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Dokumentenidentifikation DE69833260T2 28.09.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001018548
Titel ZUSAMMENSETZUNG MIT ALPHA-GLYCOSYLCERAMID ZUR STÄRKUNG ZELLULÄRER IMMUNOGENITÄT
Anmelder Kirin Beer K.K., Tokio/Tokyo, JP
Erfinder MOTOKI, Kazuhiro Kirin Beer Kabushiki Iyaku, Takasaki-shi Gunma 370-1295, JP
Vertreter HOFFMANN & EITLE, 81925 München
DE-Aktenzeichen 69833260
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 22.09.1998
EP-Aktenzeichen 989430772
WO-Anmeldetag 22.09.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/JP98/04249
WO-Veröffentlichungsnummer 1999015627
WO-Veröffentlichungsdatum 01.04.1999
EP-Offenlegungsdatum 12.07.2000
EP date of grant 18.01.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 28.09.2006
IPC-Hauptklasse C12N 5/06(2006.01)A, F, I, 20060131, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 5/08(2006.01)A, L, I, 20060131, B, H, EP   A61K 31/52(2006.01)A, L, I, 20060131, B, H, EP   A61K 31/70(2006.01)A, L, I, 20060131, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Hintergrund der Erfindung Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung für die Herstellung eines Mittels zur Erhöhung der Immunogenität von Tumorzellen oder mit einem Krankheitserreger infizierten Zellen in einem Verfahren zur Erhöhung der Immunogenität von Tumorzellen und mit einem Krankheitserreger infizierten Zellen unter Verwendung einer Verbindung mit einer &agr;-Glycosylceramidstruktur und insbesondere eine Tumortherapie unter Verwendung von Tumorzellen, deren Immunogenität erhöht wurde.

Stand der Technik

Um Tumoren einschließlich Melanom (M.S. Mitchell et al., J. Clin. Oncol., 8, 409 (1990)), Nierenkrebs (J.A. Neidart et al., Cancer, 46, 1128 (1980)), Eierstockkrebs (R.S. Freedman et al., Gynecol. Oncol., 29, 337 (1988)) und Kolonkrebs (H.C. Hoover, Cancer, 55, 1236 (1985)) zu behandeln, wurde es versucht, eine tumorspezifische Immunogenität in den krebstragenden Wirten durch Immunisierung von Patienten mit autologen oder allogenen Tumorzellen, die vorher durch Chemotherapeutika oder Bestrahlung inaktiviert wurden, zu induzieren. Die Immunogenität der Tumorzellen ist jedoch relativ niedrig, unterschiedlich von derjenigen von Fremdsubstanzen wie Bakterien, da diese ursprünglich von Wirtszellen transformiert wurden. So war die Wirksamkeit nicht wie vorhergesehen, und es wurde nur eine geringe Wirkung bei Krebsarten wie Melanom oder Nierenkrebs beobachtet, bei denen die Immunogenität relativ hoch ist (C.A. Mullen et al. in Cancer Chemotherapy and Biological Response Modifiers, Hrsg. H.M. Pinedo et al., Elsevier Science B.V., S. 285–294 (1996)).

Kürzliche Entwicklungen in der Molekularbiologie und der Biotechnologie machten es möglich, Gene einzuführen, und es wurde versucht, genetisch modifizierte Tumorzellen, die krebsverwandte Antigene exprimieren, für die Krebstherapie zu verwenden. Beispielsweise würden Tumor-Antigengene in autologe Tumorzellen oder ansonsten Nicht-Selbst-Tumorzellen transduziert, falls es schwierig ist, autologe Tumorzellen zu erhalten, und die erhaltenen Tumorzellen, deren Immunogenität gegenüber den ursprünglichen Tumorzellen erhöht war, wurden für die Tumortherapie verwendet. Jedoch wurden zu diesem Zeitpunkt, da nur eine geringe Anzahl von Antigenen als tumorverwandte Antigene identifiziert worden waren, solche Versuche nur für eine begrenzte Zahl von Krebsarten durchgeführt (R.M. Conry et al., Cancer Res., 54, 1164 (1994)). Weiterhin wurde gezeigt, daß eine therapeutische Effizienz nicht wie vorhergesagt erhalten werden kann, indem nur die Antigenität der Tumorzellen erhöht wird, da die Immunität von krebstragenden Wirten häufig deutlich durch Faktoren beeinträchtigt ist, die von Tumorzellen erzeugt werden oder ähnliches, so daß es tatsächlich recht wichtig ist, die Immunität der krebstragenden Wirte wiederherzustellen. Dementsprechend haben sich die Studien der letzten Zeit im wesentlichen auf Versuche fokussiert, die beeinträchtigte Wirtsimmunität wiederherzustellen, indem diese mit Zellen immunisiert wurden, denen Zytokingene, Haupthistokompatibilitäts-Antigengene, co-stimulatorische Moleküle oder ähnliches eingefügt wurden, um die therapeutische Wirkung zu verbessern. Beispiele für Tumorzellen, die in diesen Studien verwendet wurden, beinhalten diejenigen, in die Zytokingene wie IL-2 (J. Connor et al., J. Exp. Med., 177, 1127 (1993)), IL-4 (P.T. Golumbek et al., Science, 254, 713 (1991)), IL-6 (A. Porgador et al., Cancer Res., 52, 3679 (1992)), IFN-g (A. Belldegrun et al., J. Natl. Cancer Inst., 85, 207 (1993)), GM-CSF (G. Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 3539 (1993)) und IL-12 (H. Tahara et al., Gene Therapy, 2, 96 (1995)) eingeführt wurden und diejenigen, in die MHC Klasse II und B7-1-Gene (J. Travis et al., Science 259, 319 (1993); S. Basker et al., J. Exp. Med., 181, 619 (1995)) eingeführt wurden.

So wird eine Tumortherapie unter Verwendung von Tumorzellen, die durch einen Gentransfer modifiziert wurden, für die klinische Anwendung auf der ganzen Welt getestet (J.A. Roth et al., J. Natl. Cancer Inst., 89, 21 (1997)). Die Genmanipulation für dieses Verfahren ist jedoch kompliziert (D.M. Pardoll, Immunol. Today, 14, 310 (1993)). Weiterhin wurden Vektoren, die Gene effizient einführen, um eine ausreichende therapeutische Effizienz zu erhalten, nicht entwickelt. Daher besteht ein Bedarf an einer weiteren Verbesserung der Tumortherapie wie oben beschrieben (C.A. Mullen et al. in Cancer Chemotherapy and Biological Response Modifiers, Hrsg. H.M. Pinedo et al., Elsevier Science B.V., S. 285–294 (1996)).

&bgr;-Glycosylceramide, worin verschiedene Zucker an Ceramide über eine &bgr;-Bindung anbinden, können im Körper angetroffen werden (L. Svennerholm et al., Biochem. Biophys. Acta, 280, 626 (1972); K. Karlsson et al., Biochem. Biophys. Acta, 316, 317 (1973)). Andererseits ist es bekannt, daß &agr;-Glycosylceramide eine deutliche immunstimulierende Aktivität und Antitumoraktivität ausüben (M. Morita et al., J. Med. Chem., 38, 2176 (1995)). Solche Aktivitäten von &agr;-Glycosylceramiden sind bekanntlich stärker als diejenigen von &bgr;-Glycosylceramiden (K. Motoki et al., Biol. Pharm. Bull., 18, 1487 (1995)). Es ist weiterhin bekannt, daß Verbindungen mit einer &agr;-Glycosylceramidstruktur, die Antigen-präsentierende Funktion von Antigen-präsentierenden Zellen verstärken können, und eine Tumortherapie unter Verwendung der Antigen-präsentierenden Zellen, die durch Verbindungen stimuliert wurden, die eine &agr;-Glycosylceramidstruktur aufweisen, sehr effektiv ist. Es ist auch bekannt, daß die Verabreichung von Verbindungen mit einer &agr;-Glycosylceramidstruktur den Körper vor einer Strahlung schützt (K. Motoki et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 5, 2413 (1995)) und die Zahl der Blutplättchen und Leukozyten erhöht (K. Motoki et al., Biol. Pharm. Bull., 19, 952 (1996).

Soweit die gegenwärtigen Erfinder wissen, gibt es jedoch keine Berichte darüber, daß Tumorzellen, die mit &agr;-Glycosylceramiden behandelt wurden, in einer Tumortherapie nützlich sind und daß &agr;-Glycosylceramide die Immunogenität von Tumorzellen erhöhen.

EP 0 988 860 A beschreibt NKT-Zellaktivatoren enthaltend &agr;-Glycosylceramide, während die vorliegende Anmeldung die Verwendung der Verbindungen der Formel (I) zur Erhöhung der Immunogenität von Tumorzellen oder von Pathogenen-infizierten Zellen betrifft. Weder Tumor- noch Pathogen-infizierte Zellen werden in der EP 0 988 860 A offenbart. EP 0 957 161 A offenbart, daß Antigen-präsentierende Zellen, wie z.B. dendritische Zellen, die mit &agr;-Glycosylceramiden behandelt wurden, eine Antitumoraktivität in vivo induzieren. Dieses Phänomen hat jedoch nichts mit der Verstärkung der Immunogenität der Zielzellen zu tun, was die Grundlage der vorliegenden Erfindung bildet. Weiterhin induzieren die behandelten Tumorzellen tatsächlich eine Antitumoraktivität in vivo. EP 0 694 558 A betrifft ein Sphingoglycolipid. Die in EP 0 694 558 beschriebenen Verbindungen können als Wirkstoff in Arzneimitteln verwendet werden. Sie können als Antitumormittel, Myelomzellwachstumsbeschleuniger und Immunverstärker verwendet werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfinder haben nun festgestellt, daß Tumorzellen, die in vitro in einem Medium kultiviert werden, enthaltend eine Verbindung mit einer &agr;-Glycosylceramidstruktur, eine hohe Immunogenität aufwiesen, daß eine hohe Antitumorwirkung durch Verabreichung der obigen Zellen oder von Zellen, die durch Bestrahlung modifiziert wurden, an krebstragende Tiere beobachtet wurde, und daß die Zellen für eine Tumortherapie sehr sicher sind, da ihre Tumorigenität verlorengegangen ist. Die vorliegende Erfindung basiert auf diesen Feststellungen.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Immunogenität von Tumorzellen zu erhöhen, wodurch die für die Tumortherapie effektiven Tumorzellen einfach hergestellt werden können; ein Verfahren zur Verstärkung der Immunogenität von Zellen; Zellen, deren Immunogenität durch ein &agr;-Glycosylceramid erhöht wurde; eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die obigen Zellen für die Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Tumoren, die mit den Zellen assoziiert sind; Verwendung der Zellen für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung und ein Behandlungsverfahren für Erkrankungen, insbesondere Tumoren, die mit den Zellen assoziiert sind, anzugeben.

Für eine Verstärkung der Immunogenität von Tumorzellen oder mit Pathogenen infizierten Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung der Formel (I) in vitro verwendet:

worin

R1 H oder OH darstellt,

X eine Zahl zwischen 7 und 27 darstellt,

R2 einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden (a) bis (e) (worin Y eine ganze Zahl zwischen 5 und 17 ist) darstellt:
  • (a) -CH2(CH2)YCH3
  • (b) -CH(OH)(CH2)YCH3
  • (c) -CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2
  • (d) -CH=CH(CH2)YCH3
  • (e) -CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3, und
R3 bis R9 Substituenten darstellt wie in i) und ii) nachfolgend definiert:
  • i) wenn R3, R6 und R8 H darstellen,

    R4 H, OH, NH2, NHCOCH3 oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) darstellt:
    R5 OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (E) und (F) darstellt:
    R7 OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) darstellt:
    R9 H, CH3, CH2OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A') bis (D') darstellt:
  • ii) wenn R3, R6 und R7 H darstellen,

    R4 H, OH, NH2, NHCOCH3 oder einen Substituenten ausgewählt aus Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) darstellt:
    R5 OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (E) und (F) darstellt:
    R8 OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) darstellt:
    R9 H, CH3, CH2OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A') bis (D') darstellt:
oder ein Salz oder Solvat davon.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1 zeigt die Wirkung von &agr;-Glycosylceramiden auf die Immunogenität von Tumorzellen. Die Immunogenität wird mit der zytotoxischen Aktivität von Maus-Milzzellen bewertet. O: Kontrolle; •: EL-4/V, ☐: EL-4/KRN, &Dgr;: EL-4/583.

2 zeigt die Antitumorwirkung von &agr;-Glycosylceramidbehandelten Tumorzellen in EL-4-Lebermetastase-Modellmäusen. O: Kontrolle; •: EL-4/V, ☐: EL-4/KRN, &Dgr;: EL-4/583.

3 zeigt die Antitumorwirkung von &agr;-Glycosylceramidbehandelten Tumorzellen in B16-Melanomlungenmetastase-Modellmäusen. O: Kontrolle; •: B16/V, ☐: B16/KRN.

4 zeigt die Wirkung von &agr;-Glycosylceramiden auf die Tumorigenität von etlichen murinen Tumoren. O: unbehandelte Tumorzellen; •: mit Vehikel behandelte Tumorzellen, ∎: mit KRN 7000 behandelte Tumorzellen.

5 zeigt die Wirkung von &agr;-Glycosylceramid-behandelten bestrahlten oder nicht bestrahlten Tumorzellen in B16-Melanomlungenmetastase-Modellmäusen. O: Kontrolle; &Dgr;: nicht bestrahlte B16/V, ☐: bestrahlte B16/V,

nicht bestrahlte B16/K, ∎: bestrahlte B16/K.

6 zeigt ein Schema der Reaktionen für die Synthese von KRN 7000, der repräsentativen &agr;-Glycosylceramidverbindung, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird. In der Zeichnung bedeutet pyr Pyridin, BrPPh3 (CH2)12CH3 bedeutet Tridecantriphenylphosphoniumbromid, n-BuLi bedeutet n-Butyllithium, MsCl bedeutet Methansulfonylchlorid, BnBr bedeutet Benzylbromid und 1-PrOH bedeutet Propylalkohol.

7 ist die Fortsetzung der Reaktionen für die Synthese wie dargestellt in 6. WSC-HCl bedeutet 1-Ethyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid, MS4A bedeutet Molekularsiebe 4A und Hex4NBr bedeutet Tetrahexylammoniumbromid.

8 zeigt chemische Formeln der Verbindungen der Beispiele 1 bis 3.

9 zeigt chemische Formeln der Verbindungen der Beispiele 1 bis 3 und ist die Fortsetzung von 8.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung Verbindungen der Formel (I)

In den Verbindungen der Formel (I) bedeutet X in dem Ceramidbestandteil vorzugsweise eine ganze Zahl zwischen 11 und 25.

Y in R2 bedeutet vorzugsweise eine ganze Zahl zwischen 9 und 17, noch bevorzugter zwischen 11 und 15.

Bevorzugte Kombinationen für X und R2 in dem Ceramidbestandteil von Formel (I) sind Verbindungen, worin X eine ganze Zahl zwischen 21 und 25 ist und R2 der Substituent (b) ist (worin Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 ist).

Bevorzugte Kombinationen für R3 bis R9 in dem Zuckerbestandteil der Formel (I) sind Verbindungen, worin R3- und R6 H sind, R4 ist OH oder jeder Substituent der Gruppen (A) bis (D), R5 ist OH oder jeder Substituent der Gruppen (E) oder (F), R7 und R8 sind jeweils H oder OH (R7 und R8 repräsentieren nicht denselben Substituenten) und R9 ist CH2OH, CH3, H oder jeder Substituent der Gruppen (A') bis (D').

Noch bevorzugtere Kombinationen beinhalten Verbindungen, worin R3 und R6 H sind, R4 und R5 sind OH, R7 und R8 sind jeweils H oder OH (R7 und R8 repräsentieren nicht denselben Substituenten) und R9 ist CH2OH oder jeder Substituent der Gruppen (A') bis (D') und Verbindungen, worin R3, R6 und R8 H sind, R4, R5 und R7 OH und R9 CH2OH.

Bevorzugte Beispiele der Verbindungen der Formel (I) beinhalten Verbindungen, worin

X eine ganze Zahl zwischen 21 und 25 ist,

R2 ist der Substituent (b) (worin Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 ist),

R3 und R6 sind H,

R4 ist OH oder eine Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Gruppen (A) bis (D),

R5 ist OH oder eine Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Gruppen (E) und (F),

R7 und R8 sind jeweils H oder OH (R7 und R8 repräsentieren nicht denselben Substituenten) und

R9 ist CH2OH oder eine Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Gruppen (A') bis (D');

Verbindungen, worin

X eine ganze Zahl zwischen 21 und 25 ist,

R2 ist der Substituent (b) (worin Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 ist),

R3 und R6 sind H,

R4 und R5 sind OH,

R7 und R8 sind jeweils H oder OH (R7 und R8 repräsentieren nicht denselben Substituenten) und

R9 ist CH2OH oder eine Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Gruppen (A') bis (D'); und

Verbindungen, worin

X eine ganze Zahl zwischen 21 und 25 ist,

R2 ist der Substituent (b) (worin Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 ist),

R3, R6 und R8 sind H,

R4, R5 und R7 sind OH, und

R9 ist CH2OH.

Bevorzugte Verbindungen beinhalten (2S,3S,4R)-1-(&agr;-D-Galactopyranosyloxy)-2-hexacosanoylamino-3,4-octadecandiol (KRN 7000).

Die Verbindungen der Formel (I) können in Form der pharmazeutisch akzeptablen nicht-toxischen Salze davon vorliegen. Salze der Formel (I) beinhalten Säureadditionssalze, wie z.B. Salze mit anorganischen Säuren (z.B. Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure und Phosphorsäure) oder mit organischen Säuren (z.B. Essigsäure, Propionsäure, Maleinsäure, Ölsäure, Palmitinsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Fumarsäure, Glutaminsäure, Pantothensäure, Laurylsulfonsäure, Methansulfonsäure und Phthalsäure).

Die Verbindungen der Formel (I) können in Form von Solvaten vorliegen (z.B. Hydraten).

Die Verbindungen der Formel (I) können durch jedes zweckgerichtete Verfahren zur Synthese von &agr;-Glycosylceramiden erzeugt werden.

Zunächst wird ein Ceramidbestandteil unter Verwendung von D-Lyxose als Ausgangsmaterial synthetisiert, dann wird ein Zucker in dieses Ceramid eingeführt, um Verbindungen der Formel (I) herzustellen. Ein allgemeines Syntheseverfahren für solche &agr;-Glycosylceramide findet sich zum Beispiel in WO 93/5055, WO 94/2168; WO/9020 und WO 94/24142.

Die Verbindungen der Formel (I) können auch aus natürlichen Produkten (z.B. biologischen Organismen) isoliert und durch Säulenchromatographie oder ähnliches gereinigt werden.

Zusammensetzungen für die Erhöhung der zellulären Immunogenität

Es wurde gezeigt, daß die Verbindungen der Formel (I) für die Erhöhung der zellulären Immunogenität nützlich sind (Pharmakologische Testbeispiele 1 bis 5). Die Bezeichnung "Immunogenität" wie hier verwendet bezieht sich auf eine Aktivität von Zellen, eine Immunreaktion im Körper hervorzurufen, und eine Aktivität, von dem dadurch induzierten Immunsystem erkannt zu werden.

Die Immunogenität gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch In-vitro-Kontaktieren der Zellen, deren Immunogenität erhöht werden soll, mit einer Verbindung der Formel (I) erhöht. Zum Beispiel wurde eine Verbindung zur Erhöhung der Immunogenität gemäß der vorliegenden Erfindung einem Kulturmedium mit einer Endkonzentration der Verbindung der Formel (I) von 0,1 bis 10.000 ng/ml (vorzugsweise 1 bis 1.000 ng/ml) zugefügt und die Zellen wurden in dem Medium 30 Minuten bis 4 Tage (vorzugsweise 3 Stunden bis 2 Tage) kultiviert, um die Immunogenität der Zellen zu erhöhen. Die Bedingungen für die Kultivierung der Zellen und das zu verwendende Kulturmedium können gemäß konventionellen Verfahren gewählt werden.

Zur Erhöhung der zellulären Immunogenität gemäß der vorliegenden Erfindung können die Verbindungen in Form einer Lösung, Suspension oder Emulsion der Zellkultur zugefügt werden.

Die Verbindung kann in eine Zusammensetzung eingeschlossen werden, enthaltend pharmazeutisch akzeptable Träger oder Additive wie Verdünnungsmittel, insbesondere Lösungsmittel (z.B. Wasser und physiologische Salzlösung), löslichmachende Mittel (z.B. Ethanol und Polysolvate), isotonische Mittel, Konservierungsmittel, Antioxidanzien, Exzipienten (z.B. Lactose, Stärke, kristalline Cellulose, Mannit, Maltose, Calciumhydrogenphosphat, weiches Kieselsäureanhydrid und Calciumcarbonat), Bindemittel (z.B. Stärke, Polyvinylpyrrolidon, Hydroxypropylcellulose, Ethylcellulose, Carboxymethylcellulose und Gummi arabicum), Stabilisatoren (z.B. Lactose, Mannit, Maltose, Polysolvate, Makrogole und Polyoxyethylen-hydriertes Castoröl), Desintegrationsmittel (z.B. Stärke und Carboxymethylcellulosecalcium) und Gleitmittel (z.B. Magnesiumstearat, Talk und hydriertes Öl).

Falls nötig, können auch Glycerin, Dimethylacetamid, 70 %iges Natriumlactat, Tenside und alkalische Substanzen (z.B. Ethylendiamin, Ethanolamin, Natriumcarbonat, Arginin, Meglumin und Trisaminomethan) zugefügt werden.

Wenn Tumorzellen, die mit der Verbindung der Formel (I) kontaktiert wurden, in Mäusen immunisiert werden, wird eine Immunität gegenüber den Tumorzellen (zytotoxische Aktivität) induziert. Überraschend wird eine Immunität gegenüber anderen Tumorzellen als dem immunisierten Tumor selbst induziert (siehe Pharmakologisches Testbeispiel 1).

Zellen, deren Immunogenität erhöht werden soll, können Tumorzellen oder mit Pathogenen infizierte Zellen sein. Diese Zellen können aus Patienten mit Tumoren isoliert werden oder aus Patienten, die mit Pathogenen infiziert sind, oder in vitro künstlich erzeugt werden.

Beispiele für Tumorzellen, deren Immunogenität erhöht werden soll, beinhalten im wesentlichen alle Krebszellen, einschließlich Melanom, Nierenkrebs, Gebärmutterkrebs, Pankreaskrebs, Zerebraltumor, Glioblastom, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Hepatom, Lymphom, Leukämie und Fibrosarkom. Insbesondere werden Melanom- und Nierenkrebszellen bevorzugt.

Beispiele für die mit Pathogenen infizierten Zellen beinhalten diejenigen, die mit Viren infiziert sind. Die Bezeichnung "Pathogen" wie hier verwendet beinhaltet pathogene Mittel wie Chlamydiae, Rickettsiae, Listeria monocytogenes, Leishmaniae, Trypanosomen und Prionenproteine.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung der zellulären Immunogenität bereit, das den Schritt des Kontaktierens in vitro von Zellen mit der Verbindung der Formel (I) umfaßt oder einem Salz oder Solvat davon. Der Kontakt der Zellen mit der Verbindung der Formel (I) in vitro kann auf dieselbe Weise wie oben beschrieben durchgeführt werden.

In ihrer Immunogenität erhöhte Zellen

Die in ihrer Immunogenität erhöhten Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung können durch in vitro Kontaktieren der Verbindung der Formel (I) oder einem Salz oder Solvat davon mit Zellen erhalten werden, deren Immunogenität erhöht werden soll. Die in ihrer Immunogenität erhöhten Zellen können unter den oben beschriebenen Bedingungen hergestellt werden.

Die Verabreichung der in ihrer Immunogenität erhöhten Zellen an Säuger als Antigen induziert eine starke Immunität gegenüber den Zellen, und eine mit den Zellen assoziierte Erkrankung kann behandelt werden.

Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein therapeutisches Mittel für die Behandlung von Erkrankungen bereit, umfassend in ihrer Immunogenität erhöhte Zellen, die durch Kontaktieren von Zellen erhalten werden können, die mit einer Erkrankung assoziiert sind, mit der Verbindung der Formel (I) oder einem Salz oder Solvat davon. Die Bezeichnung "Therapie" wie hier verwendet bedeutet auch "Prävention".

Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung der Zellen wie beansprucht zur Behandlung von Erkrankungen assoziiert mit den Zellen bereit.

Tumoren können unter Verwendung der in ihrer Immunogenität erhöhten Tumorzellen als Wirkstoff behandelt werden. Infektiöse Erkrankungen können unter Verwendung von mit Pathogenen infizierten Zellen behandelt werden, deren Immunogenität erhöht wurde, als Wirkstoff.

Eine starke Immunität gegenüber Tumorzellen wird durch Immunisieren des Körpers mit Tumorzellen induziert, deren Immunogenität durch die Verbindung der Formel (I) erhöht wurde. Im Ergebnis werden Tumoren durch das Immunsystem angegriffen, was zu einer Tumorregression oder -auslöschung führt. Die Tumorzellen gemäß der vorliegenden Erfindung induzieren eine starke Immunität nicht nur bei Tumoren wie dem Melanom, von denen bekannt ist, daß ihre Immunogenität hoch ist, sondern auch gegenüber Tumoren wie dem T-Lymphom (siehe Pharmakologische Testbeispiele 2 und 3).

So stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung von Tumoren bereit, umfassend in ihrer Immunogenität erhöhte Tumorzellen, erhalten durch Kontaktieren von Tumorzellen in vitro mit der Verbindung der Formel (I) oder einem Salz oder Solvat davon.

Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung von in ihrer Immunogenität erhöhten Tumorzellen in einem Verfahren für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Tumoren bereit.

Die Bezeichnung "Tumor" wie hier verwendet bedeutet Krebsarten, einschließlich Melanom, Nierenkrebs, Gebärmutterkrebs, Pankreaskrebs, Zerebraltumor, Glioblastom, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Hepatom, Lymphom, Leukämie, Fibrosarkom und ähnliche.

Die Bezeichnung "pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung von Tumoren" wie hier verwendet beinhaltet Mittel für eine Krebsbehandlung wie z.B. Krebsvakzine oder Krebszellvakzine.

In der vorliegenden Erfindung können die in ihrer Immunogenität erhöhten Zellen über alle zweckgerichteten Wege verabreicht werden, zum Beispiel durch intraperitoneale oder subkutane Verabreichung, durch intravenöse oder intraarterielle Verabreichung und durch Lokalverabreichung per Injektion. Weiterhin können die intravenöse oder intraarterielle, lokale Verabreichung durch Injektion, intraperitoneale oder Intrathorax-Verabreichung, subkutane oder intramuskuläre Verabreichung verwendet werden, wenn an den Menschen verabreicht wird. Die intravenöse Verabreichung wird besonders bevorzugt.

Gemäß der vorliegenden Erfindung können die in ihrer Immunogenität erhöhten Zellen in Dosierungsformen wie injizierbaren Mitteln, Suspensionen und Emulsionen basierend auf konventionellen Verfahren verabreicht werden. Falls nötig können die Zellen, um die Immunogenität der Zellen weiter zu erhöhen, in Adjuvanzien wie Freunds komplettem Adjuvans suspendiert sein oder die Zellen können mit Substanzen verabreicht werden, die eine Adjuvansaktivität aufweisen, wie z.B. BCG. Pharmazeutische Zusammensetzungen für die Behandlung von Tumoren gemäß der vorliegenden Erfindung können die oben erwähnten pharmazeutisch akzeptablen Träger und Hilfsstoffe enthalten.

Ein Wirkstoff der pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kann kontinuierlich oder intermittierend, abhängig von dem spezifischen Zustand, verabreicht werden. Tatsächliche Dosen können abhängig von einer Vielzahl von Faktoren wie dem Verabreichungsweg, dem Zustand des Patienten, wie Alter, Körpergewicht, Geschlecht und Empfindlichkeit, der Verabreichungsperiode und anderen Arzneimitteln, die in Kombination genommen werden, bestimmt werden. Eine tägliche Dosis, die benötigt wird, um die Aktivität der in ihrer Immunogenität erhöhten Tumorzellen für einen erwachsenen Menschen auszuüben, z.B. durch intravenöse Verabreichung, liegt allgemein bei 1 × 105 bis 1 × 109 Zellen/kg Körpergewicht, vorzugsweise 1 × 106 bis 5 × 108 Zellen/kg Körpergewicht. Die in ihrer Immunogenität erhöhten Zellen werden vorzugsweise in injizierbare Mittel formuliert, die ohne weitere Verarbeitung als vorher eingestellte spezifizierte Konzentration verabreicht werden können oder auf eine spezifische Konzentration mit physiologischer Salzlösung vom Injektionsgrad oder ähnlichem direkt vor ihrer Verabreichung an die Patienten verdünnt werden können.

Die in ihrer Immunogenität erhöhten Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung können getötet werden oder ihre Proliferationsfähigkeit kann durch Bestrahlung oder Behandlung mit einem zytotoxischen Mittel vor Verabreichung an die Patienten ausgeschaltet werden.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele illustriert.

Synthese, Isolation und Reinigung von Verbindungen Beispiel 1: Synthese von (2S,3S,4R)-1-(&agr;-D-Galactopyranosyloxy)-2-hexacosanoylamino-3,4-octadecandiol (KRN 7000)

Die Syntheseschritte sind in den 6 und 7 dargestellt.

(1) Synthese der Verbindung G1

Schwefelsäure (0,5 ml) wurde einer Lösung aus D-Lyxose (200 g, 1,33 mol) in Aceton (3,0 l) zugefügt, die mit Calciumchlorid getrocknet worden war, und die Mischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Molekularsieb 4A Pulver (100 g) wurde hinzugefügt, die Reaktionsmischung wurde neutralisiert, dann mit Celite gefiltert und der resultierende Rest wurde mit Aceton gewaschen. Das Filtrat und die Waschung wurden kombiniert und unter Vakuum konzentriert, um ein Rohprodukt von G1 zu erhalten. Ertrag 240 g (95 %). Das Produkt wurde für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet. Eine Probe für einen Assay wurde durch Silicagel-Chromatographie unter Verwendung von Hexan:Aceton (9:1) als Elutionslösungsmittel gereinigt.

Smp. 76–78°C; FDMS m/z 191 (M + 1)+; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) &dgr; 5,45 (1H, d, J = 1,8 Hz), 4,83 (1H, dd, J = 3,7, 5,5 Hz), 4,64 (1H, d, J = 6,1 Hz), 4,27–4,30 (1H, m), 3,90–3,99 (2H, m), 1,48 (3H, s), 1,32 (3H, s)

(2) Synthese der Verbindung G2

Pyridin (10 ml) und Tritylchlorid (39,0 g) wurden einer Methylenchloridlösung (168 ml) der Verbindung G1 (239 g, ungefähr 1,26 mmol) zugefügt und die Mischung wurde 4 Stunden bei 32°C gerührt. Ethanol (8 ml) wurden tröpfchenweise zugefügt und die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Waschen mit einer wäßrigen gesättigten Ammoniumchloridlösung, einer wäßrigen gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und einer Salzlösung wurde eine Konzentration im Vakuum durchgeführt. Der resultierende Rest wurde in Ethylacetat gelöst, auf 0°C abgekühlt und dann kristallisiert. Ertrag 501 g (87 % von D-Lyxose).

Smp. 174–176°C; FDMS m/z 191 432M+; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) &dgr; 7,21–7,49 (15H, m), 5,38 (1H, d, J = 2,4 Hz), 4,75 (1H, dd, J = 3,7, 6,1 Hz), 4,59 (1H, d, J = 6,1 Hz), 4,31–4,35 (1H, m), 3,43 (1H, dd, J = 4,9, 9,8 Hz), 3,39 (1H, dd, J = 6,7, 9,8 Hz), 1,29 (3H, s), 1,28 (3H, s)

(3) Synthese von Verbindung G3

Zu einer THF-Lösung (1.500 ml) aus Tridecantriphenylphosphoniumbromid (962 g, 1,16 mol; hergestellt durch Erhitzen von 1-Bromtridecan und Triphenylphosphin für 4,5 Stunden bei 140°C) wurde eine 2,5 M Hexanlösung von n-Butyllithium (462 ml, 366 mmol) tröpfchenweise bei 0°C unter einer Argonatmosphäre zugefügt. Die Mischung wurde 15 Minuten gerührt, dann wurde eine THF-Lösung (450 ml) der Verbindung G2 (250 g, 579 mmol) tröpfchenweise zugefügt. Diese Mischung wurde 18 Stunden gerührt, während die Temperatur graduell auf Raumtemperatur angehoben wurde. Die Reaktionslösung wurde im Vakuum konzentriert, eine Mischung aus Hexan:Methanol:Wasser (10:7:3, 1.000 ml) wurde dem Rest zugefügt und die Mischung mit einer wäßrigen gesättigten Ammoniumchloridlösung gewaschen. Die Wasserschicht wurde mit Hexan (500 ml) extrahiert. Alle organischen Schichten wurden kombiniert, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert, um ein Rohprodukt von Verbindung G3 zu erhalten. Das Produkt wurde für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet. Ertrag 339 g (98 %). Eine Probe für den Assay wurde durch Silicagel-Chromatographie unter Verwendung von Hexan:Ethylacetat (9:1) als Elutionslösungsmittel gereinigt.

FDMS m/z 598M+; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) &dgr; 7,21–7,45 (15H, m), 5,48–5,59 (2H, m), 4,91 (0,7H, t, J = 7,3 Hz), 4,44 (0,3H, t, J = 7,3 Hz), 4,26 (0,3H, dd, J = 4,3, 7,3 Hz), 4,21 (0,7H, dd, J = 4,3, 6,7 Hz), 3,75 (0,7H, m), 3,69 (0,3H, m), 3,24 (0,3H, dd, J = 4,9, 9,8 Hz), 3,17 (0,7H, dd, J = 4,9, 9,8 Hz), 3,09–3,14 [1H, (3,11, dd, J = 4,9, 9,2 Hz), H1bE überlappend], 1,75–2,03 (2H, m), 1,49 (3H, s), 1,39 und 1,38 (3H, jeweils s), 1,21–1,34 (20H, m), 0,88 (3H, t, J = 6,7 Hz)

(4) Synthese der Verbindung G4

Zu einer Methylenchloridlösung (1.500 ml) der Verbindung G3 (338 g, ungefähr 565 mol) wurde Pyridin (500 ml) zugefügt und Methansulfonylchlorid (49 ml, 633 mmol) wurde tröpfchenweise zugefügt. Die Mischung wurde 24 Stunden bei 31°C gerührt. Ethanol (40 ml) wurde tröpfchenweise zugefügt und die Mischung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach einem Konzentrieren im Vakuum wurde eine Mischung aus Hexan:Methanol:Wasser (10:7:3, 1.000 ml) dem Rest für eine Abtrennung zugefügt. Die Wasserschicht wurde 3 mal mit Hexan (200 ml) extrahiert. Alle organischen Schichten wurden kombiniert, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert, um ein Rohprodukt der Verbindung G4 zu erhalten. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt verwendet. Ertrag 363 g (95 %). Eine Probe für den Assay wurde durch Silicagel-Chromatographie unter Verwendung von Hexan:Ethylacetat (9:1) als Elutionslösungsmittel gereinigt.

FDMS m/z 676M+; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) &dgr; 7,21–7,47 (15H, m), 5,41 (0,7H, ddd, J = 5,5, 9,2, 11,0 Hz), 5,32 (0,7H, bt, J = 11,0 Hz), 5,22 (0,3H, bdd, J = 9,2, 15,0 Hz), 5,02 (0,3H, dt, Jt = 7,3 Hz, Jd = 15,0 Hz), 4,8 (0,7H, ddd, J = 3,1, 5,5, 7,9 Hz), 4,73 (0,7H, dd, J = 5,5, 9,8 Hz), 4,64–4,67 (0,3H, m), 4,61 (0,3H, dd, J = 5,5, 9,2 Hz), 4,48 (0,7H, dd, J = 5,5, 7,9 Hz), 4,22 (0,3H, dd, J = 5,5, 9,2 Hz), 3,55 (0,3H, dd, J = 2,4, 11,6 Hz), 3,45 (0,7H, dd, J = 3,2, 11,0 Hz), 3,06–3,12 [4H, (3,12,s), (3,11,s), (3,09, dd, J = 3,1, 11,0 Hz)], 1,66–1,82 (2H, m), 1,47 und 1,46 (3H, jeweils s), 1,39 (3H, s), 1,13–1,35 (20H, m), 0,88 (3H, t, J = 6, 8 Hz)

(5) Synthese der Verbindung G5

Zu einer Methylenchloridlösung (1.500 ml) der Verbindung G4 (362 g, ungefähr 536 mol) wurde Methanol (350 ml) zugefügt, dann wurde konzentrierte Salzsäure (200 ml) tröpfchenweise zugefügt. Die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde durch Zugabe von Natriumhydrogencarbonat neutralisiert und dann gefiltert. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert und Ethylacetat wurde dem resultierenden Rest zugefügt und ein Waschen wurde mit einer Salzlösung durchgeführt. Die Wasserschicht wurde mit Ethylacetat extrahiert, alle organischen Schichten wurden kombiniert, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert. Die Kristallisierung wurde mit Hexan durchgeführt. Ertrag 161 g (70 % von G2).

Smp. 66–67°C; FDMS m/z 377(M-H2O)+; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3 + D2O) &dgr; 5,86 (0,3H, dt, Jt = 7,3 Hz, Jd = 14,7 Hz), 5,77 (0,7H, dt, Jt = 7,3, Jd = 10,4 Hz), 5,55 (0,3H, br.dd, J = 7,3, 14,7 Hz), 5,49 (0,7H, bt, J = 9,8 Hz), 4,91–4,97 (1H, m), 4,51 (0,7H, bt, J = 9,8 Hz), 4,11 (0,3H, bt, J = 7,3 Hz), 3,94–4,03 (2H, m), 3,67–3,73 [1H, (3,70, dd, J = 3,1, 6,7 Hz), (3,69, dd, J = 3,1, 7,3 Hz)], 3,20 und 3,19 (3H, jeweils s), 2,05–2,22 (2H, m), 1,22–1,43 (20H, m), 0,88 (3H, t, J = 6,7 Hz)

(6) Synthese der Verbindung G6

Zu einer THF-Lösung (780 ml) der Verbindung G5 (160 g, ungefähr 405 mol) wurde 5 % Palladiumbariumsulfat (16 g) zugefügt. Nach Ersetzen der Luft in einer Reaktionskammer durch Wasserstoffgas wurde die Mischung 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde unter Verwendung von Celite gefiltert, dann mit einer Mischung aus Chloroform:Methanol (1:1) gewaschen. Das Filtrat und die Waschung wurden kombiniert und im Vakuum konzentriert. Der resultierende Rest wurde mit Ethylacetat kristallisiert. Ertrag 146 g (91 %).

[&agr;]23D + 12° (c1,CHCl3/MeOH = 1:1); Smp. 124–126°C; FDMS m/z 397(M + 1)+; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD = 1:1) &dgr; 4,93–4,96 (1H, m, H2), 3,91 (1H, dd, J = 6,7, 12,2 Hz), 3,85 (1H, dd, J = 4,9, 12,2 Hz), 3,54–3,60 (1H, m), 3,50 (1H, dd, J = 1,8, 8,5 Hz), 3,19 (3H, s), 1,75–1,83 (1H, m), 1,53–1,62 (1H, m), 1,21–1,45 (24H, m), 0,89 (3H, t, J = 6,7 Hz)

(7) Synthese der Verbindung G7

Zu einer DMF-Lösung (1.000 ml) der Verbindung G6 (145 g, 365 mol) wurde Natriumazid (47 g, 730 mmol) zugefügt und die Mischung wurde 4 Stunden bei 95°C gerührt. Die Reaktionslösung wurde konzentriert, Ethylacetat wurde dem resultierenden Rest zugefügt und Waschen wurde mit Wasser durchgeführt. Die Wasserschicht wurde wieder mit Ethylacetat extrahiert. Alle organischen Schichten wurden kombiniert, mit einer Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert, um ein Rohprodukt der Verbindung G7 zu erhalten. Ertrag 122 g (97 %). Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt verwendet. Ertrag 126 g (95 %). Eine Probe für einen Assay wurde durch Silicagel-Chromatographie unter Verwendung von Hexan:Ethylacetat (9:1) als Elutionslösungsmittel gereinigt.

[&agr;]23D + 16,5° (c0,5,CHCl3-MeOH,1:1); Smp. 92–93°C; FDMS m/z 344(M + 1)+; 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) &dgr; 3,91 (1H, dd, J = 3,7, 11,6 Hz), 3,75 (1H, dd, J = 7,9, 11,6 Hz), 3,49–3,61 (3H, m), 1,50–1,71 (2H, m), 1,22–1,46 (24H, m), 0,90 (3H, t, J = 6,7 Hz)

(8) Synthese der Verbindung G8

Zu einer Methylenchloridlösung (750 ml) der Verbindung G7 (121 g, ungefähr 352 mmol) wurden Pyridin (250 ml) und Tritylchlorid (124 g, 445 mol) zugefügt und die Mischung wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Ethanol (30 ml) wurde tröpfchenweise zugefügt. Die Mischung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, mit einer wäßrigen gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung sowie einer wäßrigen gesättigten Ammoniumchloridlösung und einer Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert. Der Rest wurde durch Silicagel-Chromatographie unter Verwendung von Hexan:Ethylacetat (10:1) als Elutionslösungsmittel gereinigt. Ertrag 34,4 g (52 % von G6).

[&agr;]24D + 11,9° (c0,9,CHCl3); FDMS m/z 585M+; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3 + D2O) &dgr; 7,24–7,61 (15H, m), 3,62–3,66 (2H, m), 3,51–3,57 (2H, m), 3,42 (1H, dd, J = 6,0, 10,4 Hz), 1,23–1,56 (26H, m), 0,88 (3H, t, J = 6,7 Hz)

(9) Synthese der Verbindung G9

Zu einer DMF-Lösung (300 ml) der Verbindung G8 (33,5 g, 57,3 mmol) wurde 60 % hydriertes Natrium (5,5 g, ungefähr 138 mmol als NaH) zugefügt und die Mischung wurde 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde auf 0°C abgekühlt und Benzylchlorid (15 ml, 120 mmol) wurde tröpfchenweise zugefügt. Die Mischung wurde 18 Stunden gerührt, während die Temperatur langsam auf Raumtemperatur angehoben wurde. Eiswasser (100 ml) wurde der Reaktionslösung zugefügt. Nach Beendigung der Reaktion wurde eine Extraktion unter Verwendung von Ethylacetat durchgeführt. Der Extrakt wurde 3 mal mit Salzlösung gewaschen und alle organischen Schichten wurden kombiniert, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert, um ein Rohprodukt der Verbindung G9 zu erhalten. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt verwendet. Ertrag 42,2 g (96 %). Eine Probe für den Assay wurde durch Silicagel-Chromatographie unter Verwendung von Hexan:Ethylacetat (100:1) als Elutionslösungsmittel gereinigt.

[&agr;]24D + 9,8° (c1,0,CHCl3); FDMS m/z 738(M-N2)+; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) &dgr; 7,07–7,48 (25H, m), 4,57 (1H, d, J = 11,6 Hz), 4,44 (1H, d, J = 11,6 Hz), 4,41 (2H, s), 3,73–3,79 (1H, m), 3,46–3,56 (2H, m), 3,37 (1H, dd, J = 8,6, 10,4 Hz), 1,20–1,64 (26H, m), 0,88 (3H, t, J = 6,7 Hz)

(10) Synthese der Verbindungen G10 und G11

Zu einer 1-Propanollösung (250 ml) der Verbindung G9 (41,2 g, ungefähr 54 mmol) wurde Methanol (30 ml) zugefügt und es wurden weiterhin 5 % Palladiumkohlenstoff (4,1 g) und Ammoniumformiat (27,1 g, 4,3 mol) zugefügt. Nach Rühren für 16 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Mischung mit Ethylacetat verdünnt und mit Celite gefiltert. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert und der resultierende Rest wurde mit Ethylacetat gelöst und 3 mal mit einer wäßrigen gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und einer Salzlösung gewaschen. Alle organischen Schichten wurden kombiniert, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert, um ein Rohprodukt von G10 zu erhalten. Ertrag 38,9 g (98 %). Das so erhaltene G10 wurde ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt verwendet.

Zu einer Methylenchloridlösung (300 ml) der Verbindung G10 wurden Hexacosansäure (22,4 g, 56,5 mmol) und WSC Hydrogenchlorid (12,6 g, 64,6 mmol) zugefügt und die Mischung wurde 2 Stunden im Rückfluß erwärmt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und im Vakuum konzentriert. Dem Rest wurde Ethylacetat (500 ml) zugefügt, und Waschen wurde mit einer wäßrigen 0,5 M Salzsäurelösung sowie einer Salzlösung und einer wäßrigen gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und weiter mit einer Salzlösung durchgeführt. Alle organischen Schichten wurden kombiniert, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert, um ein Rohprodukt der Verbindung G11 zu erhalten. Ertrag 53,2 g (88 %). Das so erhaltene G11 wurde ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt verwendet. Eine Probe für einen Assay wurde durch Silicagel-Chromatographie unter Verwendung von Hexan:Ethylacetat (100:1) als Elutionslösungsmittel gereinigt.

[&agr;]24D + 5,3° (c0,4,CHCl3); FDMS m/z 1118M+; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) &dgr; 7,20–7,38 (25H, m), 5,57 (1H, d, J = 9,1 Hz), 4,80 (1H, d, J = 11,6 Hz), 4,48–4,50 (3H, m), 4,24–4,32 (1H, m), 3,83 (1H, dd, J = 3,0, 6,7 Hz), 3,43–3,51 (2H, m, H1a), 3,29 (1H, dd, J = 4,3, 9,8 Hz), 1,92 (2H, t, J = 7,3 Hz), 1,28–1,60 (72H, m), 0,88 (6H, t, J = 6,7 Hz)

(11) Synthese der Verbindung G12

Zu einer Methylenchloridlösung (180 ml) der Verbindung G11 (52,2 g, ungefähr 47 mmol) wurde Methanol (36 ml) zugefügt und dann wurde eine 10 %ige Methanolchloridlösung (3,0 ml) tröpfchenweise zugefügt und die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde mit Natriumhydrogencarbonatpulver (18 g) neutralisiert und mit Celite gefiltert. Der Rest wurde mit Methylenchlorid gewaschen. Das Filtrat und die Waschung wurden kombiniert und mit einer Salzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert. Der Rest wurde in Aceton unter Erwärmen gelöst und die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und durch Präzipitation gereinigt. Ertrag 38,6 g (77 % von G9).

[&agr;]24D–29,7° (c0,7,CHCl3); Smp. 75–76,5°C; FDMS m/z 876M+; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) &dgr; 7,30–,47 (10H, m), 6,03 (1H, d, J = 7,9 Hz), 4,72 (1H, d, J = 11,6 Hz), 4,66 (1H, d, J = 11,6 Hz), 4,61 (1H, d, J = 11,6 Hz), 4,45 (1H, d, J = 11,6 Hz), 4,12–4,17 (1H, m), 4,00 (1H, dt, Jt = 4,3, Jd = 7,3 Hz), 3,67–3,72 (2H, m), 3,61 (1H, ddd, J = 4,3, 8,6, 11,6 Hz), 1,94–2,05 (2H, m), 1,15–1,69 (72H, m), 0,88 (6H, t, J = 6,1 Hz)

(12) Synthese der Verbindung G13
  • 1) 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-D-galactopyranosylacetat (79,8 g) wurde in einer Mischung aus Toluol (160 ml) und Isopropylether (520 ml) gelöst und die Lösung wurde auf –10 bis 0°C abgekühlt. Dieser Lösung wurde eine Isopropyletherlösung (2,8 mmol/ml, ungefähr 100 ml) enthaltend 2,0 äquivalente Volumen HBr zugefügt. Nach Rühren für ungefähr 90 Minuten bei –10 bis 0°C wurde eine wäßrige 5 %ige Natriumhydrogencarbonatlösung in die Reaktionslösung gegossen und überschüssiges HBr wurde durch Rühren neutralisiert. Das gesamte Volumen wurde in einen Trenntrichter für die Abtrennung übertragen, dann wurde die wäßrige Schicht verworfen und ein 2-maliges Waschen wurde mit einer wäßrigen 10 %igen Natriumchloridlösung durchgeführt. Nach Konzentration im Vakuum wurde 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-&agr;-galactopyranosylbromid (GalBr) als Sirup erhalten.
  • 2) DMF (140 ml) und dann eine Toluollösung (250 ml) GalBr (ungefähr 137 mmol) wurden zu einer Toluollösung (420 ml) der Verbindung G12 (60,0 g, 68,6 mmol), Tetrahexylammoniumbromid (89,4 g, 206 mmol) und Molekularsieben 4A (60 g) zugefügt. Die Mischung wurde 72 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Methanol (12 ml) wurde der Reaktionslösung zugefügt und die Mischung wurde 2 Stunden gerührt. Eine Filtration mit Celite und Waschen mit einer wäßrigen gesättigten

Natriumhydrogencarbonatlösung und einer Salzlösung wurden durchgeführt, gefolgt von einem Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat und einer Konzentration im Vakuum. Acetonitril wurde dem resultierenden Rest zugefügt und die Mischung wurde 2 Stunden gerührt. Das resultierende Präzipitat wurde im Vakuum getrocknet, um ein trockenes Pulver zu erhalten. Dieses Pulver wurde durch Silicagel-Chromatographie unter Verwendung von Hexan:Ethylacetat (8:1) als Elutionslösungmittel gereinigt. Ertrag 70,9 g (74 %).

[&agr;]24D + 18,8° (c0,9,CHCl3); Smp. 74–75°C; FDMS m/z 1399(M + 1)+; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) &dgr; 7,21–7,37 (30H, m), 6,12 (1H, d, J = 9,0 Hz), 4,91 (1H, d, J = 11,6 Hz), 4,84 (1H, d, J = 3,7 Hz), 4,72–4,80 (4H, m), 4,35–4,65 (7H, m), 4,12–4,18 (1H, m), 3,99–4,05 (2H, m), 3,84–3,93 (4H, m), 3,74 (1H, dd, J = 3,7, 11,0 Hz), 3,47–3,51 (2H, m), 3,42 (1H, dd, J = 6,1, 9,1 Hz), 1,87–1,99 (2H, m), 1,18–1,70 (72H, m), 0,88 (6H, t, J = 7,4 Hz)

(13) Synthese der Verbindung KRN 7000

Die Verbindung G13 (60,0 g, 42,9 mmol) wurde zu Ethanol (960 ml) zugefügt, um eine Suspension herzustellen, wozu eine Ethanolsuspension aus 20 %igem Hydroxypalladium (6,0 g) zugefügt wurde. Weiterhin wurde eine Wasserstoffquelle, 4-Methylcyclohexen (120 ml, 93,5 mmol) zugefügt. Nach einem Erwärmen im Rückfluß für 4 Stunden wurde eine Filtration durchgeführt und das Lösungsmittel wurde entfernt. Der Rest wurde mit erwärmtem Ethanol gewaschen. Man ließ das Filtrat bei Raumtemperatur stehen, um ein weißes Präzipitat zu erhalten, und das Präzipitat wurde gefiltert und im Vakuum getrocknet. Das resultierende Pulver wurde in Ethanol:Wasser (92:8, 3,5 l) suspendiert und durch Wärme unter Rühren gelöst. Man ließ die Lösung stehen, um wiederum ein Präzipitat zu erhalten. Die Lösung mit dem Präzipitat wurde gefiltert und der Filterkuchen wurde um Vakuum getrocknet, um ein weißes Pulver zu erhalten. Ertrag 35,0 g (95 %).

[&agr;]23D + 43,6° (c1,0,Pyridin); Smp. 189,5–190,5°C; negative FABMS m/z 857(M-H); IR (cm–1, KBr) 3300, 2930, 2850, 1640, 1540, 1470, 1070; 1H-NMR (500 MHz, C5D5N) &dgr; 8,47 (1H, d, J = 8,5 Hz), 5,58 (1H, d, J = 3,7 Hz), 5,27 (1H, m), 4,63–4,70 (2H, m), 4,56 (1H, m), 4,52 (1H, t, J = 6,1 Hz), 4,37–4,47 (4H, m), 4,33 (2H, m), 2,45 (2H, t, J = 7,3 Hz), 2,25–2,34 (1H, m), 1,87–1,97 (2H, m), 1,78–1,85 (2H, m), 1,62–1,72 (1H, m), 1,26–1,45 (66H, m), 0,88 (6H, t, J = 6,7 Hz), 13C-NMR (125 MHz, C5D5N) &dgr; 173,2 (s), 101,5 (d), 76,7 (d), 73,0 (d), 72,5 (d), 71,6 (d), 71,0 (d), 70,3 (d), 68,7 (t), 62,7 (t), 51,4 (d), 36,8 (t), 34,4 (t), 32,1 (t), 30,4 (t), 30,2 (t), 30,03 (t) 30,00 (t), 29,93 (t), 29,87 (t), 29,81 (t), 29,76 (t), 29,6 (t), 26,5 (t), 26,4 (t), 22,9 (t), 14,3 (q)

Beispiel 2: Isolation und Reinigung von O-&agr;-D-Galactopyranosyl-(1→2)-O-&agr;-D-galactopyranosyl-(1→1)-(2S,3S,4R)-2-amino-N-[(R)-2-hydroxytetracosanoyl]-1,3,4-octadecantriol (S1140B-9)

Ein gefriergetrocknetes Pulver (447,1 g) von Schwämmen, die in einer Tiefe von 15 bis 25 m aus dem Meer nahe Kume Island der Okinawa-Präfektur geerntet worden waren, wurde mit einer Mischung aus Chloroform und Methanol extrahiert, dann wurde die extrahierte Flüssigkeit im Vakuum konzentriert, um 51,28 g Extrakt zu erhalten. Der Extrakt wurde mit Ethylacetat und Wasser partitioniert und die obere Schicht und die mittlere Schicht wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert, um 18,37 g bzw. 9,44 g Fraktionen zu erhalten. Eine Alkoholschicht, die durch Partitionierung der aus der oberen Schicht mit 10 %igem wäßrigen Methanol und n-Hexan erhaltenen Fraktion erhalten wurde, und die Fraktion erhalten von der mittleren Schicht wurden kombiniert und konzentriert. Durch Wiederholung der Silicagel-Chromatographie wurden 169,9 mg einer einzelnen aktiven Komponente auf Normalphasen-DC erhalten. Eine weitere Reinigung wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer ODS-AM-Säule (ein Produkt von YMC, 250 mm × 20 mm Durchmesser, Methanol, 9,0 ml/min) durchgeführt (Retentionszeit: 30,3 Minuten), um 10,2 mg der gereinigten Titelverbindung (S1140B-9) zu erhalten.

Die Titelverbindung kann auch durch das von F. Cafieri et al., Liebigs Ann. Chem. 1995, 1477–1481, beschriebene Verfahren isoliert und gereinigt werden.

Negative FABMS m/z 1007[(M-H)]; IR; 1HNMR (500 MHz, C5D5N, 24°C) &dgr; (ppm) 8,55 (1H, d, J = 9,2 Hz, NH), 5,60 (1H, d, J = 3,7 Hz, H1''), 5,57 (1H, d, J = 3,7 Hz, H1'''), 5,13 (1H, m, H2), 4,75 (1H, dd, J = 3,7, 10,4 Hz, H2''), 4,62 (2H, m), 4,54 (4H, m), 4,25–4,47 (10H, m), 2,17 (2H, m), 1,99 (1H, m), 1,87 (2H, m), 1,75 (1H, m), 1,65 (2H, m), 1,12–1,49 (60H, m), 0,85 (6H, m, terminales Methyl);

13CNMR (125 MHz, C5D5N, 45°C) &dgr; (ppm) 175,5 (s, C1'), 99,5 (d, C1'''), 98,6 (d, C1''), 76,7 (d, C2''), 76,0 (d, C3), 72,8 (d, C4), 72,6 (d, C5''), 72,6 (d, C4''), 72,5 (d, C2), 71,3 (d, C3'''), 71,0 (d), 70,8 (d), 70,5 (d, C2'''), 69,7 (d, C3''), 68,6 (t, C1), 62,7 (t), 62,5 (t), 51,2 (t, C2), 39,4 (t), 35,6 (t), 33,7 (t), 32,2 (t), 30,5 (t), 30,3 (t), 30,1 (t), 30,0 (t), 29,7 (t), 29,6 (t), 26,7 (t), 26,0 (t), 23,0 (t), 22,9 (t), 14,3 (q, terminales Methyl)

Beispiel 3

Die folgenden Verbindungen wurden gemäß den Verfahren synthetisiert, die in den in der rechten Spalte angegebenen Referenzen beschrieben sind.

Die Beziehungen zwischen den Verbindungen der Formel (I) und den in dem oben erwähnten Beispiel beschriebenen Verbindungen sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1
Biologischer Test Pharmakologischer Test 1: Wirkung von &agr;-Glycosylceramid auf die Immunogenität von Tumorzellen

Das Experiment wurde unter Verwendung von C57BL/6-Mäusen durchgeführt, die von Japan SLC, Inc. käuflich erworben wurden. Die in Beispiel 1 synthetisierte Verbindung (KRN 7000) wurde in dem folgenden Experiment als repräsentative Verbindung mit &agr;-Glycosylceramidstruktur verwendet. AGL-583, die in Beispiel 3 synthetisierte Verbindung mit einer &bgr;-Glycosylceramidstruktur wurde als negative Kontrolle verwendet.

Zunächst wurde die Wirkung eines Vehikels, KRN 7000 und AGL-583, auf die Immunogenität von Tumorzellen untersucht. Tumorzellen, Maus-T-Lymphom-EL-4-Zellen (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), wurden in einem RPMI1640 Medium, enthaltend 10 % FCS (fötales Kälberserum), Glutamin und Antibiotika, suspendiert und in vitro kultiviert. Vor dem Beginn der Behandlung mit jedem Arzneimittel wurden EL-4-Zellen gewonnen und wieder in frischem Medium suspendiert, dann begann die Inkubation direkt unter Zugabe eines Vehikels (0,1 % DMSO), KRN 7000 (100 ng/ml) oder AGL-583 (100 ng/ml). Einen Tag nach der Inkubation wurden drei Arten von Tumorzellen, d.h. EL-4/V, EL-4/KRN und EL-4/583, kultiviert in Gegenwart des Vehikels, KRN 7000 bzw. AGL-583, geerntet, zweimal mit dem Medium gewaschen und dann wiederum in frischem Medium suspendiert. Die Suspensionen wurden intravenös in den Schwanz von C57BL/6-Mäusen (weiblich, 8 Wochen alt) mit 5 × 105 Zellen/Maus immunisiert. Drei Tage später wurden Milzzellfraktionen als Effektorzellen hergestellt aus (1) Mäusen ohne Immunisierung (gesunde Kontrolle), (2) Mäusen inokuliert mit EL-4/V, (3) Mäusen immunisiert mit EL-4/KRN und (4) Mäusen immunisiert mit EL-4/583. Als Zielzellen wurden 51Cr-markierte YAC-1 (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) und EL-4-murine Tumorzellen verwendet. Die Effektorzellen und Zielzellen wurden mit einem E/T-(Effektor/Ziel)-Verhältnis von 25:1, 50:1 und 100:1 ausplattiert. Nach 4-stündiger Inkubation wurde freigesetztes 51Cr durch eine &ggr;-Zählvorrichtung gemessen, um die zytotoxische Aktivität der jeweiligen Milzzellen unter Verwendung der folgenden Formel zu berechnen.

"Maximale Freisetzung" bedeutet die Menge von freigesetztem 51Cr, wenn unter Zugabe von HCl kultiviert wird, "spontane Freisetzung" bedeutet die Menge von 51Cr, die freigesetzt wird wenn ohne Zugabe kultiviert wird, und "experimentelle Freisetzung" bedeutet die Menge an 51Cr, die freigesetzt wird, wenn individuelle Milzzellen zugefügt wurden. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt.

Wie in 1A dargestellt, war die zytotoxische Aktivität von YAC-1 in Milzzellen von Mäusen, immunisiert mit EL-4/V und EL-4/583 fast dieselbe wie bei den gesunden Mäusen. Demgegenüber zeigten Milzzellen von Mäusen, die mit EL-4/KRN immunisiert worden waren, eine deutlich höhere zytotoxische Aktivität.

Andererseits war die zytotoxische Aktivität von EL-4, wie in 1B dargestellt, bei Milzzellen von Mäusen, die mit EL-4/V oder EL-4/583 immunisiert worden waren, höher als bei denjenigen der gesunden Kontrollmäuse, jedoch war die zytotoxische Aktivität bei den Milzzellen von Mäusen noch höher, die mit EL-4/KRN inokuliert wurden.

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß die Inkubation von Tumorzellen unter Zugabe eines &agr;-Glycosylceramids die Immunogenität der Tumorzellen erhöht, so daß eine extrem starke Tumorimmunität bei Mäusen induziert wird, die mit den resultierenden Tumorzellen inokuliert werden. Obwohl eine Immunität gegen EL-4, nämlich eine Antitumorimmunität, nur gegen einen spezifischen Tumor auf einem niedrigen Niveau bei Milzzellen von Mäusen, immunisiert mit EL-4/V oder EL-4/583, induziert wurde, wurde außerdem ein extrem starke Tumorimmunität nicht nur gegen EL-4 sondern auch gegen NK-empfindliche YAC-1-Zellen bei Milzzellen bei den Mäusen induziert, die mit EL-4/KRN immunisiert wurden. Dementsprechend zeigte sich, daß nicht nur eine tumorspezifische Immunität sondern auch eine nichtspezifische Immunität durch Immunisierung mit EL-4/KRN induziert wurde.

Pharmakologischer Test 2: Therapeutische Wirkung von Tumorzellen, die mit einem &agr;-Glycosylceramid behandelt wurden, auf EL-4-Lebermetastase-Modellmäuse

Da die Ergebnisse des pharmakologischen Tests 1 ergaben, daß &agr;-Glycosylceramide wirksam waren, um eine Immunogenität von Tumorzellen zu erhöhen, untersuchten wir als nächstes, ob die Immunisierung von &agr;-Glycosylceramid-behandelten Tumorzellen eine Antitumorwirkung auf existierende Tumoren ausübt, d.h. ob die Immunisierung mit den in ihrer Immunogenität erhöhten Tumorzellen für eine Tumortherapie wirksam ist.

Maus-T-Lymphom-El-4-Zellen (4 × 105 Zellen/Maus) wurden intravenös in den Schwanz von BDF1-Mäusen (weiblich, 6 Wochen alt, Japan SLC, Inc.) mit 6 Tieren in einer Gruppe implantiert, um krebstragende Mäuse herzustellen. Die Tage der Tumorimplantation wurden als Tag 0 festgesetzt. Am selben Tag wurde ein Vehikel (0,1 % DMSO)., KRN 7000 (100 ng/ml) oder AGL-583 (100 ng/ml) den EL-4-Zellen zugefügt, die in ein frisches Medium inokuliert worden waren, und zwar auf dieselbe Weise wie im obigen pharmakologischen Test 1. Einen Tag nach Beginn der Inkubation wurden die in Gegenwart von Vehikel, KRN 700 bzw. AGL-583 kultivierten Zellen von EL-4/V, EL-4/KRN und EL-4/583 gewonnen und zweimal mit dem Medium gewaschen, woraufhin die gewonnenen Zellen intravenös in den Schwanz der krebstragenden Mäuse mit 1 × 105 Zellen/Maus immunisiert wurden. Die resultierenden Antitumorwirkungen wurden verglichen.

Die mit EL-4 implantierten Mäuse starben allgemein nach ungefähr 30 Tagen aufgrund einer Tumorbildung und eines Wachstums in etlichen Organen, insbesondere der Leber. Daher wurde eine Antitumorwirkung durch Beobachtung der Überlebenszeitspanne der krebstragenden Wirte bewertet. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt.

Wie in 2 dargestellt, war bei den EL-4-tragenden Mäusen, immunisiert mit EL-4 behandelt mit Vehikel oder AGL-583, die Überlebenszeitspanne überhaupt nicht verlängert, und es wurde keine deutliche Antitumorwirkung beobachtet im Vergleich mit Kontrollmäusen, denen nur die Tumoren implantiert worden waren. Demgegenüber war die Überlebenszeitspanne bei EL-4-tragenden Mäusen, immunisiert mit KRN 7000-behandelten EL-4, deutlich verlängert und 33,3 % der behandelten Mäuse überlebten für eine lange Zeitspanne.

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß während Tumorzellen, die mit Vehikel oder AGL-538 behandelt wurden, einer Verbindung mit einer &bgr;-Glycosylceramidstruktur, keine Wirkung aufweisen wenn diese in der Tumortherapie verwendet wurden, Tumorzellen, die unter Zugabe von KRN 7000 kultiviert wurden, einer Verbindung mit einer &agr;-Glycosylceramidstruktur, deutliche Antitumoraktivitäten aufweisen, wenn sie in der Tumortherapie verwendet werden. So zeigte sich, daß Tumorzellen, die mit einem &agr;-Glycosylceramid behandelt wurden, für die Tumortherapie effektiv waren.

Pharmakologischer Test 3: Therapeutische Wirkung von Tumorzellen, die mit &agr;-Glycosylceramid behandelt wurden, auf B16-Melanomlungenmetastase-Modellmäuse

Andere Tumorzellen als die im pharmakologischen Test 2 verwendeten, d.h. B16-Melanom (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), wurden mit einem &agr;-Glycosylceramid behandelt, um die Wirksamkeit dieser Tumorzellen in der Tumortherapie zu untersuchen.

Maus-Bl6-Melanomzellen (4 × 105 Zellen/Maus) wurden intravenös in den Schwanz von BDF1-Mäusen (weiblich, 6 Wochen alt) mit 6 Mäusen in einer Gruppe implantiert, um krebstragende Mäuse herzustellen. Der Tag der Tumorimplantation wurde als Tag 0 festgesetzt. Die Inkubation der B16-Zellen begann an demselben Tag mit einer Zugabe eines Vehikels (0,1 % DMSO) oder KRN 7000 (100 ng/ml) auf dieselbe Weise wie im pharmakologischen Test 2. Einen Tag nach der Inkubation wurden Zellen von B16/V und B16/KRN, kultiviert in Gegenwart von Vehikel bzw. KRN 7000, geerntet und zweimal mit dem Medium gewaschen. Dann wurden die geernteten Zellen intravenös in den Schwanz der oben erwähnten krebstragenden Mäuse mit 1 × 105 Zellen/Maus immunisiert. Die resultierende Antitumorwirkung wurde verglichen.

Die B16-implantierten Mäuse starben allgemein nach ungefähr 60 Tagen aufgrund der Bildung und des Wachstums metastatischer Knoten in der Lunge. Dementsprechend wurde eine Antitumorwirkung durch Beobachtung der Überlebenszeitspanne der krebstragenden Wirte bewertet. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt.

Wie in 3 dargestellt, wurden bei krebstragenden Mäusen, die mit B16/V-Zellen immunisiert worden waren, die Antitumorwirkung gar nicht beobachtet und die Überlebenszeitspanne neigte im Vergleich mit den Kontrollmäusen, in die nur Tumorzellen implantiert worden waren, eher dazu, sich zu verkürzen. Demgegenüber wurde bei mit B16/KRN inokulierten Mäusen eine deutliche Antitumorwirkung beobachtet und 50 % der Mäuse überlebten 70 Tage nach der Tumorimplantation.

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß andere Tumorzellen als die im pharmakologischen Test 2 verwendeten, und die mit einem &agr;-Glycosylceramid behandelt wurden, eine deutliche Antitumorwirkung ausüben, wenn sie in krebstragende Mäuse immunisiert werden. So ergab sich, daß mit einem &agr;-Glycosylceramid behandelte Tumorzellen in der Tumortherapie effektiv sind.

Pharmakologischer Test 4: Wirkung von &agr;-Glycosylceramid auf die Tumorigenität von Tumorzellen

Die Ergebnisse der pharmakologischen Tests 2 und 3 zeigten, daß mit einem &agr;-Glycosylceramid behandelte Tumorzellen eine Antitumoraktivität bei krebstragenden Mäusen ausübten. Allgemein wird bei der konventionellen Tumortherapie die proliferative Aktivität von Tumorzellen durch Bestrahlung oder eine andere Behandlung vor der Immunisierung aufgehoben, andererseits könnte der immunisierte Tumor selbst, der als Vakzin verwendet wird, eine Tumorlast bilden. Tatsächlich zeigen die Ergebnisse des pharmakologischen Tests 3, daß die Überlebenszeitspanne von Mäusen, die mit Tumorzellen immunisiert wurden, die mit dem Vehikel behandelt wurden, dazu neigten sich zu verkürzen, wenn auch nur sehr gering. Die Tumorzellen, die mit einem &agr;-Glycosylceramid behandelt wurden, verlängerten jedoch nicht nur die Überlebenszeitspanne, sondern es wurden ebenfalls Fälle einer fast vollständigen Heilung bemerkt. Daher werden mit &agr;-Glycosylceramid behandelte Tumorzellen unter Umständen ohne Aufheben ihrer Proliferationsfähigkeit durch Bestrahlung oder ähnliches verwendet werden können, jedoch bleibt ihre Tumorigenität (d.h. die Fähigkeit zur Bildung einer Tumorlast) noch zu bestätigen. Daher wurde die Wirkung eines &agr;-Glycosylceramids auf die Tumorigenität verschiedener muriner Tumoren wie folgt untersucht.

Sechs Arten von Maustumorzellen, d.h. drei Arten von C57BL/6-Maus-abgeleiteten Tumorzellen, d.h. murine Melanom-Bl6-Zellen (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), Maus-T-Lymphom-EL-4-Zellen (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) und Maus-Lewis-Lungenkarzinomzellen (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) und drei Arten von von BALBc-Maus-abgeleiteten Tumorzellen, d.h. Maus-Kolonkrebszelle Colon 26 (Japanese Foundation for Cancer Research), Maus-Leukämie-L1210-Zellen (Japanese Foundation for Cancer Research) und Maus-Fibrosarkom-Meth-A-Zellen (Japanese Foundation for Cancer Research), wurden mit und ohne Zugabe eines Vehikels (0,1 % DMSO) oder KRN 7000 (100 ng/ml) für einen Tag, wie in den pharmakologischen Tests oben beschrieben, kultiviert. Die resultierenden Tumorzellen wurden zweimal mit einem Medium gewaschen, wiederum in frischem Medium suspendiert und intravenös in den Schwanz der korrespondierenden Mäuse implantiert. Das heißt, B16-, EL-4- und LLC-Zellen wurden in C57BL/6-Mäuse (weiblich, 9 Wochen alt) mit 5 × 105 Zellen/Maus, 1 × 105 Zellen/Maus bzw. 5 × 105 Zellen/Maus implantiert, und Colon 26-, Meth A- und L1210-Zellen wurden in BALB/c-Mäuse (weiblich, 9 Wochen alt) mit 2 × 106 Zellen/Maus, 1 × 105 Zellen/Maus bzw. 5 × 105 Zellen/Maus implantiert.

Die in den Schwanz intravenös implantierten Tumorzellen bildeten metastasierende Knötchen an verschiedenen Organen, insbesondere der Leber oder der Lunge, und töteten schließlich die Tiere. Dementsprechend ist die Wirkung der Tumorzellen auf die Tumorigenität (eine Rate der Tumorbildung, die Fähigkeit eine Tumorlast zu bilden) durch Beobachtung der Überlebenszeitspanne bewertbar.

Wie in 4 dargestellt, starben alle Mäuse, denen die Tumorzellen implantiert worden waren, die in einem üblichen Medium ohne Arzneimittel kultiviert worden waren, und ihre Tumorigenität betrug 100 %. Ähnlich starben alle Mäuse, immunisiert mit Tumorzellen, die mit Vehikel für 1 Tag kultiviert worden waren, und ihre Tumorigenität betrug 100 %. Demgegenüber überlebten 40 bis 100 % der Mäuse, denen Tumorzellen implantiert worden waren, die mit KRN 7000 1 Tag kultiviert worden waren, und ihre Tumorigenität verminderte sich oder war vollständig verschwunden.

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß die Tumorigenität von Tumorzellen deutlich durch Kultivierung unter Zugabe von &agr;-Glycosylceramiden, repräsentiert durch KRN 7000, reduziert ist. Eine separate Studie wurde durchgeführt, um herauszufinden, ob KRN 7000 eine zytostatische Aktivität auf Tumorzellen ausübt. Die Ergebnisse zeigen, daß Tumorzellen, die unter Zugabe von KRN 7000 auf dieselbe Weise wie im pharmakologischen Test 4 kultiviert worden waren, eine ähnliche proliferative Fähigkeit aufwiesen wie Tumorzellen, die ohne Zugabe oder mit Zugabe des Vehikels kultiviert wurden. So zeigte sich, daß die beobachtete Wirkung nicht durch eine direkte Zytotoxizität von KRN 7000 selbst auf Tumorzellen hervorgerufen wird, sondern auf andere biologische Aktivitäten zurückzuführen ist.

So zeigte sich, daß mit einem &agr;-Glycosylceramid behandelte Tumorzellen als nützliches Krebsvakzin immunisiert werden können, ohne weitere Bestrahlung, um ihre proliferative Fähigkeit zu beeinträchtigen. Dementsprechend legen die Ergebnisse der pharmakologischen Tests 1 bis 4 nahe, daß wenn mit einem &agr;-Glycosylceramid behandelte Tumorzellen immunisiert werden, die Immunität des Wirts fast vollständig die immunisierten Tumorzellen selbst auslöscht und gleichzeitig immunkompetente Zellen des Wirts aktiviert werden, um eine Antitumorimmunität gegen die ursprünglich existierenden Tumoren zu induzieren.

Andere Tumorzellen als die in den pharmakologischen Tests 1 bis 3 verwendeten wurden ebenfalls in dieser Studie verwendet. Es zeigte sich, daß die Tumorigenität aller Tumorzellen durch Behandlung mit &agr;-Glycosylceramid reduziert war. Unter der Betrachtung, daß die therapeutische Wirkung von B16- und EL-4-Zellen, behandelt mit einem &agr;-Glycosylceramid, eng mit einer Reduktion der Tumorigenität assoziiert war, wird eine Tumortherapie mit Tumorzellen, wobei es sich nicht um B16 und EL-4 handelt, ebenfalls als möglich angesehen.

Pharmakologischer Test 5: Therapeutische Wirkung von Tumorzellen, behandelt mit einem &agr; -Glycosylceramid und bestrahlt auf B16-Melanomlungenmetastase-Modellmäuse

Die Ergebnisse der Pharmakologischen Tests 2 bis 4 zeigten, daß mit einem &agr;-Glycosylceramid behandelte Tumorzellen als Krebsvakzin ohne weitere Behandlung durch Bestrahlung oder Chemotherapeutika oder ähnliches zum Töten der Zellen nützlich waren. Sicherere Tumorvakzine, wobei Zellen durch Bestrahlung oder durch ähnliches getötet wurden, werden jedoch allgemein in der üblichen Tumortherapie verwendet. Dementsprechend wurde eine Studie durchgeführt, um festzustellen, ob &agr;-Glycosylceramid-behandelte Tumorzellen eine therapeutische Aktivität ausübten, wenn sie vor der Immunisierung bestrahlt wurden.

Maus-Bl6-Melanomzellen (5 × 105 Zellen/Maus) wurden intravenös in den Schwanz von C57BL/6-Mäusen (weiblich, 9 Wochen alt) mit 7 Tieren in einer Gruppe implantiert, um krebstragende Mäuse herzustellen. Der Tag der Tumorimplantation wurde als Tag 0 festgesetzt. Am selben Tag wurden B16-Zellen, suspendiert auf frischem Medium, in vitro unter Zugabe eines Vehikels (0,1 % DMSO) oder KRN 7000 (100 ng/ml) auf dieselbe Weise wie im pharmakologischen Test 4 inkubiert. Einen Tag nach der Inkubation wurden B16/V- und B16/KRN-Zellen in Gegenwart von Vehikel bzw. KRN 7000 kultiviert, geerntet und zweimal mit PBS gewaschen (phosphatgepufferte Salzlösung). Dann wurden die resultierenden Zellen in zwei Gruppen unterteilt, nämlich mit 200 Gy bestrahlte oder nicht bestrahlte, und intravenös in den Schwanz der oben erwähnten krebstragenden Mäuse mit 1 × 105 Zellen/Maus immunisiert. Die Antitumorwirkungen der beiden Gruppen der Zellen wurden verglichen.

Wie in 5 dargestellt, wurde unabhängig von einer Bestrahlung oder Nichtbestrahlung keine Antitumorwirkung bei Mäusen beobachtet, denen V16/V-Zellen inokuliert worden waren, im Vergleich mit Kontrollmäusen inokuliert mit unbehandelten Tumorzellen. Demgegenüber wurde unabhängig von einer Bestrahlung oder Nichtbestrahlung eine deutliche Antitumorwirkung bei Mäusen beobachtet, denen V16/KRN-Zellen inokuliert wurden, und ungefähr 60 bis 70 % der Mäuse überlebten bis zu 50 Tage nach der Tumorimplantation.

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß bestrahlte &agr;-Glycosylceramid-behandelte Tumorzellen eine deutliche Antitumoraktivität ausüben, ähnlich wie diejenige ohne Bestrahlung wie in den pharmakologischen Tests 2 und 3. So ergab sich, daß &agr;-Glycosylceramid-behandelte Tumorzellen weiter bestrahlt werden können, um sie für eine sicherere Tumortherapie zugänglich zu machen.


Anspruch[de]
  1. In vitro-Verwendung einer Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes oder Solvats davon zur Herstellung eines Mittels zur Verbesserung der Immunogenität von Tumorzellen oder mit einem Krankheitserreger infizierten Zellen:
    worin

    R1 H oder OH darstellt,

    X eine Zahl zwischen 7 und 27 darstellt,

    R2 einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden (a) bis (e) (worin Y eine ganze Zahl zwischen 5 und 17 ist) darstellt:

    (a) -CH2(CH2)YCH3

    (b) -CH(OH)(CH2)YCH3

    (c) -CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2

    (d) -CH=CH(CH2)YCH3

    (e) – CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3, und

    R3 bis R9 Substituenten darstellt wie in i) und ii) nachfolgend definiert:

    i) wenn R3, R6 und R8 H darstellen,

    R4 H, OH, NH2, NHCOCH3 oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) darstellt
    R5 OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (E) und (F) darstellt:
    R7 OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) darstellt:
    R9 H, CH3, CH2OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A') bis (D') darstellt:
    ii) wenn R3, R6 und R7 H darstellen,

    R4 H, OH, NH2, NHCOCH3 oder einen Substituenten ausgewählt aus Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) darstellt:
    R5 OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (E) und (F) darstellt:
    R8 OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) darstellt:
    R9 H, CH3, CH2OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A') bis (D') darstellt:
  2. In vitro-Verwendung gemäß Anspruch 1, worin in Formel (I) R3 und R6 H darstellen, R4 OH oder einen Substituenten aus einer der Gruppen (A) bis (D) darstellt, R5 OH oder einen Substituenten aus Gruppe (E) oder (F) darstellt, R7 und R8 jeweils H oder OH darstellen (R7 und R8 stellen nicht den gleichen Substituenten dar) und R9 CH2OH, CH3, H oder einen Substituenten aus einer der Gruppen (A') bis (D') darstellt.
  3. In vitro-Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin in Formel (I) X eine ganze Zahl zwischen 21 und 25 und R2 Gruppe (b) darstellt, worin Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 ist.
  4. In vitro-Verwendung gemäß Anspruch gemäß Anspruch 1, worin eine Verbindung der Formel (I) (2S,3S,4)-1-(&agr;-D-Galactopyranosyloxy)-2-hexacosanoylamino-3,4-octadecandiol ist.
  5. In vitro-Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das Mittel zur Verbesserung der Immunogenität von Tumorzellen verwendet wird.
  6. In vitro-Verwendung gemäß Anspruch gemäß Anspruch 1, worin das Mittel zur Herstellung von Tumorzellen zur Tumortherapie verwendet wird.
  7. Verfahren zur Verbesserung der Immunogenität von Tumorzellen oder von mit einem Krankheitserreger infizierten Zellen, umfassend die Schritte des Inkontaktbringens der Tumorzellen oder von mit einem Krankheitserreger infizierten Zellen mit einer Verbindung der Formel (I) in vitro:
    worin

    R1 H oder OH darstellt;

    X eine Zahl zwischen 7 und 27 darstellt,

    R2 einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden (a) bis (e) (worin Y eine ganze Zahl zwischen 5 und 17 ist) darstellt:

    (a) -CH2(CH2)YCH3

    (b) -CH(OH)(CH2)YCH3

    (c) -CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2

    (d) -CH=CH(CH2)YCH3

    (e) -CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3, und

    R3 bis R9 Substituenten darstellt wie in i) und ii) nachfolgend definiert:

    i) wenn R3, R6 und R8 H darstellen,

    R4 H, OH, NH2, NHCOCH3 oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) darstellt:
    R5 OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (E) und (F) darstellt:
    R7 OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) darstellt:
    R9 H, CH3, CH2OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A') bis (D') darstellt:
    ii) wenn R3, R6 und R7 H darstellen,

    R4 H, OH, NH2, NHCOCH3 oder einen Substituenten ausgewählt aus Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) darstellt:
    R5 OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (E) und (F) darstellt:
    R8 OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) darstellt:
    R9 H, CH3, CH2OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A') bis (D') darstellt:
    oder ein Salz oder Solvat davon, in vitro.
  8. Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei die Zellen Tumorzellen sind.
  9. Tumorzelle oder eine mit einem Krankheitserreger infizierte Zelle, wobei die Zelle erhältlich ist durch Inkontaktbringen derselben mit einer Verbindung der Formel (I):
    worin

    R1 H oder OH darstellt,

    X eine Zahl zwischen 7 und 27 darstellt,

    R2 einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden (a) bis (e) (worin Y eine ganze Zahl zwischen 5 und 17 ist) darstellt:

    (a) -CH2(CH2)YCH3

    (b) -CH(OH)(CH2)YCH3

    (c) -CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2

    (d) -CH=CH(CH2)YCH3

    (e) -CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3, und

    R3 bis R9 Substituenten darstellt wie in i) und ii) nachfolgend definiert:

    i) wenn R3, R6 und R8 H darstellen,

    R4 H, OH, NH2, NHCOCH3 oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) darstellt:
    R5 OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (E) und (F) darstellt:
    R7 OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) darstellt:
    R9 H, CH3, CH2OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A') bis (D') darstellt:
    ii) wenn R3, R6 und R7 H darstellen,

    R4 H, OH, NH2, NHCOCH3 oder einen Substituenten ausgewählt aus Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) darstellt:
    R5 OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (E) und (F) darstellt:
    R8 OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A) bis (D) darstellt:
    R9 H, CH3, CH2OH oder einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A') bis (D') darstellt:
    oder ein Salz oder Solvat davon, in vitro.
  10. Zelle gemäß Anspruch 9, wobei die Zelle eine Tumorzelle ist.
  11. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge der Zelle gemäß Anspruch 9 zur Verwendung bei der Behandlung von Krankheiten, die mit dieser Zelle verbunden sind.
  12. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung von Tumoren, umfassend eine wirksame Menge der Zelle gemäß Anspruch 9.
  13. Verwendung der Zelle gemäß Anspruch 9 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten, die mit dieser Zelle verbunden sind.
  14. Verwendung der Zelle gemäß Anspruch 10 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumoren.
Es folgen 8 Blatt Zeichnungen






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