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Dokumentenidentifikation DE69735199T2 21.09.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000894126
Titel ALKALINE-PHOSPHATASE-DEFIZIENTE, FILAMENTÖSE PILZE
Anmelder Novozymes A/S, Bagsvaerd, DK
Erfinder LEHMBECK, Jan, DK-2880 Bagsvard, DK
Vertreter Patent- und Rechtsanwälte Bardehle, Pagenberg, Dost, Altenburg, Geissler, 81679 München
DE-Aktenzeichen 69735199
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 26.03.1997
EP-Aktenzeichen 979141777
WO-Anmeldetag 26.03.1997
PCT-Aktenzeichen PCT/DK97/00135
WO-Veröffentlichungsnummer 1997035956
WO-Veröffentlichungsdatum 02.10.1997
EP-Offenlegungsdatum 03.02.1999
EP date of grant 01.02.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 21.09.2006
IPC-Hauptklasse C12N 1/15(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 15/80(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Pilzwirtszellen und Verfahren zur Herstellung von Proteinen. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Wirtszelle, die zur Expression von heterologen Proteinen nützlich ist, wobei die Wirtszelle derart genetisch modifiziert wurde, dass deutlich reduzierte Gehalte an alkalischer Proteaseaktivität exprimiert werden. Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen von Interesse in hohen Ausbeuten und unter Verwendung der Pilze der Erfindung, wobei das Verfahren das Züchten der Wirtszelle in einem geeigneten Wachstumsmedium, gefolgt von der Gewinnung des gewünschten Proteins umfasst. Die Erfindung umfasst auch Verfahren zur Herstellung derartiger Pilze und DNA-Konstrukte zur Verwendung in diesen Verfahren.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Pilze und insbesondere Fadenpilze werden allgemein kommerziell als Wirtszellen zur Expression von Proteinen verwendet, die extrazellulär sekretiert werden. Insbesondere weisen Spezies, die zur Gattung Aspergillus gehören, eine lange Geschichte der kommerziellen Verwendung zur Herstellung von endogenen und später auch heterologen Proteinen auf.

Ein Nachteil der häufig mit als Wirtszellen verwendeten Mikroorganismen anzutreffen ist, ist die Eigenproduktion und -sekretion von hohen Gehalten an proteolytischen Enzymen, die auf Grund der Proteolyse zu reduzierten Ausbeuten eines Proteinprodukts von Interesse führen können.

Verschiedene Lösungen, dies zu umgehen, wurden ins Auge gefasst. Zum Beispiel könnte man die verschiedene endogene Proteasen kodierenden Gene deletieren oder zerstören. WO 90/00192 (Genencor Inc.) beschreibt mutante Fadenpilzwirte, die dazu unfähig gemacht wurden, aktive Aspartamprotease enzymatisch zu sekretieren. Durch eine derartige Mutation zeigte es sich, dass die Ausbeute des heterologen Polypeptids Rinder-Chymosin erhöht war. EP 574 347 (Ciba Geigy AG) beschreibt einen Aspergillus-Wirt, welchem eine Serinprotease vom Subtilisin-Typ fehlt.

Jedoch ist es bekannt, dass Pilze zusätzlich zu den beiden hier erwähnten eine große Anzahl an Proteasen herstellen. Demzufolge werden immer noch keine Stämme von Fadenpilzen, die keine oder sehr niedrige Gehalte an von anderen Proteasen stammender proteolytischer Aktivität benötigen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Wirtszellen von Aspergillus oryzae (A. oryzae) zur Herstellung von heterologen Polypeptidprodukten bereitzustellen, wobei die Zelle derart genetisch modifiziert wurde, dass im Vergleich mit der Ausgangszelle deutlich reduzierte Gehalte an endogener alkalischer Protease exprimiert werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft einen derartigen A. oryzae, wobei die Transkription und/oder Translation mindestens eines eine alkalische Proteaseaktivität kodierenden Gens vollständig oder teilweise gehemmt wurde.

Erfindungsgemäß kann dieses Verfahren durch die Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie erzielt werden, wobei alkalische Proteaseaktivität des fraglichen Pilzes kodierende Gensequenzen deletiert oder mutiert werden, was zu reduzierten Graden an Proteaseexpression oder Expression einer Protease mit reduzierten Aktivitätsgehalten führt.

In einer spezifischen Ausführungsform ist das alkalische Proteasegen das alp-Gen, das in SEQ ID NR. 1 und von Murakami, K., et al., 1991, Agric. Biol. Chem. 55: 2807–2811 beschrieben ist.

Des Weiteren betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung derartiger Pilze; wobei die Inaktivierung des (der) alkalischen Gens (Gene) durch Nukleotidsubstitution, -deletion oder -einfügung in das alkalische Proteasegen erhalten wird.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung von heterologen Polypeptiden unter Verwendung von Pilzwirtszellen der Erfindung. Insbesondere erwogen sind sekretierte Polypeptide, wobei eine Pilzwirtszelle, die mit einem DNA-Konstrukt modifiziert und wahlweise transformiert wurde, das mindestens eine das Polypeptid oder Genprodukt von Interesse kodierende DNA-Sequenz umfasst, in einem geeigneten Wachstumsmedium unter geeigneten Bedingungen gezüchtet und das gewünschte Genprodukt gewonnen und gereinigt wird.

Durch die hier beschriebenen Verfahren wurde gefunden, dass die Ausbeute an durch Pilze der Erfindung sekretierten Polypeptiden größtenteils verbessert ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Die Erfindung wird des Weiteren in der Patentschrift detailliert in Bezug auf die Beispiele und die folgenden Figuren beschrieben, wobei:

1 den Schritt zeigt, der an der Konstruktion von HowB101 beteiligt ist,

2 den Schritt zeigt, der an der Konstruktion von pJaL212 beteiligt ist,

3 den Schritt zeigt, der an der Konstruktion von pJaL125 von A. oryzae beteiligt ist (alp deletiert),

4 pSX320 zeigt und

5 die Herstellung einer Endoglucanase mit 45 kD in einem Wirtstamm der Erfindung (A. oryzae JaL125) zeigt, wobei alp im Vergleich mit einem entsprechenden Stamm von A. oryzae, in welchem alp nicht deletiert wurde, deletiert wurde.

DEFINITIONEN

In der vorliegenden Patentschrift werden die folgenden Definitionen verwendet:

alp&Dgr; bedeutet einen Stamm, in welchem das alp-Gen deletiert ist.

alp bedeutet einen Stamm, der kein funktionelles alp-Polypeptid, d.h. ein alp-Polypeptid ohne proteolytische Aktivität herstellt.

Der Begriff „funktionelles Analogon" soll wie hier in Bezug auf die in SEQ ID NR. 1 dargestellte alp-Sequenz eine DNA-Sequenz anzeigen, die eine alkalische Protease kodiert, die zu der in SEQ ID NR. 1 dargestellten DNA-Sequenz unter bestimmten spezifizierten Bedingungen, die detailliert nachstehend beschrieben sind, hybridisiert und einen Homologiegrad von mindestens 70% aufweist.

Geeignete Bedingungen zum Bestimmen der Hybridisierung zwischen einer Nukleotidsonde und einer homologen DNA- oder RNA-Sequenz beinhaltet das Voreintauchen des die DNA-Fragmente oder RNA zum Hybridisieren enthaltenden Filters in 5x SSC (standardmäßiges Kochsalzcitrat) für eine Dauer von 10 Minuten und Vorhybridisierung des Filters in einer Lösung von 5x SSC (Sambrook et al. 1989), 5x Denhardt-Lösung (Sambrook et al., ebd.), 0.5% SDS und 100 &mgr;g/ml denaturierter beschallter Lachssperma-DNA (Sambrook et al., ebd.), gefolgt von Hybridisierung in derselben Lösung, enthaltend eine statistischprimierte 32P-dCTP-markierte (spezifische Aktivität > 1 × 109 cpm/&mgr;g) Sonde für eine Dauer von 12 Stunden bei ca. 45°C (Feinberg, A. P. und Vogelstein, B. 1983 Anal. Biochem. 132: 6–13). Der Filter wird dann zweimal für eine Dauer von 30 Minuten in 2x SSC, 0.5% SDS bei vorzugsweise nicht höher als 50°C, stärker bevorzugt nicht höher als 55°C, stärker bevorzugt nicht höher als 60°C, stärker bevorzugt nicht höher als 65°C, noch stärker bevorzugt nicht höher als 70°C, insbesondere nicht höher als 75°C gewaschen.

Moleküle, an welche die Oligonukleotidsonde unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden unter Verwendung eines Röntgenfilms nachgewiesen.

Die DAN-Sequenzhomologie, auf welche vorstehend Bezug genommen wurde, wird als der Identitätsgrad zwischen den beiden Sequenzen, der eine Abweichung der ersten Sequenz von der zweiten anzeigt, bestimmt. Die Homologie kann durch auf dem Fachgebiet bekannte Computerprogramme wie GAP, bereitgestellt im GCG-Programmpaket (Needleman, S.B. und Wunsch, C.D. 1970, Journal of Molecular Biology 48: 443–453), geeignet bestimmt werden. Unter Verwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen für den DNA-Sequenzvergleich: GAP-Bildungsstrafe 5,0 und GAP-Verlängerungsstrafe 0,3, zeigt die kodierende Region der DNA-Sequenz einen Identitätsgrad von vorzugsweise mindestens 70%, stärker bevorzugt mindestens 80%, stärker bevorzugt mindestens 90%, stärker bevorzugt mindestens 95%, stärker bevorzugt mindestens 97% mit dem das Enzym X kodierenden Teil der in SEQ ID NR. 1 dargestellten DNA-Sequenz.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft in ihrem ersten Aspekt einen A. oryzae, der zur Herstellung von heterologen Peptiden nützlich ist, die durch rekombinante DNA-Technologie derart modifiziert wurden, dass eine oder mehrere endogene alkalische Proteaseaktivitäten vollständig oder teilweise inaktiviert wurden.

Genetische Modifikationen

Der A. oryzae der Erfindung kann unter Verwendung von Standardtechniken der dem Fachmann bekannten rekombinanten DNA-Technologie modifiziert werden. Die für die Herstellung von alkalischen Proteasen verantwortliche Gensequenz kann teilweise inaktiviert oder vollständig eliminiert werden.

Mit anderen Worten exprimiert der A. oryzae der vorliegenden Erfindung eine alkalische Proteaseaktivität mit reduzierten Gehalten oder exprimiert überhaupt keine alkalische Proteaseaktivität oder exprimiert (eine) enzymatisch inaktive alkalische Protease(n). In einem Aspekt der Erfindung kann eine derartige Inaktivierung oder können reduzierte Gehalte an alkalischer Proteaseaktivität durch Nukleotiddeletion, -einfigung oder -substitution in einer) ein alkalisches Proteasegenprodukt kodierende(n) Sequenz erzielt werden.

In einer besonderen Ausführungsform wird die Inaktivierung durch Modifikation der Struktursequenz oder regulatorischen Sequenz, die die fragliche(n) alkalische(n) Protease(n) kodiert (kodieren), z.B. durch Stören der Regulation der die Expression des alkalischen Proteasegens regulierenden Expressionssignale erhalten.

Bekannte und nützliche Techniken schließen spezifische oder zufällige Mutagenese, PCR-gebildete Mutagenese, ortsspezifische DNA-Deletion, -einfügung und/oder -substitution, Genzerstörungs- oder Genersatztechniken, Anti-Sense-Techniken oder eine beliebige Kombination davon ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.

Eine Mutagenese kann unter Verwendung eines geeigneten physikalischen oder chemischen Mutagenisierungsmittels durchgeführt werden. Beispiele für ein physikalisches oder chemisches Mutagenisierungsmittel, das für den vorliegenden Zweck geeignet ist, schließt Ultraviolett(UV)-Strahlung, Hydroxylamin, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG), O-Methylhydroxylamin, salpetrige Säure, Ethylmethansulfonat (EMS), Natriumbisulfit, Ameisensäure und Nukleotidanaloga ein. Werden derartige Mittel verwendet, wird die Mutagenese typischerweise durch Inkubieren der Zelle zum Mutagenisieren in Gegenwart des Mutagenisierungsmittels der Wahl unter geeigneten Bedingungen zum Stattfinden der Mutagenese und Selektieren auf mutierte Zellen, die deutlich reduzierte Gehalte an alkalischer (alkalischen) Protease(n) herstellen, durchgeführt.

Eine Modifikation, die zur Inaktivierung oder zu einer reduzierten alkalischen Proteaseaktivität führt, kann auch durch das Einbringen, die Substitution oder die Entfernung von einem oder mehreren Nukleotid(en) in der/die alkalische Protease kodierende/n Sequenz oder eines regulatorischen Elements, das zur Transkription oder Translation davon nötig ist, erzielt werden. Nukleotide können z.B. derart eingefügt oder deletiert werden, dass die Einbringung eines Stoppcodons, die Entfernung eines Startcodons oder die Änderung des offenen Leserahmens erhalten wird. Die Modifikation oder Inaktivierung der Struktursequenz oder eines regulatorischen Elements kann durch ortsgerichtete Mutagenese oder PCR-gebildete Mutagenese gemäß auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren erzielt werden. Obwohl die Modifikation prinzipiell in vivo, d.h. direkt an der das alkalische Proteasegen tragenden Zelle durchgeführt werden kann, ist es gegenwärtig bevorzugt, dass die Modifikation in vitro durchgeführt wird.

Ein günstiges Verfahren zum Inaktivieren oder reduzieren der alkalischen Proteaseherstellung einer Pilzwirtszelle der Wahl basiert auf den Prinzipien der Genzerstörung. Dieses Verfahren beinhaltet die Verwendung einer DNA-Sequenz, die das endogene Gen oder Genfragment, auf welches zum Mutieren gezielt wird, kodiert. Die DNA-Sequenz wird in vitro mutiert, was zu einem defekten Gen führt, das dann in den Pilz transformiert wird. Durch homologe Rekombination ersetzt das defekte Gen das endogene Gen oder Genfragment. Es kann erwünscht sein, eine genetische Markierung einzuschließen, die zur Selektion von Transformanten von Interesse zu verwenden ist.

Verfahren zur Gendeletion oder -zerstörung sind spezifisch in Miller et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1714–1721; WO 90/00192 (Genencor); May G., 1992, Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi Seite 1–25, J.R. Kinghorn und G. Turner, Hrgb., Blackie Academic und Professional; und in G. Turner, 1994, Vectors for genetic manipulation, Seite 641–665, S.D. Martinelli und J.R. Kinghorn, Hrgb., Elsevier beschrieben.

In einer anderen Ausführungsform kann die Modifikation und/oder Inaktivierung der DNA-Sequenz durch die Verwendung von etablierten Anti-Sense-Techniken unter Verwendung einer Nukleotidsequenz, die zu der die alkalische Protease kodierenden Sequenz, z.B. der in SEQ ID NR. 1 dargestellten alp-Gennukleotidsequenz oder einem funktionellen Analogon davon komplementär ist, durchgeführt werden.

Die Anti-Sense-Technologie und ihr Einsatz sind detailliert in US-Patent Nr. 5,190,931 (University of New York) beschrieben.

Infolge der vorstehend erwähnten genetischen Modifikation exprimieren die Pilze der Erfindung deutlich reduzierte Gehalte an alkalischer Proteaseaktivität. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Gehalt an alkalischer Proteaseaktivität um mehr als etwa 50%, vorzugsweise mehr als etwa 85%, stärker bevorzugt mehr als etwa 90%, besonders bevorzugt mehr als etwa 95% reduziert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle im Wesentlichen frei von nachweisbarer alkalischer Proteaseaktivität.

Die Pilze der Erfindung weisen das alkalische Proteasegen auf, das mit einer Selektionsmarkierung wie dem pyrG-Gen, argB-Gen, sC-Gen oder dem hph-Gen, ersetzt ist.

In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung umfasst das alkalische Proteasegen die in SEQ ID NR. 1 dargestellte alp-Gensequenz oder ein funktionelles Analogon davon.

alp ist eine Serinprotease mit maximaler enzymatischer Aktivität im neutralen bis alkalischen pH-Bereich. Wie aus der Nukleotidsequenz gefolgert, ist das reife alp-Protein eine Serinprotease vom Subtilisintyp, die aus 282 Aminosäuren und einer Präpro-Region von 121 Aminosäuren in der Nähe des N-Terminals besteht. Ein Vergleich der Aminosäuresequenz zwischen alp und anderen Serinproteasen vom Subtilisintyp legt nahe, dass drei Reste in alp (Asp41, His72 und Ser228) die katalytische Stelle bilden. Dass Ser228 Teil der katalytischen Stelle ist, wird durch den Verlust an proteolytischer Aktivität unterstützt, der beobachtet wird, wenn Ser282 mit einem Alaninrest ersetzt wird (Tatsumi et al., 1991, Agri. Biol. Chem. 55: 3099–3101).

Der Wirtspilz

Erfindungsgemäß ist der Pilz Aspergillus oryzae.

Normalerweise wird der Pilz der Erfindung transformiert, um den Pilz dazu zu befähigen, dass gewünschte Proteinprodukt herzustellen.

Verfahren zum Transformieren von Pilzen sind auf dem Fachgebiet bekannt, vgl. z.B. EP 0 184 438 A2 (Gist-Brocades N.V.) und die EP-Anmeldung NR. 87103806 (Novo Nordisk A/S).

Sind die Genprodukte von Interesse für die Wirtszelle indigen, ist eine Transformation nicht nötig, jedoch kann es zum Erhöhen der Produktion vorteilhaft sein, mehrere Kopien des das Protein von Interesse kodierenden Gens in die Pilze der Erfindung einzubringen.

Verfahren zur Herstellung des Wirtspilzes

Ein anderer Aspekt der Erfindung umfasst ein Verfahren zur Herstellung des Pilzes des ersten Aspekts der Erfindung, wobei die Inaktivierung des alkalischen Proteasegens durch die folgenden Schritte erhalten wird:

  • i) Klonen von Homologen des alkalischen Proteasegens von einer Pilzwirtszelle,
  • ii) Herstellen eines das alkalische Proteasegen umfassenden DNA-Konstrukts, wobei ein Teil einer inneren Sequenz durch Nukleotidsubstitution, -deletion oder -einfügung modifiziert wurde,
  • iii) Transformieren des Pilzes mit dem DNA-Kosntrukt und
  • iv) Isolieren der Transformanten, die

    1) keine bestimmbare alkalische Proteaseaktivität,

    2) einen reduzierten Gehalt an alkalischer Proteaseaktivität oder

    3) (eine) alkalische inaktive Protease(n)
aufweisen.

Der Begriff „reduzierte" alkalische Proteaseaktivität bedeutet, dass der Aktivitätsgrad geringer ist als der Grad, der von einem nicht mutierten entsprechenden Pilz gezeigt wird.

Die alkalische Proteaseaktivität, einschließlich alp-Aktivität, kann mit dem synthetischen Substrat in N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid (Sigma Chemical Co.) getestet werden. Die Aktivität wird bei 25°C mit 1 mM Substrat in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, in einem Reaktionsvolumen von 1 ml gemessen. Die Freisetzung p-Nitroanilin wird bei 410 nm überwacht (Ramesh et al., 1994, Infection and Immunity, Jan. 79–85).

Homologe des fraglichen alkalischen Proteasegens im vorstehend erwähnten Schritt i) können entweder durch Kreuzhybridisierung mit einem vorher identifizierten Gen für alkalische Protease oder durch Komplementierung von alkalischen Proteasemutanten kloniert werden.

Die Abwesenheit von messbarer alkalischer Proteaseaktivität kann aus einer Deletion in einer Sequenz, die für die Synthese eines alkalischen Proteasegenprodukts essentiell ist, erhalten werden.

Ein reduzierter Grad an alkalischer Proteaseaktivität kann aus einer unvollständigen Inaktivierung der gesamten alkalischen Proteasegene herrühren oder zur Expression von alkalischen Proteasegenprodukten mit reduzierter Funktionalität führen.

In Verbindung mit dem vorstehend erwähnten Klonieren können DNA-Konstrukte konstruiert werden, die in das alkalische Proteasegen zu integrieren sind, oder alternativ dazu kann das alkalische Proteasegen deletiert und mit einem anderen Gen wie dem pyrG-Gen, argB-Gen, sC-Gen, oder hph-Gen substituiert werden.

Ist das Gen das alp-Gen, können die isolierten Transformanten alp oder alp&Dgr; sein.

Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft das Verfahren zur Herstellung der Pilze, wobei die Inaktivierung unter Verwendung von Antisense-Technologie erhalten wird, wobei ein derartiges Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

  • i) Konstruktion eines Expressionsplasmids, das bei der Synthese eines RNA-Moleküls, das zu dem aus dem alkalischen Proteasegen transkribierten mRNA-Molekül komplementär ist, erhalten wird,
  • ii) Transformation der Wirtspilzzelle mit dem Expressionsplasmid und einer geeigneten Markierung, entweder auf separaten Plasmiden oder auf demselben Plasmid
  • iii) Selektion von Transformanten unter Verwendung der Markierung und
  • iv) Durchmustern von Transformanten auf einer Reduktion bei der Synthese des alkalischen Proteaseprodukts.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst DNA-Konstrukte zur Verwendung in den vorstehend erwähnten Verfahren.

In Bezug auf die Verfahren, die DNA-Konstrukte der Erfindung betreffen, können die DNA-Konstrukte das alkalische Proteasegen wie das alp-Gen umfassen, wobei ein Teil einer internen Sequenz durch Nukleotidsubstitution, -deletion oder -einfügung modifiziert wurde.

Das DNA-Konstrukt kann weiterhin auch DNA-Sequenzen umfassen, die ein Polypeptidprodukt von Interesse kodieren, wie diejenigen, die hier nachstehend erwähnt sind.

In Bezug auf die vorstehend erwähnten Anti-Sense-Verfahren kann das DNA-Konstrukt eine umgekehrte DNA-Sequenz eines alkalischen Proteasegens, verbunden mit einem funktionellen Promoter umfassen, wobei die mRNA zumindest teilweise zu einer aus einem alkalischen Proteasegen hergestellten mRNA komplementär ist.

Das Verfahren

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von heterologen Polypeptiden, vorzugsweise ein sekretiertes Genprodukt, wobei der A. oryzae der Erfindung in einem geeigneten Wachstumsmedium bei geeigneten Bedingungen gezüchtet wird, wodurch das gewünschte Genprodukt gewonnen und gereinigt wird.

Bei der Herstellung von heterologen Polypeptiden, z.B. Enzymen, hängt die Wahl des Fermentations-pH-Werts häufig von Faktoren wie der zu verwendenden Wirtszelle, dem von der Wirtszelle benötigten Wachstumsmedium und der Stabilität des Polypeptids ab. Demzufolge ist es vorteilhaft, obwohl der A. oryzae der Erfindung für ein beliebiges bei einem beliebigen pH-Wert durchgeführten Fermentationsverfahren verwendet werden kann, dass das Fermentationsverfahren bei einem pH-Wert durchgeführt wird, bei welchem die Aktivitäten der endogenen sauren und/oder neutralen Proteasen, die durch die Wirtszelle hergestellt werden, inaktiviert oder zumindest deutlich reduziert werden. Folglich wird, wenn das Fermentationsverfahren bei einem pH-Wert z.B. von 5 bis 11 wie 6 bis 10,5, 7 bis 10 oder 8 bis 9,5 durchgeführt wird, der Aktivitätsgehalt von sauren Proteasen (wie Aspartam- und Serinproteasen) sowie von neutralen Proteasen im pH-Bereich über 7 reduziert und kann inaktiv werden. Damit weist die Entfernung von Aspartamproteasen, wie beschrieben in WO 90/00197, nur eine beschränkte Wirkung auf die Produktionsausbeute auf.

Jedoch können im alkalischen pH-Bereich alkalische Proteasen in einer unmodifizierten Wirtszelle aktiv und der Hauptgrund für einen Abbau der Polypeptidprodukts von Interesse sein. Demzufolge ist in derartigen Fällen die Inaktivierung eines (von) Gens (Genen), das (die) alkalische Proteaseaktivität kodiert (kodieren), besonders vorteilhaft.

Die Inaktivierung eines (von) alkalischen Proteasegens (-genen) der Erfindung ist auch besonders vorteilhaft für bestimmte Wirte, da die saure, neutrale und alkalische Proteaseaktivität unter den verschiedenen Pilzspezies variiert. Zum Beispiel ist die alkalische Proteaseaktivität in Aspergillus oryzae höher als in Aspergillus niger.

Beispiele für Enzyme, die unter Fermentationsbedingungen im vorstehend beschriebenen alkalischen pH-Bereich hergestellt werden können, schließen Endoglucanasen, Phytasen, Proteasen, Lipasen, Cutinasen, Cellulasen, Chymosine, Peroxidasen und Proteindisulfideisomerasen ein.

Das gewünschte heterologe Polypeptid kann durch herkömmliche Verfahren, einschließlich Abtrennen der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, falls nötig nach Zerstörung der Zellen, Ausfällen der proteinhaltigen Bestandteile des Überstands oder Filtrats mittels eines Salzes, z.B. Ammoniumsulfat, gefolgt von Reinigung durch beliebige einer Vielzahl von chromatographischen Verfahren, z.B. Ionenaustauschchromatografie, Affinitätschromatografie und dergleichen aus dem Medium gewonnen werden.

Das heterologe Polypeptid

Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist das gewünschte Polypeptid ein „heterologes Polypeptid", was ein Polypeptid bedeutet, das für die Pilzwirtszelle der Erfindung nicht nativ ist, oder ist ein natives Polypeptid, in welchem Modifikationen durchgeführt wurden, um die native Sequenz abzuändern (d.h. genetische Varianten), oder ist ein natives Polypeptid, dessen Expression infolge einer Manipulation einer nativen regulatorischen Sequenz, die zur Expression des nativen Polypeptids erforderlich ist, oder infolge einer beliebigen anderen Manipulation des Pilzes der Erfindung durch rekombinante DNA-Techniken quantitativ abgeändert wurde.

Das durch den Pilz der Erfindung exprimierte heterologe Polypeptid kann auch ein Vorläuferprotein, z.B. ein Zymogen, ein Hybridprotein, ein Protein, das als Pro-Sequenz oder Präpro-Sequenz erhalten wird oder in einer anderen unreifen Form vorliegt, sein.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Produkt ein Enzym, insbesondere ein Glycosidaseenzym, z.B. eine Amylase, insbesondere eine &agr;-Amylase oder eine &bgr;-Amylase; eine Cellulase, insbesondere eine Endo-1,4-&bgr;-glucanase (EC 3.2.1.4) oder eine Endo-1,3-&bgr;-glucanase (3.2.1.6); eine Xylanase, insbesondere eine Endo-1,4-&bgr;-xylanase (EC 3.2.1.8) oder eine Xylanendo-1,3-&bgr;-xylosidase (EC 3.2.1.32); eine &agr;-Galactosidase (EC 3.2.1.22); eine Polygalacturonase (EC 3.2.1.15); eine Cellulose 1,4-&bgr;-Cellobiosidase (EC 3.2.1.91); und eine Endoglucanase, insbesondere eine Endo-1,6-&bgr;-glucanase (EC 3.2.1.75), eine Endo-1,2-&bgr;-glucanase (EC 3.2.1.71), eine Endo-1,3-&bgr;-glucanase (EC 3.2.1.39) oder eine Endo-1,3-&agr;-glucanase (EC 3.2.1.59).

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Produkt ein eukariontisches Polypeptid wie Insulin, Wachstumshormon, Glucagon, Somatostatin, Interferon, PDGF, Faktor VII, Faktor VIII, Urokinase, Erythropoetin, Chymosin, Gewebeplasminogenaktivator, Serumalbumin oder Thrombopoetin.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Produkt ein Protein pilzlichen Ursprungs. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Produkt ein Pilzenzym, z.B. ein amylolytisches Enzym wie eine &agr;-Amylase, eine &bgr;-Amylase, eine Glucoamylase, eine &bgr;-Galactosidase, eine Phytase, ein cellulytisches Enzym, ein lipolytisches Enzym, ein xylanolytisches Enzym, ein proteolytisches Enzym, eine Oxidoreduktase wie eine Peroxidase oder eine Laccase, eine Pektinase, eine Cutinase und eine Proteindisulfidisomerase.

In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Produkt ein bakterielles Protein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Produkt ein bakterielles Enzym; insbesondere ein amylotytisches Enzym, z.B. eine &agr;-Amylase oder eine &bgr;-Amylase; eine Glucoamylase; eine &bgr;-Galactosidase; ein cellulytisches Enzym; ein lipolytisches Enzym und ein proteolytisches Enzym.

Bevorzugte Hybridpolypeptide sind Prochymosin und pro-Trypsin-artige Proteasen.

Die Erfindung wir detaillierter in den nachstehend angegebenen Beispielen erklärt. Diese sollten jedoch in keinster Weise als Einschränkung des wie in den anhängigen Ansprüchen definierten Umfangs der Erfindung angesehen werden. BEISPIELE Materialien und Verfahren Stämme Aspergillus oryzae IFO 4177: erhältlich vom Institute for Fermention, Osaka; 17–25 Juso
Hammachi 2-Chome Yodogawa_ku, Osaka, Japan. JaL125: Die Konstruktion dieses Stamms ist in den Beispielen beschrieben.
Gene alp: Dieses Gen kodiert für die in SEQ ID NR. 1 dargestellte alkalische Protease pyrG: Dieses Gen kodiert für Orotidin-5'-phosphatdecaroxylase, ein Enzym, das bei der Biosynthese von Uridin beteiligt ist.
Plasmide pSO2: Hergestellt gemäß Beispiel 1. pSO5: Hergestellt aus SO2 gemäß Beispiel 1. pSRe403: Hergestellt gemäß Beispiel 1. pSX320: Die Konstruktion dieses Plasmids ist in der EP-Anmeldung NR. 0 531 372 B1 beschrieben. pToC90: Ein Subklon von p3SR2, das das amdS-Gen von Aspergillus nidulans als XbaI-Fragment mit 2,7 kb (Corrick et al., 1987, Gene 53: 63–71), auf einem pUC19-Vektor (Yannisch-Perron et al., 1985, Gene 33: 103–119), hergestellt wie in WO 91/17243 beschrieben, beherbergt. Bluescript SK- M.A. Alting-Mees and Short, J.M.,1989, Nucleic Acids Res. 17: 9494–9494 pUC18 und pUC118: Viera and Messing, 1987, J. Meth. Enzymol. 153: 3–11

BEISPIEL 1 Genomische Deletion der alkalischen Protease von Aspergillus oryzae

Das alp-Gen wurde durch ein einstufiges Genersatzverfahren (G. May in Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, 1992, Seite 1–25. J. R. Kinghorn und G. Turner, Hrgb.; Blackie Academic and Professional) deletiert. Die verwendete Markierung war das pyrG-Gen von A. oryzae, der Stamm von A. oryzae, der verwendet wurde, war ein pyrG-Stamm.

Klonieren des pyrG-Gens von Aspergillus oryzae

Das pyrG-Gen von A. oryzae wurde durch Kreuzhybridisierung mit einem pyrG-Gen von A. niger kloniert (W. van Hartingsveldt et al., 1987, Mol. Gen. Genet. 206: 71–75). Eine Lambdabibliothek von teilweise mit SauIIIA verdauter DNA von A. oryzae IFO 4177 wurde mit niedriger Stringenz mit einem DNA-Fragment mit 1 kb aus dem pyrG-Gen von A. niger sondiert. DNA von einem positiven Klon wurde in einen pUC118-Vektor subkloniert. Es zeigte sich, dass das erhaltene Plasmid pSO2 durch Komplementation mit einer pyrG-Mutante von A. niger das pyrG-Gen enthielt.

Konstruktion eines pyrG-minus-Stamms von Aspergillus oryzae

Ein pyrG-Deletionsplasmid pSO5, enthaltend etwa 1 kb pyrG-Flankierungssequenzen an jedem Ende, wurde aus dem Plasmid pSO2 konstruiert. A. oryzae IFO 4177 wurde mit diesem Konstrukt transformiert, und die Transformanten wurden durch Resistenz gegen 5-Fluororotinsäure, einem für pyrG-Mutanten charakteristischen Phenotyp selektiert. Es zeigte sich durch Southern-Analyse, dass ein Transformant, HowB101, die erwartete Deletion am pyrG-Ort aufwies. Indem er eine pyrG-Mutante ist, benötigt HowB101 Uridin zum Wachstum. HowB101 kann mit dem pyrG-Gen vom Wildtyp durch Selektion auf die Fähigkeit zum Wachsen ohne Uridin transformiert werden.

Die Schritte, die an der Konstruktion von HowB101 beteiligt sind, sind in 1 veranschaulicht.

Konstruktion eines alp-minus-Stamms von Aspergillus oryzae

Ein al-Stamm von Aspergillus oryzae wurde durch Transformieren des Stamms HowB101 von A. oryzae mit dem alp-Deletionsplasmid pJaL212 konstruiert.

Konstruktion des Zerstörungsplasmids pJaL212 der alkalischen Proteaase

Eine genomische Bibliothek von A. oryzae IFO 4177 wurde durch teilweises Verdauen von genomischer DNA mit Sau3A etabliert. Fragmente wurden an mit BamHI verdautes pUC19 ligiert. Die Bibliothek wurde unter Verwendung von degenerierten Oligonukleotiden auf bekannte Proteinsequenzfragmente des alkalischen Proteasegenprodukts durchgemustert. Ein Plasmid, enthaltend ein Sau3A-Fragment mit 3,9 kb, wurde auf diese Weise isoliert. Dieses Plasmid wurde als pSRe403 bezeichnet.

pSRe403 wurde mit SacII verdaut, und das Fragment mit 5,6 kb wurde isoliert und unter Bildung von pSRe403_SacII religiert. Dieses Plasmid wurde teilweise mit HindIII verdaut, die Enden wurden unter Verwendung von Klenow-Polymerase gefüllt und religiert, um die HindIII-Stelle in pUC19 zu entfernen. Das erhaltene Plasmid wurde als pJaL173 bezeichnet. pJaL173 wurde mit HindIII verdaut, und das HindIII-Fragment mit 3,8 kb, enthaltend das pyrG-Gen von pSO2, wurde in pJaL173 unter Bildung von pJaL212 eingefügt. Die Konstruktion von pJaL212 ist in 2 umrissen.

Isolation eines alp-minus-Stamms von A. oryzae

A. oryzae HowB101 wurde mit dem SacI-SphI-Fragment mit 6,8 kb von pJaL212 unter Verwendung von Standardverfahren transformiert. Dieses Fragment besteht aus 1,5 kb des alp-Promoters, dem pyrG-Gen und 1,5 kb des 3'-Endes das alp-Gens. Die Transformanten wurden auf ihre Fähigkeit zum Wachsen in Abwesenheit von Uridin selektiert. Nach Reisolation wurde chromosomale DNA aus 12 Transformanten hergestellt, die DNA wurde mit PstI geschnitten und durch Southern-Analyse mit einem PstI/SacII-Fragment mit 599 bp von pJaL173 enthaltenden Teils des alp-Gens als radioaktive Markierungssonde analysiert. Transformanten, die eine Deletion des alp-Gens tragen, werden durch die Verschiebung der PstI-Bande vom Wildtyp von 1,0 kb zu einer Bande von 1,9 kb leicht erkannt.

In vier Transformanten verschob sich die PstI-Bande mit 1,0 kb zu der Bande mit 1,9 kb. Einer dieser Transformanten wurde als JaL125 bezeichnet.

Die an der Konstruktion von JaL125 beteiligten Schritte sind in 3 veranschaulicht.

BEISPIEL 2 Herstellung einer Endoglucanase mit 45 kD im Stamm JaL125 von A. oryzae

Die Stämme IFO 4177 und JaL125 von A. oryzae wurden mit dem Plasmid pSX320 (4), bei welchem es sich um ein Pilzexpressionsplasmid für die Endoglucanase mit 45 kD von Humicola insolens handelt, durch Kotransformation mit pToC90 transformiert. Die Konstruktion des Plasmids pSX320 wurde früher in EP 0 531 372 beschrieben.

Die Transformanten wurden auf Wachstum auf Minimalmedium, enthaltend 10 mM Acetamid, selektiert und auf die Gegenwart von pSX320 durch die Fähigkeit zur Herstellung von Carezyme® durchgemustert.

Ein Transformant von jedem Stamm wurde selektiert, und man ließ ihn bei 30°C in Schüttelkolben, enthaltend 100 ml Maltodextrin, Sojabohnenmehl und Pepton für eine Dauer von 5 Tagen wachsen. Proben der Fermentationsbrühe wurden jeden Tag entnommen und durch SDS-PAGE analysiert. Die Ausbeute der Endoglucanase mit 45 kD wurde aus den mit Coomassie Blue gefärbten Proteinbanden unter Verwendung des Gelabtastsystems Biolmage (Biolmage System, UK) quantifiziert. Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen an, dass mehr Endoglucanase mit 45 kD in der Fermentationsbrühe der Stämme, in welchen das alp-Gen deletiert wurde, als im Stamm vom Wildtyp, der das alp-Gen enthält, vorliegt. Dies gibt an, dass die Stabilität der Endoglucanase durch Deletieren des alp-Gens verbessert wird.

SEQUENZLISTE

Anspruch[de]
  1. Zelle von Aspergillus oryzae, die zur Herstellung von heterologen Polypeptiden nützlich ist und durch rekombinante DNA-Technologie in einer Weise modifiziert wurde, in welcher eine endogene alkalische Proteaseaktivität, die in einem alp-Gen mit der in SEQ ID NR. 1 dargestellten Sequenz oder einer DNA-Sequenz mit einer mindestens 80%igen Identität davon kodiert ist, vollständig oder teilweise inaktiviert wurde.
  2. Zelle nach Anspruch 1, wobei die Inaktivierung durch Nukleotiddeletion, -einfügung oder -substition in einer ein alkalisches Proteasegenprodukt kodierenden Sequenz erhalten wird.
  3. Zelle nach Anspruch 1, wobei die Inaktivierung durch Stören der Regulierung der die Expression des alkalischen Proteasegens regulierenden Expressionssignale erhalten wird.
  4. Zelle nach Anspruch 1, wobei die Inaktivierung unter Verwendung von Anti-Sense-Technologie erhalten wird.
  5. Verfahren zur Herstellung einer Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Inaktivierung des alkalischen Proteasegens durch Folgendes erhalten wird:

    i) Klonen des fraglichen alkalischen Proteasegens von einem Pilz von Interesse,

    ii) Herstellen eines das alkalische Proteasegen umfassenden DNA-Konstrukts, wobei ein Teil des Gens wie ein innerer Teil substituiert, deletiert oder eine zusätzliche DNA in das Gen eingefügt wurde,

    iii) Transformieren des Pilzes mit den DNA-Kosntrukten und

    iv) Isolieren der Transformanten, aus welchen

    1) keine alkalische Proteaseaktivität bestimmt werden kann,

    2) ein reduzierter Gehalt an alkalischer Proteaseaktivität bestimmt werden kann oder

    3) (eine) alkalische Protease(n), die ihre Funktion verloren, erhalten werden kann (können).
  6. Verfahren zur Herstellung einer Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Inaktivierung des alkalischen Proteasegens unter Verwendung von Anti-Sense-Technologie erhalten wird, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

    i) Konstruktion eines Expressionsplasmids, das bei der Synthese eines RNA-Moleküls, das zu dem aus dem alkalischen Proteasegen transkribierten mRNA-Molekül komplementär ist, erhalten wird,

    ii) Transformation der Wirtspilzzelle mit dem Expressionsplasmid und einer geeigneten Markierung,

    iii) Selektion von Transformanten unter Verwendung der Markierung und

    iv) Durchmustern von selektierten Transformanten auf einer Reduktion bei der Synthese des fraglichen alkalischen Proteaseprodukts.
  7. Verfahren zur Herstellung einer Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zelle durch ein Verfahren, umfassend das Transformieren einer parentalen Zelle des Pilzes mit einem DNA-Konstrukt, das beim Integrieren in das Genom des Pilzes eine reduzierte Herstellung einer funktionellen alkalischen Protease bewirken kann, so modifiziert wird, dass niedrigere Gehalte an alkalischer Protease als beim Wildtyp hergestellt werden.
  8. Verfahren zur Herstellung von heterologen Polypeptiden, umfassend das Züchten einer Pilzwirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die mit einer ein gewünschtes Genprodukt kodierenden DNA-Sequenz transformiert wurde.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Polypeptid in das extrazelluläre Medium durch die Pilzwirtszelle sekretiert wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Polypeptid aus dem Kulturmedium gewonnen und gereinigt wird.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die Fermentation bei einem pH-Wert von 5 bis 11, vorzugsweise 6 bis 10,5 wie 7 bis 10, insbesondere 8 bis 9,5 durchgeführt wird.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei das gewünschte Genprodukt ein Enzym, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend ein Glycosidaseenzym, z.B. eine Amylase, insbesondere eine alpha-Amylase oder eine beta-Amylase, eine Cellulose, insbesondere eine Endo-1,4-beta-glucanase oder eine Endo-1,3-beta-glucanase, eine Xylanase, insbesondere eine Endo-1,4-beta-xylanase oder eine Xylanendo-1,3-beta-xylosidase, eine alpha-Galactosidase, eine Polygalacturonase, eine Cellulose-1,4-beta-cellobiosidase und eine Endoglucanase, insbesondere eine Endo-1,6-beta-glucanase, eine Endo-1,2-beta-glucanase, Endo-1,3-beta-glucanase oder eine Endo-1,3-alpha-glucanase, ist.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei das gewünschte Genprodukt ein eukaryotisches Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Insulin, Wachstumshormon, Glucagon, Somatostatin, Interferon, PDGF, Faktor VII, Faktor VIII, Urokinase, tPA, EPO und TPO, ist.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei das heterologe Polypeptid ein Protein pilzlichen Ursprungs ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Produkt ein Pilzenzym, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend ein amylolytisches Enzym wie eine alpha-Amylase, eine beta-Amylase, eine Glucoamylase, eine beta-Galactosidase, eine Phytase, ein cellulytisches Enzym, ein lipolytisches Enzym, ein xylanolytisches Enzym, ein proteolytisches Enzym, eine Oxidoreduktase wie eine Peroxidase oder eine Laccase, eine Pektinase, eine Cutinase und eine Proteindisulfidisomerase, ist.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei das heterologe Polypeptid bakteriellen Ursprungs ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Bakterienprotein ein Enzym, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend ein amylolytisches Enzym, eine Glucoamylase, eine beta-Galactosidase, ein cellulytisches Enzym, ein lipolytisches Enzym und ein proteolytisches Enzym, ist.
Es folgen 5 Blatt Zeichnungen






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