalten. Zu Regulierungselementen gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, induzierbare und nicht induzierbare Promotoren, Enhancer, Operatoren und andere dem Fachmann bekannte Elemente, die die Expression lenken und regulieren. Die Erfindung schließt Fragmente von einer der hier offenbarten DNA-Sequenzen ein.

Zu Alternativen zum Isolieren einer Capsidgensequenz gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, chemisches Synthetisieren der Gensequenz aus einer bekannten Sequenz oder Verarbeiten von cDNA zu der RNA, die die Capsidproteine kodiert. Andere Verfahren sind möglich und innerhalb des Bereichs der Erfindung.

Nucleinsäuren, welche Derivate (einschließlich Fragmente) und Analoge von nativen Capsidproteinen kodieren, können in der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden, so lange wie derartige Derivate und Analoge die Fähigkeit behalten, in ein AAV-Capsid zu assemblieren. Insbesondere können Capsidderivate durch Verändern von Capsidsequenzen durch Substitutionen, Additionen oder Deletionen, die funktionell aktive Moleküle bereitstellen, hergestellt werden. Weiterhin können aufgrund der Degenerienheit von Nucleotid-Kodierungssequenzen andere DNA-Sequenzen, die im wesentlichen die gleiche oder eine funktionell äquivalente AAV-Capsid-Aminosäuresequenz kodieren, bei der praktischen Ausführung der Methoden der Erfindung verwendet werden. Das Genprodukt kann Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten innerhalb der Sequenz enthalten, welche zu stillen Veränderungen führen, wobei so ein bioaktives Produkt erzeugt wird. Derartige Aminosäuresubstitutionen können auf der Grundlage von Ähnlichkeit in Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie und/oder der amphipathischen Natur der beteiligten Reste gemacht werden. Zum Beispiel gehören zu negativ geladenen Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure; zu positiv geladenen Aminosäuren gehören Lysin und Arginin; zu Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen oder nichtpolaren Kopfgruppen mit ähnlichen Hydrophiliewerten gehören die folgenden: Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin, Alanin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Phenylalanin, Tyrosin.

5.2. IN-VIVO-VERPACKUNGSSYSTEME

AAV-Capsidgene können von den rekombinanten Expressionsvektoren oder von einer gentechnisch behandelten Zelllinie exprimiert werden, so dass die Proteine imstande sind, in das Capsid innerhalb der Zelle zu assemblieren.

5.2.1. REKOMBINANTE EXPRESSION VON AAV-CAPSIDPROTEINEN UND CAPSIDBILDUNG

Die Erfindung kann mit der Verwendung einer Anzahl von Viren oder Vektoren erleichtert werden, welche gentechnisch behandelt werden können, um die Gene für die AAV-Capsidproteine zu tragen. Rekombinante Viren oder Vektoren werden verwendet, um geeignete Wirtszellen zu infizieren oder zu transfizieren, und die Expression der AAV-Proteine beginnt, die zu der Herstellung adäquater Niveaus der Capsidproteine, um die Capsidbildung zu erleichtern, führt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Virus für die Konstruktion eines rekombinanten Virus ein Virus, welches ein natürlicher Helfer für Wildtyp-AAV-Infektion ist. Zu derartigen Viren könnten Herpesviren oder Adenoviren gehören. Da diese Viren für Genexpression durch ein Wildtyp-AAV erforderlich sind, kann ihre Verwendung als rekombinanter Träger für die AAV-Capsidproteine optimal für die Herstellung geeigneter Niveaus und Verhältnisse der drei Capsidproteine sein, da sie diese Verfahren in der Wildtypinfektion erleichtern können.

In einer speziellen Ausführungsform wird das Adenovirus als rekombinantes Virus verwendet. Deletionsstämme von Adenovirus können sich auf die Insertion des heterologen Materials, d.h. die AAV-Capsid-Kodierungsregion, in nichtessentielle Regionen des Adenovirus, wie beispielsweise E1 oder E3, einstellen. Infektion von Adenovirus in eine komplementierende Wirtszelllinie, wie beispielsweise die 293-Linie, erlaubt die Expression der AAV-Capsidproteine und deren nachfolgende Assemblierung in das Capsidvehikel. Heterologe Promotoren für die Capsidgene können verwendet werden, einschließlich, ohne aber darauf begrenzt zu sein, CMV, pGK, beta-Actin, RSV, SV40 und des leberspezifischen Transthyretin-Promotors. Zu Wirtszellen können AS49, HeLa, Cos-1, KB und Vero gehören.

Das rekombinante Vaccinia-Virus kann durch homologe Rekombination zwischen einem die Capsidgene tragenden Plasmid und Wildtyp-Vaccinia-Virus innerhalb einer Wirtszelle hergestellt werden. Expression dieser Gene durch das rekombinante Virus führt zu der Assemblierung der Proteine in die Capside. Zu Wirtszellen können CV-1, HeLa, BSC-40, BSC-1 und TK143B gehören.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können Baculovirus-Vektoren konstruiert werden, um die AAV-Capsid-Kodierungsregion zu tragen, indem diese Gene in die Polyhedrin-Kodierungsregion eines Baculovirusvektors gentechnisch behandelt und virale Rekombinanten durch Transfektion in eine Baculovirus-infizierte Zelle hergestellt werden. Diese Viren können die AAV-Capsidproteine exprimieren und die nachfolgende Herstellung der Capside erleichtern. Zu Wirtszellen können Sf9 und Sf24 gehören.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können rekombinante Expressionsvektoren verwendet werden, die gentechnisch behandelt sind, um einen oder mehrere von den AAV-Capsidgenen in eine Wirtszelle zu tragen, um Expression der AAV-Capsidproteine bereitzustellen.

Derartige Vektoren können in eine Wirtszelle durch Transfektion mit Calciumphosphat oder DEAE-Dextran oder durch Elektroporation oder Liposom-vermittelten Transfer eingeführt werden.

Zu rekombinanten Expressionsvektoren gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, auf der COS-Zelle basierende Expressionsvektoren wie beispielsweise CDM8 oder pDC201 oder auf der CHO-Zelle basierende Expressionsvektoren wie beispielsweise pED-Vektoren.

Die Capsid-Kodierungsregion kann mit einer beliebigen Anzahl von Promotoren in einem Expressionsvektor verknüpft sein, der in der gewählten Zelllinie aktiviert sein kann. Zusätzlich wird diese Kassette (Capsidgene und Promotor) durch einen Vektor getragen, der einen selektierbaren Marker enthält, so dass Zellen, die den Vektor aufnehmen, identifiziert werden können.

Promotoren, um die Capsidproteine innerhalb einer Zelllinie zu exprimieren, können aus denjenigen gezogen werden, die innerhalb der Wirtszelle funktionell aktiv sind. Sie können, ohne aber darauf begrenzt zu sein, den CMV-Promotor, den frühen SV40-Promotor, den Herpes-TK-Promotor und andere in rekombinanter DNA-Technologie bekannte einschließen. Induzierbare Promotoren können verwendet werden, einschließlich, ohne aber darauf begrenzt zu sein, des Metallothionin-Promotors (MT), des Mäuse-Mammatumor-Virus-Promotors (MMTV) und anderer dem Fachmann bekannter.

Selektierbare Marker und ihre begleitenden Selektionsmittel können aus der Gruppe einschließlich, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Aminoglycosid-Phosphotransferase/G418, Hygromycin-B-Phosphotransferase/Hygromycin-B und amplifizierbarer Selektionsmarker wie beispielsweise Dihydrofolat-Reduktase/Methotrexat und anderer dem Fachmann bekannter gezogen werden.

Andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung schließen die Verwendung von prokaryotischen, Insekten-, Pflanzen- und Hefeexpressionssystemen ein, um die AAV-Capsidproteine zu exprimieren. Um Capsidproteine zu exprimieren, werden die Nucleotidsequenz, kodierend für die Capsidproteine, oder ein funktionelles Äquivalent, wie vorstehend in Abschnitt 5.1 beschrieben, in einen geeigneten Expressionsvektor, d.h. einen Vektor, der die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation der insertierten Kodierungssequenzen enthält, insertiert. Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die die Capsidprotein-Kodierungssequenzen, operativ assoziiert mit geeigneten transkriptionellen/translationalen Kontrollsignalen, enthalten. Zu diesen Verfahren gehören in vitro rekombinante DNA-Techniken, Synthesetechniken und in vivo Rekombination/genetische Rekombination. Siehe zum Beispiel die Techniken und Vektoren, beschrieben bei Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren, Ein Laborhandbuch), Cold Spring Harbor Laboratory, NY und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology (Gegenwärtige Protokolle in der Molekularbiologie), Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY.

Eine Vielfalt von prokaryotischen, Insekten-, Pflanzen- und Hefe-Expressionsvektorsystemen (d.h. Vektoren, welche die notwendigen Elemente zum Richten der Replikation, Transkription und Translation von Capsid-Kodierungssequenzen enthalten) kann gleichermaßen gut vom Fachmann benutzt werden, um Capsid-Kodierungssequenzen zu exprimieren. Zu diesen gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Mikroorganismen wie beispielsweise Bakterien, transformiert mit rekombinanten Bakteriophagen-DNA-, Plasmid-DNA- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren, enthaltend die Capsid-Kodierungssequenzen; Hefe, transformiert mit rekombinanten Hefeexpressionsvektoren, enthaltend die Capsid-Kodierungssequenzen; Insektenzellsysteme, infiziert mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z.B. Baculovirus), enthaltend die Capsid-Kodierungssequenzen; Pflanzenzellsysteme, infiziert mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z.B. Blumenkohlmosaikvirus CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) oder transformiert mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren (z.B. Ti-Plasmid), enthaltend die Capsid-Kodierungssequenzen.

Die Expressionselemente dieser Vektoren können in ihrer Stärke und den Spezifitäten variieren. Abhängig von dem benutzten Wirt/Vektor-System kann ein beliebiges von einer Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden.

Spezielle Initiationssignale sind für ausreichende Translation von insertierten Proteinkodierungssequenzen ebenfalls erforderlich. Diese Signale schließen das ATG-Initiationscodon und angrenzende Sequenzen ein. Diese exogenen translationalen Kontrollsignale und Initiationssequenzen können eine Vielfalt von Ursprüngen, sowohl natürlichen als auch synthetischen, haben. Zum Beispiel enthalten E.-coli-Expressionsvektoren translationale Kontrollsequenzen, wie beispielsweise eine geeignet positionierte Ribosombindungsstelle und Initiations-ATG. Die Wirksamkeit der Expression kann durch den Einschluss von Transkriptionsattenuierungssequenzen, Enhancerelementen usw. vergrößert werden.

Ein alternatives Expressionssystem, welches verwendet werden könnte, um AAV-Capsidproteine zu exprimieren, ist ein Insektensystem. In einem derartigen System wird Autographa-californica-Nucleopolyhedrosis-Virus (AcNPV) als Vektor verwendet, um fremde Gene zu exprimieren. Das Virus wächst in Spodoptera-frugiperda-Zellen. Die AAV-Capsid-Kodierungssequenzen können in nicht essentielle Regionen (zum Beispiel das Polyhedrin-Gen) des Virus kloniert und unter Kontrolle eines AcNPV-Promotors (zum Beispiel der Polyhedrin-Promotor) plaziert werden. Erfolgreiche Insertion der AAV-Capsid-Kodierungssequenzen führt zu Inaktivierung des Polyhedrin-Gens und Herstellung von nichtokkludiertem rekombinanten Virus (d.h. Virus, dem die proteinartige Hülle, kodiert durch das Polyhedrin-Gen, fehlt). Diese rekombinanten Viren werden dann verwendet, um Spodoptera-frugiperda-Zellen zu infizieren, in denen das insertierte Gen exprimiert wird.

In einer von diesen Ausführungsformen können die Capsidproteine intrazellulär in ein AAV-Capsid assemblieren oder können alternativ die Proteine zur Konstruktion der AAV-Capside in vitro aus dem Expressionssystem isoliert werden.

Der Nachweis der AAV-Capsidproteine, hergestellt in den vorstehenden Ausführungsformen der Erfindung, kann durch Standardtechniken, einschließlich Northern-Analyse, um Expression von mRNA nachzuweisen, und auf Protein basierender Nachweistechniken wie beispielsweise Immunoblotting oder Immunpräzipitation, durchgeführt werden. Nachweis der AAV-Capside kann erreicht werden, indem ein Lysat von infizierten Zellen isopyknischer Zentrifugation unterworfen wird, um die viralen Teilchen bei der richtigen Gradientendichte zu konzentrieren. Weitere Bestätigung der Anwesenheit der viralen Capside kann durch Transmissionselektronenmikroskopie ermittelt werden, um die Teilchen sichtbar zu machen und zu messen.

5.2.2. ZELLLINIEN, GENTECHNISCH BEHANDELT, UM AAV-CAPSIDE HERZUSTELLEN

Eine Zelllinie kann gentechnisch behandelt werden, die nativ die drei AAV-Capsidproteine exprimiert, die dann in ein AAV-Capsid assemblieren.

Um eine AAV-Capsid erzeugende Zelllinie gentechnisch zu behandeln, werden Zellen mit einem Vektor transfiziert, in welchen der offene Leserahmen des AAV-Capsids insertiert worden ist. Alternativ kann jede Capsidprotein-Kodierungsregion gentechnisch in gesonderte Vektoren verändert und verwendet werden, um Wirtszellen zu transfizieren. Transfektion kann mit einer der Standardtechniken auf dem Fachgebiet erreicht werden. Alternativ kann eine Zelllinie mit der Verwendung von chiralen Vektoren etabliert werden, die imstande sind, DNA in das Wirtszellgenom zu integrieren. Zu Beispielen dieser Vektoren gehören diejenigen, die von Retroviren oder AAV abgeleitet sind.

Zu Zelllinien, die zur Integration ausgewählt werden können, gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, HeLa, COS, NIH 3T3 und andere dem Fachmann bekannte. Die Capsid-Kodierungsreaktion kann mit einer Anzahl von heterologen Promotoren verknüpft werden, die in der ausgewählten Zelllinie aktiviert werden können. Zusätzlich kann diese Insertionskassette (Capsidgene und Promotor) mit einem Gen, kodierend für einen selektierbaren Marker, verknüpft werden, in welchem Fall die Integration der Capsid-Kodierungsregion mit dem verknüpften Marker den speziellen Phänotyp, geliefert durch den Marker, an eine stabil transfizierte Zelle überträgt. So sind die Zellen, die erfolgreich die Capsidgene integriert haben, selektierbar. Alternativ kann der selektierbare Marker auf ein gesondertes Plasmid transfiziert werden.

Promotoren, um die Capsidproteine innerhalb einer Zelllinie zu exprimieren, können aus denjenigen gezogen werden, die innerhalb der Wirtszelle funktionell aktiv sind. Zu ihnen können, ohne aber darauf begrenzt zu sein, der CMV-Promotor, der frühe SV40-Promotor, der Herpes-TK-Promotor und andere in rekombinanter DNA-Technologie bekannte gehören. Induzierbare Promotoren können verwendet werden, einschließlich, ohne aber darauf begrenzt zu sein, des Metallothionin-Promotors (MT), des Mäuse-Mammatumor-Virus-Promotors (MMTV) und anderer dem Fachmann bekannter.

Selektierbare Marker und ihre begleitenden Selektionsmittel können aus der Gruppe, einschließend, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Aminoglycosid-Phosphotransferase/G418, Hygromycin-B-Phosphotransferase/Hygromycin-B und amplifizierbarer Selektionsmarker wie beispielsweise Dihydrofolat-Reduktase/Methotrexat und anderer dem Fachmann bekannter, gezogen werden.

Stabile exprimierende Zelllinien können auch durch Verknüpfen der AAV-ITR-Sequenz mit einer Expressionskassette, enthaltend die Capsid-Kodierungsregion mit den passenden transkriptionalen Signalen, um die Integration in das Wirtszellgenom zu erlauben, konstruiert werden.

Standardmäßige rekombinante DNA-Techniken können verwendet werden, um die rekombinanten Viren und Vektoren zu konstruieren (Ausubel, F. et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology (Gegenwärtige Protokolle in der Molekularbiologie), Wiley & Sons, New York, 1994).

Nachweis der Expression der Capsidgene kann durch Standardtechniken einschließlich Northern-Analyse, Immunoblotting und Immunpräzipitation durchgeführt werden. Nachweis der Herstellung der vitalen Capside kann erreicht werden, indem ein Zelllysat isopyknischer Zentrifugation unterworfen wird, wobei die vitalen Teilchen sich entsprechend ihrer Dichte vereinigen. Weitere Bestätigung der Anwesenheit der vitalen Capside kann durch Transmissionselektronenmikroskopie, um die Teilchen sichtbar zu machen und zu messen, ermittelt werden.

Zu Ausgangsstoffen für die AAV-Capsidgene können die Säugervirus-Serotypen AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4 und AAV-5 ebenso wie Rinder-AAV und Vogel-AAV gehören.

5.3. MANIPULATIONEN VON AAV-CAPSIDVEHIKELN

AAV-Capside werden in vitro aus den AAV-Capsidproteinen konstruiert und diese Vehikel können verwendet werden, um molekulare Bestandteile in eine Zielzelle abzugeben. In einer anderen Ausführungsform werden die AAV-Capside aus einer Zelle gewonnen und in vitro mit den gewünschten Bestandteilen verpackt. In noch einer anderen Ausführungsform kann das intrazellulär erzeugte AAV-Capsid in vivo mit in die gleiche Zelle eingeführter DNA oder anderen intrazellulären molekularen Bestandteilen verpackt werden.

5.3.1. INTRAZELLULÄRE BILDUNG VON VERPACKTEN CAPSIDEN

In dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die AAV-Capside, erzeugt intrazellulär durch eines der vorstehend in Abschnitt 5.2. beschriebenen Verfahren, innerhalb der Zelle mit einer beliebigen Anzahl von molekularen Bestandteilen verpackt werden. DNA, eingeführt in die Zelle, welche die Capsidproteine exprimiert, kann in ein AAV-Capsid verpackt werden und diese DNA kann vorteilhafterweise mit den AAV-ITR verknüpft werden, um die Wirksamkeit des Verpackens zu vergrößern. Andere molekulare Bestandteile, wie beispielsweise RNA, Proteine, Peptide oder eine Kombination davon, die entweder in die Zelle eingeführt werden oder natürlicherweise intrazellulär gefunden werden, können ebenfalls in das AAV-Capsid innerhalb der Zelle verpackt werden.

5.3.2. IN-VITRO-VERPACKEN VON AAV-CAPSIDEN

In dieser Ausführungsform werden AAV-Capside durch Standardverfahren für die Gewinnung von AAV-Virionen isoliert. Zellen, gentechnisch behandelt, um die AAV-Capsidproteine, wie in den vorstehenden Abschnitten 5.1 und 5.2 beschrieben, zu exprimieren, oder Zellen, infiziert mit rekombinanten Viren, tragend die AAV-Capsidgene, oder Zellen, infiziert mit Wildtyp-AAV in einem Helfervirushintergrund, werden durch Zentrifugation gesammelt und Gefrier-Auftau-Zyklen unterworfen, die virales Material von den Zellen trennen. Das Lysat wird isopyknischer Zentrifugation (CsCl) unterworfen und die Teilchen werden aus der entsprechenden Bande auf dem Gradienten gewonnen. Diese Probe wird einer zweiten Runde von CsCl-Zentrifugation unterworfen und Fraktionen von dem Gradienten werden gewonnen und durch Western-Blot-Analyse auf die Anwesenheit der AAV-Capsidproteine analysiert. Die Gradientendichte dieser angereicherten Fraktionen bestimmt die Natur der viralen Teilchen, die vereinigt werden. Fraktionen, die die Anwesenheit der drei Capsidproteine zeigen, sind diejenigen, die mit den viralen Capsiden angereichert sind. Weitere Bestätigung der Capsidherstellung kann erhalten werden, indem ein Aliquot der angereicherten Fraktionen der Transmissionselektronenmikroskopie unterworfen wird, um die AAV-Capside sichtbar zu machen.

Die Capside können durch bekannte Techniken für die Dissoziation von makromolekularen Proteinstrukturen einschließlich Denaturierung mit Harnstoff oder Guanidiumhydrochlorid, Hitze oder pH-Manipulation dissembliert werden. Wo strukturelle Integrität von Disulfidbindungserzeugung abhängig ist, bewirken Mercaptoethanol oder ein beliebiges Thiol-Reduktionsmittel den Bruch kovalenter Disulfidbindung.

Reassemblierung des AAV-Capsids mit den gewünschten Bestandteilen wird durch Coinkubation der Capsidproteine mit den zu verpackenden Materialien erreicht. Zu begünstigenden Bedingungen für Reassemblierung gehören Manipulationen von pH, Temperatur und Pufferbedingungen, die dem Fachmann bekannt sind.

In der speziellen Ausführungsform, in der DNA zu verpacken ist, kann das Molekül für optimale Enkapsidation und für Integration der DNA in das Wirtszellgenom mit dem AAV-ITR-Signal verknüpft werden.

5.3.3. IN-VITRO-ASSEMBLIERUNG VON AAV-CAPSIDEN

In dieser Ausführungsform der Erfindung können die drei AAV-Capsidproteine in vitro isoliert und kombiniert werden, um das AAV-Capsid zu erzeugen. Die Proteine können aus Lysaten von Virusinfizierten Zellen oder aus reinen Zubereitungen des AAV-Virus gewonnen werden. Alternativ können die Proteine aus Zellen, infiziert mit rekombinantem Virus, tragend die AAV-Capsidgene, oder aus Zellen, gentechnisch behandelt, um die Capsidproteine stabil zu exprimieren, gewonnen werden.

Gewinnung der Capsidproteine aus einem der vorstehenden Ausgangsstoffe kann durch die Verwendung bekannter Techniken zur Proteinisolation, d.h. Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie oder HPLC, erreicht werden (Creighton, T. E., Proteins (Proteine), W. H. Freeman and Company, New York, 1984).

Was die so isolierten AAV-Capsidproteine betrifft, können sie in vitro kombiniert werden, um die Niveaus der in dem AAV-Virion gefundenen Proteine nachzuahmen und daher die Wiederherstellung des Capsids zu erleichtern. In dieser Ausführungsform der Erfindung ist VP3 der Hauptbestandteil der in-vitro-Reaktion, da es etwa 90% des Virionproteins ausmacht, und VP2 und VP1 sind jeweils in kleineren Mengen, jeweils etwa 5%, entsprechend ihrer quantitativen Anwesenheit als Komponente des Virions vorhanden. Alternativ können die Proteine für die Bildung des Capsids in einem äquimolaren Verhältnis kombiniert werden. Optimierung für die Bildung der Capside kann auf den Parametern von pH, Temperatur oder Pufferbedingungen beruhen und ist dem Fachmann bekannt.

Die Capsidproteine können auch mit den Bestandteilen, die in das virale Teilchen verpackt werden sollen, kombiniert werden, um Assemblierung und Verpackung gleichzeitig zu erlauben. In dieser Ausführungsform kann der Bestandteil native oder heterologe DNA sein, an welche das AAV-Verpackungssignal gebunden ist. Alternativ können zu den Bestandteilen DNA, RNA, Proteine oder Peptide gehören, welche mit dem assemblierenden Capsid assoziiert oder in es enkapsidiert sein können. Capsidproteine und die Bestandteile können für die Bildung von zum Transfer bereiten verpackten AAV-Capsiden gleichzeitig in vitro kombiniert werden.

5.4. ENKAPSIDIERTE KOMPONENTEN

Moleküle, die durch die AAV-Capside verpackt werden und nachfolgend in Zellen transferiert werden können, schließen rekombinante AAV-Genome, welche vorteilhafterweise dann in das Zielzellgenom integrieren können, und andere heterologe DNA-Moleküle ein. RNA, Proteine und Peptide, oder Kombinationen derselben, können ebenfalls enkapsidiert und transferiert werden. Native molekulare Bestandteile sind als diejenigen definiert, die in einer Wildtyp-AAV-Infektion gefunden werden, wie beispielsweise das AAV-DNA-Genom, AAV-RNA oder AAV-virale Proteine. Heterologe Moleküle sind als diejenigen definiert, die bei einer AAV-Infektion nicht natürlicherweise gefunden werden; d.h. diejenigen, die nicht durch das AAV-Genom kodiert sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Segment von DNA, das enkapsidiert werden soll, mit den AAV-ITR-Sequenzen, welche die viralen Verpackungssignale enthalten, verknüpft und in eine Wirtszelle eingeführt werden, in welcher die AAV-Capside hergestellt werden, und dieses Segment kann dann in das AAV-Capsid verpackt werden. Derartige Segmente von DNA können Gene oder heterologe virale Genome kodieren. Der Einschluß des Verpackungssignals vergrößert die Wirkungsgrade der Enkapsidierung.

In einer Ausführungsform, die die Integration der verpackten DNA in das Wirtszellgenom erlaubt, kann die DNA mit den AAV-Integrationssequenzen (ITRs) verknüpft werden, die diese Sequenzen zum Ziel für Integration in das Wirtszellenchromosom 19 haben.

5.5. ASSOZIATION VON HETEROLOGEN MOLEKÜLEN MIT AAV-CAPSIDEN

Die Erfindung ist weiterhin für wirksamen Transfer therapeutisch verwendbarer Moleküle in Wirtszielzellen auf die Assoziation der Moleküle mit der Außenseite von AAV-Capsiden gerichtet. Derartige assoziierte Moleküle sind RNA, Proteine, Peptide oder Kombinationen davon. In einer Ausführungsform der Erfindung können die therapeutisch verwendbaren Moleküle kovalent mit den Capsidproteinen verknüpft werden. Alternativ können AAV-Capsidproteine genetisch verändert werden, um für Fusions-Capsidproteine zu kodieren, an welche assoziierende Moleküle sich binden können.

5.6. REKOMBINANTE AAV-CAPSIDE ALS EPITOPTRÄGER

Die Erfindung ist weiter auf die Herstellung von AAV-Capsiden durch eines der vorstehenden Verfahren gerichtet, die gentechnisch behandelt werden, um ein heterologes Epitop innerhalb eines der drei Capsidproteine, VP1, VP2 oder VP3, zu tragen. In dieser Ausführungsform wird DNA, kodierend ein Capsidprotein, durch Standardtechniken in der Molekularbiologie gentechnisch behandelt, die, ohne aber darauf begrenzt zu sein, stellengerichtete Mutagenese oder mutagene Techniken der Polymerasekettenreaktion (PCR) einschließen, um eine heterologe Sequenz einzubringen, die ein Epitop von einem klinisch relevanten Antigen kodiert. Dies führt zu der Expression eines Capsidfusionsproteins. Das fremde Epitop ist vorzugsweise gentechnisch in eine Region des Capsidproteins verändert, die die Capsidbildung nicht beeinträchtigt.

Zu Beispielen von Antigenen, die der Ausgangsstoff dieser Epitope sein können, gehören diejenigen aus bakteriellem, viralem oder zellulärem Ursprung. Zu Antigenen aus Bakterien gehören diejenigen aus Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Cholera und Mycobacterium (TB). Zu Beispielen von Antigenen aus Viren gehören das env-Protein von HIV, HA-Protein von Influenza, Hepatitis-Oberflächenartigen, Herpes-Glycoprotein und das Oberflächenartigen von menschlichem Papilloma-Virus. Zu Beispielen von Antigenen aus zellulären Ausgangsstoffen gehören diejenigen, identifiziert als tumorspezifische Antigene bei Krebs, zum Beispiel das karzinoembryonale (CEA) Antigen, gefunden bei Darmkrebs, oder das PSA-Antigen, gefunden bei Prostatakrebs. Zusätzlich sind Antigene, entsprechend Antiimmunoglobulinsequenzen, die verwendet werden könnten, um Antikörper hervorzurufen, die diese in Autoimmunerkrankungen, einschließlich, ohne aber darauf begrenzt zu sein, multipler Sklerose, Lupus erythematodes, Diabetes und Sklerodermie, neutralisieren würden, innerhalb des Bereichs der Erfindung.

5.7. VERWENDUNG VON AAV-VEHIKELN

Die AAV-Capsidvehikel können an einen Patienten in therapeutisch wirksamen Dosen verabreicht werden. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezeichnet diejenige Menge der Verbindung, die ausreichend ist, um zur Besserung von Symptomen einer Krankheit zu führen.

Toxizität und therapeutische Wirksamkeit der AAV-Capsidvehikel können durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt werden, z.B. zum Bestimmen der LDS50 (die Dosis, letal für 50% der Population) und der ED50 (die Dosis, therapeutisch wirksam bei 50% der Population). Das Verhältnis der Dosis zwischen toxischen und therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index und kann als das Verhältnis LD50/ED50 ausgedrückt werden. Dosen, welche große therapeutische Indizes zeigen, werden bevorzugt. Wenn auch Dosen, die toxische Nebenwirkungen zeigen, verwendet werden können, sollte Sorge getragen werden, ein Abgabesystem zu entwerfen, das derartige AAV-Capsidvehikel auf die Stelle der Behandlung zielt, um die Schädigung für unbehandelte Zellen zu minimieren und Nebenwirkungen zu verringern.

Die Werte, erhalten aus Zellkulturassays und Tieruntersuchungen, können beim Formulieren eines Bereiches der Dosierung zur Verwendung bei Menschen verwendet werden. Die Dosierung derartiger Capsidvehikel liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereiches von zirkulierenden Konzentrationen, die die ED50 mit wenig oder keiner Toxizität einschließen. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereiches variieren, abhängig von der angewendeten Dosierungsform und dem benutzten Weg der Verabreichung. Für eine beliebige Verbindung, verwendet in dem Verfahren der Erfindung, kann die therapeutisch wirksame Dosis am Anfang aus Zellkulturassays geschätzt werden. Eine Dosis kann in Tiermodellen formuliert werden, um einen Bereich der zirkulierenden Plasmakonzentration zu erreichen, der die IC50 (d.h. die Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Infektion oder eine halbmaximale Hemmung erreicht), wie in der Zellkultur bestimmt, einschließt. Derartige Information kann verwendet werden, um verwendbare Dosen bei Menschen genauer zu bestimmen. Niveaus in Plasma können, zum Beispiel, durch Hochleistungsflüssigchromatographie gemessen werden.

Pharmazeutische Zusammensetzungen, die die AAV-Capsidvehikel zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, können in herkömmlicher Weise unter Verwendung von einem oder mehreren physiologisch verträglichen Trägern oder Excipienten formuliert werden. Zum Beispiel können die AAV-Capsidvehikel in einem Träger wie beispielsweise PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) suspendiert werden.

Die AAV-Capsidvehikel und ihre physiologisch verträglichen Salze und Solvate können zur Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation (entweder durch den Mund oder die Nase) oder für orale, bukkale, parenterale oder rektale Verabreichung formuliert werden.

Zur Verabreichung durch Inhalation werden die AAV-Capsidvehikel zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung herkömmlicherweise in der Form einer Aerosolspraydarbietung aus Druckpackungen oder eines Zerstäubers mit der Verwendung eines geeigneten Treibmittels, z.B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes Gas, abgegeben. In dem Fall eines Druckaerosols kann die Dosierungseinheit durch Bereitstellen eines Ventils zur Abgabe einer abgemessenen Menge bestimmt werden. Kapseln und Patronen von z.B. Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator können formuliert werden, die ein Pulvergemisch einer therapeutischen Verbindung und einer geeigneten Pulvergrundlage wie beispielsweise Lactose oder Stärke enthalten.

Für orale Verabreichung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen die Form von zum Beispiel Tabletten oder Kapseln annehmen, die durch herkömmliche Mittel mit pharmazeutisch verträglichen Excipienten, wie beispielsweise Bindemittel (z.B. vorgelatinisierte Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylcellulose); Füllstoffe (z.B. Lactose, mikrokristalline Cellulose oder Calciumhydrogenphosphat); Schmiermittel (z.B. Magnesiumstearat, Talkum oder Kieselerde); Sprengmittel (z.B. Kartoffelstärke oder Natriumstärkeglycolat); oder Benetzungsmittel (z.B. Natriumlaurylsulfat) hergestellt werden. Die Tabletten können durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren beschichtet werden. Flüssige Zubereitungen für orale Verabreichung können die Form von zum Beispiel Lösungen, Sirupen oder Suspensionen annehmen, oder sie können als trockenes Produkt zur Konstituierung mit Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel vor dem Gebrauch dargeboten werden. Derartige flüssige Zubereitungen können durch herkömmliche Mittel mit pharmazeutisch verträglichen Zusatzstoffen, wie beispielsweise Suspendiermittel (z.B. Sorbitsirup, Cellulosederivate oder hydrierte Speisefette); Emulgiermittel (z.B. Lecithin oder Akaziengummi), nichtwässerige Vehikel (z.B. Mandelöl, ölige Ester, Ethylalkohol oder fraktionierte Pflanzenöle); und Konservierungsstoffe (z.B. Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure), hergestellt werden. Die Zubereitungen können ebenfalls Puffersalze, Aroma-, Farb- und Süßungsmittel wie geeignet enthalten.

Zubereitungen zur oralen Verabreichung können geeignet formuliert werden, um kontrollierte Freisetzung der aktiven Verbindung zu ergeben.

Für bukkale Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen annehmen, die in herkömmlicher Weise formuliert werden.

Die AAV-Capside können für parenterale Verabreichung durch Injektion, z.B. durch Bolus-Injektion oder kontinuierliche Infusion, formuliert werden. Formulierungen zur Injektion können in einheitlicher Dosierungsform, z.B. in Ampullen oder in Multidosisbehältern, mit einem hinzugefügten Konservierungsstoff dargeboten werden. Die Zusammensetzungen können derartige Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässerigen Vehikeln annehmen und können Formulierungsmittel wie beispielsweise Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel enthalten. Alternativ kann der Wirkstoff in Pulverform zur Konstituierung mit einem geeigneten Vehikel, z.B. sterilem pyrogenfreien Wasser, vor dem Gebrauch sein.

Die AAV-Capsidvehikel können auch in rektalen Zusammensetzungen, wie beispielsweise Suppositorien oder Retentionseinläufe, formuliert werden, die z.B. herkömmliche Suppositoriengrundlagen wie Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten.

Zusätzlich zu den bereits beschriebenen Formulierungen können die AAV-Capsidvehikel auch als Depotzubereitung formuliert werden. Derartige langwirkende Formulierungen können durch Implantation (zum Beispiel subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden. So können zum Beispiel die therapeutischen Verbindungen mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (zum Beispiel als Emulsion in einem verträglichen Öl) oder Ionenaustauschharzen oder als schwer lösliche Derivate, zum Beispiel als schwer lösliches Salz, formuliert werden.

Die Zusammensetzungen können wenn gewünscht in einer Packung oder Dispenservorrichtung dargeboten werden, welche ein oder mehrere den Wirkstoff enthaltende einheitliche Dosierungsformen enthalten können. Die Packung kann zum Beispiel Metall- oder Kunststofffolie, wie beispielsweise eine Blisterpackung, umfassen. Die Packung oder Dispenservorrichtung kann von Instruktionen zur Verabreichung begleitet sein.

6. BEISPIEL: HERSTELLUNG VON AAV-CAPSIDEN AUS REKOMBINANTEM ADENOVIRUS 6.1. KONSTRUKTION VON DL324/CMV CAP

Die AAV2-Capsid-Kodierungsregion von psub201 (Samulski, R. J., et al., J. Virol. 61: 3096–3101, 1987) wurde in pCMV-Ad kloniert (Dolph, P. J., J. Virol. 62: 2059–2066, 1988), um ein Plasmid (pCAD/Cap) abzuleiten, in welchem die Capsidgene unter der Kontrolle des CMV-Promotors waren. Dieses Plasmid wurde mit dem linearisierten DNA-Fragment von Adenovirus d1324 in 293-Zellen cotransfiziert, um d1324/CMV/Cap, ein rekombinantes Adenovirus, enthaltend die AAV2-Capsidgene, zu erzeugen (1). Plaquen, resultierend aus der Infektion dieses Virus in 293-Zellen, wurden aufgenommen und auf die Expression der AAV2-Capsidproteine überprüft. Ein Isolat (d1324/CMV/CapFF) wurde zur weiteren Analyse in ein virales Ausgangsmaterial expandiert (2). Korrektes Spleißen der Capsid-Botschaften erfolgte, um die drei Capsidproteine (VP1, VP2 und VP3) in Gehalten hervorzurufen, die die in Wildtypinfektion gesehenen nachahmten (5% VP1, 5% VP2 und 90% VP3).

6.2. CHARAKTERISTISCHE WACHSTUMSEIGENSCHAFTEN VON DL324/CMV/CAPFF

Das rekombinante Adenovirus wurde auf seine Fähigkeit getestet, Wildtypwachstum in 293-Zellen zu zeigen. Zellen wurden mit einem MOI von 200 Teilchen pro Zelle, ausreichend, um einstufiges Wachstum zu bewirken, infiziert. Das Kontrollvirus war rekombinantes Adenovirus, enthaltend das B-gal-Gen, d1324-Bgal. Ergebnisse über einen 48-h-Zeitraum demonstrierten, dass das Ad-AAV-rekombinante Virus ähnliche einstufige Wachstumseigenschaften wie das Kontrollvirus hatte (3).

6.3. ZEITLICHE EXPRESSION DER CAPSIDPROTEINE AUS AD/AAV-VIRUS

Um zu beurteilen, ob die Capsidproteine in einer zeitlichen Weise ähnlich dem Wildtyp-AAV exprimiert wurden, wurden 293-Zellen mit dem rekombinanten Virus infiziert und Proben wurden über einen 48-h-Lauf der Infektion gesammelt. Immunoblotting demonstrierte, dass die zeitliche Expression der AAV-Capsidproteine sich nur leicht hinter der von Wildtyp-AAV verzögerte (4).

6.4. mRNA-VERARBEITUNG IN EINER AD/AAV-INFEKTION

Um zu bestimmen, ob die Capsid-RNA korrekt gespleißt wurde, um die passenden mRNAs entsprechend den drei Capsidproteinen zu ergeben, enthüllte RT-PCR, durchgeführt an mRNAs, isoliert aus infizierten 293-Zellen, die Anwesenheit der korrekt gespleißten mRNAs, identisch mit den in einer Wildtypinfektion gesehenen (5).

6.5. SUBZELLULÄRE LOKALISATION DER AAV-CAPSIDPROTEINE, EXPRIMIERT VON DEM AD/AAV-VIRUS

Um zu bestimmen, ob die Capsidproteine, exprimiert von dem rekombinanten Virus, korrekt lokalisiert wurden, wurde Immunofluoreszenz von HeLa-Zellen, infiziert mit dem Virus, durchgeführt. Unter Verwendung eines anti-AAV-Capsid-Antikörpers (Hoggan, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55: 1460–1474, 1966) wurden getrennte Bereiche der Färbungskonzentration innerhalb des Kerns gesehen, ähnlich denjenigen, die in einer Wildtyp-AAV-Infektion sichtbar gemacht wurden (6).

6.6. BILDUNG VON LEEREN VIRALEN TEILCHEN IN DER AD/AAV-INFEKTION

Virale Lysate von 293-Zellen, infiziert mit d1324/CMV/Cap, wurden durch isopyknische Zentrifugation in einem CsCl-Dichtegradienten vereinigt. Von Fraktionen von dem Gradienten wurden mit anti-AAV-Capsid-Antikörper Immunoblots ausgeführt, um die Anwesenheit der AAV-Capsidproteine zu lokalisieren (7). Dichtemessungen wurden für die Fraktionen (14-30) berechnet, die die höchsten Gehalte von AAV-Capsidproteinen zeigten. Die Dichte dieser Fraktionen war 1,31 g/ml, was mit Dichtemessungen übereinstimmt, die für leere virale Teilchen berichtet wurden (Myers, M. W. und Carter, B. J., Virology 102: 71–82, 1980).

Weitere Charakterisierung durch Transmissionselektronenmikroskopie demonstrierte, dass der mittlere Durchmesser dieser Teilchen 20 nm war, typisch für Wildtyp-AAV2-Teilchen (8).

7. BEISPIEL: VERPACKEN VON AAV-VEKTOR-DNA-MOLEKÜL UNTER VERWENDUNG VON ADENOVIRUS-HYBRID, TRAGEND AAV-CAPSIDGENE

Der folgende Unterabschnitt beschreibt nachstehend Experimente, die die in-vivo-Enkapsidation von AAV-Vektor-DNA in virale Capside in Zellen, infiziert mit dem rekombinanten Ad/DMV/CAP-Virus, demonstrieren.

7.1. MATERIALIEN UND METHODEN 7.1.1. PLASMIDE UND VIRUS

Plasmid pAB11 ist das psub201-Plasmid; früher beschrieben bei Samulski et al., 1987 J. Virol. 61: 3096–3101, tragend ein insertiertes lacZ-Reportergen. Plasmid pAd/AAV kodiert für sowohl die REP- als auch die CAP-Proteine (Samulski et al, 1989, J. Virol. 63: 3822–3828). Plasmid pUHD RepA ist ein psub201-Derivat, exprimierend nur die AAV-Rep-Proteine unter der Kontrolle des Tetracyclin-Repressor-Promotors. Das pUGD-Konstrukt enthält die AAV-Kodierungssequenzen für REP, welches die AAV-Nucleotide 321-2234 einschließt. Das Tetracyclin-Repressor-Promotor-Inducer-Plasmid, pUHD 15-1, ist bei Gossen und Buyard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547–5551, beschrieben.

7.1.2. TRANSFEKTION UND INFEKTION VON ZELLEN

Humane 293-Zellen wurden mit 2 &mgr;g pAB11 und 12 &mgr;g pUHD 15-1 transfiziert. Nach 12 Stunden wurde die Monoschichtzellkultur mit Ad/CMV/CAP mit 5 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro Zelle infiziert. 48 Stunden nach der Infektion wurden virale Lysate hergestellt. Das Kontrollexperiment bestand aus der Transfektion von 293-Zellen mit 2 &mgr;g pAB11, 12 &mgr;g pAD/AAV und nachfolgender Infektion mit 5 pfu pro Zelle Wildtyp-Adenovirus (WT300).

200&lgr; von den vorstehenden Lysaten wurden verwendet, um eine neue Monoschicht von 293-Zellen zu infizieren. 24 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen für beta-Galactosidase-Aktivität angefärbt. Außerdem wurde als zusätzliche Kontrolle Wildtyp-Adenovirus mit der pAB11-Plasmid-DNA gemischt.

7.2. ERGEBNISSE

Nach dem Anfärben der infizierten Zellen für beta-Galactosidase-Aktivität wurde positive Färbung mit viralen Lysaten beobachtet, wobei das Ad/CMV/CAP-Helfervirus als Ausgangsstoff von AAV-Capsidprotein benutzt wurde, und mit dem pAD/AAV-Helfer-Plasmid, welches sowohl rep- als auch cap-Gene exprimiert (9, mittlere Tafel A und mittlere Tafel B). Es gab keinen Nachweis von beta-Galactosidase-Aktivität in allen mit Wildtyp-Adenovirus und pAB11 infizierten Zellen.

Diese Ergebnisse zeigen an, dass AAV lacZ DNA aus dem Plasmid gewonnen, repliziert und unter Verwendung entweder des traditionellen Verpackungssystems oder des Ad/CMV/CAP-Virus-Einsatzmaterials in AAV-Teilchen verpackt werden kann. Diese Ergebnisse demonstrieren klar das Potential zum Erzeugen infektiöser AAV-Teilchen unter Verwendung des Adenovirus-Hybrid-Virus als Ausgangsmaterial zum Herstellen von AAV-Capsidproteinen.

Die vorliegende Erfindung soll im Bereich nicht durch die beschriebenen speziellen Ausführungsformen begrenzt sein, welche als einzelne Veranschaulichungen individueller Aspekte der Erfindung vorgesehen sind, und funktionell äquivalente Methoden und Komponenten sind innerhalb des Bereichs der Erfindung. In der Tat werden verschiedenartige Modifizierungen der Erfindung zusätzlich zu den hier gezeigten und beschriebenen für den Fachmann aus den vorhergehenden Beschreibungen und den begleitenden Zeichnungen offensichtlich. Derartige Modifizierungen sollen in den Bereich der angefügten Ansprüche fallen.


Anspruch[de]
  1. AAV-Capsidabgabevehikel (adenoassoziiertes Virus-Capsidabgabevehikel), umfassend AAV-Capsidproteine (adenoassoziierte Virus-Capsidproteine), die mit einem RNA-Molekül, einem Protein, einem Peptid, oder einer Kombination davon kovalent verknüpft sind, daran gebunden sind oder sie enkapsidieren.
  2. AAV-Capsidabgabevehikel nach Anspruch 1, umfassend AAV-Capsidproteine, die kovalent mit einem ein RNA-Molekül verknüpft sind oder an eines gebunden sind oder eines enkapsidieren.
  3. AAV-Capsidabgabevehikel nach Anspruch 1, umfassend AAV-Capsidproteine, die mit einem Protein kovalent verknüpft sind oder an eines gebunden sind oder eines enkapsidieren.
  4. AAV-Capsidabgabevehikel nach Anspruch 1, umfassend AAV-Capsidproteine, die mit einem Peptid kovalent verknüpft sind oder an eines gebunden sind oder eines enkapsidieren.
  5. Verfahren zur Herstellung eines verpackten AAV-Capsids in vitro, umfassend:

    a) Rückgewinnung der AAV-Capsidproteine aus einem rekombinanten Virus, einem Expressionsvektor oder aus einer Zelllinie, die stabil integrierte AAV-Capsidgene oder -kodierungssequenzen aufweist; und

    b) Coinkubation der AAV-Capsidproteine mit einem Molekül, das dergestalt mit AAV-Capsiden assoziiert ist oder in sie einkapsidiert ist, dass die Reassemblierung des Capsids mit dem zu verpackenden Molekül erreicht wird, worin das Molekül aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem heterologen DNA-Molekül, einem RNA-Molekül, einem Protein oder einer Kombination davon.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, worin das Verhältnis von Capsidproteinen in den AAV-Capsiden ca. 90% VP3, 5% VP1 und 5% VP2 beträgt.
  7. Verpacktes AAV-Capsid, das gemäß dem Verfahren nach Anspruch 5 oder 6 erhalten wird.
  8. Verwendung eines AAV-Capsids, das gemäß dem Verfahren nach Anspruch 5 zum Transfer eines heterologen DNA-Moleküls in eine Zelle hergestellt wird.
  9. Verwendung eines AAV-Capsidabgabevehikels nach Anspruch 1 zum Transfer eines RNA-Moleküls, eines Proteins, eines Peptids oder einer Kombination davon in eine Zelle.
  10. Verwendung eines AAV-Capsidabgabevehikels gemäß dem Verfahren nach Anspruch 5 zum Transfer eines RNA-Moleküls in eine Zelle.
  11. Verwendung eines AAV-Capsidabgabevehikels gemäß dem Verfahren nach Anspruch 5 zum Transfer eines Proteins in eine Zelle.
  12. Verwendung eines AAV-Capsidabgabevehikels gemäß dem Verfahren nach Anspruch 5 zum Transfer eines Peptids in eine Zelle.
Es folgen 10 Blatt Zeichnungen






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