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Dokumentenidentifikation DE69635584T2 21.09.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000865486
Titel ZUSAMMENSETZUNG STABILER, BIOTINYLIERTER BIOMOLEKÜLE UND VERFAHREN
Anmelder Bristol-Myers Squibb Co., Skillman, N.J., US
Erfinder BURTON, J., Steven, Peterborough PE2 5XJ, GB;
PEARSON, C., James, Chesterton, Cambridge CB4 1DX, GB;
EDWARDSON, A., Peter, Chester CH1 4BE, GB;
MENZIES, Alan, Connah's Quay CH5 4LG, GB
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69635584
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, IE, IT, LI, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 24.10.1996
EP-Aktenzeichen 969370055
WO-Anmeldetag 24.10.1996
PCT-Aktenzeichen PCT/US96/17200
WO-Veröffentlichungsnummer 1997017435
WO-Veröffentlichungsdatum 15.05.1997
EP-Offenlegungsdatum 23.09.1998
EP date of grant 14.12.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 21.09.2006
IPC-Hauptklasse C12N 11/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 11/02(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 11/16(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12P 21/06(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   G01N 33/53(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND

Die auf Avidin-Biotin-Affinität basierende Technologie hat seit der Pionierarbeit von Dr. Edward Bayer und Dr. Meier Wilchek in den siebziger Jahren breite Anwendungsmöglichkeiten auf zahlreichen Gebieten der Biologie und Biotechnologie gefunden. Die Affinitätskonstante zwischen Avidin und Biotin ist bemerkenswert hoch und wird nicht nennenswert verringert, wenn Biotin an eine breite Anzahl von Biomolekülen gekoppelt ist. Außerdem bleibt diese Affinität, sogar wenn Derivatformen von Biotin verwendet werden, weitgehend erhalten und es wurden zahlreiche chemische Wege zur Kopplung von Biomolekülen an Biotin mit minimalem oder vernachlässigbarem Verlust der Aktivität oder von anderen gewünschten Eigenschaften des Biomoleküls identifiziert. Bei bestimmten Anwendungen wird Avidin auf einem inerten Material immobilisiert, über das eine Lösung, die biotinylierte Biomoleküle enthält, geschickt wird. Die Affinität des Biotins für Avidin sorgt für die Trennung der Biomoleküle aus der Lösung. Eine Übersicht über die Biotin-Avidin-Technologie findet man bei Bayer et al., „Applications of Avidin-Biotin Technology to Affinity-Based Separation",J. of Chromatography (1990), Seite 3-11.

EP 592242 beschreibt ein neues Fibrin-Dichtungsmittel, das gegenüber den traditionellen Fibrinogen-basierten Dichtungsmitteln auf Fibrin-Monomer basiert und das die Einwirkung eines thrombinähnlichen Enzyms, das vorzugsweise nach einer solchen Behandlung entfernt wird, auf Fibrinogen einschließt. EP 592242 beschreibt, dass der Enzymeinfang und die Enzymentfernung durch die Verwendung von biotinyliertem Batroxobin erreicht werden können, das mit einem Avidinmaterial wiedereingefangen werden kann. Diese und andere Anwendungen würden von praktischeren Formen von biotinylierten Biomolekülen und Avidinmaterialien profitieren. Momentan sind diese Materialien manchmal schwierig zu handhaben, können instabil sein, können bei der Verarbeitung wie der Lyophilisierung die Enzymaktivität verlieren, können übermäßig hygroskopisch sein und halten Sterilisationsprozesse nicht aus.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden neue Zusammensetzungen und Verfahren für biotinylierte Biomoleküle und die Biotin/Avidin Affinitätstechnologie beschrieben. Die stabile Zusammensetzung für ein biotinyliertes Biomoleküle umfasst:

  • i) das biotinylierte Biomolekül in einer Konzentration, die gemäß einer bestimmten Anwendung ausgewählt ist,
  • ii) 0,01 bis 50 Gew-% eines Biomolekül-Schutzmittels, das fähig ist, die gewünschte Aktivität des Biomoleküls im Wesentlichen aufrechtzuerhalten, und ausgewählt ist aus Trehalose, Glycerin, Ammoniumsulfat und einer Aminosäure, die ein Zwitterion ist, nämlich Glycin, Alanin oder Valin,
  • iii) Puffermittel, um den pH-Wert der Zusammensetzung auf einem gewünschten Wert zu halten,
  • iv) 1 bis 50 Gew.-% von einem oder mehreren wasserlöslichen Füllmittel(n) und
  • v) Endsterilisations-Schutzmittel ausgewählt aus Antioxidantien, Radikalfängern und Reduktionsmitteln zum Schutz der Zusammensetzung und des Biomoleküls vor Abbau oder Instabilität während der Endsterilisation.

Diese Zusammensetzung ist praktischerweise eine wässrige Lösung. Am meisten bevorzugt ist diese Zusammensetzung gefriergetrocknet, um eine stabile, bestrahlbare Pulverform des biotinylierten Biomoleküls bereitzustellen. Verfahren zur Herstellung eines Fibrinmonomer-Materials, das beispielsweise in einem Fibrin-Dichtungsmittel verwendet werden kann, werden ebenfalls offenbart.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die vorliegende Erfindung offenbart neuartige, stabile Zusammensetzungen für Biotin-Biomoleküle. Die bevorzugten Zusammensetzungen sind gefriergetrocknet und stabil, leicht zu handhaben und können z.B. durch Gammastrahlung ohne Beschädigung der Zusammensetzungen endsterilisiert werden. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn die Zusammensetzung ein biotinyliertes Biomolekül ist, da herausgefunden wurde, dass es sehr effizient ist, wenn man das lyophilisierte biotinylierte Biomolekül ohne Schädigung dessen Aktivität endsterilisieren kann. Die vorliegenden lyophilisierten Biotin-basierten Zusammensetzungen haben überall, wo die Avidin-Biotin-Technologie verwendbar ist, breite Anwendungsmöglichkeiten, da diese Zusammensetzungen wasserlöslich sind, geringe Feuchtigkeitsaufnahme zeigen, geringe Biolast aufweisen, endsterilisiert (z.B. bestrahlt) werden können, stabil bleiben und pharmakologisch verträglich sind. Diese Vorteile werden bereitgestellt durch die einmalige Kombination von Schutzmitteln und Füllmitteln, wie hier beschrieben.

Diese neuartigen Zusammensetzungen enthalten, zusammen mit dem biotinylierten Biomolekül, ein Biomolekül-Schutzmittel, Puffermittel, um den gewünschten pH-Wert zu halten, ein oder mehrere wasserlösliche Füllmittel und ein Schutzmittel für die Endsterilisation (z.B. durch Gammastrahlung). Das Biomolekül kann jedes gewünschte Enzym oder Protein sein, das in einer biotinylierten Form verwendet werden soll. Nach dem Stand der Technik existieren zahlreiche biotinylierte Biomoleküle und alle diese Biomoleküle des Standes der Technik können hier ebenfalls verwendet werden. Im Hinblick auf das neuartige Fibrinmonomer-Verfahren im vorstehend erwähnten EP 592242 können thrombinähnliche Enzyme in biotinylierter Form hilfreich sein. Derartige thrombinähnliche Enzyme schließen Thrombin oder ein thrombinähnliches Enzym, ausgewählt aus Akutin, dem Schlangengiftenzym Venzyme, Ancrod, Asperase, Batroxobin (aus B. Altrox, B. Moojeni oder B. Maranhao), Botropase, Crotolase, Flavoxogin und Gabonase ein. Nicht beschränkende Beispiele anderer biotinylierter Biomoleküle schließen biotinylierte Lektine, Antikörper, Mitogene, DNA, RNA, tRNA, rRNA-Fragmente, Nucleosomen, Membranen, Membranproteine, Glycoproteine und synthetische Peptide ein.

Die Biotinkomponente des biotinylierten Biomoleküls kann Biotin oder jede Derivatform oder jedes Analogon davon sein oder jedes Molekül, das eine Affinität für Avidin aufweist, einschließlich monomeres Avidin, Streptavidin oder irgendein Protein mit biotinbindenden Eigenschaften, einschließlich der rekombinanten Formen von jedem der vorstehend genannten. Patente und Literatur sind voll mit den verschiedenen Biotin-Verbindungen, einschließlich verschiedener Spacer, Verbindungsgruppen und dergleichen, zur Verwendung in den vorliegenden Anmeldungen.

Nicht beschränkende Beispiele sind zu finden in Savage, M.D. et al, (1992) „Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook", Pierce Chemical Co., DE 3629194, US 5,180,828, US 4,709,037 und US 5,252,743, US 4,798,795, US 4,794,082, WO 85/05638, die hierin durch Bezugnahme enthalten sind.

Vorzugsweise ist das Biomolekül-Schutzmittel eine Aminosäure und stärker bevorzugt ist die Aminosäure ein einfaches Zwitterion wie Glycin, Alanin, und Valin, wobei Glycin am meisten bevorzugt wird.

Das Puffermittel in den vorliegenden Biotin-Zusammensetzungen kann jeder praktische Puffer sein, der geeignet ist, den pH-Wert der Zusammensetzung auf einem gewünschten Level zu halten. Im Fibrinmonomer-Verfahren von EP 592242 ist es gewünscht, das biotinylierte Biomolekül bei einem pH-Wert von etwa 7 zu halten, daher sind Natriumbarbital-, Citrat-, Barbital-Natrumphosphat, Kaliumphosphat-, Imidazol-HCl-, Piperazin-, Natriumbicarbonat-5%CO2-, Triethanolamin-HCl-NaOH-, Tris(hydroxymethyl)aminomethan- und Natriumphosphatpuffer verwendbar, wobei Natriumphosphat bevorzugt wird.

Das Füllmittel in den vorliegenden Biotin-Biomolekül-Zusammensetzungen ist ausgewählt aus wasserlöslichen, nicht-ionischen Polymeren. Das Füllmittel verleiht den vorliegenden Zusammensetzungen sowohl chemische als auch physikalische Stabilität und bewahrt die neuartigen Zusammensetzungen, beispielsweise wenn sie in Form eines gefriergetrockneten Kuchens vorliegen, vor dem Zusammenfallen. Die nicht-ionischen, wasserlöslichen Polymere stellen ebenfalls einen Schutz des Biomoleküls bereit. Es wurde gefunden, dass Dextran und ähnliche Polysaccharide die Stabilität der vorliegenden Zusammensetzungen erhöhen. Nicht beschränkende Beispiele für derartige Füllmittel schließen Dextran, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyethylenglykol, hydrolysierte Stärke und Polysaccharide (z.B. Lactose, Glucose, Maltose, Mannit etc.) ein, wobei Dextran, besonders Dextrane mit einem Molekulargewicht zwischen 50.000 und 100.000 Dalton (z.B. Dextran T-70 von Pharmacia Co.), bevorzugt wird.

Bevorzugte Endsterilisation-Schutzmittel sind Antioxidatien wie reduziertes Glutathion, &agr;-Tocopherol, N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin und Natriumascorbat, wobei Natriumascorbat am meisten bevorzugt wird.

Die Herstellung des biotinylierten Moleküls wird durch bekannte Techniken erreicht. Zum Beispiel kann ein Biotinderivat (das jede gewünschte Biotin-Verbindung mit Spacer-Arm und/oder Abgangsgruppen, wie vorstehend diskutiert, sein kann) wie N-Hydroxysuccinimid-Biotin (NHS-Biotin) mit dem gewünschten Biomolekül, z.B. dem löslichen Enzym Batroxobin, in einem Lösungsmittel und in Anwesenheit eines Puffers umgesetzt werden. Das NHS fungiert wie eine Abgangsgruppe, um das so gebildete Biotin-Batroxobin bereitzustellen. Dies kann unter Verwendung von Standardverfahren gereinigt werden, zum Beispiel durch Reinigen des Biotin-Batroxobin über eine SephadexTM-Chromatographiesäule, um freies Biotin, NHS-Biotin und andere niedermolekulare Bestandteile zu entfernen.

Danach wird eine wässige Lösung, umfassend die Bestandteile der Zusammensetzung, d.h. das biotinylierte Biomolekül, Biomolekül-Schutzmittel, Puffermittel, Füllmittel und Endsterilisations-Schutzmittel, hergestellt. Vorzugsweise kann im vorstehenden Reinigungsschritt der im Endprodukt gewünschte Puffer verwendet werden, was voraussetzt, dass Wasser und Füllmittel zum biotinylierten Biomolekül und dem Puffer zugegeben werden, um die wässrige Lösung zu bilden.

Die wässrige Lösung dieser Erfindung umfasst:

0,01 bis 50 Gew.-% Biomolekül-Schutzmittel;

1 bis 50 Gew.-% Füllmittel;

das biotinylierte Biomolekül in einer Konzentration, die gemäß der bestimmten Anwendung ausgewählt ist;

das Endsterilisations-Schutzmittel;

Wasser und

den Puffer, der nötig ist, um den gewünschten pH-Wert zu halten.

Diese Lösung oder Suspension ist auch eine hilfreiche, stabile Form des biotinylierten Biomoleküls und wird als solche als Teil der vorliegenden Erfindung angesehen. Wenn Sterilität benötigt wird, kann die Lösung aseptisch hergestellt werden. Das Endsterilisations-Schutzmittel liegt in der wässrigen Lösung typischerweise in einer Menge von etwa 0,01 bis etwa 10 % vor.

Diese Bereiche sind besonders für Zusammensetzungen, die 0,1 bis etwa 1,0 mg Enzym oder Biomolekül pro ml der Zusammensetzung enthalten, nützlich und stellen außerdem einen signifikanten Schutz für Zusammensetzungen, die bis zu 5 mg Enzym pro ml der Zusammensetzung enthalten, bereit. Vorzugsweise sollten für Zusammensetzungen, die mehr als 1 mg/ml Enzym enthalten und besonders für Zusammensetzungen, die mehr als 5 mg/ml enthalten, die Prozentsätze jedes Bestandteils in einer Weise erhöht werden, die grob proportional ist zum Anstieg der Enzymkonzentration.

Eine bevorzugte erfindungsgemäße wässrige Zusammensetzung umfasst etwa 2 % Biomolekül-Schutzmittel, etwa 2 % Füllmittel, etwa 50 mM Puffer, etwa 0,25 % Endsterilisations-Schutzmittel und die benötigte Konzentration (vorzugsweise 0,1 bis 0,5 mg/ml) an Biomolekül.

Am meisten bevorzugt wird wenn das Biomolekül Batroxobin in einer Menge von etwa 50 bis 200 Aktivitätseinheiten pro ml Lösung ist und wenn die Zusammensetzung 2 Gew-% Glycerin, 50 mM Natriumphosphatpuffer (um einen pH-Wert von 7 zu halten), 2 Gew.-% Dextran und 0,25 Gew.-% Natriumascorbat enthält.

In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die wässrige Lösung lyophilisiert, um eine praktische Pulverzusammensetzung, typischerweise in Form eines Kuchens, bereitzustellen. Lyophilisierungstechniken sind wohlbekannt und jede geeignete Technik kann angewendet werden. Eine geeignete Lyophilisierung, d.h. ein Gefriertocknungsprozeß, umfasst die Vorkühlung des Lyophilisierungsgerätes auf –45°C, Frieren der Lösung auf –40°C, Erwärmung des Produktes auf –25°C und Halten dieser Temperatur für 11 Stunden oder mehr, Kühlen des Produktes auf –43°C, Reduzierung des Druckes (d.h. Vakuum) auf etwa 0,1 mbar und Halten des verringerten Druckes bei –43°C, bis die Trocknung vollständig ist, was durch das Nachlassen der Wasserdampfentwicklung angezeigt wird, Reduzieren des Druckes auf den niedrigsten Wert und gleichzeitige Erhöhung der Temperatur in Einheiten von 5°C/Stunde auf 30°C und Bewahren des so behandelten Produktes bei 30 °C für mindestens 5 Stunden.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die eine biotinylierte Form von Thrombin oder einem thrombinähnlichen Enzym, z.B. Batroxobin, einschließen, sind verwendbar, um Fibrinogen oder eine Fibrin enthaltende Zusammensetzung in ein Fibrinmonomer oder eine Fibrinmonomer enthaltende Zusammensetzung umzuwandeln. Demnach schließt die vorliegende Erfindung außerdem ein neuartiges Verfahren zum Herstellen eines Fibrinmonomers ein, das z.B. bei der Herstellung eines Fibrin-Dichtungsmittels verwendbar ist. Dieses neuartige Verfahren umfasst die Zugabe einer Fibrinogenquelle zu einer stabilen, biotinylierten Thrombinzusammensetzung oder thrombinähnlichen Enzymzusammensetzung, wie hier definiert, um Fibrinogen in Fibrinmonomer umzuwandeln, „Einfangen" des biotinylierten Enzyms mit einem Avidinmaterial und Entfernen des Enzyms, das ein Teil des so gebildeten Biotin/Avidin Komplexes ist.

Obwohl in einem idealen Aufbau ein Teil des Avidins aus seinem Agarose- (oder anderem inerten) Träger aussickern sollte und hoffentlich das gesamte biotinylierte Biomolekül vom Avidin- oder inerten Hilfsmaterial eingefangen wird, wird angenommen, dass dies nicht immer der Fall sein könnte. Es wurde nun gefunden, dass freies Avidin, das aus seinem inerten Träger ausgesickert ist, dazu fähig ist, mit einem biotinylierten Biomolekül (z.B. Batroxobin) zu koppeln oder umgekehrt, was das Einfangen und Entfernen des Enzymkomplexes aus der Lösung erlaubt. Entsprechend wird die Zuverlässigkeit der vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren weiter verstärkt durch das hier beschriebene Selbst-fang-medium.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können außerdem in eine Überarbeitungseinheit, z.B. eine automatische Zentrifuge zur Herstellung von Fibrinmonomer, wie vorstehend definiert, eingeschlossen werden. Die biotinylierte Biomolekülzusammensetzung kann in die Überarbeitungseinheit in Pulverform voreingebracht werden oder kann in situ in der Apparatur oder in einem kontrollierten Entlassungsabschnitt der Apparatur lyophilisiert werden.

Die Biotinylierung des Biomoleküls kann, wie vorstehend diskutiert, durch jedes bekannte Biotinylierungsverfahren erreicht werden. Es wurde gefunden, dass die vorsichtige Steuerung des Biotin zu Biomolekül-Verhältnisses wichtig ist für die letztendlich gewünschte Leistung des Biomoleküls. Zum Beispiel ist es im Fall von biotinyliertem Batroxobin zur Verwendung im Verlauf der Herstellung eines Fibrinmonomers in EP 592242 wichtig, genügend Aktivität des Batroxobins zu erhalten, um so Fibrinogen effizient in Fibrinmonomer umzuwandeln. Es ist auch wichtig, dass das biotinylierte Batroxobin für die gründliche Trennung des Enzyms von dem Fibrinmonomer-Produkt ohne weiteres von dem Avidin-Material eingefangen werden kann. Im Falle von Batroxobin können theoretisch 14 Biotinmoleküle an das Enzym gekoppelt sein. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass die mittlere Anzahl von Biotinmolekülen pro Batroxobinmolekül in einer Zusammensetzung im Bereich von 5-12, vorzugsweise 6-8, liegen sollte. Es wird angenommen, dass, wenn das Mittel unter etwa 5 liegt, eine signifikante Anzahl von Batroxobinmolekülen tatsächlich nicht biotinyliert werden kann, was in einem unvollständigen Enzymfang resultieren würde. Es wurde außerdem gefunden, dass die Batroxobinaktivität reduziert ist, wenn das Mittel über etwa 8 liegt. Es wird angenommen, dass dies auch auf andere Biomoleküle anwendbar ist, besonders auf Thrombin und thrombinähnliche Enzyme. Entsprechend sollten Zusammensetzungen, die Biomoleküle enthalten, die 10 oder mehr Bindungsstellen pro Biomolekül aufweisen, die in der Lage sind, mit einem Biotinylierungreagens zu reagieren, eine mittlere Anzahl von mindestens 5, vorzugweise 6 Biotinmolekülen/Biomolekül aufweisen. Fachleuten sollte klar sein, dass diese bevorzugten Bereiche von Biotinmolekülen pro Biomolekül verringert werden können, wenn irgendwelche Oberflächen-Reaktionsstellen auf dem Biomolekül hyperaktiv sind oder wenn das Biotinylierungsverfahren den physikalischen Schutz eines Teils der Biomolekül-Oberfläche (vor biotinylierenden Agentien) z.B. durch reversible Bindung des Biomoleküls an eine feste Oberfläche einschließt.

Die erfindungsgemäßen biotinylierten Biomolekülzusammensetzungen sind stabile Zusammensetzungen, die der Lyophilisierung und Endsterilisation standhalten können, während ein bemerkenswerter Anteil der Biomolekülintegrität und die hervorragende Aufnahme durch Avidinmoleküle erhalten bleibt. Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher beschrieben, soll allerdings nicht durch die darin beschriebenen Details eingeschränkt sein.

Referenzbeispiel 1

Zu einer Lösung von Batroxobin (10,75 mg; 3560 Einheiten) in 0,2 M Natriumbicarbonatpuffer, pH 8,5 (1,6 ml) wurde Wasser (1,6 ml) zugegeben, gefolgt von 0,08 ml einer Lösung, umfassend N-Hydroxysuccinimidobiotin (13,5 mg) in DMSO (1 ml). Die Mischung wurde für 1 Stunde bei 20 °C gerührt und dann direkt auf eine Säule (1 cm Durchm. × 40 cm) aus Sephadex G-25-Chromatographiemedium gegeben, die zuvor in einer Lösung, umfassend 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, und Glycin (1 % Gew./Vol.) äquilibriert worden war. Das Biotin-Batroxobin wurde mit einer Flußrate von 0,4 ml/min von der Säule eluiert. Der erste UV Absorptionspeak, der von der Säule eluiert wurde, enthielt gereinigtes Biotin-Batroxobin, das als frei von jeglichem Biotinylierungsreagens und assoziierten Abbauprodukten bestimmt wurde. Diese waren im zweiten UV-Absorptionspeak, der von der Säule eluiert wurde, enthalten. Das gereinigte Biotin-Batroxobin enthielt 6,9 Mol Biotin pro Mol Batroxobin. Wenn das gereinigte biotinylierte Batroxobin für 5 Minuten bei 20°C mit einer Suspension von Avidin-Agarosegel in 0,2 M Natriumacetatpuffer, pH 4,0, gemischt wurde, wurden > 99,5 % des gereinigten biotinylierten Batroxobins gefangen.

Beispiel 2

Gereinigtes Biotin-Batroxobin, das hergestellt wurde, wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben, wurde verdünnt mit einer Lösung, umfassend 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, und Glycin (1 % Gew./Vol.), um eine Lösung von Biotin-Batroxobin bereitzustellen, die 235 Batroxobin-Aktivitätseinheiten pro Milliliter enthielt. Ein Volumen dieser Lösung wurde gemischt mit einem Volumen einer Lösung, umfassend: Glycin (3 % Gew./Vol.), Dextran (4% Gew./Vol.), Ascorbinsäure (0,5 % Gew./Vol.) und Natriumdihydrogenorthophosphat (90 mM), eingestellt auf pH 7,0 durch Zugabe von Natriumhydroxid. Das auf diese Weise formulierte Biotin-Batroxobin zeigte keinen Verlust der Enzymaktivität, wenn es für 1 Monat bei –20°C, 4°C und 20°C aufbewahrt wurde.

Beispiel 3

Formuliertes Biotin-Batroxobin, das wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt wurde, wurde in Glasreaktionsgefäße gefüllt (0,3 ml pro Reaktionsgefäß) und in eine Lyophilisierungsapparatur gestellt. Das formulierte Biotin-Batroxobin wurde auf –40°C gekühlt, dann auf –25°C erwärmt und für 11 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Am Ende dieser Periode wurde das formulierte Biotin-Batroxobin auf –43°C gekühlt und der Druck wurde auf 0,1 Millibar verringert. Diese Bedingungen wurden über die erste Trocknungsphase, die nach 22 Stunden beendet war, gehalten. Bei Beendung der ersten Trocknung wurde der Druck auf 0.08 Millibar verringert und das gefriergetrocknete Biotin-Batroxobin wurde schrittweise um 5°C pro Stunde auf 30°C erwärmt. Das gefriergetrocknete Biotin-Batroxobin wurde vor Entfernung aus der Lyophilisierungsapparatur für 5 Stunden bei 30°C gehalten.

Die Untersuchung des gefriergetrockneten Biotin-Batroxobins zeigte, dass kein Verlust der Batroxobinaktivität während des Gefriertrocknungsverfahrens auftrat. Auf diese Weise hergestellte gefriergetrocknete Formulierungen von Biotin-Batroxobin zeigten keinen Verlust der Batroxobinaktivität nach Aufbewahrung bei 4°C für 3 Monate. Wenn das gefriergetrocknete Biotin-Batroxobin mit Wasser rekonstituiert wurde und für 5 Minuten bei 20°C mit einer Suspension von Avidin-Agarosegel in 0,2 M Natriumacetatpuffer, pH 4,0, gemischt wurde, wurden > 99,5 des biotinylierten Batroxobins eingefangen.

Beispiel 4

Gefriergetrocknetes Biotin-Batroxobin, das, wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt wurde, wurde einer sterilisierenden Dosis (25 Kilogray) Gammabestrahlung unterworfen. Nach einem anfänglichen Verlust von Batroxobinaktivität, der 10 – 15 % der vorhandenen Ausgangsaktivität entsprach, wurde über einen Zeitraum von 1 Monat kein weiterer Verlust an Batroxobinaktivität beobachtet. Nach elektrophoretischer Analyse mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese war keine Degradation des bestrahlten Biotin-Batroxobins erkennbar. Wenn das gammabestrahlte gefriergetrocknete Biotin-Batroxobin mit Wasser rekonstituiert wurde und für 5 Minuten bei 20°C mit einer Suspension von Avidin-Agarosegel in 0,2 M Natriumacetatpuffer, pH 4,0, gemischt wurde, wurden > 99,5 % des biotinylierten Batroxobins eingefangen.

Tabelle 1 gibt weitere Beispiele für formulierte Biotin-Batroxobin Zusammensetzungen, die mit den Verfahren in Referenzbeispiel 1 und Beispiel 2 hergestellt werden können, außer dass der Säulenäquilibrierungspuffer in Referenzbeispiel 1 und der Formulierungspuffer in Beispiel 2 angepasst sind, um die entsprechende Menge an Dextran, Glycin und Ascorbinsäure in der final formulierten Biotin-Batroxobin Lösung, wie in Spalte II, III und IV von Tabelle 1 genannt, bereitzustellen. Diese formulierten Lösungen von Biotin-Batroxobin wurden gemäß dem Verfahren in Beispiel 3 gefriergetrocknet und gemäß dem Verfahren in Beispiel 3 einer Gammabestrahlung unterworfen. Der Prozentsatz verbleibender Batroxobinaktivität nach Gammabestrahlung ist in Spalte V von Tabelle 1 gegeben. Die Nummer des erfindungsgemäßen Beispiels ist in Spalte I von Tabelle 1 gegeben.

Tabelle I

Anspruch[de]
  1. Stabile Zusammensetzung für ein biotinyliertes Biomolekül, dadurch gekennzeichnet, dass sie umfasst:

    das biotinylierte Molekül in einer Konzentration, die gemäß einer bestimmten Anwendung ausgewählt ist,

    0,01 bis 50 Gew.-% eines Biomolekül-Schutzmittels, das fähig ist, die gewünschte Aktivität des Biomoleküls im wesentlichen aufrechtzuerhalten und ausgewählt ist aus Trehalose, Glycerin, Ammoniumsulfat und einer Aminosäure, die ein Zwitterion ist, nämlich Glycin, Alanin oder Valin,

    Puffermittel, um den pH-Wert der Zusammensetzung auf einem gewünschten Wert zu halten,

    1 bis 50 Gew.-% von einem oder mehreren wasserlöslichen Füllmittel(n) und

    Endsterilisations-Schutzmittel ausgewählt aus Antioxidantien, Radikalfängern und Reduktionsmitteln zum Schutz der Zusammensetzung und des Biomoleküls vor Abbau oder Instabilität während der Endsterilisation.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das biotinylierte Biomolekül ein Enzym oder Protein ist, das an Biotin oder ein Analogon oder eine Derivatform davon gekoppelt ist.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Thrombin oder ein thrombinähnliches Enzym ist, ausgewählt aus Akutin, dem Schlangengiftenzym Venzyme, Ancrod, Asperase, Batroxobin (aus B. Altrox, B. Moojeni oder B. Maranhao), Botropase, Crotolase, Flavoxogin und Gabonase.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das biotinylierte Biomolekül Biotin-Batroxobin ist.
  5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Puffermittel einen Wirkstoff umfasst, der den pH-Wert der Zusammensetzung bei etwa 7 halten kann.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Puffermittel ausgewählt ist aus Natriumphosphat-, Barbital-Natrium-, Citrat-, Barbital-Natriumphosphat-, Kaliumphosphat-, Imidazol-HCl-, Piperazin-, Natriumbicarbonat-5% CO2-, Triethanol amin-HCl-NaOH-, Tris(hydroxymethyl)-aminomethan- und Natriumphosphatpuffer sind nützlich, wobei Natriumphosphat bevorzugt ist.
  7. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Antioxidantien ausgewählt sind aus reduziertem Glutathion, Alpha-Tocopherol, N-N-Dimethyl-p-phenylendiamin und Natriumascorbat.
  8. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Füllmittel ein nichtionisches wasserlösliches Polymer ist.
  9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ausgewählt ist aus Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyethylenglycol und Polysacchariden.
  10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Polysaccharide ausgewählt sind aus Dextran, hydrolysierter Stärke, Lactose, Glucose, Maltose und Mannit.
  11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Dextran ein Molekulargewicht zwischen etwa 50.000 und 100.000 Dalton aufweist.
  12. Zusammensetzung nach Anspruch 1 in Form einer wässrigen Lösung.
  13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das biotinylierte Biomolekül in einer Menge von etwa 50 bis etwa 200 Aktivitätseinheiten pro ml Lösung vorliegt.
  14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das biotinylierte Biomolekül in einer Menge von etwa 100 bis etwa 135 Aktivitätseinheiten pro ml Lösung vorliegt.
  15. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie zwischen etwa 0,01 bis etwa 10,0 Gew.-% eines Endsterilisations-Schutzmittels umfasst.
  16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Endsterilisations-Schutzmittel in einer Menge von etwa 0,25 Gew.-% vorliegt.
  17. Zusammensetzungen nach Anspruch 1 und Anspruch 12 in Form eines Trockenpulvers.
  18. Verfahren zur Endsterilisation eines biotinylierten Biomoleküls, das für die Sterilität der Zusammensetzung sorgt, während ihre Stabilität und Biomolekül-Aktivität erhalten bleibt, wobei das Verfahren die Endsterilisierung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1 umfasst.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das biotinylierte Biomolekül in Form eines Trockenpulvers vorliegt.
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