PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69734999T2 21.09.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000940467
Titel PROMOTOREN VON KOMPLEMENTINHIBITOREN DES SCHWEINES.
Anmelder Nippon Meat Packers, Inc., Osaka, JP
Erfinder TOYOMURA, Koji, Tsukuba-shi, Ibaraki 300-26, JP;
FUJIMURA, Tatsuya, Tsukuba-shi, Ibaraki 300-26, JP;
MURAKAMI, Hiroshi, Tsukuba-shi, Ibaraki 300-26, JP;
SHIGEHISA, Tamotsu, Tsukuba-shi, Ibaraki 300-26, JP
Vertreter HOFFMANN & EITLE, 81925 München
DE-Aktenzeichen 69734999
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, FR, GB, IT, LI, NL, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 19.05.1997
EP-Aktenzeichen 979220977
WO-Anmeldetag 19.05.1997
PCT-Aktenzeichen PCT/JP97/01677
WO-Veröffentlichungsnummer 1997044449
WO-Veröffentlichungsdatum 27.11.1997
EP-Offenlegungsdatum 08.09.1999
EP date of grant 28.12.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 21.09.2006
IPC-Hauptklasse C12N 15/11(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Diese Erfindung stellt DNA bereit, bestehend aus einer spezifischen Basensequenz. Insbesondere stellt die Erfindung ein Promotor-Gen für einen Schweine-Komplementinhibitor bereit.

Hintergrund der Erfindung

Kürzlich wurde in vielen Ländern eine Organtransplantation weit verbreitet durchgeführt. Die Entwicklung hoch effektiver immunsupprimierender Mittel (z.B. Cyclosporin und FK506) hat das Problem der Abstoßung von Organen gelöst, die vom Menschen zum Menschen transplantiert werden, jedoch wird das Fehlen von Organspendern zu einem ernsthaften Problem. Ein solches Problem hat Studien im Hinblick an einer Tier-zum-Menschen-Organtransplantation, nämlich einer Xenotransplantation, veranlasst. Obwohl ungefähr 3.500 Fälle einer Herztransplantation jährlich in europäischen Ländern und den Vereinigten Staaten durchgeführt wurden, decken diese nur ungefähr 20 bis 30% der Patienten ab, die eine Herztransplantation benötigen. Die Verwendung von Tieren, die mit Menschen eng verwandt sind, als Spender (z.B. Primaten wie Paviane und Schimpansen) involviert etliche Schwierigkeiten aufgrund der Seltenheit dieser Tiere und ihrer hohen Intelligenz, jedoch involviert die Verwendung von Haustieren als Spender weniger Probleme. Insbesondere haben Schweine den Vorteil einer einfachen Zufuhr aufgrund einer Massenanzucht, ihre Organgrößen sind ähnlich denjenigen des Menschen und es gibt etablierte Grundtechnologien einschließlich dem Erhalt der Stämme. Dementsprechend wurde eine Organtransplantation vom Schwein zum Menschen untersucht.

Unter den Abstoßungen, die bei einer Schwein-zum-Menschen-Organtransplantation auftreten, könnte eine Abstoßung durch die auf den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) bezogene zelluläre Immunität nicht auftreten, da die evolutionäre Verwandtschaft zwischen Schweinen und Menschen so rar ist, dass es keine Ähnlichkeit zwischen ihren MHCs gibt. Weiterhin könnte eine Anwendung von effektiven immunsupprimierenden Mitteln eine solche Abstoßung verhindern, falls sie jemals auftritt.

Menschliches Blut enthält jedoch endogene Antikörper gegen Schweine (nämlich natürliche Antikörper). Wenn dementsprechend ein Schweineorgan in den Menschen transplantiert wird, erkennen die natürlichen Antikörper das Organ (Antigen), was zur Bildung von Antigen-Antikörperkomplexen führt, die das menschliche Komplement aktivieren. Das aktivierte menschliche Komplement führt zu einer Nekrose des transplantierten Organs (Abstoßung). Ein solches Phänomen tritt direkt (innerhalb einer Stunde) nach der Transplantation auf und wird so als hyperakute Abstoßung bezeichnet.

Es wurde bis jetzt kein Arzneimittel entwickelt, das eine hyperakute Abstoßung, ausgelöst durch Komplementaktivierung, verhindern könnte. Kein menschliches Organ wird durch menschliches Komplement verletzt, da Faktoren, die eine Komplementaktivierung verhindern, auf den menschlichen Organen exprimiert werden. Solche Faktoren werden Komplementinhibitoren (oder Komplement inhibierende Faktoren) genannt. Unter den Komplementinhibitoren sind drei Faktoren, nämlich DAF (decay accelerating factor, CD55), MCP (Membran-Cofaktor-Protein, CD46) und CD59 wichtig. Es wird angenommen, dass DAF und MCP die Aktivierung von Komplement durch Beschleunigung der Zerstörung von C3b- und C3/C5-Konvertase inhibieren und CD59 bewirkt dies durch Inhibition des C9-Schritts.

Die Komplementinhibitoren sind artspezifisch. Schweine-Komplementinhibitoren können die Komplementaktivität von Schweinen, aber nicht die von Menschen inhibieren. Die Schweine-Komplementinhibitoren können menschliches Komplement nicht inhibieren, aktiviert durch das in den Menschen transplantierte Schweineorgan. Daher durchläuft das in den Menschen transplantierte Schweineorgan eine Nekrose.

Eine Schwein-zum-Menschen-Organtransplantation löst nicht nur eine hyperakute Abstoßung aus, sondern auch eine Thrombinbildung und Blutplättchenkoagulation, was zu einer Thrombose im vakuslären System wie auch im transplantierten Organ des Wirts führt. Komponenten des Blutkoagulationsweges, wie z.B. Thrombin, Fibrin und Fibrin-Abbauprodukte können ebenfalls den Gewebeschaden vervielfältigen, die Immunreaktion modifizieren und entzündliche Reaktionen verstärken (Xenotransplantation, Band 3(1), 24–34, 1996).

Solche Probleme, die sich ergeben, wenn ein Schweineorgan in einen Menschen transplantiert wird, würden gelöst werden, wenn menschliche Komplementinhibitoren und/oder solche Thrombose-inhibierenden Faktoren wie Thrombomodulin (im folgenden allgemein als Komplementinhibitoren bezeichnet) in den Schweineorganen durch die Gentechnologie exprimiert würden. Bei der Transplantation des Schweineherzens gäbe es keine Probleme, wenn die menschlichen Komplementinhibitoren durch die vaskulären Endothelzellen des Schweins exprimiert würden.

Von einem solchen Standpunkt aus betrachtet wurden Studien an rekombinanten Schweinen (transgenen Schweinen), integriert mit menschlichem Komplementinhibitor-Genen, weit verbreitet durchgeführt.

Es wurde auch als nützlich betrachtet, solche Faktoren, die zu einer Unterdrückung der Thrombose in der Lage sind (z.B. Thrombomodulin, Proceedings of the XVth World Congress of the Transplantation Society, Seiten 77–79, 1995) mit oder ohne die menschlichen Komplementinhibitoren in den Schweineorganen durch genetische Manipulation zu exprimieren.

In der EMBL data base, EMBL Nr.: D70897 wird eine Schweine-mRNA für ein Schweinemembran-Cofaktorprotein offenbart. Darin wird eine isolierte DNA offenbart, umfassend ungefähr 0,05 kb vom 3'-Ende der SEQ ID NO: 1.

Mc Curry et al., Nature Medicine, Band 1, Nr. 5, 1995, Seiten 423 bis 427 beschrieben transgene Schweine, worin menschliche Komplement-regulatorische Proteine von den Alphaglobulin-Transkriptions-regulatorischen Elementen exprimiert wurden.

Oldham et al., Transplantation Proceedings, US, Orlando, Band 28, Nr. 2, 1996, Seite 693 zeigen eine ähnliche Offenbarung, die weiterhin den Bedarf an höheren Niveaus menschlicher CRP-Expression auf dem vaskulären Endothel transgener Organe anspricht. Keines dieser Dokumente offenbart den tatsächlichen Schweine-Promotor.

Murakami et al., Molecular Reproduction and Development, 2002, Band 61, Nr. 3, Seiten 302 bis 311 geben weiterhin explizit an, dass keine transgenen Schweine mit einer 5,4 Kbp MCP-Sequenz erhalten werden konnten.

Wie oben beschrieben, wurde eine Xenotransplantation unter Verwendung transgener Schweine, integriert mit den menschlichen Komplement-Inhibitorgenen, untersucht. Bis jetzt wurden Promotoren, abstammend von dem menschlichen Komplement-Inhibitorgen oder Viren verwendet, um solche transgenen Schweine herzustellen. Für die in Schweinen zu exprimierenden Komplementinhibitoren könnten jedoch Promotoren, die von Schweinen abstammen, effizienter sein. Um solche Promotoren zu erhalten, werden cDNAs der Schweine-Komplementinhibitoren benötigt. Daher haben die gegenwärtigen Erfinder Untersuchungen im Hinblick auf eine Isolation und Reinigung von cDNA durchgeführt, die einen Schweine-Komplementinhibitor (bezeichnet im folgenden als pMCP) betreffen und waren erfolgreich bei der Isolation und Sequenzierung der cDNA (siehe japanische Patentanmeldung Nr. 178254/1995).

Die gegenwärtigen Erfinder haben weitere Untersuchungen durchgeführt und waren bei der Identifikation und dem Sequenzieren des Promotorbereichs von pMCP durch Herstellung von genomischen Schweine-Bibliotheken und dann durch ihr Screening mit pMCP-cDNA als Sonde erfolgreich.

Wie oben beschrieben, stammt der pMCP-Promotor der Erfindung von einer pMCP-genomischen DNA, die durch Verwendung von cDNA von pMCP isoliert wurde. Die pMCP-cDNA stammte von RNA ab, transkribiert in vaskulären Endothelzellen von Schweinen. Das heißt, der pMCP-Promotor der Erfindung reguliert die Expression von pMCP in den vaskulären Endothelzellen von Schweinen. Dementsprechend können unter Verwendung des pMCP-Promotors der Erfindung Gene menschlicher Komplementinhibitoren und diejenigen von z.B. Thrombose inhibierenden Faktoren, wie Thrombomodulin, in den Schweineorganen, insbesondere den vaskulären Endothelzellen von Schweinen exprimiert werden. Weiterhin können unter Verwendung des pMCP-Promotors der Erfindung verschiedene Strukturgene effektiv, selektiv und spezifisch in Schweineorganen exprimiert werden, insbesondere in vaskulären Endothelzellen von Schweinen.

Andererseits konnten die Promotoren, die von dem menschlichen Komplement-Inhibitorgen oder einem viralen Genom abstammten, die alle in den früheren Studien verwendet wurden, weder selektiv, spezifisch, noch effektiv den menschlichen Komplementinhibitor in den Endothelzellen von Schweinen exprimieren.

Diese Erfindung wurde auf der Basis dieser Feststellungen bewirkt. Der Zweck der Erfindung war die Bereitstellung einer DNA, die eine Aktivität eines pMCP-Promotors besaß.

Offenbarung der Erfindung

Diese Erfindung stellt eine isolierte Promotor-DNA bereit mit einer ungefähr 4,1-, 2,4-, 1,7-, 0,9- oder 0,5 kb stromaufwärts gelegenen Sequenz vom 3'-Ende der Basensequenz, wie definiert durch SEQ ID NO: 1 und eine DNA mit der Basensequenz, wie definiert in SEQ ID NO: 2 oder Fragmente davon, die dieselbe Promotoraktivität besitzen.

Diese DNAs besitzen pMCP-Promotoraktivitäten.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die Promotoraktivität von jedem Promotorbereich ist in 1 dargestellt.

Die Promotoraktivitäten der Erfindung und von hDAF werden in 2 verglichen.

Beste Ausführungsform der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wird im Detail wie folgt erklärt:

Die durch Sequenz Nr. 1 definierte Basensequenz ist eine DNA mit der Promotoraktivität von pMCP. Eine solche DNA kann erhalten werden, indem genomische DNA des Strukturgens von pMCP von einer kommerziell erhältlichen genomischen Bibliothek des Schweins hergestellt wird, die Promotorregion identifiziert wird, die in einem stromaufwärts gelegenen Bereich der genomischen DNA existiert und diese mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut wird.

Mit cDNA von pMCP oder Teilen als Sonden können genomische DNAs des pMCP-Strukturgens aus der genomischen Bibliothek des Schweins durch konventionelle Plaques oder Kolonie-Hybridisierungsverfahren kloniert werden. Bei dem Plaque-Hybridisierungsverfahren werden Plaques von Phagen gebildet, die die pMCP-genomische DNA enthalten und werden wie folgt identifiziert: ➀ Phagen, die die genomische Schweine-Bibliothek enthalten und E. coli werden auf Agarplatten zur Herstellung von Plaques cokultiviert; ➁ die Plaques werden auf Nitrocellulose-Membranfilter übertragen und dann wird Phagen-DNA in den Plaques auf den Filtern fixiert und ➂ die Phagen-DNAs werden mit pMCP-Sonden, markiert mit Radioisotopen, hybridisiert und dann werden Autoradiogramme der Filter aufgenommen. Durch Wiederholung solcher Verfahren können Phagen, die pMCP-genomische DNA enthalten, kloniert werden.

Um die positiven Phagenklone zu selektieren, die den Promotorbereich der genomischen DNA enthalten, kann eine Region, korrespondierend zum ersten bekannten Exon der menschlichen MCP-cDNA aus der pMCP-cDNA ausgeschnitten und als Sonde verwendet werden, um die Plaque-Hybridisierung ähnlich wie oben erwähnt durchzuführen, da angenommen wird, dass das Promotor-Gen von pMCP das erste Exon besitzt.

So kann eine pMCP-genomische DNA, enthaltend den Promotorbereich, aus der klonierten Phagen-DNA hergestellt werden.

Die Promotorbereich-DNA von pMCP kann durch Verdau des stromaufwärts gelegenen Bereichs der pMCP-genomischen DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen, Überprüfung der Promotoraktivitäten der verdauten Fragmente und Sammeln der Fragmente, die Promotoraktivitäten besitzen, hergestellt werden.

Die Promotoraktivität kann konventionell wie folgt überprüft werden: z.B. Integration des Restriktionsenzym-verdauten Fragments in einen Vektor für eine Luciferase-Aktivitätsbestimmung, Transfektion des Vektors in geeignete Wirtszellen, Inkubation der Zellen für eine bestimmte Zeitspanne, Lyse der Zellen und dann Bestimmung der Fluoreszenz der Luciferase im Zelllysat.

Der Promotorbereich der pMCP-genomischen DNA wurde so von der genomischen Schweine-Bibliothek erhalten. Wie in den im folgenden beschriebenen Beispielen dargestellt, wurde ein Promotorbereich, umfassend ungefähr 5.400 bp, erhalten. Durch Sequenzierung der Region durch ein konventionelles Verfahren wurde die in Sequenz Nr. 1 (5.418 Basen) definierte Basensequenz identifiziert.

Durch Verdau des Promotorbereichs mit geeigneten Restriktionsenzymen und Überprüfung der Promotoraktivitäten der resultierenden Fragmente durch das oben beschriebene Verfahren erwies es sich, dass der ungefähr 1.700 bp stromaufwärts gelegene Bereich eine hohe Promotoraktivität besaß. Durch Sequenzieren des 1.700 bp-Bereichs wurde die in der Sequenz Nr. 2 definierte Basensequenz (1.622 bp) identifiziert.

Wie in den Beispielen dargestellt, wurde gezeigt, dass auch Regionen, die kürzer und länger als der in Sequenz Nr. 2 dargestellte Promotor waren, die Promotoraktivitäten besitzen konnten. Dementsprechend kann die DNA der vorliegenden Erfindung aus einem Teil der in Sequenz Nr. 1 dargestellten Basensequenz bestehen, solange die Aktivität des pMCP-Promotors erhalten bleibt.

Die DNA der vorliegenden Erfindung kann als Promotor zur Expression nicht nur von pMCP, sondern auch verschiedener anderer Strukturgene verwendet werden. In solchen Fällen können geeignete Regionen aus der gesamten Sequenz gewählt werden, abhängig von den zu exprimierenden Strukturgenen, der Wirtszelle und dem Wirtstier.

Die so erhaltene DNA der vorliegenden Erfindung besitzt die Promotoraktivität, um die Strukturgene, einschließlich pMCP zu exprimieren und kann für verschiedene Zwecke verwendet werden. Wie oben beschrieben, kann die erfindungsgemäße DNA in günstiger Weise in den stromaufwärts gelegenen Teil menschlicher Komplementinhibitor-Gene integriert werden und verwendet werden, um ein transgenes Schwein zu erzeugen, transformiert mit den menschlichen Komplementinhibitor-Genen. Insbesondere kann die DNA der Erfindung den Komplementinhibitor auf den Endothelzellen des Schweins exprimieren. Weiterhin kann die DNA der Erfindung als Promotor zur Expression verschiedener anderer Strukturgene außer dem pMCP-Gen verwendet werden.

Die DNA der vorliegenden Erfindung ist nicht auf die begrenzt, die durch das oben beschriebene Verfahren erzeugt wurde, sondern schließt auch andere ein, die durch andere Verfahren hergestellt wurden.

Gewerbliche Anwendbarkeit

Die DNA der vorliegenden Erfindung ist das Promotor-Gen von pMCP. Bei der Erzeugung der transgenen Schweine, die mit dem menschlichen Komplementinhibitor-Gen transformiert sind, kann das Promotor-Gen in den stromaufwärts gelegenen Teil der menschlichen Komplementinhibitor-Gene integriert werden. Da Gewebe und Organe solcher transgener Schweine keine hyperakute Abstoßung auslösen, können sie in den Menschen transplantiert werden. Dementsprechend kann das Problem eines Fehlens von Spendern für eine Transplantation effektiv gelöst werden.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird spezifisch im Detail durch die Beispiele erklärt, jedoch ist der Umfang der Erfindung nicht auf diese Beispiele begrenzt.

Beispiel 1 A. Erhalt des Promotorbereichs von pMCP ➀ Klonierung eines Phagenklons durch Hybridisierung

Um die genomischen Klone von pMCP zu erhalten, wurde &lgr;FIXII (Stratagene) und Gesamtlängen-pMCPcDNA (hergestellt durch Expressionsklonieren und Verdau des Expressionsvektors mit XhoI und NotI) für eine Hybridisierung als genomische Bibliothek des Schweins bzw. als Sonde verwendet. Die Plaque-Hybridisierung wurde wie folgt durchgeführt:

Zunächst wurden zwei Millionen Klone des oben beschriebenen Phagen und eine E. coli-Suspension auf 50 Platten (gesamt 100 Million Klone) verteilt. Die Phagenklone bildeten Plaques nach einer Über-Nacht-Inkubation bei 37°C. Um die Phagen in den Plaques zu absorbieren, wurde ein Blatt eines Nitrocellulosemembranfilters für die Hybridisierung auf jede Platte für ungefähr 1 Minute platziert.

Danach wurde der Filter umgedreht und in einer alkalischen Denaturierungslösung (0,2 M NaOH, 1,5 M NaCl) untergetaucht, um die Kerne für 20 Sekunden aufzubrechen und daraufhin in einer neutralisierenden Lösung [2x SSC, 0,4 M Tris-HCl (pH 7,5)] für 20 Sekunden. Nach dem Trocknen wurden sie unter UV-Bestrahlung (GS Gene Linker, Bio Rad) vernetzt.

Zweitens wurden diese Filter in einem Prähybridisierungspuffer [50% deionisiertes Formamid, 4x SSC, 50 mM HEPES (pH 7), 10x Denhardt-Lösung, 100 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA] bei 37°C für 4 Stunden blockiert.

Die Sonde wurde durch Behandlung der pMCPcDNA mit dNTP und Klenow (DNA-Polymerase I) in Gegenwart eines Radioisotops [a-32P] ATP markiert. Eine radioisotop-markierte Umkehrkette wurde so mit der cDNA als Matrize hergestellt. Die Umkehrkette kann mit dem Phagenklon, der die identischen DNA-Sequenzen aufweist, hybridisieren.

Dann wurde die radioaktiv markierte Sonde auf einer Gelfiltrationssäule platziert, herabzentrifugiert, um die nicht umgesetzten und nicht markierten Nukleotide zu entfernen, 3 Minuten bei 90°C inkubiert, auf Eis gekühlt, um eine Einzelkettenform der DNA zu erhalten, und einer Hybridisierung unterzogen.

Die prähybridisierten Filter wurden in HybriPacks platziert und über Nacht bei 37°C mit der oben beschriebenen Sonde in Hybridisierungspuffer hybridisiert.

Als nächstes wurden die Filter zweimal mit SSC und SDS gewaschen, man ließ sie mit den Bildanalyseplatten 2 Stunden bei Raumtemperatur reagieren und dann wurde mit einem Bildanalysator (Fuji Film Co.) analysiert.

Schließlich wurden 30 positive Klone erhalten. Gels der positiven Klone wurden mit Pasteur-Pipetten abgezogen und mit SM-Puffer verdünnt. Die klonhaltige Lösung wurde so hergestellt.

➁ Sekundäres und weiteres Screening

Die klonhaltige Lösung wurde in geeigneter Weise verdünnt und auf Platten verteilt (insgesamt 30 Platten). Danach wurde wiederum eine Hybridisierung durchgeführt. Es wurden auf 20 Platten viele positive Plaques beobachtet. Zwanzig positive Klone wurden so erhalten.

Diese Verfahren wurden dreimal wiederholt. Schließlich wurden alle Klone gereinigt.

➂ Klassifizierung der Klone auf der Basis der Restriktionsenzymverdauprofile

Um zu bestätigen, ob die Klone unabhängig waren, wurden sie mit einem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und dann elektrophoretisch aufgetrennt. Identische Klone zeigen dasselbe Verdauprofil. Von verschiedenen Verdauprofilen wurden auf diese Weise 10 unterschiedliche Klone erhalten.

➃ Selektion der Phagenklone, die den Promotorbereich enthalten, unter Verwendung des cDNA-Führungsbereichs

Die Phagenklone, die den Promotorbereich enthalten, sollten das erste Exon aufweisen. Dementsprechend wurde eine Region, die vermutlich zu dem ersten Exon des menschlichen MCPs korrespondierte, aus pMCPcDNA ausgeschnitten (SalI-SphI) und einer Hybridisierung als Sonde unterzogen. Vier Klone ergaben positive Ergebnisse.

➄ Selektion von Promotorbereich enthaltenden Phagenklonen durch Verdau mit einer seltenen Restriktionsenzymstelle

Vier Klone wurden mit FspI verdaut, da diese Restriktionsenzymstelle in dem ersten Exon von pMCPcDNA selten existiert. Es wurde nur ein Klon mit dem Enzym verdaut.

Dementsprechend wurde es als hoch wahrscheinlich angesehen, dass dieser Phagenklon den Promotorbereich enthielt.

➅ Bestätigung des Promotorbereichs durch Sequenzieren

Der Phagenklon wurde mit einer Kombination von FspI und einem anderen Restriktionsenzym (EcoRI) verdaut, um die FspI-Stelle des ersten Exons am Ende des verdauten Fragments zu lokalisieren, integriert in einen Sequenzierungsvektor pBSIIKS+ (Stratagene) und es wurde sequenziert (373 DNA-Sequenzierer, Applied Biosystems, Inc.).

Das Ergebnis zeigte, dass der Phagenklon tatsächlich das erste Exon enthielt.

Durch das Restriktionsenzym-Verdauprofil wurde bewiesen, dass dieser Phagenklon den pMCP-Promotorbereich enthielt, dessen Gesamtlänge ungefähr 13 kb stromaufwärts des Genoms betrug.

B. Bestimmung der Aktivität des pMCP-Promotorbereichs ➀ Herstellung eines Konstrukts zur Bewertung der Promotoraktivität

Die Promotoraktivität wurde mit einem System, das Luciferase-cDNA verwendete, bestimmt.

Ein 5,4 kb-Promotorbereich von pMCP, der eine T7-Primer-Erkennungsstelle für eine Sequenzierung trug (da die 13 kb-DNA des Phagenklons zu groß für eine Integration war, wurde sie an den EcoRI-Stellen verdaut) wurde mit den Restriktionsenzymen BstEII und BssHII von dem oben beschriebenen Sequenzierungsplasmid verdaut. Die DNA-Sequenz des 5,4 kb-Promotor-Gens wurde konventionell bestimmt, wie dargestellt durch Sequenz Nr. 1 (5.418 bp).

Das Ende des oben beschriebenen Promotorbereichs wurde mit T4-DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen und in einen pGL-3-Grundvektor (Promega) für eine Luciferase-Aktivitätsbestimmung an den SmaI-Stellen subkloniert. Dem Vektor für die Luciferase-Aktivitätsbestimmung fehlt selbst ein Promotor-Gen, so dass er nützlich zur Bestimmung der Promotoraktivität durch Integration eines zu überprüfenden Promotors in den stromaufwärts gelegenen Bereich des Luciferasegens und Bestimmung der Luciferaseaktivität ist. Die Luciferaseaktivität kann durch Lyse transformierter Zellen zur Herstellung eines enzymhaltigen Lysats, Umsetzen des Lysats mit einem Substrat des Enzyms und Ablesen der emittierten Fluoreszenzintensität bestimmt werden.

➁ Herstellung von Deletionsmutanten

Um Promotorbereiche unterschiedlicher Größen zu erhalten, wurden Deletionsmutanten mit einem Kilosequenzkit (Takara) hergestellt.

Eine Reihe von pGL-3-Vektoren, die Promotoren mit Längen von 4,1-, 2,4-, 1,7-, 0,9-, 0,5-, 0,07- und 0,05 kb trugen, wurden so hergestellt.

Ähnlich wurde ein pGL-3-Vektor, der einen SV40-Promotor trug, zur Kontrolle hergestellt.

Weiterhin wurden ebenfalls zum Vergleich ein Vektor hergestellt, der eine umgekehrte Sequenz des oben beschriebenen 5,4 kb-Promotors trug und einer, der einen menschlichen DAF(hDAF)-Promotor (ungefähr 4 kb) trug.

➂ Elektroporation der Plasmide in die Aorta-Endothelzellen von Schweinen

Die Luciferaseaktivitäten wurden unter Verwendung einer Aorta-Endothelzelllinie von Schweinen bestimmt.

Die kultivierten Zellen wurden mit einer Trypsin/EDTA-Lösung abgelöst, gewaschen und in HeBS-Puffer mit einer Konzentration von 3 x 106 Zellen/800 &mgr;l suspendiert.

Ein 800 &mgr;l-Teil der Zellsuspension und ein 15 &mgr;g-Teil der oben beschriebenen Plasmide wurde in eine Küvette mit einer 0,4 cm Elektrodenclearance (eine Küvette für eine Zell-Elektroporation) übertragen und mit einem Gene Pulser (Bio Rad) mit 500 &mgr;F und 300 V elektroporiert. Die Plasmide wurden in die Zellen integriert.

➃ Bestimmung der Luciferaseaktivität

Die oben beschriebenen Zellen wurden 48 Stunden kultiviert, gesammelt, mit PBS gewaschen und mit der Zelllyselösung 10 Minuten behandelt. 10 &mgr;l des Zelllysats wurden mit 50 &mgr;l des Substrats der Luciferase vermischt. Die Fluoreszenz der Reaktionsmischung wurde mit einem Luminescence Reader (Aloka) abgelesen.

Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt. Die Aktivitäten pro 1 × 105 lebensfähiger Zellen wurden berechnet. Jede Säule zeigt eine relative Aktivität, wobei die Aktivität eines Kontroll-pGL-3-Vektors, der den SV40-Promotor trägt, als 100 definiert ist. In 1 bedeutet ein Symbol von 5,4 kb einen Vektor, der ein umgekehrtes Fragment eines ungefähr 5,4 kb-Promotorbereichs trägt. Ähnlich bedeutet das von hDAF einen Vektor, der den hDAF-Promotor trägt.

Aus den Luciferaseaktivitäten waren die Aktivitäten der Promotoren im Bereich von ungefähr 0,07 bis 1,7 kb höher als die der positiven Kontrolle, was höher war als die hDAF-Promotoraktivität (1). Aktivitäten der Promotoren mit ungefähr 5,4-, 4,1-, 2,4- und 0,05 kb Länge wurden ebenfalls bemerkt. Der Vektor, der das umgekehrte Fragment trug, zeigte jedoch keine Aktivität. Aus diesen Ergebnissen wurde deutlich, dass die oben beschriebenen Regionen sicherlich Promotoraktivitäten besaßen.

Beispiel 2 Sequenzierung des Promotorbereichs

DNA einer ungefähr 1,7 kb-Promotorregion, die eine hohe Aktivität besaß, wie in 1 dargestellt, wurde sequenziert.

Mit der T7-Primer-Erkennungsstelle, die in die stromaufwärts gelegene Stelle von jeder Deletionsmutante integriert worden war, wurde die DNA durch das Farbstoff-Primerverfahren sequenziert. Das Sequenzieren wurde zweimal wiederholt. Bei schwierig zu identifizierenden Regionen wurden diese in pBSIIKS+ subkloniert und unter Verwendung der T3-Primer-Erkennungsstellen sequenziert.

Im Ergebnis wurde deutlich, dass die oben beschriebene, ungefähr 1,7 kb-Promotorregion die in Sequenz Nr. 2 definierte DNA-Sequenz besaß (1.622 Basen).

Beispiel 3 Bestimmung der Promotoraktivität (Expression des menschlichen Komplementinhibitors) ➀ Transfektion

hDAFcDNA wurde mit jedem der 5,4 kb (Sequenz Nr. 1), 1,7 kb (Sequenz Nr. 2) und 0,9 kb pMCP-Promotoren oder dem hDAF-Promotor verbunden. Diese Gene wurden linearisiert, zusätzlich mit einem Neomycin-Resistenzgen als Selektions-Marker ligiert und in 3 × 106 Schweinezellen durch Elektroporation bei 500 &mgr;F und 300 V mit einem Gene Pulser (Bio Rad) transfiziert. Die Zellen wurden in einem Kulturmedium, das 250 &mgr;g/ml Neomycinsulfat (Gibco) enthielt, kultiviert. Koloniebildende Zellen wurden gesammelt. Die Expression von hDAF auf der Zelloberfläche wurde mit einem FACScan (Becton Dickinson) nach Färbung der Zellen mit biotinylierten anti-hDAF-monoklonalen Antikörpern (IA10, IIH6 und VIIIA7; Kinoshita, T., et al.(1985) J. Exp. Med. 162: 75) und PE-konjugiertem Streptavidin analysiert.

➁ Assay auf die Komplementresistenz

Einige durch das oben beschriebene Verfahren erhaltene Klone wurden gewählt. Fünfzehntausend Zellen von jedem Klon ließ man mit Antikörpern und Komplement in einer Platte mit 96 Vertiefungen reagieren. Als Antikörper wurden 100 &mgr;l inaktiviertes menschliches Serum jeder Vertiefung zugefügt und man ließ dies 30 Minuten bei 4°C stehen. Nach einem Waschen mit PBS wurde geeignet verdünntes menschliches normales Serum jeder Vertiefung als Komplementquelle zugefügt und man ließ dies 3 Stunden bei 37°C stehen. Überlebende Zellen wurden mit einem WST-1 (Boehringer Mannheim) bestimmt.

➂ Ergebnisse 1. Vergleich der Expression mit verschiedenen Promotoren:

Ein Teil der Ergebnisse, die eine Beziehung zwischen jedem Promotor und der hDAF-Expression zeigen, ist in 2 dargestellt.

Die horizontale Achse von 2, FL2-H, repräsentiert die Menge von exprimiertem hDAF; sie steigt an, wenn sich die Achse nach rechts verlagert. Die Vertikalachse, Zahl, repräsentiert die Zellzahl; sie steigt, wenn sich die Achse nach oben verlagert. Jeder Peak zeigt die Aktivität eines Promotors, angegeben durch die Markierung. Schwarze und leere Peaks zeigen FACScan-Reaktionen, erhalten durch Zellen, die ohne bzw. mit anti-hDAF-Antikörpern umgesetzt wurden. Im Ergebnis wurde kein hDAF ohne Promotor exprimiert. Im Vergleich mit dem hDAF-Promotor exprimierten alle pMCP-Promotoren hDAF effektiv um mehr als das 20fache. Es wurde nämlich bestätigt, dass die ungefähr 5,4-, 1,7- und 0,9 kb Promotoren den menschlichen Komplementinhibitor in den Endothelzellen von Schweinen effektiv exprimierten.

2. Vergleich der Resistenz gegen Komplement durch verschiedene Promotoren:

In 50%igem menschlichem Serum wurde keine Resistenz beobachtet, wenn hDAF durch den hDAF-Promotor exprimiert wurde; es wurde demgegenüber eine Resistenz von mehr als 80% bemerkt, sogar in 100%igem menschlichem Serum, wenn hDAF durch die pMCP-Promotoren exprimiert wird. Dadurch wurde bestätigt, dass hDAF seine ursprüngliche Funktion ausübte und gegen das menschliche Komplement Widerstand leistete, wenn hDAF auf den Endothelzellen von Schweinen durch die pMCP-Promotoren exprimiert wurde.

SEQUENZPROTOKOLL

Anspruch[de]
  1. Isolierte Promotor-DNA, bestehend aus 4,1 kb, 2,4 kb, 1,7 kb, 0,9 kb, 0,5 kb, vom 3'-Ende der Basensequenz, definiert als Sequenz Nr. 1.
  2. Isolierte Promotor-DNA, bestehend aus einer Basensequenz, definiert als Sequenz Nr. 2, oder Fragmenten davon, die dieselbe Promotoraktivität besitzen.
Es folgen 2 Blatt Zeichnungen






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com