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Dokumentenidentifikation DE102005015294A1 05.10.2006
Titel Scanmikroskop und ein Verfahren zur Phasenkontrastmikroskopie
Anmelder Leica Microsystems CMS GmbH, 35578 Wetzlar, DE
Erfinder Knebel, Werner, Dr., 76709 Kronau, DE
Vertreter Ullrich & Naumann, 69115 Heidelberg
DE-Anmeldedatum 01.04.2005
DE-Aktenzeichen 102005015294
Offenlegungstag 05.10.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 05.10.2006
IPC-Hauptklasse G02B 21/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, DE
IPC-Nebenklasse G02B 21/14(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   
Zusammenfassung Ein Scanmikroskop, insbesondere konfokales Scanmikroskop, mit einer Lichtquelle (1) zur Erzeugung eines Beleuchtungslichts (2), mit einem Objektiv (17, 21) zur Führung des Beleuchtungslichts (2) zu einer Probenebene einer Probe (19) und einem Positionsdetektor (28) zum Messen der durch die Probe (19) hervorgerufenen lateralen Ablenkung eines durch die Probe (19) hindurchgetretenen Beleuchtungslichts (2) ist im Hinblick auf eine besonders hohe Auflösung derart ausgestaltet und weitergebildet, dass auf beiden Seiten der Probenebene jeweils mindestens ein Objektiv (17, 21) angeordnet ist und dass mindestens zwei einander bezüglich der Probenebene gegenüberliegende Objektive (17, 21) aufeinander zu gerichtet sind, so dass durch ein Objektiv (17, 21) zur Probe (19) geführtes Beleuchtungslicht (2) durch das gegenüberliegende Objektiv (21, 17) auffangbar und als Detektionslicht zum Positionsdetektor (28) führbar ist. Des Weiteren ist ein Verfahren zur Phasenkontrastmikroskopie mit einem derartigen Scanmikroskop angegeben.

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Scanmikroskop, insbesondere konfokales Scanmikroskop, mit einer Lichtquelle zur Erzeugung eines Beleuchtungslichts, mit einem Objektiv zur Führung des Beleuchtungslichts zu einer Probenebene einer Probe und einem Positionsdetektor zum Messen der durch die Probe hervorgerufenen lateralen Ablenkung eines durch die Probe hindurchgetretenen Beleuchtungslichts. Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Phasenkontrastmikroskopie mit einem derartigen Scanmikroskop.

Aus der US 4 745 270 ist ein Scanmikroskop bekannt, bei dem ein Phasenkontrast bezüglich einer Probe mittels eines im Strahlengang nach der Probe angeordneten Positionsdetektors untersucht wird. Dabei wird ein Beleuchtungslicht über ein Objektiv zu einer Probenebene einer Probe geführt und eine laterale Ablenkung des durch die Probe hindurchgetretenen Beleuchtungslichts mittels des Positionsdetektors bestimmt.

Proben aus lebendem Material, wie beispielsweise Zellen, Zellkulturen und Gewebeschnitte, lassen die Amplitude des Lichts praktisch unverändert. Eine für die Hellfeldbeobachtung notwendige Anfärbung dieser Proben ist schwer oder überhaupt nicht möglich, da dieser Eingriff tiefgreifende Veränderungen am Objekt zufolge hätte. Bei derartigen Präparaten beeinflussen lokale Unterschiede im Brechungsindex die Phasenlage der Lichtwelle und man spricht von Phasenobjekten. Mit optischen Kontrastierverfahren, wie Dunkelfeld-, Phasen- und Interferenzkontrast-Verfahren können auch Phasenobjekte beobachtet werden.

Gebräuchlich sind verschiedene Kontrastierverfahren, beispielsweise das Phasenkontrastverfahren nach Zernecke, das Hoffman-Modulations-Kontrastverfahren (siehe beispielsweise DE 39 26 199 A1) oder das DODT-Kontrastverfahren, das aus der DE 195 14 358 C2 bekannt ist.

Beim DODT-Verfahren ist in einer Fourierebene eine Segmentblende und beim Hoffman-Verfahren eine Segment-Polarisationsoptik angeordnet.

Das in der Biologie bevorzugte Verfahren ist das differenzielle Interferenzkontrast-Verfahren (DIC; Differential Interference Contrast). Nach Nomarski (G. Nomarski, J. Rad. Phys. 16 (1955) 9.) Beim differenziellen Interferenz-Kontrastverfahren wird das linear polarisierte Beleuchtungslicht vor dem Objektiv mit Hilfe eines Wollaston-Prismas in zwei linear polarisierte Teilstrahlen, die senkrecht zueinander liegende Polarisationsrichtungen aufweisen, räumlich aufgespalten. Die Teilstrahlen durchlaufen die Probe auf leicht unterschiedlichen Wegen, um nach dem Kondensor mit Hilfe eines zweiten Wollaston-Prismas vereinigt zu werden. Haben die beiden Teilstrahlen unterschiedlich lange optische Weglängen zurückgelegt, so äußert sich dies nach der Strahlvereinigung in den Polarisationseigenschaften des wiedervereinigten Lichtstrahls – in der Regel elliptisch polarisiertes Licht –, die mit Hilfe eines Polfilters als Analysator detektiert werden können.

Das differenzielle Interferenz-Kontrastverfahren (DIC) ist nachteiligerweise bei doppelbrechenden Proben aufgrund der polarisationsbeeinflussenden Wirkung dieser Proben nicht oder nur sehr eingeschränkt einsetzbar, da unter anderem bei der Bildauswertung nicht unterscheidbar ist, ob die Signale auf die Probendoppelbrechung oder auf eine Variation des Brechungsindex innerhalb der Probe zurückzuführen sind. Ebenso ist die Verwendung von doppelbrechenden Probenbehältnissen oder doppelbrechenden Objektträgern, beispielsweise aus Plastik, nicht möglich.

Aus T. Wilson, „Enhanced differential phase contrast imaging in scanning microscopy using a quadrant detector", Optik, 80, No. 4 (1987) 167-170, ist bekannt, die Winkelablenkung eines fokussierten Laserstrahls als Funktion der Fokusposition mit einem Quadrantendetektor zu messen, um eine Phasenkontrastabbildung zu erzielen. Dieses Verfahren liefert nur dann verwendbare Ergebnisse, solange die Strahlintensität während des Abscannens der Probe weitgehend konstant bleibt. Die optischen Auflösungseigenschaften bei diesem Verfahren sind bei dicken Proben sehr viel schlechter, als beim differenziellen Interferenz-Kontrastverfahren, so dass dieses Verfahren – so weit es sich überhaupt verbreitet hat – ausschließlich bei sehr dünnen Proben eine Anwendung finden kann.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Scanmikroskop sowie ein Verfahren zur Phasenkontrastmikroskopie mit einem derartigen Scanmikroskop anzugeben, wonach eine besonders hohe Auflösung mit konstruktiv einfachen Mitteln erreicht ist.

Erfindungsgemäß wird die voranstehende Aufgabe durch ein Scanmikroskop mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. Danach ist das Scanmikroskop der eingangs genannten Art derart ausgestaltet und weitergebildet, dass auf beiden Seiten der Probenebene jeweils mindestens ein Objektiv angeordnet ist und dass mindestens zwei einander bezüglich der Probenebene gegenüberliegende Objektive aufeinander zu gerichtet sind, so dass durch ein Objektiv zur Probe geführtes Beleuchtungslicht durch das gegenüberliegende Objektiv auffangbar und als Detektionslicht zum Positionsdetektor führbar ist.

Erfindungsgemäß ist erkannt worden, dass die voranstehende Aufgabe durch die Führung des durch die Probe hindurchgetretenen Beleuchtungslichts über ein weiteres Objektiv zum Positionsdetektor auf überraschend einfache Weise gelöst ist. Im Konkreten ist hierzu auf beiden Seiten der Probenebene jeweils mindestens ein Objektiv angeordnet, wobei mindestens zwei einander bezüglich der Probenebene gegenüberliegende Objektive aufeinander zu gerichtet sind. Durch ein Objektiv zur Probe geführtes Beleuchtungslicht kann somit durch das gegenüberliegende Objektiv aufgefangen und als Detektionslicht zum Positionsdetektor geführt werden.

Mit dem erfindungsgemäßen Scanmikroskop wird unabhängig von der Dicke der Probe, insbesondere bei lebenden biologischen Präparaten, eine besonders hohe Auflösung erreicht, wobei des Weiteren auch die Untersuchung von polarisationsbeeinflussenden – insbesondere doppelbrechenden – Proben ermöglicht ist. Folglich ist mit dem erfindungsgemäßen Scanmikroskop ein Scanmikroskop angegeben, wonach eine besonders hohe Auflösung mit konstruktiv einfachen Mitteln erreicht ist.

Eine weitere Verbesserung der Auflösung kann erreicht werden, wenn das Beleuchtungslicht durch zwei einander bezüglich der Probenebene gegenüberliegende und aufeinander zu gerichtete Objektive geführt und durch das jeweils gegenüberliegende Objektiv aufgefangen und als Detektionslicht zum Positionsdetektor geführt wird. Mit anderen Worten wird hierbei das Beleuchtungslicht nicht nur durch ein Objektiv, sondern durch zwei einander bezüglich der Probenebene gegenüberliegende Objektive geführt, die aufeinander zu gerichtet sind. Die Probe wird hierbei von zwei Seiten beleuchtet. Das durch die Probe hindurchgetretene Beleuchtungslicht des einen Objektivs wird dabei vom jeweils gegenüberliegenden Objektiv aufgefangen und als Detektionslicht zum Positionsdetektor geführt. Der Positionsdetektor empfängt dabei sowohl das Detektionslicht, das von dem einen Objektiv aufgefangen worden ist, als auch das Detektionslicht, das vom gegenüberliegenden Objektiv aufgefangen worden ist.

Weiterhin zur Gewährleistung einer besonders hohen Auflösung könnte im Strahlengang des Detektionslichts vor dem Positionsdetektor eine Detektionslochblende angeordnet sein. Mit einer derartigen Detektionslochblende kann gewährleistet werden, dass ausschließlich Detektionslicht, das im Fokus der Objektive durch die Probe moduliert wird, durch die Detektionslochblende und damit auf den Positionsdetektor gelangt. Sowohl bei einer einseitigen Beleuchtung der Probe als auch bei der alternativen beidseitigen Beleuchtung der Probe ist hierdurch ein sehr eng begrenzter Fokuspunkt betrachtbar. Dieser Vorteil ergibt sich insbesondere bei einem konfokalen Betrieb des Scanmikroskops. Letztendlich werden durch die Detektionslochblende Detektionslichtanteile, die nicht aus dem gewünschten, eng begrenzten Fokusbereich stammen, herausgefiltert.

Im Hinblick auf eine besonders einfache Realisierung der Beleuchtung der Probe von zwei Seiten könnte im Strahlengang des Beleuchtungslichts vor dem Objektiv oder vor den Objektiven ein Strahlteiler angeordnet sein. Der Strahlteiler dient zur Aufspaltung des Beleuchtungslichts und zur Zusammenführung des Detektionslichts.

Zur sicheren Führung des Beleuchtungslichts über die Probe könnte im Strahlengang des Beleuchtungslichts vor dem Objektiv oder den Objektiven eine Scaneinrichtung angeordnet sein. Eine derartige Scaneinrichtung kann durch Spiegel realisiert sein. Dabei könnte das durch die Probe hindurchgetretene Beleuchtungslicht als Detektionslicht über die Scaneinrichtung und/oder eine weitere Scaneinrichtung zum Positionsdetektor führbar sein.

Bei einer konstruktiv besonders vorteilhaften Ausgestaltung könnte der Positionsdetektor ein RDC-Detektor – Refractive Differential Contrast-Detektor – sein.

Der Positionsdetektor könnte eine Vielzahl von Einzeldetektoren aufweisen, die eine wesentlich kleinere optisch wirksame Detektionsfläche aufweisen als die Querschnittsfläche eines Detektionslichtstrahls. Im Konkreten könnten die Einzeldetektoren in einer Zeile oder in einem Array oder in einer Matrix angeordnet sein. Hierbei bietet sich eine Photodiodenzeile oder ein Photodiodenarray an.

Bei einer weiteren Ausgestaltung könnte der Positionsdetektor einen Photomultiplier aufweisen. Hierbei wäre ein Mehrkanal- oder Mehranoden-Photomultiplier besonders vorteilhaft. Der Photomultiplier könnte in weiter vorteilhafter Weise als Resistive-Anode-Photomultiplier ausgebildet sein. Bei einer weiteren Variante könnte der Positionsdetektor eine Micro-Chanel-Plate aufweisen. Bei der Wahl des geeigneten Photomultipliers ist auf den jeweiligen Anwendungsfall abzustellen.

Weiterhin könnte der Positionsdetektor mindestens einen CCD-Chip oder einen positionssensitiven Detektor – PSD – aufweisen.

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform könnte der Positionsdetektor eine im Wesentlichen stetige Punktauflösungsfunktion aufweisen. Hierbei könnte der Positionsdetektor in vorteilhafter Weise als PSD – Position Sensitive Detektor oder Device – ausgestaltet sein. Ein positionsempfindlicher Detektor – PSD – arbeitet ähnlich wie eine übliche Photodiode. Das auf das aktive Gebiet fallende Licht generiert einen Photostrom, der in Richtung des p- und des n-Gebiets abfließt. Im Gegensatz zu einer Photodiode verfügt ein PSD jedoch über mehrere elektrische Kontakte. Dadurch kommt es zu einer Aufteilung des Photostroms unter die Kontakte in Abhängigkeit von der Position des Lichtflecks. Die Position wird durch Bildung der Stromdifferenz zwischen zwei gegenüberliegenden Kontakten ermittelt. Ein eindimensionaler PSD erlaubt die kontinuierliche Positionsbestimmung eines Lichtflecks entlang einer Achse. Besonders vorteilhaft ist eine Ausgestaltungsvariante, bei der der Positionsdetektor einen zweidimensionalen PSD aufweist, der eine kontinuierliche Positionsbestimmung entlang von zwei Achsen – beispielsweise X- und Y-Richtung – ermöglicht.

Bei einer besonders bevorzugten Ausgestaltungsform mit einem zweidimensional detektierenden Positionsdetektor könnte die Scherungsrichtung durch vorzugsweise elektronische Verarbeitung der Signale der ersten und der zweiten Dimension gedreht werden. In der einfachsten Variante wird durch Vertauschen der Signale eine Drehung der Scherungsrichtung um 90° erzielt. Es ist auch möglich, durch gewichtetes Verrechnen der Signale der ersten und zweiten Dimension eine Drehung der Scherungsrichtung um einen beliebigen Winkel zu erzielen.

In jedem Fall könnte der Positionsdetektor an eine elektronische Verarbeitungseinrichtung gekoppelt sein, wobei eine Wechselspannungskopplung besonders vorteilhaft ist. Bei einer vorteilhaften Ausführungsform sind zur Beseitigung der bildbeeinträchtigenden Folgen von Schwankungen der Lichtleistung des Beleuchtungslichts, wie sie beispielsweise bei der Verwendung von Gaslasern auftreten, logarithmische Strom-Spannungs-Wandler vorgesehen, um die Signale des Positionsdetektors im Rahmen der Verarbeitungseinrichtung weiter zu verarbeiten. Hierzu könnte die Verarbeitungseinrichtung mindestens einen logarithmischen Strom-Spannungs-Wandler aufweisen. Insbesondere in der konfokalen Fluoreszenzrastermikroskopie, in der die Lichtleistung des Beleuchtungslichts variiert werden muss, um eine ausreichende Fluoreszenzanregung zu erreichen, ist die Verwendung von logarithmischen Strom-Spannungs-Wandlern besonders vorteilhaft, wobei in der Variante, in der der Positionsdetektor einen PSD aufweist, vorteilhafterweise nach der Strom-Spannungs-Wandlung die Differenz der Signale bezüglich der beiden Messrichtungen erzeugt wird. Diese Variante ist besonders vorteilhaft, um simultan ein Phasenkontrastbild und mindestens ein Fluoreszenzbild der Probe aufzunehmen. In jedem Fall könnte mittels des Positionsdetektors ein Phasenkontrastbild aufgenommen werden, wobei gleichzeitig andere Beobachtungstechniken eingesetzt werden könnten, beispielsweise im Rahmen der Zweiphotonenanregung, FRET oder CARS.

Die gleichzeitige Aufnahme eines Fluoreszenz- und eines Phasenkontrastbilds ermöglicht es beispielsweise, Mikropipetten oder Mikro-Patch-Clamps bei Sichtkontrolle in einer Fluoreszenzprobe zu positionieren.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Positionsdetektor – wie bereits erwähnt – an eine elektronische Verarbeitungseinrichtung gekoppelt. Vorzugsweise handelt es sich bei der Kopplung um eine Wechselspannungskopplung, wodurch die Anforderung an die Zentrierung des Positionsdetektors in Bezug auf die optische Achse erheblich verringert wird, da sich bei einer solchen Anordnung systematische laterale Ablagen nicht in einem Offsetstrom manifestieren.

Vorzugsweise ist der Positionsdetektor in einer zu der Probenebene oder Fokalebene konjugierten Ebene – Fourierebene – angeordnet. Der aus dem Mikroskopobjektiv austretende fokussierte Beleuchtungslichtkegel wird durch das Phasenobjekt in der Brennebene des Objektivs abgelenkt, so dass der divergente von der Brennebene ausgehende Kegel gegenüber dem einfallenden Beleuchtungslichtkegel eine eher gekippte Mittelachse aufweist. Der Grad der Kippung ist ein direktes Maß für die Variation des Brechungsindex an der Stelle des zu beobachtenden Pixels. In einer zur Brennebene konjugierten Ebene wirkt sich diese Kippung der Mittelachse als Parallelverschiebung des kollimierten durch die Probe getretenen Beleuchtungslichtbündels aus. Es ist besonders vorteilhaft, den Positionsdetektor in einer solchen konjugierten Ebene zu positionieren, um dort die erzeugte Parallelverschiebung zu messen.

Bei einer weiter vorteilhaften Ausgestaltung könnte im Strahlengang eine DIC-Optik – Differential Interference Contrast-Optik – angeordnet sein.

Bei einer weiter alternativen Ausgestaltung könnte im Strahlengang vor dem Objektiv oder den Objektiven und nach der Probe jeweils ein Wollaston-Prisma angeordnet sein.

Bei einer konkreten Ausgestaltung könnte das Scanmikroskop ein 4Pi-Mikroskop sein. Hierdurch kann ein konfokales Transmissions-Bild erzeugt werden. Mit dem erfindungsgemäßen Scanmikroskop kann aus einer Phaseninformation – beispielsweise Brechungsunterschiede – ein Amplitudenkontrast ohne störende Hintergrundinformation erzeugt werden.

Im Gegensatz zu einem üblichen Durchlichtdetektor kann mit Hilfe des zweiten Objektivs das transmittierte Licht wieder aufgesammelt werden, über den Rückweg über den Scanspiegel der Rastervorgang wieder aufgehoben werden und somit das Licht auf die Detektionslochblende fokussiert werden. Licht, das in der Probe gestreut, gebrochen oder gebeugt wurde, wird an der Lochblende ausgefiltert. Dies erlaubt eine komplett neue Sichtweise der Transmissionsbilder, wobei nur Information aus der Fokusebene abgebildet wird. Die Unschärfe aus den anderen Fokusebenen wird durch die Detektionslochblende unterdrückt.

Erfindungsgemäß wird die obige Aufgabe des Weiteren durch ein Verfahren zur Phasenkontrastmikroskopie mit den Merkmalen des Patentanspruchs 24 gelöst. Danach ist das Verfahren derart ausgestaltet, dass auf beiden Seiten der Probenebene jeweils mindestens ein Objektiv angeordnet wird und dass mindestens zwei einander bezüglich der Probenebene gegenüberliegende Objektive aufeinander zu gerichtet werden, so dass durch ein Objektiv zur Probe geführtes Beleuchtungslicht durch das gegenüberliegende Objektiv aufgefangen und als Detektionslicht zum Positionsdetektor geführt wird.

Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens könnte das Beleuchtungslicht durch zwei einander bezüglich der Probenebene gegenüberliegende und aufeinander zu gerichtete Objektive geführt und durch das jeweils gegenüberliegende Objektiv aufgefangen und als Detektionslicht zum Positionsdetektor geführt werden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren könnte mittels des Positionsdetektors ein Phasenkontrastbild aufgenommen werden, wobei simultan ein Phasenkontrastbild und mindestens ein Fluoreszenzbild aufgenommen werden könnten.

Hinsichtlich der Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf die voranstehend beschriebenen Vorteile eines entsprechenden Scanmikroskops zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwiesen.

Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläuterung eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Lehre anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung des bevorzugten Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Lehre anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen

1 in einer schematischen Darstellung ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Scanmikroskops und

2 in einer weiteren schematischen Darstellung eine an das Scanmikroskop angeschlossene Verarbeitungseinrichtung mit einem Monitor.

1 zeigt ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop mit einer Lichtquelle 1, die als Mehrlinienlaser ausgeführt ist. Das Scanmikroskop ist als konfokales Scanmikroskop ausgebildet. Die Lichtquelle 1 erzeugt ein Beleuchtungslicht 2, das von einer Optik 3 auf eine Beleuchtungslochblende 4 fokussiert wird. Das durch die Beleuchtungslochblende 4 getretene Beleuchtungslicht 2 gelangt zu einem Hauptstrahlteiler 5 und wird von diesem über eine weitere Optik 6 zu einer Scaneinrichtung 7 gelenkt, die einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 8 aufweist. Die Scaneinrichtung 7 lenkt das Beleuchtungslicht 2 durch eine Scanoptik 9, über einen Umlenkspiegel 12, durch eine Tubusoptik 14, über einen Umlenkspiegel 15 und durch ein Objektiv 17 hindurch auf eine Probe 19, die beispielsweise ein Gehirnschnitt sein kann. Die Pupille des Objektivs 17 ist mit der Bezugsziffer 16 gekennzeichnet.

Optiken 10 und 11 sind für die Anpassung des 4Pi-Moduls an den konfokalen Strahlengang notwendig, wobei ein Strahlteiler 13 das Beleuchtungslicht 2 in Richtung Objektiv 17 und/oder 21 aufteilt. Das 4Pi-Modul, das an die restlichen Bestandteile des Scanmikroskops angeflanscht werden kann, wird im Wesentlichen durch den Strahlteiler 13 und die im nachfolgenden Strahlengang vorgesehenen Bauteile, insbesondere Optiken 14 und 24 sowie Objektive 17 und 21, gebildet.

Die Probe 19 befindet sich auf einem Objektträger 20 und ist mit einem ersten Immersionsmittel 18, das beispielsweise Wasser, Glyzerin oder Öl sein kann, optisch an das Objektiv 17 angekoppelt. Auf der der Probe 19 abgewandten Seite des Objektträgers 20 ist ein Objektiv 21 angeordnet, das mit einem weiteren Immersionsmittel, das beispielsweise Wasser, Öl oder Glyzerin sein kann, optisch angekoppelt ist.

Das Objektiv 21 kollimiert das durch die Probe 19 getretene Beleuchtungslichtbündel 2 in einer zur hinteren Fokalebene 22 des Objektivs 21 korrespondierenden Ebene 25 sowie in einer weiteren korrespondierenden Ebene 29, und zwar über einen Umlenkspiegel 23 mit Hilfe einer Linse 24, der Optiken 11 und 10, der Scanoptik 9, der Optik 6 und einer weiteren Linse 27.

Im Strahlengang nach der Linse 27 ist ein Positionsdetektor 28 angeordnet, der als Position-Sensitive-Device (PSD) ausgeführt ist. Die hintere Fokalebene 22 des Objektivs 21 und die hierzu korrespondierende Ebene 29 sind Fourierebenen zur Brennebene des Objektivs 17.

Der Positionsdetektor 28 misst die laterale, durch die Probe 19 hervorgerufene Ablenkung des Beleuchtungslichts 2, die sich am Ort des Positionsdetektors 28 in einem im Wesentlichen Parallelversatz des kollimierten durch die Probe 19 getretenen Beleuchtungslichts 2 zeigt. Der Positionsdetektor 28 detektiert die laterale Ablenkung in zwei Dimensionen – X- und Y-Richtung –, wobei in der 1 der Übersichtlichkeit halber nur die Beschaltung für eine Dimension dargestellt ist.

Bezüglich der dargestellten Dimension weist das Position-Sensitive-Device (PSD) zwei Kontakte auf, die jeweils an einen logarithmischen Strom-Spannungs-Wandler angeschlossen sind. Die Signale der beiden logarithmischen Strom-Spannungs-Wandler werden einem Differenzverstärker übergeben und das von diesem erzeugte Ausgangssignal an einen PC zur weiteren Bildverarbeitung und Darstellung weitergeleitet. Der PC ist in 1 der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt. Die logarithmischen Strom-Spannungs-Wandler sowie der Differenzverstärker sind Bestandteil einer elektronischen Verarbeitungseinrichtung 30.

Als Position-Sensitive-Device kann beispielsweise das Modell zwei L4SP der Firma Sitek verwendet werden.

Das in 1 gezeigte Scanmikroskop kann letztendlich auf zwei Arten betrieben werden. Zum einen kann das Beleuchtungslicht 2 nur durch ein Objektiv 17 oder 21 geführt werden und nach seinem Durchgang durch die Probe 19 dann vom anderen Objektiv 21 oder 17 aufgefangen und zum Positionsdetektor 28 geführt werden. Alternativ hierzu kann eine Beleuchtung über beide Objektive 17 und 21 und dann ein entsprechendes Auffangen des durch die Probe 19 hindurchgetretenen Detektionslichts durch die korrespondierenden Objektive 21 und 17 erfolgen. In beiden Fällen erfolgt eine Verarbeitung des Detektionslichts mittels des Positionsdetektors 28 und mittels der Verarbeitungseinrichtung 30.

Das von der Lichtquelle 1 ausgehende Beleuchtungslicht 2 umfasst zusätzlich eine Wellenlängenkomponente zur optischen Fluoreszenzanregung der Probe 19. Das von der Probe 19 ausgehende Fluoreszenzlicht gelangt durch das Objektiv 17 und/oder das Objektiv 21, die Tubusoptiken 14 und/oder 24, die Scanoptik 9 sowie die weiteren Optiken 11 und 10 über die Scaneinrichtung 8 und die Optik 6 zum Hauptstrahlteiler 5. Das Fluoreszenzlicht passiert den Hauptstrahlteiler 5 und die nachfolgende Detektionslochblende 26 und gelangt über einen weiteren Strahlteiler 31 schließlich zu einem Detektor 32, der als Photomultiplier oder APD ausgeführt ist. Der Detektor 32 erzeugt elektrische, zur Leistung des Fluoreszenzlichts proportionale Signale, die ebenfalls zur weiteren Bildverarbeitung und Darstellung an den nicht gezeigten PC weiter gegeben werden.

Mit dem gezeigten Scanmikroskop ist es somit möglich, gleichzeitig sowohl ein Phasenkontrastbild als auch ein Fluoreszenzbild der Probe 19 zu erzeugen, um diese getrennt und auch gegebenenfalls überlagert darzustellen.

2 zeigt in einer schematischen Darstellung die Linse 27, den Positionsdetektor 28 und die Verarbeitungseinrichtung 30, wobei an die Verarbeitungseinrichtung 30 noch eine Kontrollunit 33 und ein Monitor 34 angekoppelt sind. Über den Monitor 34 kann ein Phasenkontrastbild und/oder ein Fluoreszenzbild der Probe 19 betrachtet werden.

Hinsichtlich weiterer vorteilhafter Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Lehre wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung sowie auf die beigefügten Patentansprüche verwiesen.

Schließlich sei ausdrücklich darauf hingewiesen, dass das voranstehend beschriebene Ausführungsbeispiel lediglich zur Erörterung der beanspruchten Lehre dient, diese jedoch nicht auf das Ausführungsbeispiel einschränkt.


Anspruch[de]
Scanmikroskop, insbesondere konfokales Scanmikroskop, mit einer Lichtquelle (1) zur Erzeugung eines Beleuchtungslichts (2), mit einem Objektiv (17, 21) zur Führung des Beleuchtungslichts (2) zu einer Probenebene einer Probe (19) und einem Positionsdetektor (28) zum Messen der durch die Probe (19) hervorgerufenen lateralen Ablenkung eines durch die Probe (19) hindurchgetretenen Beleuchtungslichts (2), dadurch gekennzeichnet, dass auf beiden Seiten der Probenebene jeweils mindestens ein Objektiv (17, 21) angeordnet ist und dass mindestens zwei einander bezüglich der Probenebene gegenüberliegende Objektive (17, 21) aufeinander zu gerichtet sind, so dass durch ein Objektiv (17, 21) zur Probe (19) geführtes Beleuchtungslicht (2) durch das gegenüberliegende Objektiv (21, 17) auffangbar und als Detektionslicht zum Positionsdetektor (28) führbar ist. Scanmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungslicht (2) durch zwei einander bezüglich der Probenebene gegenüberliegende und aufeinander zu gerichtete Objektive (17, 21) führbar und durch das jeweils gegenüberliegende Objektiv (21, 17) auffangbar und als Detektionslicht zum Positionsdetektor (28) führbar ist. Scanmikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Strahlengang des Detektionslichts vor dem Positionsdetektor (28) eine Detektionslochblende (26) angeordnet ist. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass im Strahlengang des Beleuchtungslichts (2) vor dem Objektiv (17, 21) oder den Objektiven (17, 21) ein Strahlteiler (13) angeordnet ist. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass im Strahlengang des Beleuchtungslichts (2) vor dem Objektiv (17, 21) oder den Objektiven (17, 21) eine Scaneinrichtung (7) angeordnet ist. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das durch die Probe (19) hindurchgetretene Beleuchtungslicht (2) als Detektionslicht über die Scaneinrichtung (7) und/oder eine weitere Scaneinrichtung zum Positionsdetektor (28) führbar ist. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Positionsdetektor (28) ein RDC-Detektor – Refractive Differential Contrast-Detektor – ist. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Positionsdetektor (28) eine Vielzahl von Einzeldetektoren aufweist, die eine wesentlich kleinere optisch wirksame Detektionsfläche aufweisen als die Querschnittsfläche eines Detektionslichtstrahls. Scanmikroskop nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Einzeldetektoren in einer Zeile oder in einem Array angeordnet sind. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Positionsdetektor (28) einen Photomultiplier aufweist. Scanmikroskop nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Photomultiplier (28) als Mehranoden-Photomultiplier ausgebildet ist. Scanmikroskop nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Photomultiplier (28) als Resistive-Anode-Photomultiplier ausgebildet ist. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Positionsdetektor (28) eine Micro-Chanel-Plate aufweist. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Positionsdetektor (28) mindestens einen CCD-Chip aufweist. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Positionsdetektor eine stetige Punktauflösungsfunktion aufweist. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Positionsdetektor (28) an eine elektronische Verarbeitungseinrichtung (30) gekoppelt – vorzugsweise wechselspannungsgekoppelt – ist. Scanmikroskop nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Verarbeitungseinrichtung (30) mindestens einen logarithmischen Strom-Spannungs-Wandler aufweist. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Positionsdetektor (28) in einer zu der Probenebene konjugierten Ebene – Fourierebene – angeordnet ist. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass mittels des Positionsdetektors (28) ein Phasenkontrastbild aufnehmbar ist. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, das simultan ein Phasenkontrastbild und mindestens ein Fluoreszenzbild aufnehmbar sind. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass im Strahlengang eine DIC-Optik – Differential Interference Contrast-Optik – angeordnet ist. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass im Strahlengang vor dem Objektiv oder den Objektiven und nach der Probe jeweils ein Wollaston-Prisma angeordnet ist. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Scanmikroskop ein 4Pi-Mikroskop ist. Verfahren zur Phasenkontrastmikroskopie mit einem Scanmikroskop, insbesondere konfokalen Scanmikroskop, nach einem der Ansprüche 1 bis 23, mit einer Lichtquelle (1) zur Erzeugung eines Beleuchtungslichts (2), mit einem Objektiv (17, 21) zur Führung des Beleuchtungslichts (2) zu einer Probenebene einer Probe (19) und einem Positionsdetektor (28) zum Messen der durch die Probe (19) hervorgerufenen lateralen Ablenkung eines durch die Probe (19) hindurchgetretenen Beleuchtungslichts (2), dadurch gekennzeichnet, dass auf beiden Seiten der Probenebene jeweils mindestens ein Objektiv (17, 21) angeordnet wird und dass mindestens zwei einander bezüglich der Probenebene gegenüberliegende Objektive (17, 21) aufeinander zu gerichtet werden, so dass durch ein Objektiv (17, 21) zur Probe (19) geführtes Beleuchtungslicht (2) durch das gegenüberliegende Objektiv (21, 17) aufgefangen und als Detektionslicht zum Positionsdetektor (28) geführt wird. Scanmikroskop nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungslicht (2) durch zwei einander bezüglich der Probenebene gegenüberliegende und aufeinander zu gerichtete Objektive (17, 21) geführt und durch das jeweils gegenüberliegende Objektiv (21, 17) aufgefangen und als Detektionslicht zum Positionsdetektor (28) geführt wird. Scanmikroskop nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass mittels des Positionsdetektors (28) ein Phasenkontrastbild aufgenommen wird. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, das simultan ein Phasenkontrastbild und mindestens ein Fluoreszenzbild aufgenommen werden.






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