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Dokumentenidentifikation DE69635589T2 21.09.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001021720
Titel ELEKTROCHEMISCHE BESTIMMUNG VON FRUCTOSAMIN
Anmelder LXN Corp., San Diego, Calif., US
Erfinder BURD, F., John, San Diego, US;
NEYER, Gebhard, Los Angeles, US
Vertreter Uexküll & Stolberg, 22607 Hamburg
DE-Aktenzeichen 69635589
Vertragsstaaten BE, DE, DK, ES, FR, GB, IT, NL, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 16.10.1996
EP-Aktenzeichen 969364793
WO-Anmeldetag 16.10.1996
PCT-Aktenzeichen PCT/US96/16451
WO-Veröffentlichungsnummer 1997014965
WO-Veröffentlichungsdatum 24.04.1997
EP-Offenlegungsdatum 26.07.2000
EP date of grant 14.12.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 21.09.2006
IPC-Hauptklasse G01N 33/553(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12Q 1/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft ein Assaysystem zur Bestimmung des glykämischen Zustands eines Diabetikers. Genauer betrifft sie das elektrochemische Messen der Fructosamin-Konzentration in einer Körperfluid-Probe des Patienten.

ANGABEN ZUM HINTERGRUND

Personen, die unter Diabetes Mellitus leiden, haben einen abnormal hohen Blutzuckerspiegel, da die Bauchspeicheldrüse keine ausreichenden Mengen des aktiven Hormons Insulin in den Blutstrom sekretiert, um den Kohlenhydrat-Stoffwechsel zu regulieren. Wenn man einen abnormal hohen Blutzuckerspiegel, der als hyperglykämischer Zustand bekannt ist, für längere Zeiträume andauern lässt, wird die Person unter den chronischen Komplikationen von Diabetes, einschließlich Retinopathie, Nephropathie, Neuropathie und cardiovaskulärer Erkrankung leiden. Studien zeigen, dass diabetische Patienten, die in der Lage sind, sich nahe der normalen glykämischen Kontrolle zu halten, die Wahrscheinlichkeit dieser furchtbaren Komplikationen stark reduzieren. Somit wurden verschiedene Tests entwickelt, um den glykämischen Zustand zu messen und zu überwachen.

Ein häufiger medizinischer Test, um den glykämischen Zustand zu überwachen, ist das direkte Messen des Blutglucosespiegels durch Diabetiker. Da Blutglucosespiegel über einen Tag hinweg signifikant fluktuieren, beeinflusst durch Nahrung, Aktivität und Behandlung, abhängig von der Natur und Schwere des individuellen Falls, messen manche Patienten ihre Blutglucosespiegel bis zu sieben Mal pro Tag. Basierend auf dem beobachteten Muster der gemessenen Glucosespiegel, passen der Patient und der Arzt zusammen die Nahrung, körperliche Bewegung und Insulin-Einnahme an, um mit der Erkrankung besser zurechtzukommen. Natürlich sollte diese Information dem Patienten sofort zur Verfügung stehen.

Wegen der häufigen Fluktuation der Glucosespiegel an einem gegebenen Tag wurden jedoch auch Tests entwickelt, die unabhängig von der Diät, der Aktivität und/oder der Behandlung des Patienten sind und längerfristige Anzeigen der Blutglucosespiegel bereitstellen. Diese Tests schließen die Bestimmung von an Proteine gebundener Glucose ein.

Proteine, wie diejenigen, die im Vollblut, im Serum oder anderen biologischen Flüssigkeiten vorhanden sind, reagieren mit Glucose unter nicht-enzymatischen Bedingungen, um glycosylierte Proteine, auch als Fructosamin bekannt, zu bilden. Das Ausmaß der Reaktion hängt direkt von der Glucose-Konzentration des Blutes ab. Folglich haben Diabetiker gewöhnlich eine erhöhte Fructosamin-Konzentration im Vergleich zu einer gesunden Person. Somit wurde die Konzentration der glycosylierten Serum-Proteine als Indikator eines hyperglykämischen Zustands verwendet. Insbesondere ist die Messung der Fructosaminspiegel nützlich, um diabetische Kontrolle zu überwachen, da die Fructosamin-Konzentration einen Durchschnitt der Serum-Glucosespiegel über einen Zeitraum, ungefähr über einen Zeitraum von einem halben Monat, widerspiegelt.

Fructosamine werden wie folgt gebildet. Die Blutproteine, wie zum Beispiel Serumalbumine, werden in vivo durch eine nicht-enzymatische Kondensationsreaktion zwischen Glucose und verfügbaren Aminogruppen von Blutproteinen, in erster Linie den &egr;-Aminogruppen von Lysin-Resten und den &agr;-Aminogruppen der terminalen Aminosäure der Proteine, glycosyliert. Die Glucose bindet an die Aminogruppe des Proteins, um eine Schiff'sche Base, das heißt, ein Glycosylamin oder Aldimin, zu bilden. Das Glycosylamin vollzieht eine molekulare Umlagerung, speziell eine Amadori-Umlagerung, um ein stabiles Ketoamin, als "Fructosamin" bezeichnet, zu bilden. Diese Reaktionssequenz ist in 1a dargestellt. Sobald sie gebildet ist, verbleibt die stabile Ketoamin-Struktur beim Protein während seiner gesamten Lebensdauer.

Eine besonders nützliche Eigenschaft von Fructosamin ist, dass es unter basischen Bedingungen im Gleichgewicht mit seinem Eneaminol-Tautomer, auch als Fructosamin-Eneaminol-Tautomer, steht. Diese Gleichgewichtsumwandlung ist in 1b ausgeführt. Das Eneaminol-Tautomer ist ein reduzierendes Agens. Siehe zum Bespiel Burd et al. U.S.-Patent Nr. 5,470,752, 28. November 1995 und Ismail, U.S.-Patent Nr. 4,956,301, 11. September 1990. Es sind die reduzierenden Eigenschaften von Fructosamin und dessen Tautomer, das sich selbst für einen Aspekt der vorliegenden Erfindung und die elektrochemische Bestimmung von Fructosamin eignet. Die Oxidation des Eneaminol-Tautomers ergibt Glucoson und deglycosyliertes Protein, wie es weiter ausgeführt ist in 1c.

Verschiedene Methoden zur Bestimmung von Fructosamin durch andere Mittel als die elektrochemische Bestimmung sind bereits bekannt. Zum Beispiel offenbart Baker in U.S.-Patent Nr. 4,642,295 und 4,645,742 Methoden zur Bestimmung von Fructosaminspiegeln in einem Lösungsassay. Diese Arten von Assays haben verschiedene praktische Limitierungen, wie zum Beispiel die Unannehmlichkeiten, die mit Lösungsassays einhergehen und der Bedarf an relativ großen Volumina einer flüssigen Probe. Solche Methoden sind an die Chemie der trockenen Phase angepasst worden, zum Beispiel durch Ismail, wie im U.S.-Patent Nr. 4,956,301 offenbart. Jedoch ist Ismails Trockenphasenassay eine Teststreifen-Vorrichtung, die die Verwendung eines Reaktionsbeschleunigers erfordert. Die offenbarten Beschleuniger-Verbindungen sind nicht in der Lage, mit bestimmten Reagenzien, die in Fructosamin-Assays besonders nützlich sind, nämlich Nitro blau Tetrazoliumchlorid (NBT) und Carbonat-Puffer, verwendet zu werden. Mehrlagige Testvorrichtungen zur Bestimmung der Fructosamin-Konzentration sind im Stand der Technik auch bekannt. Zum Beispiel beschreibt Sakamoto in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung mit der Publikationsnummer 0 473 189 ein mehrlagiges analytisches Element zur Bestimmung von Fructosamin. Staniford et al. diskutiert in der europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 526,150 eine enzymatische Methode, die eine Vorbehandlung einer Fructosamin-enthaltenden Probe mit einer Protease umfasst, mit anschließender Reaktion der Probe mit Ketoamin-Oxidase und colorimetrischer Messung der Ergebnisse. Modrovich et al. bestimmt in der europäischen Patentanmeldung Nr. 573,942 Fructosamin colorimetrisch mit einem Tetrazoliumsalz unter Verwendung einer Subtraktionsmethode, die eine zusätzliche Reaktion unterhält, bei der die Probe mit Borsäure behandelt wurde, um die Oxidation von Fructosamin zu blockieren.

Hill et al., U.S.-Patent Nr. 4,820,636, beschreibt die elektrochemische Bestimmung einer Fructosamin-ähnlichen Verbindung, glycosyliertes Hämoglobin (HbA1c), unter Verwendung Glucose Oxidase und einer Metallocen-Boronsäure als Mediator. Wenn HbA1c vorhanden ist, reagiert es mit Metallocen-Boronsäure, um die Reaktion zwischen diesem Metallocen-Mediator und reduzierter Glucose Oxidase zu verhindern. Ishikawa et al., U.S.-Patent Nr. 5,387,109 und europäische Patentanmeldung Nr. 576 838, beschreibt im Großen und Ganzen die colorimetrische Bestimmung von Fructosamine unter Verwendung des Enzyms Fructosylamin-Deglycase. Ishikawa et al. erwähnt kurz die Detektion der H2O2/O2-Reaktionprodukte der Enzym-katalysierten Reaktion mit spezialisierten H2O2-beziehungsweise O2-Elektroden, aber es ist viel ungewöhnlicher, solche Elektroden zu verwenden, als die vorliegenden Biosensoren, die Fructosamin, Enzyme und Mediatoren detektieren.

Davis et al., U.S.-Patent Nr. 4,758,323, beschreibt ein Multi-Enzymsystem zum Nachweis eines Enzyms oder seines spezifischen Substrats, das einen Co-Faktor umfasst, der den Enzym (E1)/Mediator-Teil des Systems mit dem Enzym (E2)/Substrat-Teil desselben Systems verbindet.

Die meisten der oben diskutierten Methoden setzen colorimetrische Methoden des Nachweises ein. Bei der colorimetrischen Bestimmung gibt es häufig eine Interferenz durch die natürliche Farbe der Probe oder des Präzipitats. Zum Beispiel können die roten Blutzellen aus der Blutprobe des Patienten mit der colorimetrischen Bestimmung interferieren. Darüber hinaus ist das Volumen der Probe, das häufig bei den oben beschriebenen Assays für eine vernünftige Bestimmung häufig benötigt wird, typischerweise eine signifikante Menge. Es besteht ein Bedarf für ein Fructosamin-Assay, der keine Interferenz durch Farbe oder Präzipitat hat und der mit relativ kleinen Probenvolumina verwendet werden kann. Darüber hinaus besteht ein Bedarf an einem schnellen und praktischen Assay zum Messen von Fructosamin in vielen Arten von Körperflüssigkeitsproben. Schließlich ist es wünschenswert, einen Assay zur Verfügung zu haben, der mit relativ einfacher Instrumentierung auskommt und der vorzugsweise miniaturisiert werden kann. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf und stellt ebenso entsprechende Vorteile bereit.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Methode zur elektrochemischen Bestimmung der Konzentration eines Fructosamins in einer Körperfluid-Probe eines Patienten. Das wird sichergestellt durch Kontaktieren der Körperfluid-Probe mit einem Pufferungsmittel und einem Biosensor, wobei der Biosensor eine Anode und eine Kathode umfasst. Eine Spannung wird an der Anode angelegt, und der elektrische Strom, der zwischen der Anode und der Kathode fließt, wird gemessen. Die gemessene Strommenge wird mit einer Standardkurve von Strom gegen Fructosamin-Konzentration, wie für das Körperfluid bestimmt, verglichen. Das Pufferungsmittel stellt den pH-Wert der Körperfluid-Probe zwischen etwa 10 und etwa 12,5 ein. Das Pufferungsmittel kann sich auf dem Biosensor befinden oder anderweitig der Probe zugegeben werden, bevor der Strom gemessen wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1a stellt diagrammartig die Kondensation eines Proteins und Glucose zur Bildung eines Glycosylamins und die anschließende Amadori-Umlagerung zu einem Fructosamin dar.

1b stellt diagrammartig das alkalische Gleichgewicht zwischen einem Fructosamin und dessen Eneaminol-Tautomer dar.

1c stellt diagrammartig einen Typ einer Oxidationsreaktion eines Fructosamins oder Eneaminols dar, resultierend in Glucoson und einem freien Protein.

2 stellt schematisch die Oxidation von Fructosamin ("F") oder des Eneaminol-Tautomers an der Anode dar (schattierter Bereich).

3 stellt die Ergebnisse, die unten in Beispiel I erhalten werden, dar. Die drei Datenpunkte sind für die 0,5, 1,0 und 1,5 mM Lösungen von glycosyliertem humanem Serumalbumin, das als "Fructosamin" an der Abszisse der graphischen Darstellung bezeichnet wird.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung schließt die Bestimmung des Glucosespiegels in Säugerblut durch elektrochemisches Messen der Menge an Fructosamin (auch "Ketosamine") (1a) oder dessen Tautomer bei hohem Alkaligehalt, ein "Eneaminol" (1b) genannt, das in der Patientenprobe vorliegt, ein. Die Erfindung bietet gemäß einem Aspekt die Bequemlichkeit des direkten Messens, bei alkalischem pH-Wert, der Konzentration des vorhandenen Eneaminols.

Genauer ist die elektrochemische Technik, die bei der vorliegenden bioanalytischen Erfindung verwendet wird, als Amperometrie bekannt. Diese Technik schließt das Messen des bei einer fixierten Spannung durchgeführten Stroms ein. Die Spannung ist im vorliegenden Fall durch die Oxidationsspannung von Fructosamin und dessen Eneaminol-Tautomer, die starke Reduktionsmittel sind, fixiert.

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt die direkte elektrochemische Bestimmung von Fructosamin und genauer von dessen alkalischer Eneaminol-Tautomer-Form ein (2). Somit wird die Körperfluid-Probe mit einem festen Pufferungsmittel (auf der Oberfläche des Biosensors) oder einer Pufferlösung (zugegeben zu der Körperfluid-Probe) in Kontakt gebracht, um den pH-Wert der resultierenden Lösung auf von etwa 10 bis etwa 12,5 und vorzugsweise etwa 10,3 bis etwa 11,5 zu bringen. Das verwendete Pufferungsmittel sollte keine oxidierbaren Gruppen enthalten. Geeignete Pufferungsmittel schließen CAPS (3-(Cyclohexylamin)-1-Propanschwefelsäure, Sigma Chemical, St. Louis, Missouri); Natriumhydrogenphosphat/Natriumhydroxid; Guanidiniumsalze wie zum Beispiel Guanidiniumcarbonat und Guanidiniumphosphat; Kaliumchlorid/Natriumhydroxid; Kaliumhydrogenphosphat; methanolisches Natriumhydroxid; Tetramethylammoniumhydroxid; Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat; bestimmte Aminosäuren; und andere geeignete Puffer, wie sie im Stand der Technik gut bekannt sind; oder eine Kombination davon, ein. Das Pufferungsmittel kann auf einem porösen Sieb, das die Anode umgibt (und jegliche Siebe, die andere Elektroden umgeben) getrocknet werden, um zu erreichen, dass das Agens bei Kontakt in die Körperfluid-Probe hinein aufgelöst werden kann.

Eine Variation der direkten Detektion von Fructosamin bringt es mit sich, eine Kontrollzelle zu betreiben, wobei die Elektroreaktivität des Fructosamins in der Körperfluid-Probe durch Verwendung Borsäure oder einem oder mehreren Boronsäure-Derivaten, wie unten diskutiert, blockiert wird.

Körperfluide enthalten oftmals Substanzen, die bei ähnlichem pH-Wert und Spannung wie Fructosamin oxidiert werden können. Solche Substanzen schließen Harnsäure und Ascorbinsäure ein. In der Situation, in der eine solche Interferenz auftritt, kann eine zusätzliche Oxidation an einem Teil der Körperfluid-Probe unter Verwendung von Fructosamin-bindenden Agenzien, die im Stand der Technik bekannt sind, durchgeführt werden, um die Oxidation von Fructosamin zu blockieren. Zum Beispiel kann Borsäure zu einem Teil der Probe selbst in Verbindung mit der Verwendung eines porösen Siebs auf einem Biosensor zugegeben werden. In einer identischen Anode-Halbzelle wird der durchgeleitete Strom in derselben Weise wie der unbehandelte Anolyt oder die unbehandelte Probe gemessen. Der Stromwert aus den behandelten Anolyten oder der behandelten Probe wird von dem Stromwert der Unbehandelten subtrahiert, um die Konzentration von Fructosamin zu bestimmen. Die Genauigkeit dieser Methode wird sichergestellt, indem das Fructosamin, das in Vollblut und vergleichbaren Körperfluiden normalerweise vorliegt, in der größten Konzentration irgendeiner Boronsäure oder Borsäure-bindenden Verbindungen vorliegt, die der Reduktion bei einem pH-Wert von 10 bis 12,5 unterliegen. Die Verwendung von Borsäure in nicht-elektrochemischer Analyse ist in I.E. Modrovich, europäische Patentanmeldung Publikationsnummer 573,942, veröffentlicht am 15. Dezember 1993, beschrieben. Alternativ können Metallocen-Boronsäuren oder andere Boronsäure-Derivate, wie in Hill et.al., U.S.-Patent Nr. 4,820,636, erteilt am 11. April 1989, diskutiert, in derselben Weise wie Borsäure, um eine geeignete Kontrollmethode bereitzustellen.

Alternativ können Fructosamin-bindende Agenzien Antikörper gegen Epitope von Fructosamin sein, was die Genauigkeit der vorliegenden Erfindung erhöhen kann. Solche Antikörper sind in U.S.-Patent Nr. 4,478,744 für Mezer, U.S.-Patent Nr. 4,806,468 für Wagner et al., U.S.-Patent Nr. 5,183,739 für Cohen und U.S.-Patent Nr. 5,206,144 für Zeuthen et al. exemplifiziert.

Die Konzentration von Fructosamin oder des Eneaminol-Tautomers kann indirekt gemessen werden, sozusagen durch Messen der Konzentration einer Substanz, die Elektronen von Fructosamin oder dem Eneaminol annimmt, was dann an der Anode oxidiert wird. Diese Substanzen können, neben anderen Vorteilen, eine Reduktion der Spannung oder des pH-Werts des Assays bieten.

Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Vorrichtung kann eine konventionelle elektrochemische Zelle oder eine kleinere Form einer elektrochemischen Zelle, gewöhnlich als "Biosensor" bezeichnet, sein. Der Ausdruck "Biosensor" meint dasselbe wie der im Stand der Technik verwendete Ausdruck, mit anderen Worten sind wenigstens eine Anode und eine Kathode in einem isolierenden Träger enthalten, so dass so wenig wie ein Tropfen (das heißt nicht mehr als etwa 10 Mikroliter) an Patientenprobe mit sowohl der Anode und der Kathode in Kontakt treten. Der Unterschied zwischen einem Biosensor und einer konventionellen elektrochemischen Zelle ist hauptsächlich die physikalische Größe der Anode und Kathode, die Größe oder vollständige Abwesenheit eines Anolyten beziehungsweise Katholyten sowie die Menge der zu messenden Fluidprobe. Ungeachtet des verwendeten Vorrichtungstyps müssen die Elektroden sowohl an eine elektrische Stromversorgung als auch eine Vorrichtung zur Messung sowohl der angelegten Spannung zwischen den Elektroden als auch des aus der Oxidation von Fructosamin und dessen Tautomer an der Anode erzeugten Strommenge verbunden sein. Da es die Oxidation von Fructosamin oder dem Tautomer ist, die direkt oder indirekt gemessen wird, ist die Anode die Arbeitselektrode für die vorliegende Erfindung. Eine dritte Elektrode, auch als Referenzelektrode bezeichnet, kann optional verwendet werden, um den Fortschritt anderer Reaktionen an der Anode überwachen zu helfen.

Schließlich ist es eine weitere Option, eine vierte oder Hilfselektrode zu verwenden, die eine zweite Anode ist, die auf eine unterschiedliche, gewöhnlich niedrigere Spannung als die Arbeitselektrode eingestellt wird. Die Hilfselektrode kann verwendet werden, um interferierende Substanzen (wie zum Beispiel Harnsäure) zu oxydieren.

Diese Erfindung wird durch elektrochemische Zellen und Biosensoren ausgeführt, in denen die Zusammensetzung und Form der Elektroden und, soweit zutreffend, Elektrolysezellunterteilern und porösen Sieben, die die Elektroden umgeben, im Stand der elektrochemischen und biologischen Technik bekannt sind. Besonders nützliche Lehrbücher schließen Organic Electrochemistry, M.M. Baiser, Herausgeber, Marcel Dekker, Inc., New York (1973) und Biosensor Fundamentals and Applications, Turner, Karube and Wilson, Herausgeber, OUP (1987) ein. Zusätzlich können weitere Lehren über Zellen und Biosensoren, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, in McAleer et al., U.S.-Patent Nr. 5,264,106, erteilt am 23. November 1993; Green et al., U.S.-Patent Nr. 4,876,205, erteilt am 24. Oktober 1989; Higgins et al., U.S.-Patent Nr. 4,545,382, erteilt am 8. Oktober 1985; Foulds et al., U.S.-Patent Nr. 5,124,253, erteilt am 23. Juni 1992; Hill et al., U.S.-Patent Nr. 4,820,636, erteilt am 11. April 1989; Kuhn et al., U.S.-Patent Nr. 5,385,846, erteilt am 31. Januar 1995; und N.G. Carter et al., europäische Patentanmeldung Nr. 593,096, veröffentlicht am 20. April 1994, gefunden werden.

Anoden zur Verwendung in dieser Erfindung sind zum Beispiel aus Glaskohlenstoff (glassy carbon), Kunststoffpaste, Kohlefilz, Graphit, Graphitfilz, pyrolytischem Graphit, Quecksilber, Kupfer, Blei, Zink, Platin, Silber, Gold, Titan oder Cadmium oder ein kohlenstoffhaltiges Material, das mit einer katalytischen Schicht eines Übergangsmetalls beschichtet ist. Vorzugsweise ist die Anode aus einem Übergangsmetall gefertigt oder aus einer Form des Kohlenstoffs und bevorzugter aus Gold, Platin oder Glaskohlenstoff. Das Anodenmaterial sollte recht hoch gereinigt sein, wie es normalerweise in dieser Technik der Fall ist.

Die Kathode kann aus irgendeinem gereinigten Material gefertigt sein, das nicht von der reduktiven Seite der Fructosamin-Oxidation angegriffen wird. Kathoden für diese Erfindung sind gewöhnlich aus Edelmetallen gefertigt, besonders Platin, oder aus einem anderen gewöhnlich verwendeten Elektrodenmaterial, wie zum Beispiel Kohlenstoff. Eine Platinelektrode ist die bevorzugte Kathode.

Die Referenzelektrode, wenn sie verwendet wird, ist gewöhnlich eine bekannter Standardspannung. Solche eine Elektrode kann eine Quecksilber/Quecksilberchlorid(gesättigtes Kalomel oder SCE) oder Silber/Silberchlorid-Elektrode sein, wobei Letztere bevorzugt ist.

Die Formen der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Elektroden sind nicht kritisch; sie können gleich oder verschieden sein und können ein festes Blatt, ein Stab, ein Film, eine Gaze, ein Tuch, unlösliche oder poröse Mikropartikel oder ein Partikel-Fließbett sein, mit ebenso guten Resultaten.

Es ist am effektivsten, die Elektroden so zu arrangieren, dass der Abstand zwischen der Anode und der Kathode und den anderen Elektroden, soweit vorhanden, so klein wie möglich ist, ohne dass die Halbreaktionen, die an jeder Elektrode stattfinden mit der entsprechenden Halbreaktion an den anderen Elektroden interferieren. In einer Biosensor-Konfiguration ist es wünschenswert, die Anode und Kathode ohne zusätzliche Flüssigkeit einzuspannen, so dass die Verwendung von nur einem Tropfen oder zwei der Körperfluid-Probe (zum Beispiel Blut, Plasma, Serum, Speichel oder Urin) notwendig ist. Im Allgemeinen ist eine geringe physikalische Nähe wünschenswert, um den Stromfluss zu minimieren und den Temperaturanstieg zu minimieren, der durch den Widerstand der Körperfluid-Probe gegenüber dem Stromfluss verursacht wird.

Die Spannung zwischen der Kathode und der Anode kann auf verschiedene Weise kontrolliert werden. Die effektivste und präziseste Art, die Spannung zu kontrollieren ist durch Verwendung einer Referenzelektrode. Die gewünschte Spannung für den Prozess wird aus der Untersuchung eines Voltammogramms des Systems bestimmt, und die Spannung zwischen der Kathode und der Anode wird eingestellt, um die gewünschte konstante Spannung zwischen der Referenzelektrode und der Kathode zu ergeben. Diese Kontrollmethode ist sehr viel effektiver als die Kontrolle durch die Gesamtspannung zwischen der Kathode und der Anode, da diese Spannung vom Zustand der teilenden Membran, der Konzentration des Katholyten sowie der Konzentration der zu detektierenden Fructosaminverbindung abhängt. Die Stromänderungen können dann bei einer fest eingestellten Spannung vorzugsweise durch Messen des Strom-Zeit- (I-t) Transienten bei einer geeigneten Spannung gegen eine Kathode-Elektrode überwacht werden. Ein geeigneter Spannungsbereich ist von etwa 200 bis etwa 1100 Millivolt, wobei 1000 bis 1100 Millivolt bevorzugt sind, gegen eine Silber/Silberchlorid-Referenzkathode für die im Folgenden ausgeführten direkten Methoden, und von etwa 100 mV bis 1000 mV für die Hilfsmethoden.

Der elektrochemische Sensor zur Verwendung in dieser Erfindung kann ein solcher sein, der eine amperometrische Detektion einschließt, und er kann ein solcher sein, der ein Streifenelement einsetzt, insbesondere einen wegwerfbaren Trockenstreifen. Demgemäß können die Sensorelektroden Elektrodenbereiche umfassen, die zum Beispiel durch Siebdruck, Sprühen oder andere geeignete Ablagerungstechnik gebildet werden.

Der Trockenstreifensensor kann ein längliches, elektrisch isolierendes Substrat umfassen, das darauf ein Paar länglicher, im wesentlichen paralleler elektrisch leitender Spuren hat, wobei jede Spur an dem selben Ende mit Mitteln zur elektrischen Verbindung an ein Auslesegerät bereitgestellt wird und mit einer Anode und Kathode versehen ist und zusätzliche Elektroden vorliegen können, wie es hierin diskutiert ist.

Noch genauer ist ein solcher Sensor geeigneterweise in der Form eines Trägerstreifens aus einem elektrisch isolierendem Material, wie zum Beispiel einem synthetischen Polymer (zum Beispiel PVC) konfiguriert, das an einer Stelle zwischen seinen Enden die Elektroden unterstützt auf elektrisch leitenden gedruckten Spuren trägt. Zum Beispiel können die Elektroden die Form zweier rechteckiger Bereiche nebeneinander auf dem Streifen einnehmen. Solche Bereiche können als Zielbereiche konfiguriert sein, um mit einem einzelnen Tropfen einer Körperfluid-Probe bedeckt zu werden, um die Konzentration an Fructosamin zu testen. Wenn es gewünscht ist, können nicht-rechteckige Elektrodenbereiche, zum Beispiel rautenförmige, halbkreisförmige oder dreieckige Bereiche eingesetzt werden, um ein Zielbereich für optimierten Kontakt durch eine flüssige Probe zu bilden.

Ferner kann eine dritte Elektrode ähnlich der Anode-Elektrode auf dem Trägerstreifen vorhanden sein. Eine solche Hilfselektrode kann zu verlässlicheren Resultaten führen, indem, wenn eine geringere Spannung an der Hilfselektrode angelegt wird, der zwischen der letztgenannten Elektrode und der Kathode hindurch geleitete Strom von dem an der Anode durchgeleiteten Strom subtrahiert werden kann, wobei der dann resultierende Strom auf der Oxidation von Fructosamin beruht.

In einer typischen Herstellungsprozedur für einen Biosensor kann ein Kleber durch Siebdruck oder anderweitig um den Probenzielbereich auf jedem Biosensor-Streifen aufgebracht werden, gefolgt durch Plazieren und Kleben eines Papiers über diesen Bereich, das mit einem Mediator, Co-Faktor und/oder Enzym, soweit vorliegend, beschichtet ist. Ein poröses Schutzsieb, das mit einem Puffer beschichtet ist, kann über der Proben-Targetschicht positioniert werden und durch einen im allgemeinen auf das Testelement aufgebrachten Isolationsdruck am Ort gehalten werden, um sowohl das den Probenzielbereich und die terminalen Enden, die in ein Auslesegerät einzuführen sind, unbeschichtet zu lassen. Das Sieb kann Polymer sein, zum Beispiel Nylon oder Polyester. Der darauf imprägnierte Puffer ist oben diskutiert.

Das folgende Beispiel soll die Erfindung illustrieren aber nicht limitieren.

BEISPIEL I Direkte Bestimmung von Fructosamin

Glycosyliertes humanes Serumalbumin (gHSA) wurde in 1M Guanidincarbonat (pH 11, 5) aufgelöst, um 0, 5, 1, 0 und 1, 5 mM Lösungen zu ergeben. Die Spannung dieser Lösung wurde linear von –100 mV bis +1200 mV abgetastet, wobei an diesem Punkt die Richtung umgekehrt wurde, um auf –100 mV zurückzufahren. Eine 3mm Glaskohlenstoff-Arbeitselektrode zusammen mit einer Ag/AgCl Referenzelektrode und einer Platin-Hilfselektrode wurden verwendet. Die Oxidation des gHSA erfolgte bei +1040 mV, und der entsprechende Strom wurde gemessen, wie es mit der Dosis-Wirkungskurve in 3 dargestellt ist.


Anspruch[de]
  1. Verfahren zum elektrochemischen Bestimmen der Konzentration eines Fructosamins in einer Körperfluid-Probe eines Patienten, welches die Schritte umfasst:

    a) die Körperfluid-Probe mit einem Pufferungsmittel und einem Biosensor in Kontakt zu bringen, wobei der Biosensor eine Anode und eine Kathode umfasst;

    b) an die Anode eine Spannung anzulegen;

    c) den zwischen der Anode und der Kathode fließenden elektrischen Strom zu messen; und

    d) die gemessene Strommenge mit einer Standardkurve von Strom gegen Fructosamin-Konzentration, wie für das Körperfluid bestimmt, zu vergleichen;

    wobei das Pufferungsmittel den pH der Körperfluid-Probe auf zwischen ungefähr 10 und ungefähr 12,5 einstellt und das Pufferungsmittel sich auf dem Biosensor befinden oder auf andere Weise der Probe zugesetzt werden kann, bevor der Strom gemessen wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Anode ein Übergangsmetall oder eine Form von Kohlenstoff umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Anode Glaskohlenstoff, Platin oder Gold ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der pH des Anolyten auf einen pH von ungefähr 10,5 bis ungefähr 11,5 eingestellt wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner umfasst, gleichzeitig eine Referenzelektrode mit der Körperfluid-Probe in Kontakt zu bringen und die Spannung zwischen der Referenzelektrode und der Anode zu messen.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Referenzelektrode eine Silber/Silberchlorid-Elektrode ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, welches zusätzlich umfasst:

    a) die Körperfluid-Probe mit einem zweiten Biosensor in Kontakt zu bringen, wobei der zweite Biosensor das gleiche Pufferungsmittel, die gleiche Anode und die gleiche Kathode wie der Biosensor einsetzt;

    b) die Körperfluid-Probe mit einem Fructosamin-bindenden Mittel in Kontakt zu bringen;

    c) an die zweite Anode eine identische Spannung anzulegen;

    d) zusätzlich den Strom zwischen der Anode und der Kathode des zweiten Biosensors zu messen;

    e) den durch den zweiten Biosensor gemessenen Strom von jenem, der für den anderen Biosensor gemessen worden ist, abzuziehen; und

    f) die Differenz der beiden Werte mit der Standardkurve zu vergleichen;

    wobei das Fructosamin-bindende Mittel sich auf dem Biosensor befinden oder auf andere Weise der Probe hinzugesetzt werden kann, bevor der Strom gemessen wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Fructosamin-bindende Mittel Borsäure, ein oder mehrere Boronsäurederivate oder ein oder mehrere anti-(Fructosamin)-Antikörper ist.
Es folgen 5 Blatt Zeichnungen






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