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Dokumentenidentifikation DE69333855T2 28.09.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000957162
Titel Aus einer mit einem Stamm von Multiple-Sklerosis-Virus infizierten Zellinie hergestelltes biologisches Virusmaterial
Anmelder Bio Merieux, Marcy l'Etoile, FR
Erfinder Perron, Herve, 69005 Lyon, FR;
Seigneurin, Jean-Marie, 39190 Bernin, FR
Vertreter Witte, Weller, Gahlert, Otten & Steil, 70178 Stuttgart
DE-Aktenzeichen 69333855
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument FR
EP-Anmeldetag 02.04.1993
EP-Aktenzeichen 991138967
EP-Offenlegungsdatum 17.11.1999
EP date of grant 10.08.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 28.09.2006
IPC-Hauptklasse C12N 7/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 5/08(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 5/10(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/38(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/85(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Gegenstand der vorliegende Erfindung ist ein isolierter viraler Virus-Stamm, der mit der Multiplen Sklerose verbunden ist, und als POL-2 benannt ist. Dieser Stamm ist in der Zelllinie PLI-2 enthalten, welche Gegenstand der europäischen Stammanmeldung 93 908 989.2 (EP-587 873) ist, sowie ein Verfahren zu dessen Gewinnung.

Multiple Sklerose (MS) ist eine Entmarkungskrankheit des zentralen Nervensystems (ZNS), von der man seit mehreren Jahren annimmt, dass sie mit einem Virus assoziiert ist, obwohl das ursächliche Agens noch nicht mit Sicherheit bestimmt worden ist.

Zahlreiche Arbeiten haben diese Hypothese einer viralen Ätiologie dieser Krankheit untermauert, aber keines der getesteten, bekannten Viren hat sich als das gesuchte, ursächliche Agens erwiesen.

Später hat die Beobachtung von einer Autoimmunreaktion vergleichbaren Phänomenen bei diesen an multipler Sklerose erkrankten Patienten zu einer "essentiellen" ätiologischen Autoimmun-Hypothese geführt (Lisak R.P., Zweiman B. New Engl. J. Med. 1977; 297; 850–853, und Lassmann H. und Wisniewski H.M. Arch. Neurol. 1979; 36, 490–497). Mittlerweile hat sich diese gegen bestimmte Komponenten des Zentralnervensystems gerichtete "Autoimmunität" als wenig spezifisch für MS und als häufig in Entzündungen des ZNS erwiesen, die mit einer Infektion in Zusammenhang stehen oder auch nicht, wie es gezeigt wurde von Hirayama M. et al. (Neurology 1986; 36, 276–8), Kenneth G. Warren et al. (Annals of Neurology 1986; 20, 20–25); Suzumura A. et al. (Journal of Neuroimmunology 1986; 11, 137–47) und Tourtelotte W. et al. (Journal of Neurochemistry 1986; 46, 1086–93). Darüber hinaus hat keine der immunosuppressiven Therapien es ermöglicht, entscheidende Ergebnisse gegen MS zu erreichen, worauf E.J. Field (The Lancet 1989; 1, 1272) aufmerksam gemacht hat.

Es wurde eine Hypothese aufgestellt, gemäß der ein Retrovirus am Anfang dieser Krankheit stehen soll. Die Entdeckung von A. Gessain et al. (J. Infect. Disease 1988; 1226–1234) von neurologischen Syndromen, die mit dem HTLV-1-Virus assoziiert sind, das bekannt ist als Ursprung sowie Agens der T-Leukämie von Erwachsenen, hat zahlreiche Autoren wie H. Koprowski et al. (Nature 1985; 318, 154), M. Ohta et al. (J. Immunol. 1986; 137, 3440), E.P. Reddy et al. (Science 1989; 243, 529), S.J. Greenberg et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989; 86, 2878), J.H. Richardson et al. (Science 1989; 246, 821), S.L. Hauser et al. (Nature 1986; 322, 176) und A. Karpas et al. (Nature 1986; 322, 177) dazu geführt, nach einer Beteiligung dieses humanen Retrovirus an MS zu suchen, jedoch ohne Erfolg oder mit Resultaten, die an Kreuzreaktionen erinnern.

Es existiert übrigens ein Tiermodell, das der MS sehr nahe kommt und durch ein Retrovirus induziert wird: das Schafsvirus MAEDI-VISNA. Es ist bekannt, dass die natürliche Infektion mit diesem Virus eine Schafskrankheit hervorruft, die MS nahe kommt, wie es berichtet wird von Johnson R.T. (Rev. Infect. Dis. 1985; 7, 66–67), Narayan O. und Cork L.C. (Rev. Infect. Dis. 1985; 7, 89–98) und Nathanson N. et al. (Rev. Infect. Dis. 1985; 7, 75–82). Die experimentelle Infektion von Schafen durch intra-ventrikuläre Inokulation von neuro-virulenten Stämmen des VISNA-Virus hat es ermöglicht, die Verantwortung dieses Virus bei der Entstehung dieser Demyelinisations-Krankheit des Schafes festzustellen. Wie es Nathanson N. et al. (Rev. Infect. Dis. 1985; 7, 75–82), Hoffman P.M. und Panitch H.S. ("Handbook of Clinical Neurology, 12; Viral diseases" R.R. Mc Kendall, ed., Elsevier Science Publishing, Amsterdam, 1989, 453–466) und A. Haase (Nature 1986; 322, 130–136) erklären, unterscheidet sie sich ein bisschen von der natürlichen Infektion, bleibt jedoch trotzdem dicht bei der MS. Es ist übrigens interessant zu bemerken, dass in der Gesamtheit der von den vorstehend erwähnten Autoren auf diesem Gebiet durchgeführten Arbeiten das VISNA-Virus in den Zellen des Plexus Choroidei des Gehirns von infizierten Schafen vorgefunden wurde, wobei diese Zellen eine Basis für die Latenz und die gelegentliche Replikation des VISNA-Provirus bilden; die Lokalisation dieser Zellen an der cerebrospinalen Blut-Liquor-Schranke erklärt dieses Phänomen sicherlich.

All diese Resultate sprechen für die Rolle eines unbekannten Retrovirus in der MS.

Kürzlich haben es die Arbeiten von H. PERRON et al. (Res. Virol. 1989; 140, 551–561 in "Current concepts in multiple sclerosis" Wiethölter et al., eds. Amsterdam, Elsevier, 1991, S. 111–116 und The Lancet 1991; 337, 862–863) erlaubt, ausgehend von einer Lumbalpunktion des cerebrospinalen Liguor eines an MS leidenden Patienten eine nicht-lymphoidische Zelllinie zu isolieren und in dem Überstand von Zellkulturen dieser Linie die Anwesenheit eines Virus nachzuweisen, das die Eigenschaften eines Retrovirus hat und insbesondere eine Reverse-Transkriptase-Aktivität aufweist. Die elektronenmikroskopische Untersuchung von Zellen dieser Linie hat es erlaubt, virale Partikel mit einem Durchmesser zwischen ungefähr 110 und 140 nm zu zeigen, wobei die Größe der Partikel in Abhängigkeit davon variiert, ob es sich um reife oder unreife Partikel handelt. Eine serologische Untersuchung mit der ELISA-Technik und unter Verwendung eines zellulären Extraktes von infizierten Zellen dieser Linie konnte übrigens zeigen, dass bei 40 Seren von Patienten, unter denen 20 an MS erkrankt waren (MS sicher) und 20 mutmaßliche Kranke waren (MS wahrscheinlich), 60 % der Resultate positiv waren. Eine vergleichende Untersuchung mit 40 Seren von an anderen neurologischen Krankheiten als MS erkrankten Patienten hat nicht mehr als 5 % positive Resultate ergeben. Diese Linie, die die Autoren LM7 genannt haben, ist klonal und nicht unsterblich und ihre immunzytochemische sowie ultrastrukturelle Untersuchung hat es ermöglicht, ihren leptomeningitischen Ursprung zu charakterisieren.

Dieses Virus hat sich mittlerweile als sehr schwierig zu untersuchen erwiesen, weil es einerseits in vitro in der primären Zelllinie leptomeningitischen Ursprungs nur sehr schwach exprimiert wird, und weil andererseits diese Zelllinie nach etwa dreißig Passagen durch Verlust ihres mitotischen Vermögens ziemlich schnell degeneriert, derart, dass sie keine weitere virale Expression erlaubt.

Die Autoren haben auch einen neuen Ansatz in Betracht gezogen (H. Perron et al., The Lancet, Band 337, 862–863, (1991)), der darin besteht, bei einem an MS erkrankten Patienten eine Blutprobe zu nehmen, eine Kultur von Monozyten anzulegen und den Überstand zu entnehmen, um die Expression einer Reverse-Transkriptase-Aktivität zu verifizieren, entweder direkt im Sediment einer Ultrazentrifugation oder nach Gleichgewichtssedimentation auf Saccharosegradienten. Auf diese Weise wurde ein Peak in der Aktivität der Reverse-Transkriptase in dem Überstand bei den an MS erkrankten Patienten gezeigt, und dass sich diese Aktivität in der Fraktion mit der Dichte von ungefähr 1,17 g/ml wiederfindet. Eine Untersuchung von infizierten Zellen im Elektronenmikroskop hat den Retroviren vergleichbare Partikel von 100 bis 120 nm zeigen können, die sich in den Sedimentationen der Ultrazentrifugation von Überständen von Kulturen wiederfinden, die eine erhöhte Reverse-Transkriptase-Aktivität zeigen. Die Zelltrümmer und möglicherweise virale Partikel enthaltenden Sedimente der Zentrifugation sind daraufhin auf den Abwehr-Blutzellen kultiviert worden, um eine virale Expression zu zeigen. Wie von den Autoren berichtet, ist mittlerweile ein cytopathogener Effekt in den infizierten Abwehr-Blutzellen beobachtet worden, der aber nach sechs Wochen nicht mehr detektierbar ist, so dass diese Art der Kultur für eine vertiefte Untersuchung der Eigenschaften dieses Virus nicht zufriedenstellend ist.

Es ist daher unbedingt notwendig, ein Verfahren zur in vitro Kultivierung von mit diesem Virus infizierten Zellen bereitzustellen.

Es wurde eine Hypothese aufgestellt und verifiziert, gemäß der permissive Zellen des humanen Plexus Choroidei für das bei an MS erkrankten Patienten gefundene Virus permissive Zellen sein können. Auf der Basis dieser Entdeckung wurde ein Verfahren zur in vitro Kultur von mit einem mit MS assoziierten Virus infizierten Zellen entwickelt.

Das Verfahren besteht darin, Zellen des Plexus Choroidei, die nach postmortaler Explantation des humanes Plexus Choroidei erhalten wurden, in einem geeigneten Milieu in Kultur zu nehmen, das Aminosäuren, Vitaminfaktoren, anorganische Salze und Glukose enthält, jeweils in Gesamtgewichtskonzentrationen zwischen 400 und 2250 mg/l, 3,5 und 130 mg/l, 9100 und 1300 mg/l bzw. 1000 und 6000 mg/l, vorteilhafterweise ergänzt durch einen Wachstumsfaktor wie ECGF ("Endothelzellen-Wachstumsfaktor"), um das Wachstum der Zellen zu begünstigen, und wenigstens ein Antibiotikum, und die so kultivierten Zellen des Plexus Choroidei in ihrem Kulturmedium mit infizierten primären oder abgeleiteten Zellen oder einem das Virus enthaltenden Kulturüberstand unter bestimmten Bedingungen in Kontakt zu bringen, die die Propagation des Virus der infizierten Zellen in den kultivierten Zellen, dessen Replikation sowie dessen Expression ermöglichen.

Unter von primären Zellen abgeleiteten Zellen versteht man eine beliebige Kultur, die direkt oder indirekt ausgehend von den genannten primären Zellen erhalten wird, z.B. durch Konservierung bei tiefer Temperatur oder Aufrechterhaltung der Viabilität der genannten Zellen. Es kann sich z.B. um in einer Sammlung hinterlegte Referenzzellen handeln.

Obwohl verfügbar, beruht die Propagation des Virus ausgehend von einigen infizierten Zellen jedoch relativ beschränkt auf der Abfolge von sukzessiven Passagen und benötigt zahlreiche Passagen, um ein hinreichendes Expressionsniveau zu erhalten. Da die Lebensdauer dieser Zellen in Kultur begrenzt ist, geschieht es nicht häufig, dass in den letzten Passagen die Expression quantifizierbar wird, was den Wert des genannten Verfahrens merklich begrenzt.

Die Arbeiten der vorliegenden Erfinder haben diese dazu geführt, dass sie völlig überraschend die Produktion von Interferon Beta durch die Zellen des Plexus Choroidei in Antwort auf einen viralen Angriff aufzeigen konnten. Bis heute war jedoch nur von den Fibroblasten, Epithelzellen und Makrophagen bekannt, dass sie Interferon Beta produzieren (Interferon: Principles and Medical Applications, the University of Texas Medical Branch at GALVESTON, Department of Microbiology, GALVESTON, TX, 1992). Die Wirkungen der Interferone sind gut bekannt, sie induzieren insbesondere bei Zellen einen die Synthese und die Replikation von viralem Material hemmenden Zustand, wodurch sie so die Propagation und die Produktion von Viren in Kultur inhibieren. Es wurde unter diesen Umständen sehr wahrscheinlich, dass die Produktion von Interferon Beta bei den Zellen des Plexus Choroidei ein ausschlaggebender limitierender Faktor in dem in vitro Kulturverfahren von Zellen sein kann, die mit einem Virus infiziert sind, das bei an Multipler Sklerose erkrankten Individuen vorhanden ist.

Auf der Basis dieser unerwarteten Entdeckung haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung ein neues Kulturmedium hergestellt, welches in einem in vitro Kulturverfahren von Zellen verwendbar ist, die mit einem Virus infiziert sind, der bei an MS erkrankten Patienten zu finden ist.

Ein geeignetes Kulturmedium für das in vitro Kulturverfahren von mit einem Virus infizierten Zellen, das bei an Multipler Sklerose erkrankten Individuen vorhanden ist, umfasst, neben Aminosäuren, Vitaminfaktoren, anorganischen Salzen und Glukose, jeweils in Gesamtgewichtskonzentrationen zwischen 400 und 2250 mg/l, 3,5 und 130 mg/l, 9100 und 13000 mg/l, und 1000 und 6000 mg/l, und mindestens einen Anti-Interferon Beta Antikörper.

Noch genauer umfasst das Medium zumindest die folgenden Bestandteile:

  • – Eine oder mehrere Aminosäuren, ausgesucht unter den folgenden Verbindungen, nämlich:

    Arginin: 100 bis 500 mg/l, vorzugsweise 100 bis 300 mg/l

    Zystein und/oder Zystin: 25 bis 300 mg/l, vorzugsweise

    Zystin: 25 bis 100 mg/l

    Glutamin: 200 bis 1000 mg/l, vorzugsweise 200 bis 500 mg/l

    Histidin: 5 bis 50 mg/l, vorzugsweise 5 bis 20 mg/l

    Isoleucin: 20 bis 100 mg/l, vorzugsweise 20 bis 60 mg/l

    Leucin: 20 bis 100 mg/l, vorzugsweise 20 bis 60 mg/l

    Lysin: 20 bis 100 mg/l, vorzugsweise 20 bis 80 mg/l

    Methionin: 5 bis 50 mg/l, vorzugsweise 5 bis 30 mg/l

    Phenylalanin: 10 bis 70 mg/l, vorzugsweise 10 bis 50 mg/l

    Threonin: 15 bis 100 mg/l, vorzugsweise 15 bis 60 mg/l

    Tryptophan: 2 bis 30 mg/l, vorzugsweise 2 bis 25 mg/l

    Tyrosin: 10 bis 70 mg/l, vorzugsweise 10 bis 50 mg/l

    Valin: 10 bis 80 mg/l, vorzugsweise 10 bis 60 mg/l
  • – ein oder mehrere Vitamine, ausgewählt aus den folgenden Verbindungen:

    Panthothenat: 0,15 bis 5 mg/l, vorzugsweise Kalziumsalz: 0,15 bis 2 mg/l

    Cholin: 0,5 bis 10 mg/l, vorzugsweise Chlorsalz: 0,5 bis 5 mg/l

    Folsäure: 0,5 bis 10 mg/l, vorzugsweise 0,5 bis 5 mg/l

    Inositol: 1 bis 70 mg/l, vorzugsweise 1 bis 50 mg/l

    Nicotinamid und/oder Niacinamid: 0,5 bis 10 mg/l, vorzugsweise Nicotinamid: 0,5 bis 5 mg/l

    Pyridoxin und/oder Pyridoxal: 0,5 bis 10 mg/l, vorzugsweise Pyridoxin-HCl: 0,5 bis 5 mg/l

    Riboflavin: 0,05 bis 1 mg/l, vorzugsweise 0,05 bis 0,5 mg/l

    Thiamin: 0,5 bis 10 mg/l, vorzugsweise 0,5 bis 5 mg/l
  • – ein oder mehrere anorganische Salze, ausgewählt unter den folgenden Verbindungen, nämlich:

    Kalziumsalze: 100 bis 200 mg/l, vorzugsweise wasserfreies CaCl2

    Kaliumchlorid: 350 bis 450 mg/l

    Magnesiumsalze: 40 bis 60 mg/l, vorzugsweise wasserfreies MgSO4

    Natriumchlorid: 6.000 bis 8.000 mg/l

    Salze von HCO3: 2.000 bis 3.000 mg/l, vorzugsweise NaHCO3

    Salze von HPO4: 600 bis 1.000 mg/l, vorzugsweise wasserfreies Na2HPO4
  • – und Glukose: 1.000 bis 6.000 mg/l, vorzugsweise D-Glukose,
  • – Anti-Interferon Beta Antikörper: ungefähr 10 U/ml.

Vorzugsweise sind die Aminosäuren ausgewählt unter denen der natürlichen L-Reihe.

Das Medium kann auch wenigstens ein Antibiotikum umfassen, vorzugsweise eine Mischung aus Penizillin und Streptomycin, und falls gewünscht, Clindamycin, um Mycoplasmen-Kontaminationen zu verhindern.

Das Medium kann zusätzlich wenigstens einen Wachstumsfaktor ausgewählt unter ECGF („Endothelzellen-Wachstumsfaktor"), auch saures FGF genannt, und basischem FGF („Fibroblast-Wachstumsfaktor"), in veränderlichen Anteilen, die der Fachmann ausgehend von seinem allgemeinen Wissen über Zellkulturen und die Mittel, die ihm zur Verfügung stehen, bestimmen kann. Als Beispiel liegt die Konzentration des Wachstumsfaktors zwischen 1 und 50 &mgr;g/l des Kulturmediums in Anwesenheit von Heparin zwischen 50 und 50 &mgr;g/l. Vorteilhafterweise ist der ausgewählte Wachstumsfaktor ECGF (10 &mgr;g/l, in Anwesenheit von Heparin, wie vorstehend erwähnt).

Ein Verfahren zur Gewinnung einer in vitro Kultur von infizierten Zellen des menschlichen Plexus Choroidei, welche postmortal aus dem Körper eines an MS erkrankten Individuums oder Patienten gewonnen werden, umfasst die Schritte, nach welchen man die erhaltenen Zellen in einem Kulturmedium wie vorgehend beschrieben unter vorbestimmten Bedingungen kultiviert, um eine erste Kultur von primären Zellen des Plexus Choroidei zu gewinnen, sie anschließend serienmäßig in dem Kulturmedium kultiviert, d.h. durch aufeinander folgende Transfers, und die primäre Zellkultur oder die Subkultur der Letzteren entnimmt, um eine Zellkultur von infizierten Zellen des Plexus Choroidei zu gewinnen.

Mit diesem Verfahren kann eine infizierte Zelllinie von Zellen des Plexus Choroidei gewonnen werden, welche mit PLI-2 bezeichnet ist, die am 22. Juli 1992 unter der Nummer 92072201 gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags bei der ECACC hinterlegt wurde.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein isolierter menschlicher Virus-Stamm, der mit der Multiplen Sklerose assoziiert ist, und welcher als POL-2 benannt ist sowie in der oben genannte Zelllinie PLI-2 enthalten ist. Der Stamm wurde bei der ECACC am 22. Juli 1992 unter der Nummer V92072202 gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags hinterlegt.

Die Zellen der Linie PLI-2 sind vorzugsweise mit einem „unmittelbar-frühen" Gen eines Virus der Familie Herpesviridae transfiziert, um die virale Expression in den Zellen zu verbessern.

Ein Verfahren zur Gewinnung einer lebensfähigen oder kontinuierlichen, infizierten Zellkultur oder Zelllinie, welche Zellen aufweist, die durch zumindest einen menschlichen Virus-Stamm infiziert sind, der mit der MS assoziiert ist, besteht aus Folgendem:

  • (a) Man kultiviert mit dem Virus-Stamm infizierte humane Zellen, um wenigstens eine mit dem genannten Stamm infizierte primäre oder abgeleitete Kultur zu erhalten,
  • (b) man kultiviert menschliche Zellen, die nicht infiziert und für den genannten Stamm permissiv sind, vorzugsweise nicht infizierte Zellen des humanen Plexus Choroidei, wobei die genannten permissiven Zellen dazu geeignet sind, sich zu infizieren und den genannten Virus-Stamm zu replizieren, um wenigstens eine permissive Kultur zu erhalten,
  • (c) man ko-kultiviert wenigstens eine Probe einer primären infizierten Kultur und einer Probe der permissiven Kultur, um eine primäre abgeleitete Kultur zu erhalten, die mit einem derartigen Virus-Stamm infiziert ist,
  • (d) man kultiviert die infizierte, abgeleitete primäre Kultur in Serie, d.h. durch aufeinanderfolgendes Passagieren; zu diesem Zweck wiederholt man über der Zeit den Schritt, der auf dem Ko-Kultivieren, z.B. für 5 bis 8 Tage, einer neuen Probe einer nicht infizierten permissiven Kultur und einer Probe der infizierten, abgeleiteten primären Kultur oder einer Subkultur der letzteren besteht, um eine neue Subkultur derselben infizierten, abgeleiteten primären Kultur zu erhalten, wodurch in nicht unsterblichen Zellen eine dauerhafte virale Kultur gebildet wird.

Unter einer von der primären Kultur abgeleiteten Kultur versteht man jede Kultur oder Subkultur, die direkt oder indirekt ausgehend von der primären Kultur erhalten wird, durch Konservierung bei tiefer Temperatur oder z.B. durch Aufrechterhalten der Viabilität der genannten Kultur. Es kann sich z.B. um eine Referenzkultur handeln, die bei einer Sammlung hinterlegt ist.

Zumindest einer der Schritte (a) bis (d) wird in einem Kulturmedium durchgeführt, das einen Anti-Interferon Beta Antikörper enthält.

Vorteilhafterweise wird die infizierte primäre Kultur ausgehend von mit dem genannten Virus-Stamm infizierten humanen Zellen erhalten, was mit dem vorstehend beschriebenen in vitro Herstellungsverfahren, z.B. zu der Zelllinie 92072201 der ECACC führt, und/oder ausgehend von mit dem genannten Virus-Stamm infizierten humanen Zellen, die ausgewählt sind aus der Leptomeningitis-Zellen, Plexus Choroidei-Zellen, myeloide Blutzellen, insbesondere Makrophagen und Monozyten, sowie Lymphozyten umfassenden Gruppe.

Die permissive Kultur wird vorzugsweise ausgehend von humanen Zellen des Plexus Choroidei erhalten.

Vorteilhafterweise werden die Zellen, die den kontinuierlichen Virus-Stamm enthalten, mit zumindest einem „unmittelbar-frühen" Gen eines Virus der Familie Herpesviridae infiziert, um die virale Expression in den Zellen zu verbessern.

Die Verwendung von Seren oder Antikörpern gegen humanes Interferon Beta hat es möglich gemacht, eine verstärkte Propagation von Virus-Stämmen zu erhalten, die in den aus anatomischen Teilen explantierten Zellen vorhanden sind, oder durch Kokultur in nicht infizierte Zellen des Plexus Choroidei eingebracht wurden. Auf diese Weise konnte die Gesamtexpression des Virus in den Kulturen aus Zellen des Plexus Choroidei verstärkt und die Verzögerung verringert werden, mit der ein detektierbares Signal erhalten wird, nach dem pathologische Isolate in Kultur genommen wurden. Diese Effekte sind der durch die Antikörper bewirkten Neutralisation von Interferon Beta oder einem nahen antigenischen Molekül zuzurechnen, das in der viralen Expression eine inhibierende Rolle spielt und durch diese Zellen bei Anwesenheit des Virus produziert wird.

Unter "Antikörper gegen Interferon &bgr;" versteht man jede Präparation, die Antikörper monoklonalen oder polyklonalen Ursprungs enthält, die auf gereinigt (z.B. durch Affinitätschromatographie) sind oder nicht, die Epitope erkennen, die auf humanem Interferon Beta oder einem beliebigen analogen antigenischen Molekül auftreten, das in der viralen Expression eine inhibierende Rolle spielt.

Gemäß einem bestimmten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird die infizierte primäre Kultur zuvor durch Bestrahlung behandelt, z.B. durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, bevor sie in Kontakt mit den kultivierten, permissiven Zellen gebracht wird.

Gemäß einem bestimmten Ausführungsbeispiel der Erfindung erhält man mehrere primäre Kulturen, die mit verschiedenen Virus-Stämmen oder Isolaten von MS infiziert sind, wobei während Schritt (b) verschiedene Proben der genannten primären Kulturen bzw. von Subkulturen der letzteren ko-kultiviert werden. Man erhält so in der Zellkultur eine Mischung von Virus-Stämmen, was die Rekombination zwischen den Stämmen, die Komplementierung möglicherweise defekter Genome und das Auftauchen von rekombinierten Stämmen ermöglicht, deren Anpassbarkeit an bestimmte Kriterien deutlich verbessert sein kann. Dies ermöglicht es auch, an die Kultur in vitro äußerst angepasste Stämme zu erhalten oder ausgehend von defekten Stämmen replikationsfähige Stämme zu erhalten.

Der Ausdruck "infizierte Zellen", so wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf:

  • i) infizierte primäre Zellen, die ausgehend von einer Kultur von Zellen erhalten wurden, die unmittelbar aus einer Gewebeprobe oder biologischen Flüssigkeiten in vivo oder postmortal aus einem Individuum hervorgegangen sind, sowie auf abgeleitete Zellen, die durch Passagieren dieser primären Zellen gewonnen wurden, und
  • ii) auf infizierte sekundäre Zellen, die durch Ko-Kultivieren von infizierten primären Zellen und permissiven Zellen gewonnen wurden, sowie auf abgeleitete Zellen, die durch Passagen dieser sekundären Zellen gewonnen wurden.

Unter "primären Zellen" versteht man Zellen oder Kulturen, die unmittelbar aus Gewebeproben oder biologischen Flüssigkeiten hervorgegangen sind und in Kultur genommen wurden, ohne eine einzige Ko-Kultur oder eine Inokulation von Virus-Stämmen, die von anderen Zellen stammen.

Die in vivo oder postmortal entnommenen Zellen können beliebige mit dem Virus infizierte Zellen sein, zum Beispiel aus dem Liquor cerebrospinalis eines Patienten isolierte Leptomeningitiszellen (H. Perron et al., Res. Biol., 140, 551–561 (1989)), myeloide Zellen, die im Blut, im Liquor cerebrospinalis, im Gewebe oder in Knochenmark vorkommen, insbesondere Makrophagen oder Monozyten (H. Perron et al., The Lancet, Band 337, 862–863, 10. April 1991), wobei Lymphozyten (S.A. Haahr et al., The Lancet, Band 337, 863–864, 6. April 1991) oder analoge. Ein weiterer Kandidat für die Präparation einer Kultur von primären Zellen ist durch die humanen Zellen des Plexus Choroidei gegeben, von denen angenommen wird, dass sie ein Latenzsitz für ein mit Multipler Sklerose assoziiertes Virus sind.

Der Ausdruck "Makrophage(n)" bezieht sich auf Zellen, die unmittelbar von Monozyten im Blut, von Zellen, die sich im Gewebe befinden (z.B. Mikrogliazellen, Küpfer-Zellen) und von Zellen des Retikuloendothel-Systems abstammen, insbesondere den Langerhans-Zellen.

Die permissiven Zellen sind Zellen, die sich mit einem gegebenen Virus infizieren und dessen Replikation mit Produktion von insbesondere extrazellulären, viralen Partikeln ermöglichen können, die man untersuchen kann, z.B. auf ihre Reverse-Transkriptase-Aktivität in den Überständen.

Der Ausdruck "Passage" bezieht sich auf eine Zellkultur und entspricht der Dissoziation der Zellen in einer Kulturflasche, um sie in eine oder mehrere neue Flaschen zu übertragen.

Spezialisten ist es gut bekannt, dass spontane oder induzierte Modifikationen im Karyotyp während der Lagerung oder den Passagen eintreten können. Auf diese Weise können von einer Referenzzelllinie abgeleitete Zellen nicht genau identisch zu den ursprünglichen Kulturen oder Zellen sein. Gleichfalls ist die genetische Variabilität von Retroviren gut bekannt, ein gegebener retroviraler Stamm kann seine Charakteristika durch spontane oder induzierte Mutationen während der Kulturen verändern.

Das virale biologische Material der Erfindung ist direkt oder indirekt zu verschiedenen Zwecken verwendbar, insbesondere zu klinischen, therapeutischen, diagnostischen oder analytischen Zwecken.

Um in einem beliebigen biologischen, dem menschlichen Körper entnommenen Fluid, die Anwesenheit eines gegen einen MS-Virus gerichteten Antikörpers zu detektieren, reicht es aus, die Probe des biologischen Fluids mit einen Antigenextrakt eines wie zuvor definierten viralen biologischen Materials, entweder insgesamt oder einen Teil eines Antigenextrakts, der immunologisch analog zu dem Virus ist, welcher durch chemische Synthese oder genetische Rekombination erhalten wird, und der zumindest ein Epitop eines viralen Stammes umfasst, der mit der MS assoziiert ist; anschließend untersucht man mittels beliebigen geeigneten Mitteln, bspw. durch eine chromogene, chromophore oder radioaktive Reaktion, die Anwesenheit eines Antikörper-Epitopkomplexes.

Die Erfindung wird besser verstanden anhand der folgenden ausführlichen Beschreibung, die sich auf die beigefügten Figuren bezieht, in denen:

1 die Reverse-Transkriptase-Aktivität von Partikeln zeigt, die aus dem Kulturmedium der Linie PLI-2 auf konzentriert wurden und auf einem Saccharosegradienten bei einer Dichte sedimentieren, die für die Retroviren bekannt ist;

die 2 bis 5 Partikel vom retroviralen Typ repräsentieren, die im Elektronenmikroskop in den PlI-2 Zellen beobachtet werden, nach Transaktivierung durch Transfektion mit Plasmiden, die das Gen ICP0 oder ICP4 des Virus Herpes Simplex Typ 1 enthalten. Die Maßstäbe sind in &mgr;m.

Genauer gesagt zeigt 2 einen Teil der Zelle PLI-2 (der gezeigte Maßstab entspricht 1 &mgr;m). Die 3 zeigt Partikel vom retroviralen Typ, die intracytoplasmatischen Nukleokapsiden entsprechen, wie sie in vermehrter Zahl nach Stimulation (Transaktivierung) durch das Produkt des Genes ICP0 des Virus Herpes Simplex Typ 1 beobachtet werden. Die 4 zeigt ein Detail der intracytoplasmatischen Partikel in viel stärkerer Vergrößerung. Die 5 zeigt ein Detail eines Partikels mit reiferem Aussehen, in den PLI-2 Zellen, die durch Transfektion mit dem Gen ICP4 des Virus Herpes Simplex Typ 1 stimuliert sind.

Beispiel 1: Nachweis der Produktion von Interferon Beta durch die Zellen des Plexus Choroidei.

In vitro in Kultur befindliche Zellen des Plexus Choroidei, die mit dem früher beschriebenen Stamm LM7 infiziert sind, sind durch eine Lösung aus Trypsin oder EDTA dissoziiert worden, in ein Röhrchen übertragen worden, das gegebenenfalls eine kleine Menge an fötalem Kälberserum für den Fall einer Dissoziation mit Trypsin von Zellen enthält, die der alleinigen Wirkung von EDTA widerstehen, und durch Zentrifugation bei 1600 Upm für 5 bis 15 Minuten sedimentiert. Das zelluläre Sediment wird in einem PBS ("Phosphate Buffer Saline")-Puffer resuspendiert und in jede Vertiefung einiger Objektträger wird ein Tropfen der Suspension gegeben. Nach dem Trocknen der Ablagerung werden die Träger durch Inkubation in einer Mischung aus Methanol und Aceton (1 Volumen/1 Volumen) bei –20°C für 15 Minuten fixiert.

Alternativ können die gleichen Zellen auf den Trägern mit Kulturkammern (durch die Société Labtek vertrieben) kultiviert und nach schnellem Waschen mit PBS wie vorstehend beschrieben fixiert werden.

Mehrere Verdünnungen in PBS von monoklonalen Antikörpern (Boehringer Mannheim, Bezugsnummer 853 577; Verdünnungen: 1/250, 1/500, 1/1000, 1/2000) oder von polyklonalen Antikörpern (VIE 3000-ZI LA JUFFARDE 01360 BALAN FRANCE; Verdünnungen: 1/50, 1/100, 1/500, 1/1000) gegen humanes Interferon Beta werden auf die Plättchen (Träger) gegeben und für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Träger werden daraufhin mehrere Minuten in zwei aufeinanderfolgenden Bädern von PBS und dann in einem Bad mit sterilem Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen der Träger werden geeignete Verdünnungen von mit Fluorochrom markierten Antikörpern, Anti-IgG von Maus für den monoklonalen Antikörper und Anti-IgG von Ziege für den polyklonalen Antikörper, jeweils auf die entsprechenden Träger gegeben, die dann für eine Stunde bei 37°C inkubiert werden. Die Träger werden dann gewaschen wie vorstehend beschrieben und nach Trocknen zur Beobachtung auf einem Fluoreszenzmikroskop befestigt.

Um die umgebenden zellulären Strukturen besser zu visualisieren, werden bestimmte Träger ungefähr eine Minute in einer Lösung des Farbstoffs "Bleu Evans" inkubiert, dann gewaschen und vor dem Montieren getrocknet.

Auf diese Weise wurde das Vorhandensein einer spezifischen immunologischen Reaktion nachgewiesen, die sich durch die Emission einer Fluoreszenz zeigte, die die Produktion von Anti-Interferon Beta bei den Zellen des Plexus Choroidei bestätigt.

Zur Bestätigung werden Zellen des Plexus Choroidei gemäß dem folgenden Protokoll mit einem äußerst replikativem Virus infiziert.

Nicht infizierte Zellen des Plexus Choroidei werden in flachen Flaschen vom Typ "Labtek" in dem nachstehend im Beispiel 3 beschriebenen Medium, jedoch ohne den Antikörper gegen Interferon Beta in Kultur genommen.

Die Zellen werden dann mit dem Virus Herpes Simplex Typ 1 (HSV-1) infiziert. Nach einem Kontakt von ungefähr einer Stunde mit einem HSV-1 Virionen enthaltenden Überstand werden sie so über Nacht stehen gelassen.

Am nächsten Tag werden die Überstände abgenommen und bei –80°C eingefroren, die konstitutiven Träger der Flaschen, auf denen die Zellen gewachsen sind, werden von den Kammern befreit, mit Paraformaldehyd fixiert und genauso wie Träger von nicht infizierten Zellen dann für eine Analyse mit einer klassischen Technik der Immunperoxydase mit polyklonalen Antikörpern gegen Interferon Beta (Beispiel: polyklonale Antikörper von Ziege gegen Humaninterferon Beta, vertrieben von VIE-3000, Frankreich) und einer Entwicklung durch einen mit Peroxydase markierten sekundären Antikörper (Beispiel: Kaninchen-Antikörper gegen Immunglobuline von Ziege) verwendet.

Auf diese Weise wurde eine spezifische Markierung von Zellen des Plexus Choroidei, die mit einem stark replikativen Virus wie HSV-1 infiziert waren, mit den Antikörpern gegen Interferon Beta nachgewiesen, was bei nicht infizierten Zellen nicht der Fall ist.

Dies bestätigt die Produktion von Interferon Beta durch Zellen des Plexus Choroidei als Antwort auf eine virale Aggression.

Beispiel 2: In vitro Präparation einer Kultur von primären Zellen, die mit einem bei einem an MS leidenden Patienten vorhanden Virus infiziert sind.

Die Verfahren zur Präparation von Kulturen von primären Zellen aus infizierten Zellen, z.B. aus leptomeningitischen Zellen, Monozythen oder Lymphozyten, sowie die Bedingungen für ihr Wachstum in vitro sind dem Fachmann bekannt (siehe die Zitate hier oben).

Beispiel 3: Präparation einer Kultur von infizierten Zellen des humanen Plexus Choroidei.

Infizierte Zellen des Plexus Choroidei werden nach postmortaler Explantation des humanen Plexus Choroidei bei einem Patienten gewonnen. Das steril entnommene anatomische Teil wird vorsichtig mit Pinzetten zerrissen und für einige Minuten bei ungefähr 37°C in eine Trypsin-Lösung gegeben. Die Gewebsfragmente werden nach Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (500 U/min) entnommen und der Überstand wird für 5 bis 15 Minuten bei 16000 U/min zentrifugiert. Der Bodensatz der Zentrifugation wird in einem Medium RPMI 1640 (kommerziell erhältlich von Boehringer Mannheim) aufgenommen, das enthält: Penicillin (200.000 U/l), Streptomycin (200 mg/l), Clindamycin (75 mg/l), L-Glutamin (6 mM/l), Pyruvat 1%, Serum, vorzugsweise 20 bis 30% durch Inkubation bei 56°C für 30 Minuten dekomplementiertes fötales Kälberserum, nicht essentielle Aminosäuren (Boehringer Mannheim MEM, A.A.N.E. 100x, Bestellnummer 210293) und Antikörper gegen humanes Interferon Beta, entweder polyklonale Antikörper, wie sie von VIE 3000 kommerziell vertrieben werden, oder monoklonale Antikörper mit einer neutralisierenden Aktivität gegenüber Interferon Beta (10 U/ml). Vorteilhafterweise umfasst das Kulturmedium weiter einen Wachstumsfaktor, wie den Wachstumsfaktor der Endothelzellen (ECGF), assoziiert mit Heparin (BOEHRINGER, Bestellnummer 1/79/87: ECGF ungefähr 1 bis 20 ng/ml enthaltend Heparin 50–150 &mgr;g/ml).

Die Zellen werden in ihrem Kulturmedium belassen und bleiben in einem Brutschrank unter CO2, bis die zelluläre Proliferation eine konfluente Schicht bildet, d.h. einen Teppich von anhaftenden Zellen. In diesem Stadium werden die Zellen mit einer Lösung von EDTA (Versehe) dissoziiert. Die Zellkulturen werden dann solange regelmäßig in zwei Teile aufgeteilt, wie es das mitotische Vermögen erlaubt. Die Kulturmedien werden wenigstens zweimal pro Woche und jeweils am nächsten Tag nach einer neuen Passage gewechselt, d.h. bei jedem neuen Anlegen einer Flasche mit in Suspension dissoziierten Zellen.

Man beobachtet eine progressive Extinktion des mitotischen Vermögens der infizierten Kulturen nach ungefähr 14 Passagen, was mit Beobachtungen übereinstimmt, die in Abwesenheit der Antikörper gegen Interferon Beta gemacht wurden. Aber wurde jemals in dem Verfahren zur in vitro Kultur von infizierten Zellen des Plexus Choroidei in einem Kulturmedium ohne Antikörper gegen Interferon Beta beobachtet, dass einige klonale Proliferationsherde progressiv nach der letzten Passage der infizierten Zellen des Plexus Choroidei aufgetreten sind, die bei einem an MS leidenden Patienten entnommen wurden. Drei dieser Herde konnten übertragen werden und einer davon hat sich als Linie mit starkem Wachstumsvermögen in vitro etabliert. Diese Linie wurde von der Anmelderin PLI-2 genannt.

Die Kulturüberstände dieser etablierten Linie von infizierten Zellen des Plexus Choroidei mit einem minimalen Volumen von 15 ml werden gesammelt, für 30 Minuten bei 10.000 Upm vorzentrifugiert, um Zelltrümmer zu beseitigen, dann für 2 Stunden bei 35.000 Upm (100000 g) ultrazentrifugiert, um die retroviralen Partikel zu sedimentieren. Die Sedimente werden wiederaufgenommen (finales Volumen ungefähr 1.000-fach konzentriert in einem Puffer, Tris-HCl 0,05 M pH 9,5) und bei –80°C konserviert für eine abschließende Bestimmung der Reverse-Transkriptase-Aktivität und die Präparation des konzentrierten Virus, wie nachstehend beschrieben.

Beispiel 4: Bestimmung der Reserve-Transkriptase-Aktivität für die Abfolge der Produktion von viralen Partikeln vom Typ LM7 im Überstand von Zellen von PLI-2.

Alle Schritte werden mit sterilem Material und sterilen Lösungen vorgenommen, um jegliche Beeinträchtigung durch bakterielle Nukleasen oder Proteasen insbesondere während der Inkubationsphasen bei 37°C zu vermeiden.

Die die konzentrierten viralen Partikel in Tris-HCL 0,01 M, pH 8, enthaltenden Bodensätze werden wieder aufgetaut und homogenisiert: 20 &mgr;l werden entnommen und einer Reaktionslösung zugeführt, die enthält: 5 &mgr;l Tris 0,5 M-DTT 0,04 M pH 8,2/5 &mgr;l NaCl 0,1 M/5 &mgr;l MgCl2 0,3 M/23 &mgr;l bidestilliertes H2O/10 &mgr;l NP4O 2 %/2 &mgr;l PolyCm-oligodGl2-18 (10 U OD/ml; Pharmacia) und 5 &mgr;l 3H-,3H-Guanosin-Tri-Phosphat (1 mCi/ml; NEN). Die die Mischungen enthaltenden Glasröhrchen werden für 75 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird abgestoppt, indem bei +4°C 75 &mgr;l einer Lösung zugegeben werden, die enthält: 12,5% H2O gesättigt mit Natriumphosphat, 12,5% H2O gesättigt mit Natriumpyrophosphat und 20 % Trichloressigsäure (TCA). Nach 30 Minuten bis einer Stunde bei 4°C werden die Röhrchen mit einer Lösung von 5 % TCA aufgefüllt, entleert und fünfmal mit der Lösung von 5 % TCA gespült, und zwar auf eine Zelluloseacetatmembran (Sartorius Bestellnummer 11106 25 N; Durchmesser der Poren: 0,45 &mgr;; Durchmesser der Membran: 25 mm), durch die hindurch die Proben in einen Fraktionssammler 1125 (Millipore; Bestellnummer XX2702550) gefiltert werden. Bevor sie entfernt werden, werden die Membranen noch einmal mit 20 ml 5 % TCA gespült. Die Membranen werden dann in Fläschchen gegeben, die man mit Szintilationsflüssigkeit (Ready-Safe, Beckman) auffüllt, und die Aktivität wird in einem Betazähler in cpm (counts per minute, Impulse pro Minute) sowie dpm (Zerfälle pro Minute) gemessen.

Jede Probe wird dreimal getestet und der Mittelwert der Werte als Ergebnis verwendet. Wenn die Differenz zwischen diesem Mittelwert und einem der Messwerte die an Referenzwerten gemessene Standardabweichung um das Zweifache überschreitet, wird die entsprechende Probe erneut getestet.

Um zu verifizieren, dass die Reverse-Transkriptase-Aktivität gut mit den Partikeln vom retroviralen Typ assoziiert ist, werden die Bodensätze von durch Ultrazentrifugation von Kulturüberständen auf Glycerolkissen (PBS-Lösung +30 % Glycerol) konzentrierten Virionen auf Saccharosegradienten (15 bis 50 Gewichts-%) gegeben und bei +4°C für 6 bis 16 Stunden bei 35.000 Upm (100.000 g) in einem Becherrotor ultrazentrifugiert. Es werden 10 Fraktionen aufgefangen, und 20 &mgr;l aus jeder Fraktion werden entnommen, um darin die Reverse-Transkriptase-Aktivität zu bestimmen, wie es oben beschrieben wurde. Der spezifische Spitzenwert der Aktivität findet sich in der Fraktion der Dichte von ungefähr 1,17 g/ml (refraktometrische Bestimmung) wieder, was einer Sedimentationsdichte im Gleichgewicht entspricht, die für die retroviralen Partikel bekannt ist (1,16 bis 1,18 g/ml). (1).

Beispiel 5: Transfektion von Zellen der Linie PLI-2 mit den "unmittelbar-frühen" Genen des Virus Herpes Simplex Typ 1.

So wie es gezeigt wurde (Perron et al. Res. Virol. 1989) stimuliert das Virus Herpes Simplex Typ 1 (HSV-1) die Produktion des Virus LM7 in den leptomeningitischen Zellen. Außerdem hat sich erwiesen, dass HSV-1 die Expression des Retrovirus HIV durch das Produkt eines seiner "unmittelbar-frühen" Gene, ICP0 oder IE1 transaktiviert (Chapman J.C., Harris J.D., Collins M.K.L. & Latchman, D.S. 1991, A recombinat HIV provirus is synergistically activated by the HIV Tat protein and the HSV IE1 protein but not by the HSV IE3 protein. AIDS 5, 945–950, und Mosca, J.D. Bednarik, D.P. Raj, N.B. Rosen, C.A. Sodroski, J.G. Haseltine, W.R. & Pitha, P.M. 1987. Activation of human immunodeficiency virus by herpesvirus infection: identification of a region within the long terminal repeat that responds to a trans-acting factor encoded by herpes simplex virus 1. Proceedings of the National Academy of Sciences 84, 7408–7412).

Auf der Basis dieser Feststellungen haben die Erfinder dann die Verwendung der "unmittelbar-frühen" Gene des Virus HSV-1 zur Verstärkung der viralen Expression durch die zelluläre Linie PLI-2 in Betracht gezogen. Verschiedene Plasmide, die jeweils ein unmittelbar-frühes Gen des Virus HSV-1 enthielten, wurden folglich durch Transfektion in die infizierten Zellen des Plexus Choroidei getestet. Auf diese Weise konnte durch Elektronenmikroskopie und Bestimmung der Reverse-Transkriptase-Aktivität nachgewiesen werden, dass die Gene ICP0 (in das Plasmid pJR3 kloniert) und ICP4 (in das Plasmid XhoC kloniert) die Expression eines LM7 ähnlichen Virus in den Zellen der Linie PLI-2 (2 bis 5) stark transaktivieren. Virale Partikel von ungefähr 100 nm finden sich in den Bodensätzen der Ultrazentrifugation von Überständen dieser Kulturen, die eine verstärkte Reverse-Transkriptase-Aktivität exprimieren.

Das experimentelle Protokoll der Transfektion ist nachstehend beschrieben.

Das Plasmid pJR3 enthält ein Restriktionsfragment Pst I-Sacl von HSV-1 (Nukleotide 18663 bis 25066), das für ICP0 kodiert, kloniert in einen Vektor pUC9. Das Plasmid XhoC ist ein Restriktionsfragment Xhol von HSV-1 (Nukleotide 23028 bis 33520), das für ICP4 codiert, kloniert in einen Vektor pAT153.

Die Transfektion wird mit Transfectam (registrierte Marke, SEPRACOR, Villeneuve la Garenne, Frankreich) realisiert. Das Prinzip dieser Transfektion besteht in einer spezifischen Interaktion zwischen einem kationischen Lipopolyamin und dem ADN des Plasmides.

Die Plasmide werden aufgelöst in einer sterilen Lösung von NaCL 0,3 M im Verhältnis von 2 &mgr;g/250 &mgr;l und 5 bis 7 &mgr;g/106 Zellen. Diese Lösung wird unmittelbar vor der Transfektion mit dem gleichen Volumen an bidestilliertem Wasser gemischt, das 5 &mgr;l der Stammlösung von Transfektam pro &mgr;g an Plasmid enthält. Diese Mischung Transfektam-Plasmid wird dann auf die Kulturen gegossen, die zuvor mit RPMI ohne Serum gewaschen wurden (2 × 15 Min.), und gemischt mit einem Volumenminimum des erfindungsgemäßen Mediums, aber ohne fötales Kälberserum, und verbleibt in den Flaschen, so dass sie die Oberfläche mit einer Monoschicht von anhaftenden Zellen bedeckt. Die Kulturflaschen werden dann 6 Stunden in einem Brutschrank mit 5 % CO2 bei 37°C inkubiert. Nach 6 Stunden wird die Mischung Transfektam-Plasmid entnommen und durch das erfindungsgemäße Kulturmedium ersetzt.

Die Zellen werden erneut in dem Brutschrank inkubiert und die Überstände werden ungefähr einen Tag nach den 6 Stunden des Kontaktes mit der Transfektionsmischung und dann jeweils täglich für eine Woche entnommen. Die Überstände, in denen sich das Transfektam mit dem Plasmid befindet, werden bei –80°C konserviert oder, wie in Beispiel 6 unten beschrieben, konzentriert und später als Quelle angereicherter Virionen verwendet.

Die Expression der Gene ICP0 oder ICP4 in den transfizierten Zellen wird durch indirekte Immunfluoreszenz mit den polyklonalen Antikörpern von Kaninchen oder den monoklonalen Antikörpern von Maus gegen die durch diese Gene produzierten Proteine verifiziert.

Beispiel 6: Präparation von konzentriertem gereinigtem Virus aus Kulturüberständen der Linie PLI-2.

Für die Präparation von konzentriertem und gereinigtem Virus wird ein Volumen des gemäß Beispiel 3 oder 5 gewonnenen Überstandes (zwischen 5 und 10 Litern) wieder aufgetaut und durch tangentielle Ultrafiltration (System Minitan, Millipore) auf einer Serie von Membranen konzentriert, die eine Trennschärfe bei 300000 Dalton haben. Das Konzentrat wird dann gemäß Beispiel 3 zentrifugiert, der Bodensatz wird jedoch in dem Puffer PBS wieder aufgenommen. Die so erhaltenen Bodensätze werden dann wieder zusammengeführt und auf einen Saccarosegradienten in einem sterilen PBS-Puffer (15 bis 50% Gewicht/Gewicht) gegeben und bei 35.000 Upm (100 000 g) für 6 Stunden bei +4°C in einem Becherrotor ultrazentrifugiert. 10 Fraktionen werden gesammelt und 20 &mgr;l von jeder Fraktion werden entnommen, um dafür die Reserve-Transkriptase-Aktivität gemäß der vorstehend beschriebenen Technik nachzuweisen. Die Fraktionen, die den Spitzenwert der spezifischen Aktivität enthalten, was einer für die retroviralen Partikel bekannten Sedimentationsdichte im Gleichgewicht zwischen 1,16 und 1,18 g/ml entspricht, werden dann in einen sterilen PBS-Puffer verdünnt und eine Stunde bei 35000 Upm (100000 g) ultrazentrifugiert, um die viralen Partikel zu sedimentieren. Der so erhaltene Bodensatz von gereinigten Virionen wird dann in einem kleinen Volumen eines für die später gewünschte Anwendung geeigneten Puffers aufgenommen (Beispiel: Puffer Guanidium Thiocyanat für die Extraktion von ARN; steriles PBS für die Lagerung bei –80°C).

Alternativ können große Mengen an Flaschen mit PLI-2-Zellen in Kultur genommen werden; die Überstände, deren Gesamtvolumen bei jedem Medienwechsel 2 Liter übersteigt, werden bei 10000 Upm vorzentrifugiert und dann direkt mit dem System Minitan (registrierte Marke, Millipore) ohne zwischenzeitliches Einfrieren konzentriert.

Beispiel 7: Ko-Kultur einer mit einem bei einem an MS leidenden Individuum vorhandenen Virus infizierten Zelllinie und nicht infizierten, für das Virus permissiven Zellen.

Zellen einer, wie Beispiel 2 beschrieben, mit einem Virus infizierten Primärkultur, das bei einem an MS leidenden Individuum vorhanden ist, z.B. dem Virus LM7, werden von ihrer Kulturflasche entnommen, dann in einem für die Ko-Kultur geeigneten Kulturmedium wieder aufgenommen, d.h. in einem Kulturmedium für infizierte Zellen des Plexus Choroidei mit einem Antikörper gegen humanes Interferon Beta, wie es im Beispiel 3 beschrieben ist.

Parallel werden nicht infizierte Zellen des Plexus Choroidei, die nach postmortaler Explantation des humanes Plexus Choroidei erhalten werden, unter den Bedingungen des Beispiels 3 kultiviert, d.h. mit einem Antikörper gegen humanes Interferon Beta. Dann werden die Zellen in ihrer Kulturflasche in einer Lösung von Trypsin-EDTA dissoziiert. Die Zellen werden dann zentrifugiert und in ihrem Kulturmedium resuspendiert sowie zu der Flasche der infizierten Zellkultur hinzugegeben. Die Flasche wird in einen Brutschrank mit CO2 gegeben, und man lässt die Zellen des Plexus Choroidei für 24 Stunden am Boden der Flasche anhaften und proliferieren, die bereits die infizierten Zellen enthält. Das Medium wird nach 24 Stunden ausgetauscht und die Mischung von Zellen bleibt in dem Brutschrank bei CO2 bis die Proliferation der permissiven Zellen des Plexus Choroidei eine konfluente Schicht bildet, d.h. einen Teppich von anhaftenden Zellen. In diesem Stadium werden die Zellen noch für 5 bis 7 Tage gehalten, um den Transfer des Virus von den infizierten Zellen zu den Zellen des Plexus Choroidei sicherzustellen. Die Zellkultur wird dann in zwei Teile geteilt und in zwei neue Flaschen gegeben, in denen jeweils in Suspension dissoziierte Zellen des Plexus Choroidei ausgesät sind, und denselben, oben beschriebenen Bedingungen für die Adhäsion und die Proliferation der Zellen, den Transfer, die Expression und die Replikation des Virus unterzogen. Die Zellkulturen werden dann regelmäßig in zwei Teile aufgeteilt und solange mittels Transfer gezüchtet, wie es das mitotische Vermögen der permissiven Zellen erlaubt. Die Zellen, die ein Virus vom Typ LM7 in sich tragen und produzieren, können während ihrer Weiterzüchtung verwendet werden, um neue Zellen mittels Ko-Kultur, wie oben beschrieben, zu infizieren und so den Virus-Stamm in Kultur zu halten.

Die Kulturmedien werden immer wenigstens zweimal pro Woche und jeweils am nächsten Tag nach einer neuen Passage gewechselt, d.h. bei jedem neuen Anlegen einer Flasche mit in Suspension dissoziierten Zellen.

Vor der Ko-Kultur können die einen Virus-Stamm enthaltenden Zellen unter Umständen bestrahlt werden, um ihre spätere Proliferation innerhalb einer neuen infizierten Kultur zu vermeiden. Die Bestrahlung kann z.B. mit einer Gesamtdosis von 6.000 Rad Röntgenstrahlen realisiert werden.

Man beobachtet eine Extinktion des mitotischen Vermögens nach ungefähr 14 Passagen, was den zuvor gemachten Beobachtungen in Abwesenheit von Antikörpern gegen Interferon Beta entspricht.

Wie durch die Kultur der infizierten Zellen des Plexus Choroidei aus Beispiel 3 nachgewiesen wurde, sind mittlerweile einige klonale Proliferationsherde in mehreren Kulturflaschen nach der letzten Passage aufgetaucht. Dasselbe Phänomen hat zum Auftauchen von Zellen mit starkem mitotischem Vermögen geführt, die die vorgealterten Zellen in einer Subkultur des Stammes LM7 (LM7 PG genannt) verdrängt haben.

Die Überstände der Kultur dieser etablierten Linie werden gemäß dem Protokoll aus Beispiel 3 gesammelt und eingefroren.

Die Bestimmung der Reverse-Transkriptase-Aktivität für die Abfolge der viralen Partikel vom Typ LM7 im Überstand der Zellen LM7 PG wird gemäß dem in Beispiel 4 beschriebenen experimentellen Protokoll bewirkt und hat zu dem Nachweis eines Spitzenwertes der spezifischen Aktivität in der Fraktion mit der ungefähren Dichte 1,17 g/ml geführt, was einer für die retroviralen Partikel bekannten Dichte (1) entspricht.

Die Zellen und die Zelllinie LM7 PG werden dann gemäß einem zu dem in Beispiel 5 beschriebenen identischen Protokoll transfiziert, was es möglich gemacht hat zu zeigen, dass die Gene ICP0 (Plasmid pJR3) und ICP4 (Plasmid XhOC) die virale Expression in der Zellen der Linie LM7 PG stark transaktivieren. Die erzeugten viralen Partikel zeigen die Charakteristiken von Retroviren.

Die Präparation des konzentrierten gereinigten Virus wird ausgehend von erhaltenen Überständen entweder direkt nach Ko-Kultur oder durch Transfektion der Zellen der Linie LM7 PG mit den Genen ICP0 und/oder ICP4 des Virus HSV-1 erhalten.


Anspruch[de]
  1. Isolierter menschlicher Virus-Stamm, POL-2 benannt, der am 22. Juli 1992 unter der Nummer V92072202 gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages bei der ECACC hinterlegt wurde und der in der PLI-2 benannten Zelllinie enthalten ist, die am 22. Juli 1992 unter der Nummer 92072201 gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags bei der ECACC hinterlegt wurde.
Es folgen 5 Blatt Zeichnungen






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