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Dokumentenidentifikation DE69735202T2 02.11.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000906119
Titel STIMULIERUNG WIRTSEIGENER ABWEHRMECHANISMEN GEGEN KREBS
Anmelder Pharma Pacific Pty. Ltd., Brighton-Le-Sands, Neusüdwales, AU
Erfinder TOVEY, Gerard, Michael, F-75005 Paris, FR
Vertreter LEINWEBER & ZIMMERMANN, 80331 München
DE-Aktenzeichen 69735202
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 05.05.1997
EP-Aktenzeichen 979195641
WO-Anmeldetag 05.05.1997
PCT-Aktenzeichen PCT/IB97/00490
WO-Veröffentlichungsnummer 1997041884
WO-Veröffentlichungsdatum 13.11.1997
EP-Offenlegungsdatum 07.04.1999
EP date of grant 01.02.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 02.11.2006
IPC-Hauptklasse A61K 38/21(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP

Beschreibung[de]

Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Stimulierung von Wirts-Abwehrmechanismen gegen pathologische Leiden bei einem Menschen durch Verabreichung von hohen Dosen an Interferon über die Mundschleimhaut. Insbesondere ist die Erfindung in Verfahren zur Behandlung von Krebs einsetzbar.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

&agr;-Interferone werden umfassend zur Behandlung zahlreicher verschiedener hämatologischer Malignitäten, umfassend Haarzellenleukämie, chronische myelogene Leukämie, minderschwere Lymphome, Haut-T-Zell-Lymphome und mit AIDS verbundenes Kaposi-Sarkom, eingesetzt (J.U. Gutterman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1198–1205 (1994)). Tumorbekämpfende Wirkungen werden üblicherveise bei hohen Dosierungen beobachtet, häufig im Bereich von mehreren Dutzend Millionen Einheiten von Interferon-&agr; (IFN-&agr;), die mittels parenteraler Injektion verabreicht werden. Interferon-&bgr; (IFN-&bgr;) ist für die klinische Verwendung zur Behandlung von multipler Sklerose mit Rückfalls- und Remissionsphasen und von chronischer viraler Hepatitis B und C zugelassen.

Interferon-&agr; und Interferon-&bgr; sind beide Interferone vom Typ I. Interferone vom Typ I sind eine große Gruppe von natürlich vorkommenden Cytokinen, die über 16 Untergruppen von IFN-&agr; plus IFN-&bgr; und IFN-&ohgr; umfasst. Die Interferone vom Typ I binden sich an einen einzelnen Zelloberflächenrezeptor und stimulieren eine komplexe Reihe von Signaltransduktionsereignissen, die schließlich zu antiviralen, antiproliferativen und anderen immunmodulierenden Wirkungen, Cytokininduktion und HLA-Klasse-I- und -Klasse-II-Regulation führen (Pestka et al., Annu. Rev. Biochem. 56, 727 (1987)). Einzelne Subtypen von Typ-I-IFN variieren in ihrer Aktivität. Die am häufigsten beobachtete Aminosäure an jeder Position wurde durch Scannen einer großen Anzahl an Allel-Subtypen von IFN-&agr; identifiziert, und ein synthetisches Interferon vom Typ I mit der Consensus-Sequenz wurde synthetisiert (Alton et al., in "The Biology of the Interferon System", E. de Maeyer & H. Schellekens (Hrsg.), Elsevier, 1991–128 (1983)). Dieses Consensus-Interferon ist im Handel erhältlich (Infergen; Amgen, Inc.), und es wurde erst kürzlich dafür gezeigt, dass es höhere Aktivität (gewichtsbezogen) als IFN-&agr;2a oder IFN-&agr;2b aufweist; es wurde vorgeschlagen, dass Consensus-IFN klinisch gesehen IFN eines individuellen natürlichen Subtyps überlegen ist (Blatt et al., J. Interferon and Cytokine Research 16, 489–499 (1996)).

Auch wenn zahlreiche Arten der Verabreichung, einschließlich intravenöser, subkutaner, intramuskulärer, topischer und intraläsionaler Injektion, üblicherweise zur Verabreichung von Typ-I-Interferonen verwendet werden, wurde die orale Verabreichung im Allgemeinen nicht verwendet, da Interferone Proteine sind, von denen angenommen wird, dass sie durch proteolytische Enzyme deaktiviert werden, und die nicht in annehmbarer Weise in ihrer nativen Form im Magendarmtrakt absorbiert werden. Tatsächlich konnten in zahlreichen Studien nach oraler Verabreichung keine Interferone im Blut nachgewiesen werden (Cantell & Pyhäla, J. Gen. Virol. 20, 97–104 (1973); Wills et al., J. IFN Res. 4, 399–409 (1984); Gilson et al., J. IFN Res. 5, 403–408 (1985)).

Es wird durchwegs in Betracht gezogen, dass, um die maximale therapeutische Wirkung zu erzielen, die höchstmögliche Dosis an Interferon verwendet werden sollte (Hayden et al., J. Infect. Dis. 148, 543–550 (1983); US 5286748). Auch wenn die Verfügbarkeit von rekombinantem Material bedeutete, dass sehr hohe Dosen verabreicht werden könnten, wurde in der praktischen Anwendung erkannt, dass die Nebenwirkungen von Interferonverabreichung die einsetzbare Interferondosis und die Behandlungsdauer stark einschränkten. Diese Nebenwirkungen umfassen starkes Unbehagen und Depression, was in manchen Fällen sogar zum Suizid führen kann. Ein erst jüngst erschienener Leitartikel von Hoofnagle im New England Journal of Medicine fasst diese Probleme zusammen (J.H. Hoofnagle & D. Lau, New Eng. J. Medicine 334, 1470–1471 (1996)). Eine Meta-Analyse der Wirkung von Interferon-&agr;-Behandlung bei Patienten mit Hepatitis B, wie antigenpositive chronische Hepatitis B, zeigte eine Remissionsrate von 25 bis 40 % unter Patienten mit typischer chronischer Hepatitis B, die mit 5 Millionen IE täglich oder 10 Millionen IE dreimal wöchentlich, 3 bis 6 Monate lang, behandelt wurden. Diese Resultate zeigen dennoch keine Eignung als Behandlung auf, da die meisten Patienten bezüglich Hepatitis-Oberflächenantigen positiv bleiben und virale DNA in sich tragen, wenn sie mittels Polymerasekettenreaktion getestet werden. Weiters werden diese Dosen an Interferon nur schlecht vertragen, und 10 % bis 40 % der Patienten bedürfen aufgrund von nicht annehmbaren Nebenwirkungen einer Reduktion der Dosis. Bei einer gut vertragenen Dosis von 1 Million IE täglich liegt die Remissionsrate jedoch bei nur 17 % (Perrillo et al., New Eng. J. Medicine 323, 295–301 (1990)). Bei Patienten mit chronischer Hepatitis C wird langfristige Verbesserung mit dem Verlust an HCV RNA assoziiert, der nur bei 10 bis 20 % der Patienten, die mit einer Dosis von 3 Millionen IE dreimal wöchentlich 6 Monate lang behandelt wurden, eintritt (Hoofnagle & Lau, s.o.). Bei Patienten mit Krebs werden signifikante Reaktionsreaten üblicherweise bei den höchsten tolerierten Dosen von Interferon-&agr; beobachtet. Somit beträgt bei Patienten mit multiplem Myelom beispielsweise die Reaktionsrate 50 % bei jenen Patienten, die mit 3 Millionen IE behandelt wurden. Sehr wenige Patienten sind jedoch in der Lage, den hochdosierten Behandlungsplan länger als eine kurze Zeit zu tolerieren (Ahre et al., Eur. J. Hematol. 41, 123–130 (1988)). Somit gibt es auf dem Gebiet der Erfindung eindeutig einen Bedarf an Mitteln, die die Verabreichung von hohen Dosen an Interferon ermöglichen würden, ohne schwer wiegende Nebenwirkungen zu induzieren.

Es gab mehrere vereinzelte Berichte zur Wirksamkeit von geringen Dosen an Interferon, die als Nasenspray oder als eine orale Flüssigformulierung im Rahmen der Behandlung zahlreicher verschiedener Viruserkrankungen, insbesondere Influenza, verabreicht wurden. In den meisten dieser Berichte waren die Interferonpräparate jedoch relativ unrein. Ein Placebo-kontrollierter Versuch mit einer relativ hohen Dosis an intranasal verabreichtem Interferon zur Behandlung von Rhinovirusinfektion zeigte, dass die Behandlung wirksam war, dass jedoch ein signifikantes Auftreten von Nebenwirkungen zu beobachten war (Hayden et al., J. Infect. Dis. 148, 914–921 (1983)). In ähnlicher Weise konnten, auch wenn mehrere Studien, die zwei randomisierte klinische Doppelblindversuche umfassten (Douglas et al., New Engl. J. Med. 314, 65–80 (1986); Hayden et al., New Engl. J. Med. 314, 71–75 (1986)) die Wirksamkeit von nasal verabreichtem rekombinantem Interferon-&agr;2 in hohen Dosen beim Schutz von gegenüber Rhinovirusinfektionen ausgesetzten Individuen aufzeigten, diese Versuche keinen Beweis für eine systemische Wirkung liefern.

In noch jüngerer Vergangenheit beschrieb eine Reihe von Patenbeschreibungen die Verwendung von geringen Dosen an oral verabreichtem Interferon, das seinen Ursprung in einer heterologen Spezies fand, zur Behandlung von infektiöser Rhinotracheitis ("Läusefleckfieber") bei Rindern und von feliner Leukämie sowie zur Behandlung anderer Erkrankungen, zur Steigerung der Effizienz von Vakzinen; zur Verbesserung der Effizienz der Nahrungsverwertung; und zur Prävention von Rinder-Theileriose. Siehe das US-Patent Nr. 4.462.985, das Australische Patent Nr. 608519, das Australische Patent Nr. 58332 bzw. das US-Patent Nr. 5.215.741. Darüber hinaus offenbart das US-Patent Nr. 5.017.371 die Verwendung von Interferon auf diese Weise zur Behandlung von Nebenwirkungen von Krebschemotherapie oder -strahlentherapie. In diesen Beschreibungen war das verwendete Interferon menschliches Interferon-&agr;, hergestellt durch das Verfahren von Cantell, verabreicht in phosphatgepufferter Kochsalzlösung in einer Dosis von 0,01 bis 5 IE pro Pfund Körpergewicht. Während diese Beschreibungen in Betracht ziehen, dass solche geringen Dosen an Interferon, die an die oropharyngeate Mucosa, vorzugsweise in einer Form, die an längeren Kontakt mit der Mundschleimhaut angepasst ist, verabreicht werden, zur Behandlung zahlreicher verschiedener Erkrankungen einschließlich Krebs wirksam sein können, stellen die aus den Versuchen gewonnenen Resultate für Leiden abgesehen von Läusefleckfieber, feliner Leukämie, caninem Parvovirus und Theileriose fast durchwegs nur vereinzelte Beweise dar. Insbesondere werden keine sorgfältig kontrollierten Versuche zur dieser Behandlung in keiner der Tiermodelle für menschliche Krebsarten dargeboten.

Noch aktuellere Studien zu den Wirkungen von sehr geringen Dosen an Interferon, die über die orale und oropharyngeale Mucosa verabreicht werden, wurden ebenfalls bereits veröffentlicht (Bocci, Clin. Pharmacokinet. 21, 411–417 (1991); Critic. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 9, 91–133 (1992); Cummins & Georgiades, Archivum Immun. Therap. Exp. 41, 169–172 (1993)). Es wurde vorgeschlagen, dass dieser Behandlungstyp zur Behandlung von HIV-Infektion besonders nützlich ist und die Lebensqualität von AIDS-Patienten zumindest verbessern kann (Kaiser et al., AIDS 6, 563–569 (1992); Koech et al., Mol. Biol. Ther. 2, 91–95 (1990)). Andere Berichte weisen jedoch darauf hin, dass solche Behandlungen keinen klinischen Nutzen bringen. Eine Phase-I-Studie zur Verwendung von oralen Pastillen, die geringe Dosen an Interferon enthalten, zur Behandlung von Hepatitis B wurde ebenfalls bereits veröffentlicht (Zielinska et al., Archiv. Immunol. Therap. Exp. 41, 241–252 (1993)).

Hingegen zeigte die Internationale Patentanmeldung Nr. WO 95/27499 des Brigham and Women's Hospital, dass Interferon-&bgr;, verabreicht über Magenintubation, die Entwicklung von Autoimmunkrankheiten wie Typ-I-Diabetes, multipler Sklerose und Autoimmunarthritis in anerkannten Tiermodellen zumindest teilweise unterdrückte, wenn es vor dem induzierenden Antigen verabreicht wurde. Interferon-&bgr;, das auf diesem Weg oder intraperitoneal in Verbindung mit intragastrischem "Bystander"-Antigen verabreicht wurde, war bei der Induktion von Toleranz sogar noch wirksamer. Dies lässt darauf schließen, dass Interferon-&bgr; zur Steigerung der Induktion von oraler Toleranz wirksam ist, und nicht zur Induktion von entweder humoralen oder zellulären Antworten auf exogenes Antigen.

In der Australischen Provisional Patent-Anmeldung Nr. PN 9765 wurde für geringe Dosen an Interferon, die in den oropharyngealen Hohlraum über die Mundschleimhaut verabreicht wurden, gezeigt, dass sie beim Schutz von Mäusen vor einem Challenge mit hoch metastasierenden Tumorzellen wirksam waren. Die eher außergewöhnliche Natur dieser Resultate zeigt zusammen mit der Tatsache, dass sehr wenige Substanzen Aktivität gegen diese sehr aggressiven Tumoren aufweisen, dass die Verabreichung von Interferon in den oropharyngealen Hohlraum bei der Behandlung von Krebs nützlich ist. Geringe Dosen an Interferon, verabreicht in die Mundschleimhaut, waren auch bei der Behandlung von Mäusen, denen Enzephalomyokarditisvirus (EMCV) intraperitoneal injiziert wurde, wirksam, das normalerweise eine rasch fortschreitende, tödliche Erkrankung induziert, die durch Einbindung des Zentralnervensystems und Enzephalitis gekennzeichnet ist. Auch wenn dieses System ein sehr strenger Test auf antivirale Aktivität ist, war die Verabreichung von Interferon über die Mundschleimhaut gegenüber intraperitonealer Verabreichung vergleichsweise wirksam.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung stellt ein Verfahren zur Stimulation von Wirts-Abwehrmechanismen bei einem Menschen mittels Verabreichung eines Interferons über die Mundschleimhaut in Dosen bereit, die höher als jene sind, die eine pathologische Antwort induzieren, wenn sie Menschen parenteral, im Allgemeinen in Dosen über etwa 20 × 106 IE homologes Interferon-&agr;, verabreicht werden. Für andere Typen von Interferon kann die eine pathologische Antwort induzierende Dosis von jener unterscheiden, die beim Menschen durch homologes Interferon-&agr; induziert wird.

In einem Aspekt kann die Erfindung als Verfahren zur Stimulation der Immunantwort bei einem Menschen durch Verabreichung einer immunstimulierenden Menge eines Interferons über Kontakt mit der Mundschleimhaut an den Menschen betrachtet werden, worin die Menge mehr als eine Dosis desselben Interferons umfasst, die eine pathologische Reaktion induziert, wenn sie parenteral verabreicht wird.

Alternativ dazu stellt die Erfindung ein Verfahren zur Steigerung des therapeutischen Index von Interferon durch Verabreichung von Interferon über die Mundschleimhaut bereit.

Die Verabreichung über die Mundschleimhaut kann die Verabreichung einer wirksamen Dosis an Interferon in einer einzelnen Dosis umfassen, oder die wirksame Dosis kann in mehreren kleinen Dosen über einen Zeitraum hinweg verabreicht werden, der ausreicht, um Immunstimulation hervorzurufen, die jener einer einzelnen Dosis entspricht. In ähnlicher Weise kann die Interferon-Dosis kontinuierlich über einen Zeitraum hinweg verabreicht werden, der ausreicht, um eine Wirkung zu erzielen, die jener einer einzelnen Dosis entspricht.

In ihren Anwendungsaspekten stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Krebsleiden über die Verabreichung einer wirksamen Menge an Interferon an das Säugetier über Kontakt mit der Mundschleimhaut bereit, worin die Menge mehr als die Dosis desselben Interferons umfasst, die eine pathologische Reaktion induziert, wenn sie parenteral verabreicht wird.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung von multiplem Myelom, Haarzellenleukämie, chronischer myelogener Leukämie, minderschwerem Lymphom, Haut-T-Zell-Lymphom, karzinoiden Tumoren, Zervixkrebs, Sarkomen einschließlich Kaposi-Sarkom, Nierentumoren, Karzinomen, umfassend Nierenzellkarzinom, hepatisches zelluläres Karzinom, Nasopharynxkarzinom, hämatologischen Malignitäten, Kolorektalkrebs, Glioblastom, Larynxpapillomen, Lungenkrebs, Kolonkrebs, malignen Melanomen und Hirntumoren einschließlich maligner Hirntumoren bereit. In einer Ausführungsform ist das Verfahren im Allgemeinen bei der Behandlung von Krebsarten mit nichtviraler Ätiologie einsetzbar.

Die pharmazeutische Zusammensetzung zur Verabreichung über die Mundschleimhaut kann eine therapeutisch wirksame Menge an zumindest einem Interferon, worin die Menge größer als jene Menge ist, die eine pathologische Antwort hervorruft, wenn sie parenteral verabreicht wird, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen. Die Zusammensetzung kann als Lösung, Tablette, Pastille, Gel, Sirup, Paste oder als Mundschleimhaut-Zufuhrsystem mit gesteuerter Freisetzung bereitgestellt werden. Gegebenenfalls kann die Zusammensetzung Puffer, Stabilisatoren, Eindickmittel, Absorptions- und Viskositäts-Enhancer und dergleichen enthalten.

In einer Ausführungsform wird die pharmazeutische Zusammensetzung in einer Einheitsdosis mit etwa 20 × 106 IE bis etwa 1.000 × 106 IE Interferon, vorzugsweise etwa 20 × 106 IE bis etwa 500 × 106 IE, noch bevorzugter etwa 50 × 106 IE bis etwa 500 × 106 IE, bereitgestellt.

Das Verfahren kann entweder als unabhängiger therapeutischer Ansatz oder als Ergänzung zu Strahlentherapie, Chemotherapie oder gemeinsam mit anderen Cytokinen, wie Interleukin-2, -12 oder -15, oder mit IFN-Induktoren durchgeführt werden.

Das Verfahren wird vorzugsweise unter Verwendung eines Typ-I- oder Typ-II-IFN, ausgewählt aus &agr;, &bgr;, &ggr;, &ohgr; und Consensus-Interferonen, am meisten bevorzugt mit einem rekombinanten IFN-&agr;, durchgeführt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung wird nun im Detail anhand von Verweisen und nur unter Verwendung der folgenden Definitionen und Beispielen beschrieben.

Definitionen

Wie hierin verwendet bezieht sich "Interferon" auf ein Interferon vom Typ I oder Typ II, einschließlich jener, die üblicherweise als &agr;, &bgr;, &ggr; und &ohgr; bezeichnet werden, und Gemischen davon, einschließlich der Consensus-Sequenz. Interferone sind aus zahlreichen verschiedenen Handelsquellen erhältlich und sind zur Behandlung zahlreicher Indikationen anerkannt. Das Interferon kann aus natürlichen Quellen stammen, ist vorzugsweise jedoch ein rekombinantes Produkt. Für die Zwecke der Erfindung umfasst die Bezeichnung "Interferon" auch Polypeptide oder ihre Fragmente, die Interferonaktivität aufweisen, und chimäre oder mutierte Formen von Interferon, in die Sequenzmodifikationen eingeführt wurden, beispielsweise um Stabilität zu steigern, ohne die Natur ihrer biologischen Aktivität zu beeinflussen, wie sie u.a. beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5.582.824, 5.593.667 und 5.594.107 offenbart sind.

Unter der Bezeichnung "hohe Dosis" wird eine Dosis über der maximalen, üblicherweise tolerierten Dosis desselben Interferon bei parenteraler Verabreichung, z.B. intravenöser oder intraperitonealer Verabreichung, verstanden. Wie zur Zeit angenommen beläuft sich eine hohe Dosis an Interferon auf mehr als etwa 20 × 106 IE homologes Interferon-&agr; für eine erwachsene Person mit 70 kg. Vorzugsweise liegt die Dosis über etwa 30 × 106 IE. In einer besonders bevorzugten Form der Erfindung beläuft sich die Gesamtdosis auf etwa 50 × 106 IE bis etwa 1.000 × 106 IE, am meisten bevorzugte auf etwa 50 × 106 IE bis 500 × 106 IE. Wie hierin verwendet wird eine "hohe Dosis" im Allgemeinen als eine therapeutisch wirksame Dosis betrachtet, wenn sie über die Mundschleimhaut verabreicht wird, und die, wenn sie parenteral verabreicht wird, eine pathologische Antwort induzieren würde, die sich entweder durch das Auftreten von unerwünschten Nebenwirkungen oder durch Ersatzmarker von Toxizität zeigen würde. Die Definition von hoher Dosis ist notwendigerweise flexibel, da sie u.a. je nach individueller Empfindlichkeit, Größe, Gewicht und Alter des Patienten, der Art und Schwere der zu behandelnden Erkrankung, dem jeweils verwendeten Interferon und dem spezifischen Verabreichungsvehikel variieren kann. Ein Arzt, der einen Patienten mit einem bestimmten Interferon behandelt, wird in der Lage sein, den geeigneten hohen Dosierungsbereich für den zu behandelnden Patienten problemlos zu bestimmen.

Gegebenenfalls kann das Interferon gleichzeitig mit einem Induktor von Interferonsynthese und -freisetzung verabreicht werden. Der Induktor kann zusammen mit dem Interferon oder getrennt verabreicht werden. Interferoninduktoren umfassen beispielsweise Polynucleotide wie Poly I:C; vorzugsweise wird ein niedermolekularer, oral verabreichbarer Interferoninduktor verwendet. Geeignete Induktoren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, beispielsweise Tiloron (US-Patent Nr. 3592819; Albrecht et al., J. Med. Chem. 17, 1150–1156 (1974)) und das Chinolonderivat Imiquimod (Savage et al., Brit. J. Cancer 74, 1482–1486 (1996)).

Die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung können gegebenenfalls in Verbindung mit einer oder mehreren anderen Behandlungen für die jeweilige Erkrankung verwendet werden, und der zuständige Arzt wird leicht in der Lage sein, solch eine andere Behandlung, die unter den bestimmten Umständen geeignet sein könnte, auszuwählen.

In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Krebs bei einem Menschen bereit, das den Schritt der Verabreichung von Interferon wie zuvor beschrieben umfasst. Der Krebs kann ein metastasierender Krebs sein.

Obwohl des Verfahren der Erfindung ohne gleichzeitige Behandlung mit anderen Mitteln eingesetzt werden kann, wird erwogen, dass diese Ausführungsform der Erfindung in den folgenden Situationen besonders nützlich ist:

  • a) als Adjuvanstherapie, nach einem chirurgischen Eingriff, einer Chemotherapie oder einer Strahlentherapie gemäß herkömmlichen Therapievorschriften;
  • b) zur Behandlung von Interferon-empfindlichen Krebsarten wird das Verfahren der Erfindung entweder alleine oder in Verbindung mit herkömmlicher Chemotherapie oder Strahlentherapie eingesetzt; und
  • c) zur Behandlung von Interfern-resistenten Krebsarten wird das Verfahren der Erfindung entweder alleine oder am meisten bevorzugt in Verbindung mit herkömmlicher Chemotherapie oder Strahlentherapie eingesetzt.

Die obigen Verfahren zielen darauf ab, eine Remission der Erkrankung zu induzieren und/oder aufrechtzuerhalten. Unter "in Verbindung mit einer anderen Behandlung" wird verstanden, dass das Interferon vor, während und/oder nach der Strahlentherapie oder einer anderen Chemotherapie verabreicht wird. Die geeignetste Therapievorschrift hängt von zahlreichen verschiedenen Faktoren ab, wie nachstehend noch erläutert wird.

Insbesondere wird erwogen, dass das Verfahren der Erfindung vorzugsweise in Verbindung mit zumindest einer anderen Behandlung, ausgewählt aus der aus Chemotherapie unter Verwendung von zytostatischen Wirkstoffen, einem oder mehreren Cytokinen, die Antikrebs-Aktivität aufweisen, jedoch einen anderen Wirkmechanismus als Interferon haben, antiangiogenen Mitteln und Mitteln, die die Aktivität von Interferon potenzieren, bestehenden Gruppe, verwendet wird. Vorzugsweise ist das zweite Cytokin Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-12 (IL-12) oder Interleukin-15 (IL-15); vorzugsweise ist der Angiogeneseinhibitor AGM-1470; vorzugsweise erfolgt die Interferon potenzierende Behandlung mittels Hyperthermie oder Argininbutyrat.

Bevorzugte zytostatische Wirkstoffe, die in Verbindung mit Interferon verabreicht werden, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Cyclophosphamid, Cisplatin, Carboplatin, Carmustin (BCNU; N,N-Bis(2-chlorethyl)-N-nitrosoharnstoff), Methotrexat, Adriamycin, &agr;-Difluormethylornithin und 5-Fluoruracil.

Die Krebsarten, die für dieses Verfahren anfällig sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Krebsarten, die auf parenterale Verabreichung von hohen Dosen an IFN-&agr; reagieren, wie hämatologische Malignitäten, multiples Myelom, Haarzellenleukämie oder chronische myelogene Leukämie, minderschwere Lymphome, Haut-T-Zell-Lymphome, feste Tumoren wie Nierenzellkarzinom und -melanom, karzinoide Tumoren oder mit AIDS verbundenes Kaposi-Sarkom, insbesondere maligne Tumoren mit nichtviraler Ätiologie.

Bei der Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verwendung in dieser Erfindung können zahlreiche verschiedene Vehikel und Arzneimittelträger für IFN verwendet werden, wie Fachleuten sicherlich bekannt ist. Beispielhafte Formulierungsverfahren werden u.a. in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. Auflage, Mack Publishing Co., Easton, PA (1995), und den vorangehenden Auflagen beschrieben. Die IFN-Formulierung kann Stabilitäts-Enhancer wie Glycin oder Alanin, wie im US-Patent Nr. 4.496.537 beschrieben, und/oder einen oder mehrere Träger wie ein Trägerprotein umfassen. Zur Behandlung von Menschen beispielsweise wird üblicherweise menschliches Serumalbumin mit pharmazeutischer Reinheit, gegebenenfalls zusammen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung als Verdünnungsmittel, verwendet. Ist der Arzneimittelträger für IFN menschliches Serumalbumin, so kann das menschliche Serumalbumin aus menschlichem Serum stammen oder es kann rekombinanten Ursprungs sein. Normalerweise ist Serumalbumin, wenn es verwendet wird, homologen Ursprungs.

Das IFN kann durch jegliches Mittel verabreicht werden, das für Kontakt von IFN mit dem mit Mundschleimhaut ausgekleideten Hohlraum des Rezipienten sorgt. Somit ist eindeutig verständlich, dass die Erfindung nicht auf einen bestimmten Formulierungstyp beschränkt ist. Die vorliegende Beschreibung beschreibt die Verabreichung von IFN tief in den mit Mundschleimhaut ausgekleideten Hohlraum hinein; dies kann mit Flüssigkeiten, Feststoffen oder Aerosolen sowie mit Nasentropfen oder -sprays erreicht werden. Somit umfasst die Erfindung, ist jedoch nicht beschränkt auf, Flüssigkeiten, Spray, Sirup, Pastillen, Tabletten zur oralen Einnahme und Zerstäuberformulierungen. Fachleute werden erkennen, dass für Aerosol- oder Zerstäuberformulierungen die Partikelgröße des Präparats wichtig sein kann, und sie werden geeignete Verfahren kennen, mittels derer die Partikelgröße modifiziert werden kann.

In einem Aspekt wird das Interferon in einer einzelnen Dosis verabreicht. Alternativ dazu wird das Interferon in mehreren kleineren Dosen, die auf einen bestimmten Zeitraum aufgeteilt sind, verabreicht, sodass die tatsächliche Wirkung jener der Verabreichung der einzelnen höheren Dosis entspricht. Ein Ansatz zu diesem Zufuhrverfahren arbeitet über die Bereitstellung einer Retardvorrichtung oder einer Vorrichtung zur gesteuerten Freisetzung, die im Mundschleimhauthohlraum angebracht oder in diesen implantiert und so konzipiert ist, dass sie Interferon über einen bestimmten Zeitraum in einer Menge freisetzt, die jener einer einzelnen hohen Dosis entspricht.

Beispiele für Interferonformulierungen zur Anwendung an der Mundschleimhaut umfassen die folgenden Formulierungen (alle % sind Gew.-%):

Tablette: Dextrose BP 45 %; Gelatine BP 30 %; Weizenstärke BP 11 %; Carmellose-Natrium BP 5 %; Ovalbumin BPC 4 &; Leucin USP 3 %; Propylenglykol BP 2 %; und 50 × 106 IE IFN-&agr;2. Die Tablette kann je nach Bedarf unverändert verwendet und langsam im Mund auflösen gelassen werden, oder sie kann in Wasser aufgelöst und im Mund in Kontakt mit der Mundschleimhaut gehalten werden.

Eine Interferonpaste kann wie im US-Patent Nr. 4.675.184 beschrieben aus Glycerin 45 %, Natrium CMC 2 %, Citratpuffer (pH 4,5) 25 %, destilliertem Wasser auf 100 % und 50 × 106 IE IFN-&agr;2 hergestellt werden. Die Interferonpaste kann an die Mundschleimhaut aufgetragen werden.

In ähnlicher Weise kann ein Gurgelmittel oder ein Sirup durch Zusatz der erwünschten Mengen an Interferon zu einem handelsüblichen Mundwasser oder einer Hustensirupformulierung hergestellt werden.

Innerhalb der spezifischen Dosierungsbereich, auf die oben Bezug genommen wurde, hängt die optimale Behandlung in jedem einzelnen Fall von der Art des betreffenden Leidens, der Phase der Erkrankung, früheren Therapien, anderen kontinuierlichen Therapien, dem allgemeinen Gesundheitszustand des Säugetiers, der Empfindlichkeit des Individuums gegenüber Interferon und dergleichen ab und wird somit nach dem Ermessen des behandelnden Arztes bestimmt, der all diese Umstände bei seiner Entscheidung berücksichtigt. Die Dauer der Behandlung variiert natürlich mit der zu behandelnden Erkrankung, beispielsweise wird erwartet, dass die Behandlung eines langsam wachsenden Krebses, wie Prostatakrebs, einen anderen Behandlungsverlauf umfasst als die Behandlung eines rasch wachsenden Krebses, wie beispielsweise von hepatischem zellulärem Karzinom.

Die hierin offenbarte, wirksame Dosis ist eine, die eine pathologische Antwort im Patienten hervorruft, wenn sie parenteral verabreicht wird, die jedoch sowohl wirksam und entweder nichttoxisch oder weniger toxisch ist, wenn sie über die Mundschleimhaut verabreicht wird. Eine pathologische Antwort kann akut, chronisch oder kumulativ sein und kann sich durch Veränderungen der Körperchemie, z.B. in Form von Leukozytopenie, Knochenmarkdepression oder anderen histologischen Parametern, manifestieren. Wie hierin verwendet umfasst eine pathologische Antwort negative Nebenwirkungen wie Fieber, Unwohlsein oder grippeähnliche Symptome, vaskuläre Reaktionen wie Phlebitis und lokale Entzündungsreaktionen an der Stelle der Injektion. Solche Antworten variieren in Anbetracht der individuellen Unterschiede bezüglich der Empfindlichkeit gegenüber Interferon unter den verschiedenen Patienten stark.

Für zahlreiche Patienten wird angenommen, dass Dosen für die Mundschleimhaut jene überschreiten, die in bestehenden anerkannten Therapievorschriften zur parenteralen Verabreichung toleriert werden können. In einer Ausführungsform kann die Gesamtdosis in mehreren kleineren Dosen über einen bestimmten Zeitraum verabreicht werden, oder sie kann sogar kontinuierlich oder in Intervallen aus einer Vorrichtung zur gesteuerten Freisetzung, die an der Mundschleimhaut angebracht oder in diese implantiert ist, zugeführt werden.

INTERFERONE UND INTERFERONFORMULIERUNGEN Maus-IFN-&agr;/&bgr;

Maus-IFN-&agr;/&bgr; (Mu IFN-&agr;/&bgr;) wurde aus Kulturen von C243-3-Zellen, induziert mit Newcastle-Krankheitsvirus (NDV), hergestellt und wie zuvor beschrieben gereinigt (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 146, 809–815 (1974)). Das in dieser Studie verwendete Präparat hatte einen Titer von 4 × 106 Internationalen Einheiten (IE)/ml und eine spezifische Aktivität von 5 × 107 IE/mg Protein, wie an Maus-929-Zellen, provoziert mit Gingivostomatitis-herpetica-Virus (vesicular stomatitis virus, VSV) wie zuvor beschrieben (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 146, 809–815 (1974)), getestet wurde. Das Präparat wurde auf das internationale Referenzpräparat von murinem IFN-&agr;/&bgr; der National Institutes of Health (NIH) (G-002-9004-5411) bezogen standardisiert.

Menschliches IFN-&agr;-1-8

Rekombinantes menschliches IFN-&agr;-1-8 (Hu IFN-&agr; 1–8; BDBB Chargen-Nr. CGP 35269-1, Ciba-Geigy, Basel, Schweiz) wurde wie zuvor beschrieben (Meister et al., J. Gen. Virol. 67, 1633–1643 (1986)) hergestellt und gereinigt. Das in dieser Studie verwendete Präparat hatte einen Titer von 70 × 106 IE/ml an homologen menschlichen WISH-Zellen, provoziert mit VSV wie zuvor beschrieben (Tovey et al., Nature 267, 455–457 (1977)), und einen Titer an heterologen Maus-L929-Zellen von 1 × 106 IE/ml. Das Präparat wurde im Vergleich sowohl auf das internationale menschliche IFN-&agr;-Referenzpräparat der NIH (G-023-901-527) als auch auf den murinen IFN-&agr;/&bgr;-Standard (G-002-9004-5411) bezogen standardisiert. Die spezifische Aktivität des IFN-Präparats betrug 2 × 108 IE/mg Protein.

REKOMBINANTES MURINES INTERFERON-&agr;

Rekombinantes murines Interferon-&agr; wurde bei Life Technologies Inc. erworben. Das in dieser Studie verwendete Präparat (Chargen-Nr. HKK404) hatte einen Titer von 6 × 106 IE/ml und eine spezifische Aktivität von 6 × 108 IE/mg Protein, wie an Maus-L929-Zellen, provoziert mit VSV (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 146, 809–815 (1974)), getestet wurde.

REKOMBINANTES MURINES INTERFERON-&bgr;

Rekombinantes murines Interferon-&bgr; wurde bei R & D Systems Inc. erworben. Das in dieser Studie verwendete Präparat (Chargen-Nr. 1976–01S) hatte einen Titer von 3,2 × 104 IE/ml und eine spezifische Aktivität von 8 × 106 IE/mg Protein, wie an Maus-L929-Zellen, provoziert mit VSV (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 146, 809–815 (1974)), getestet wurde.

REKOMBINANTES MURINES INTERFERON-&ggr;

Rekombinantes murines Interferon-&ggr; wurde bei R & D Systems Inc. erworben. Das in dieser Studie verwendete Präparat (Chargen-Nr. 2580–03SA) hatte einen Titer von 2 × 105 IE/ml und eine spezifische Aktivität von 1 × 107 IE/mg Protein, wie an Maus-L929-Zellen, provoziert mit VSV (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 146, 809–815 (1974)), getestet wurde.

Alle Interferonpräparate wurden gleichzeitig im selben Test titriert und auf das internationale Referenzpräparat von murinem Interferon &agr;/&bgr; der US National Institutes of Health (G-002-9004-5411) bezogen standardisiert.

Sowohl murines Interferon-&agr;/&bgr; als auch rekombinante murine Interferone wurden vor der Verabreichung in FerimmuneTM-Arzneimittelträger aufgenommen.

ARZNEIMITTELTRÄGER

Interferonpräparate wurden entweder in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, oder in den nachstehend beschriebenen, markenrechtlich geschützten Arzneimittelträgern verdünnt. Rinderserumalbuminfraktion V (RIA-Grad; Immunglobulin-frei; Kat.-Nr. A7888; Sigma; USA) wurde in einer Endkonzentration von 100 &mgr;g/ml in PBS (pH 7,4) aufgelöst und durch Filtration sterilisiert (0,2 &mgr;, Millex-GV, Millipore, USA).

In den hierin beschriebenen Versuchen wurden die Interferonpräparate in einem markenrechtlich geschützten Arzneimittelträger verdünnt. Der verwendete Arzneimittelträger wurde wie folgt in Form von Tabletten zugeführt (FerimmuneTM, Pharma Pacific):

Eine einzelne Tablette wurde in 1,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung aufgelöst, bei 16.000 g 15 min lang zentrifugiert und anschließend steril filtriert (0,2 ×, Millex-GV, Millipore, USA) und bei 4°C bis zur Verwendung gelagert. Arzneimittelträger wurde täglich vor der Verwendung hergestellt.

INTERFERON-ZUFUHRSYSTEM

Frühere Versuche zeigten, dass die Anwendung von 5 &mgr;l Kristallviolett in jeder Nüster einer normalen erwachsenen Maus unter Verwendung einer P20-Eppendorf-Mikropipette zu einer beinahe unmittelbaren Verteilung des Farbstoffs über die gesamte Oberfläche des oropharyngealen Hohlraums führte. Die Färbung des oropharyngealen Hohlraums war auch etwa 30 min nach Anwendung des Farbstoffs noch sichtbar. Im Wesentlichen ähnliche Resultate wurden unter Verwendung von 125I-markiertem, rekombinantem menschlichem IFN-&agr; 1–8, das in derselben Weise angewandt wurde, erzielt. Dieser Verabreichungsverfahren wurde daher in allen nachfolgenden Versuchen verwendet.

Für die Zwecke der in dieser Beschreibung dargestellten Tierversuche ist eindeutig zu verstehen, dass die Ausdrücke "oromucosal" ("Mundschleimhaut") oder "oropharyngeal" oder "intranasal/oral" oder "intranasal plus oral" oder "in/or" in Bezug auf die Art der Verabreichung von IFN eine Art Verabreichung des IFN-Präparats tief in den Nasenhohlraum, sodass es rasch in den mit Mundschleimhaut ausgekleideten Hohlraum, d.h. den Mund und Hals des Rezipientensäugetiers, verteilt wird, um mit der diesen Hohlraum auskleidenden Schleimhaut in Kontakt zu treten, bezeichnen.

EMCV (ENZEPHALOMYOKARDITISVIRUS)

  • Charge: Chargen-Nr. 095001
  • Ablaufdatum: Dezember 1997
  • Herstellung: EMCV-Stamm JH wurde auf Maus-L929-Zellen unter Verwendung von bereits früher beschriebenen Verfahren (I. Gresser, C. Bourali, M.T. Thomas, E. Falcoff. Effect of repeated inoculation of interferon preparations on infection of mice with encephalomyocarditis virus. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 127, 491–496 (1968)) vermehrt
  • Charakterisierung: Der in dieser Studie verwendete Virusstamm hatte einen Titer von 5 × 108 62TCID50 an Maus-L929-Zellen.
  • Lagerung: Stamm-EMCV wurde bei –70°C gelagert. Ein Stromausfall an Tag 1 der Virus-Titration erforderte vorübergehenden Transfer in Sicherungslagerplätze bei etwa denselben Temperaturen. Das Material blieb über den gesamten Zeitraum hinweg gefroren. An Tag +8 der Virus-Titration wurde die Temperatur des –70°C-Gefriergerätes auf –60°C angehoben. Verdünntes EMCV wurde unmittelbar vor Verwendung hergestellt und wurde bis zur Verwendung auf Eis oder im Tierraum-Kühlgerät gehalten.

FRIEND-ERYTHROLEUKÄMIEZELLEN

Der IFN-&agr;/&bgr;-resistente Klon, 3C18, von Friend-Erythroleukämiezellen (FLC) wurde von Dr. E. Affabris, Rom, erhalten und wird im Detail auch von Affabris et al., Virology 120, 441–452 (1982), beschrieben. Diese Zellen wurden daraufhin durch In-vivo-Passage aufrechterhalten. Kurz zusammengefasst wurden DBA/2-Mäuse durch intraperitoneale (ip) Injektion mit etwa 100 LD50 von 3C18-Zellen inokuliert, und eine Woche später wurden die Tumorzellen aus dem Peritoneum der Mäuse geerntet, gezählt, und andere Mäuse wurden wiederum mit 100 LD50 von 3C18-Zellen inokuliert. Dieses Verfahren wurde für 60 bis 100 Passagen wiederholt. Es wurde gezeigt, dass die bei der 60. und 100. In-vivo-Passage verwendeten 3C18-Zellen für die Leber und Milz hoch metastasierend waren (Gresser et al., Int. J. Cancer 39, 789–792 (1987)). Der Phänotyp von IFN-Resistenz wurde routinemäßig durch Kultivieren der In-vivo-Passage unterzogenen Zellen in vitro in der Gegenwart von IFN-&agr;/&bgr; bestätigt (Belardelli et al., Int. J. Cancer 30, 813–820 (1982)).

L1210R6-KLON & EL4-TRANSPLANTIERBARER TUMOR

Der IFN-&agr;/&bgr;-resistente Klon, L1210R6, von L1210-Lymphomzellen wurde in den Laboratorien der Erfinder isoliert (Gresser et al., Interferon and cell division. IX. Interferon-resistant L1210 cells: Characteristics and Origin., J. Nat. Cancer Inist. 52, 553–559 (1974)).

Der EL4-transplantierbare Tumor stammte ursprünglich aus Mäusen, die mit dem chemischen Karzinogen 1-2-Dimethylbenzanthrein inokuliert worden waren (P.A. Gorer, Br. J. Cancer 4, 372–381 (1950)).

Die L1210-Lymphomzellen wurden durch serielle In-vivo-Passage in spezifischpathogenfreien DBA/2-Mäusen aufrechterhalten.

Der EL4-Tumor wurde durch serielle In-vivo-Passage in spezifisch-pathogenfreien C57BL/6-Mäusen aufrechterhalten.

B16-MELANOM

Das B16-Melanom ist ein transplantierbarer Tumor spontanen Ursprungs, der aus einer C57BL/6-Maus stammt (I.J. Fidler & M.L. Kriple, Science 197, 893–897 (1977)). Das B16-Melanom ist ein rasch wachsender, hoch anaplastischer, Melanin-produzierender Tumor, der prinzipiell in die Lunge metastasiert. Das B16-Melanom wird als gutes Modell für rasch wachsende, hochaggressive menschliche Tumoren angesehen.

B16-Melanomzellen wurden durch serielle In-vivo-Passage in spezifisch-pathogenfreien C57BL/6-Mäusen aufrechterhalten.

TIERE

Die in dieser Studie verwendeten Mäuse wurden aus einer spezifisch-pathogenfreien Kolonie (IFFA CREDO, Frankreich) erhalten. Sie wurden in einer spezifisch-pathogenfreien Tiervorrichtung am Institut Federatif CNRS in Villejuif gemäß EEC-Standards untergebracht.

INTERFERON-BIOASSAY

Interferon wurde gemäß einem herkömmlichen Verfahren getestet. Kurz zusammengefasst wurden Proben (20 &mgr;l) in 80 &mgr;l Eagle's Minimal Essential Medium (MEM) (Gibco, Frankreich), das 2 % hitzedeaktiviertes fötales Rinderserum (FCS) (Gibco, Frankreich) enthielt, verdünnt und zu jedem Well einer Mikrotiterplatte (Falcon, Kat.- Nr. 3072) unter Verwendung einer Mehrkanalmikropipette (Finnpipette, Labsystem, 50–300 &mgr;l) zugesetzt. WISH- oder L929-Zellen (2 × 104 Zellen/Well) wurden in 100 &mgr;l MEM, das 2 % FCS enthielt, zugesetzt und über Nacht bei 37°C in einer Atmosphäre von 5 % CO2 in Luft (Forma 3029 CO2-Inkubator) inkubiert. Die Zellen wurden auf jegliche Zeichen von Toxizität unter Verwendung eines verkehrten Olympus-IIM-GLDW-Mikroskops, das mit einem 10X-Objektiv ausgestattet war, untersucht. Proben, die keine nachweisbare Toxizität aufwiesen, wurden anschließend Zweifach-Reihenverdünnungen, ausgehend von einer Anfangs-1:10-Verdünnung in einem Gesamtvolumen von 200 &mgr;l Eagle's MEM, das 2 % FCS enthielt, durch Übertragen von 100 &mgr;l verdünntem Material mit einer Mehrkanalmikropipette in eine Mikrotiterplatte, die 100 &mgr;l pro Well an frischem Eagle's MEM mit 2 % FCS enthielt, unterzogen. Ebenfalls wurden Zweifach-Reihenverdünnungen des menschlichen IFN-&agr;-Referenzstandard der NIH (G-023-901-527) oder des murinen IFN-&agr;/&bgr;-Referenzstandard der NIH (G-002-9004-5411) hergestellt. WISH- oder L929-Zellen (2 × 104 Zellen/Well) in 100 &mgr;l Eagle's MEM mit 2 % FCS wurden anschließend zu jeder Platte, sofern geeignet, zugesetzt und über Nacht bei 37°C in einer Atmosphäre von 5 % CO2 in Luft inkubiert. Die Zell-Monolayer wurden dann auf jegliche Zeichen von Toxizität überprüft, und bei Abwesenheit von jeglicher augenscheinlicher Toxizität wurde die Kultur abgesaugt und durch 200 &mgr;l Eagle's MEM, das 2 % FCS enthielt, das 100 TCID50 von VSV enthielt (2 × 10–4 VSV23 für WISH-Zellen oder 10–5 VSV23 für L929-Zellen) ersetzt. Die Platten wurden dann über Nacht bei 37°C in einer Atmosphäre von 5 % CO2 in Luft inkubiert. Die Zell-Monolayer wurden anschließend unter Verwendung eines verkehrten Olympus-IM-ULWD-Mikroskops auf spezifische virale zytopathogene Wirkung untersucht. Interferontiter wurden anhand des Kehrwerts der Verdünnung bestimmt, der 50 % Schutz vor spezifischer viraler zytopathogener Wirkung ergab, und sind in internationalen Referenzeinheiten/ml (IE/ml) angegeben.

Beispiel 1 Wirkung von hochdosiertem Interferon auf das Überleben nach letalem Challenge mit EMCV (Enzephalomyokarditisvirus)

Die Wirkungen von IFN-&agr;-Dosen von 1.000, 10.000 und 100.000 IE, verabreicht über die Mundschleimhaut, wurde in männlichen und weiblichen Mäusen, denen eine letale Dosis an EMCV verabreicht wurde, getestet. Verschiedene Typen von IFN-&agr; wurden getestet, und die Wirkung der Verabreichung über die Mundschleimhaut wurde mit jener von intraperitonealer (ip) Verabreichung verglichen. Zusätzlich zur Beobachtung des Überlebens nach dem letalen Challenge wurde die Toxizität der IFN-Behandlung unter Verwendung verschiedener klinisch-chemischer und hämatologischer Parameter beobachtet.

Die Behandlung von Mäusen mit 105 IE an IFN-&agr; durch Verabreichung über die Mundschleimhaut einmal täglich 4 Tage lang führte zu einem vollständigen Schutz aller Tiere, wenn die Behandlung nach der Virusinfektion begonnen wurde. Hundert Tage nach der Infektion mit der letalen Dosis an EMCV (100 LD50) unter denselben Bedingungen, unter denen alle virusinfizierten, nicht behandelten Kontrolltiere innerhalb von 7 Tagen starben, hatten 100 Prozent der IFN-behandelten Tiere überlebt und waren sogar bei gutem Gesundheitszustand.

Bezogen auf das Körpergewicht entspricht die Behandlung von Mäusen mit 105 IE mittels Verabreichung über die Mundschleimhaut einer Dosis beim Menschen von 240 Millionen IE, was nach Kenntnis der Erfinder wesentlich mehr ist, als jemals einem Menschen verabreicht wurde.

Da die Behandlung von Mäusen mit 105 IE an IFN-&agr; über den in/or-Weg zu einem höheren Maß an Schutz führte als die Behandlung von Tieren mit 104 IE an IFN-&agr;, ist es wahrscheinlich, dass sogar noch stärkere Wirkungen (gegen eine noch größere Virusbelastung oder Tumorbelastung) mit sogar noch höheren Dosen an IFN-&agr; erzielt werden können. Bis heute konnten die Erfinder noch keinen Hinweis auf einen Abflachung der Dosis-Reaktions-Kurve feststellen.

Die Resultate der Erfinder zeigen auch, dass hohe bis extrem hohe Dosen an IFN, die über den in/or-Weg verabreicht werden, eine stark schützende antivirale Wirkung zeigen und dass 105 IE an IFN-&agr;, die auf diesem Weg verabreicht werden, eine vollständige Behandlung gegen die verwendete EMCV-Dosis bereitstellt. Trotz der Tatsache, dass die verwendeten Dosen auf das Körpergewicht gerechnet noch viel höher waren als jene, die je an Menschen verabreicht worden waren, nämlich 240 × 106 IE, wurde kein klinischer, biochemischer oder hämatologischer Beweis für Toxizität beobachtet. Hingegen liegt die maximale tolerierte Dosis an parenteral verabreichtem IFN in der klinischen Praxis im Bereich von 20 bis 30 × 106 IE täglich.

Beispiel 2 Wirkung von hochdosiertem IFN-&agr; auf Mäuse. die mit stark metastasierenden Tumorzellen provoziert wurden

Gruppen von 10, sechs Wochen alten DBA/2-Mäusen wurden intravenös entweder mit 105 Friend-Erythroleukämiezellen des Interferon-resistenten Klons 3C18 oder mit 105 L1210-Lymphomzellen (Interferon-resistente L1210R-Zellen) an Tag 0 provoziert. Nach der Inokulation wurden die Mäuse entweder unbehandelt gelassen oder zweimal täglich 20 Tage lang über den in/or-Weg mit 105 IE Maus-IFN-&agr;/&bgr; in einem Volumen von 10 &mgr;l Arzneimittelträger oder mit 10 &mgr;l Arzneimittelträger alleine (Kontrolle) behandelt.

Hundert Tage nach der Inokulation mit den stark metastasierenden Friend-Erythroleukämiezellen hatten 50 Prozent der Tiere, die mit IFN über den in/or-Weg behandelt worden waren, überlebt und befanden sich in einem guten Gesundheitszustand. Hundert Tage nach der Inokulation mit den stark L1210-Lymphomzellen hatten 30 Prozent der Tiere, die mit IFN über den in/or-Weg behandelt worden waren, überlebt und befanden sich in einem guten Gesundheitszustand. Klinische Beobachtungen lassen darauf schließen, dass alle der IFN-behandelten Tiere, die 100 Tage lang überlebten, auch eine normale Lebensdauer lang gelebt hätten, wenn sie nicht getötet worden wären. Histologische Untersuchungen von Organen zeigten keine verbleibenden Tumoren. Hingegen waren alle unbehandelten Tiere und Kontrolltiere innerhalb von 13 Tagen nach dem Challenge mit Friend-Erythroleukämiezellen bzw. innerhalb von 14 Tagen nach dem Challenge mit L1210-Lymphomzellen tot.

Diese Resultate sind äußerst bedeutend, da beide der verwendeten Tumorzelllinien äußerst aggressiv sind und da die verwendete Challenge-Dosis etwa dem 20.000fachen der LD50 entsprach. Darüber hinaus sind Friend-Leukämie und L1210-Lymphom darin sehr unterschiedliche Tumortypen, dass Friend-Leukämiezellen ein Retrovirus, das Friend-Leukämievirus, tragen, während L1210-Lymphom mit keiner der bekannten viralen Ätiologien assoziiert werden kann. Die mit in/or-IFN-&agr;-Therapie von Tieren, die mit L1210-Lymphom inokuliert wurden, erhaltenen Resultate scheinen jenen zu entsprechen oder ihnen sogar überlegen zu sein, die mit systemischer IFN-&agr;-Therapie in diesem Modell erzielt wurden (I. Gresser, nicht veröffentlichte Resultate). In der früheren Studie der Erfinder, über die in der Australischen vorläufigen Anmeldung Nr. PN9765 der Erfinder berichtet wurde, überlebte keine der mit Friend-Leukämiezellen inokulierten und mit 100 oder 1.000 IE an IFN-&agr; behandelten Mäuse, und bei einer Dosis von 10.000 IE wurden nur 10–20 % der Tiere als geheilt angesehen.

Beispiel 3 Wirkung von hochdosiertem IFN-&agr; auf Mäuse, die mit stark metastasierenden B16-Melanomzellen oder EL4-Tumorzellen provoziert wurden

Gruppen von 10 Wochen alten C57B1/6-Mäusen wurden intravenös entweder mit 105 B16-Melanomzellen oder mit 105 EL4-Tumorzellen provoziert. Nach der Inokulation wurden die Mäuse entweder unbehandelt belassen oder zweimal täglich 20 Tage lang über den in/or-Weg mit 105 IE an Maus-IFN-&agr;/&bgr; in einem Volumen von 10 &mgr;l Arzneimittelträger oder mit 10 &mgr;l Arzneimittelträger alleine (Kontrolle) behandelt.

Dreißig Prozent der mit IFN über den in/or-Weg behandelten Tiere waren 100 Tage nach Inokulation mit hoch metastasierenden B16-Melanomzellen oder EL4-Tumorzellen am Leben und bei guter Gesundheit. Hingegen starben alle unbehandelten Tiere und Kontrolltiere innerhalb von 20 Tagen nach dem Challenge mit B16-Melanomzellen bzw. innerhalb von 22 Tagen nach dem Challenge mit L4-Tumorzellen. Klinische Beobachtungen lassen darauf schließen, dass alle der IFN-behandelten Tiere, die nach 100 Tagen noch am Leben waren, auch weiter überlebt hätten, wenn sie nicht getötet worden wären, obwohl die Interferonbehandlung nach 20 Tagen beendet worden war. Histologische Untersuchungen der Organe zeigten, dass in Interferon-behandelten Tieren, die nach 100 Tagen getötet worden waren, kein Tumor verblieben war.

Vergleichsbeispiel 4 Wirkung von über die Mundschleimhaut verabreichtem Interferon gegen Gingivostomatitis-herpetica-Virus

Gruppen von zehn 6 Wochen alten Mäusen aus einer spezifischen, pathogenfreien Zuchtkolonie wurden intranasal mit 100 LD50 an Gingivostomatitis-herpetica-Virus (VSV) (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 146, 406–415 (1974)) in einem Volumen von 10 &mgr;l infiziert. Sieben Stunden nach der Virusinfektion wurden Mäuse entweder unbehandelt belassen oder einmal täglich 4 Tage lang mittels intranasaler/oraler Verabreichung mit einer gegeben Dosis an murinem Interferon &agr;/&bgr; in einem Volumen von 10 &mgr;l Ferimmune-Arzneimittelträger oder mit 10 &mgr;l Arzneimittelträger alleine (Kontrolle) behandelt.

Die Behandlung von erwachsenen Mäusen mit murinem Interferon &agr;/&bgr; resultierte in einem ausgeprägten Anstieg des Prozentsatzes an Tieren, die die Infektion mit einer letalen Dosis an VSV überlebten. Somit waren 30 % der mit 10.000 IE Interferon &agr;/&bgr; behandelten Tiere 21 Tage nach der Infektion mit der letalen Dosis an VSV am Leben, und dies unter denselben Bedingungen, unter denen alle unbehandelten Tiere oder die mit Arzneimittelträger behandelten, virusinfizierten Kontrolltiere bis zum 10. Tag tot waren. Klinische Beobachtungen lassen darauf schließen, dass die meisten der Interferon-behandelten Tiere, die bis zum 21. Tag überlebten, auch weiter überleben würden.

Beispiel 5 Wirkung von über die Mundschleimhaut verabreichtem Interferon auf die Expression von zellulären Proteinen

IFN-&agr; ist bekannt dafür, die Expression zahlreicher zellulärer Proteine nach Bindung des Proteins an seinen Zelloberflächenrezeptor zu induzieren. Von diesen Proteinen wird angenommen, dass sie einen nützlichen Marker für IFN-Wirkung darstellen.

Die Erfinder bewerteten die Wirkung von IFN-&agr;, das über den in/or-Weg verabreicht wurde, auf die Expression von drei IFN-induzierten Proteinen, MHC-Klasse-I-Antigenen, Ly-6A/E-Antigen und 2'-5'-Oligoadenylatsynthetase.

Die Behandlung von DBA-2-Mäusen (H-2Kd) mit bis zu 20.000 IE an Mu IFN-&agr; über den in/or-Weg steigerte H-2-Kd-Expression an peripheren Blutlymphozyten, -monozyten oder -granulozyten unter Bedingungen nicht signifikant, unter denen eine geringe Menge wie 20 IE an Mu IFN-&agr;, das intraperitoneal verabreicht wurde, die Expression von H-2-Kd-Antigenen sowohl an peripheren Blutmonozyten als auch -granulozyten deutlich steigerte. Tatsächlich war die Expression an Monozyten leicht unterdrückt.

In ähnlicher Weise zeigte die Behandlung von Mäusen mit bis zu 20.000 IE an IFN-&agr; über den in/or-Weg keine signifikante Wirkung auf die Expression von Ly6-A/E-Antigenen, deren Expression an der Oberfläche von zahlreichen verschiedenen Lymphzellen nach parenteraler Verabreichung von Typ-I-IFN deutlich anstieg (Dumont et al., J. Immunol. 137, 201–210 (1986)). Ähnliche Resultate wurden mit 200 oder 20.000 IE von entweder Mu IFN-&agr; oder Hu IFN-&agr; 1–8 über den in/or-Weg erzielt.

Die Behandlung von entweder Swiss- oder DBA/2-Mäusen mit nur 20 IE an Mu IFN-&agr;, ip injiziert, resultierte in einem deutlichen Anstieg der 2'-5'-Oligoadenylatsynthetaseaktivität sowohl in peripheren einkernigen Blutzellen als auch in Splenozyten. Hingegen steigerte im selben Versuch die Behandlung von Mäusen mit bis zu 20.000 IE an Mu IFN-&agr; über den in/or-Weg die Expression von 2'-5'-Oligoadenylatsynthetaseaktivität nicht signifikant. Weiters zeigte die Behandlung mit 200 oder 20.000 IE an entweder Mu IFN-&agr; oder Hu IFN-&agr; über den in/or-Weg zu keinem getesteten Zeitpunkt innerhalb der ersten 10 Tage nach Beginn der IFN-Behandlung eine signifikante Wirkung auf 2'-5'-Oligoadenylatsynthetaseaktivität.

Beispiel 6 Bioverfügbarkeit von Interferon nach Verabreichung über die Mundschleimhaut

Um die Bioverfügbarkeit und Pharmakokinetik von IFN zu untersuchen, wurden Mäuse, die das günstigste Verhältnis zwischen Wirkstoff und Blutvolumen für solche Studien aufweisen, mit einer einzelnen hohen Dosis an rekombinantem IFN-&agr;, markiert bis zur höchstmöglichen spezifischen Radioaktivität mit 125I, behandelt.

Ein reines Präparat von 70 × 106 IE an Hu IFN-&agr; 1–8 wurde in 1,4 ml PBS aufgenommen und wie von Mogensen et al. (Int. J. Cancer 28, 575–582 (1981)) beschrieben unter Verwendung einer Modifikation des Chloramin-T-Verfahrens, das von Hunter & Greenwood (Nature 194, 495–496 (1962)) beschrieben wurde, iodiert.

Das 125I-markierte Hu IFN-&agr; 1–8 (Chargen-Nr. CGP35269-1) wies eine biologische Aktivität von 2 × 107 IE/ml, wenn es an menschlichen WISH-Zellen, provoziert mit VSV, getestet wurde, und von 1 × 106 IE/ml, wenn es an Maus-L929-Zellen, provoziert mit VSV, getestet wurde, auf.

Sechs bis sieben Wochen alten, weiblichen Swiss-Mäusen wurden 2 × 107 IE entsprechend 1 × 106 murinen IE von 125I Hu IFN-&agr; 1–8 (1,0369 × 107 cpm/Maus) iv oder ip injiziert, oder sie wurden damit in/oder behandelt. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden drei Mäuse pro Gruppe getötet, Blut wurde abgenommen, und das Volumen wurde bestimmt. Niere, Leber, Lunge, Milz und Magen/Speiseröhre wurden entnommen, geblottet und mit einer Genauigkeit von ±1,0 &mgr;g gewogen. Die Radioaktivität jeder Probe wurde einzeln unter Verwendung eines &ggr;-Zählers bestimmt. Vollblut wurde anschließend durch Zentrifugation (800 g × 10 min., 4°C) aufgetrennt, das Serum wurde entnommen, gezählt und bei –80°C gefroren. Das Serum wurde dann auf IFN-Gehalt unter Verwendung eines Standard-Bioassays sowohl an menschlichen WISH-Zellen als auch an Maus-L929-Zellen wie zuvor beschrieben getestet. Das in den Serumproben vorhandene, radioaktive Material wurde dann durch Affinitätsimmunfällung isoliert und mittels SDS-PAGE analysiert.

Sehr hohe Konzentrationen an Radioaktivität (> 2 × 106 cpm/ml) wurden im peripheren Blut von Tieren 5 min nach der Injektion von 1,0369 × 107 cpm/Maus von 125I-markiertem Hu IFN-&agr; 1–8 über einen intravenösen Bolus detektiert. Die Menge an Radioaktivität, die im Vollblut vorhanden war, ging dann nach 15 und 30 min nach und nach zurück. Die Konzentrationen an Radioaktivität, die im peripheren Blut von Tieren 5 min nach der intraperitonealen Injektion von 1,0369 × 107 cpm/Maus von 125I-markiertem Hu IFN-&agr; 1–8 detektiert wurden, waren etwa 20fach geringer als die Konzentrationen, die nach einem intravenösen Bolus detektiert wurden. Die Konzentrationen an Radioaktivität stiegen dann schrittweise nach 15 und 30 min nach der Injektion an. Die Konzentrationen an Radioaktivität, die im Blut von Tieren nach 5, 10 und 15 min nach der in/or-Verabreichung von 125I IFN-&agr; 1–8 detektiert worden waren, waren signifikant niedriger als jene, die zu einem gegebenen Zeitpunkt nach der ip-Injektion derselben Menge an radioaktivem IFN detektiert worden waren. Bei allen drei Arten der Verabreichung wurden im Serum höhere Konzentrationen an Radioaktivität als im Gesamtblut nach in/or-Verabreichung von 125I-markiertem IFN-&agr; 1–8 detektiert. Die geringeren Konzentrationen an Radioaktivität, die pro ml Gesamtblut detektiert wurden, im Vergleich zu demselben Volumen an Serum, spiegelt das tatsächlich größere Volumen an Serum wider, das nach der Entfernung der zellulären Komponente von Vollblut gezählt wurde.

Serumproben aus allen Mäusen der Studie wurden auf die Gegenwart von biologisch aktivem IFN unter Verwendung eines Standard-Bioassays, wie zuvor beschrieben, getestet und zeigten zu allen getesteten Zeitpunkten leicht nachweisbare Konzentrationen an biologisch aktivem IFN im Serum aller Tiere, denen 125I Hu IFN-&agr; 1–8 entweder iv oder ip injiziert worden war. Hingegen wurde nach der in/or-Verabreichung von IFN, trotz der Gegenwart von relativ hohen Konzentrationen an Radioaktivität im Serum dieser Tiere, in keinem der Tiere zu irgendeinem getesteten Zeitpunkt biologisch aktives IFN im Serum detektiert.

Um zu bestimmen, ob das im Serum der mit 125I HU IFN-&agr; 1–8 behandelten Tiere detektierte radioaktive Material tatsächlich natives IFN darstellte, wurden die Proben mit Protein-A-G-Agarose immungefällt, um in der Probe vorhandene Immunglobuline auszufällen, mit einem Affinititäts-gereinigten, polyklonalen Anti-IFN-&agr;-Antikörper behandelt und weiter immungefällt. Die Proben wurden dann SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) wie zuvor beschrieben unterzogen.

SDS-PAGE-Analyse des radioaktiven Materials in Serum nach iv- oder ip-Injektion von 125I Hu IFN-&agr; 1–8 zeigte eine einzelne homogene Bande, die mit einer elektrophoretischen Mobilität migrierte, die mit jener von nicht injiziertem 125I Hu IFN-&agr; 1–8 identisch war. Das scheinbare Molekulargewicht des Materials wurde auf etwa 20.000 Da geschätzt, was dem Molekulargewicht von nativem Hu IFN-&agr; 1–8 exakt entspricht. Hingegen enthielt keine der Serumproben aus Mäusen, die in/or mit 125I IFN-&agr; 1–8 behandelt worden waren, Material mit einem scheinbaren Molekulargewicht, das jenem von nativem IFN ähnlich war, auch wenn eine identische Menge an radioaktivem Material auf jedes Gel geladen worden war.

Die Gewebeverteilung von radioaktiv markiertem Material zeigte sehr hohe Konzentrationen an Radioaktivität in den Nieren, hohe Konzentrationen in der Leber, Lunge und Milz von Tieren 5 min nach iv-Injektion von 125I IFN-&agr; 1–8. Es wurde beobachtet, dass die in jedem dieser vier Organe vorhandene Konzentration an Radioaktivität nach 15 und 30 min schrittweise zurückging. Dahingegen stieg die Konzentration an Radioaktivität im Magen nach 15 und 30 min schrittweise an, um schließlich eine mit jener Konzentration vergleichbare Konzentration zu erreichen, die im Serum von Tieren 30 min nach einem iv-Bolus vorhanden war.

Die Verabreichung von 125I IFN-&agr; 1–8 durch ip-Injektion führte zu Höchstkonzentrationen an Radioaktivität in allen innerhalb von 15 min untersuchten Geweben, woraufhin ein Rückgang nach 30 min folgte. In ähnlicher Weise führte in/or-Verabreichung von 125I Hu IFN-&agr; 1–8 zu Höchstkonzentrationen an Radioaktivität in allen innerhalb von 15 min untersuchten Geweben, wobei die Konzentrationen an nach 30 min vorhandener Radioaktivität leicht zurückging. Die Konzentrationen an Radioaktivität, die in Magen/Speiseröhre vorhanden waren, waren um eine Größenordnung größer als jene, die in jedem anderen Organ nach in/or-Verabreichung von 125I-markiertem IFN-&agr; 1–8 detektiert wurden, und waren deutlich höher als die Konzentrationen, die in diesen Geweben nach parenteraler Verabreichung derselben Menge an radioaktiv mar- kiertem Hu IFN-&agr; 1–8, entweder iv oder ip, vorhanden waren.

Beispiel 7 Pharmakokinetik von Interferon nach intranasaler/oraler Verabreichung

Zur exakten Bestimmung der Pharmakokinetik von Hu IFN-&agr; 1–8 wurden Mäuse iv, ip oder in/oder mit 1,0369 × 107 cpm/Maus an 125I-markiertem Hu IFN-&agr; 1–8 behandelt, und die Konzentrationen an Radioaktivität, die sowohl im Vollblut als auch im Serum vorhanden waren, wurden zu mehreren verschiedenen Zeitpunkten innerhalb von 24 h bestimmt.

Das pharmakokinetische Profil von 125I markiertem Hu IFN-&agr; 1–8, das im Blut von Mäusen nach einem iv-Bolus vorhanden war, folgte fast exakt einer logarithmischen Clearance-Kurve. Dies stimmte mit Resultaten aus einer früheren Studie überein, die an Mäusen unter Verwendung eines eng verwandten Moleküls, d.h. von rekombinantem menschlichem &agr;-A/D (Bgl), durchgeführt wurde (Bohoslawed et al., J. IFN Res. 6, 207–213 (1986)). Die Menge an bioverfügbarem Material, die aus der Fläche unter der Kurve von Konzentration über Zeit berechnet wurde, war jener für menschliches &agr;-A/D ebenfalls ähnlich. Eine zweiphasige, viel Zeit umfassende Clearance-Kurve wurde nach einem iv-Bolus von 125I IFN-&agr; 1–8 beobachtet, was für Substanzen charakteristisch ist, die durch die Nieren geklärt werden, was mit den Resultaten aus Beispiel 6 übereinstimmt. Die Pharmakokinetik von 125I-markiertem IFN-&agr; 1–8 nach ip-Injektion war jener, über die bereits frühere für IFNs, die intramuskulär verabreicht wurden, berichtet wurde, sehr ähnlich.

Leicht nachweisbare Konzentrationen von biologisch aktivem IFN waren im Serum aller Tiere entweder nach einem iv-Bolus oder nach ip-Injektion von 125I-markiertem IFN-&agr; 1–8 vorhanden.

1. Diskussion der Antitumor-Aktivität

Das Friend-Erythroleukämiemodell stellt einen sehr strengen präklinischen Test zu Antitumor-Aktivität dar, da FLC äußerst maligne sind und sowohl in der Leber als auch der Milz metastasieren, wenn sie iv injiziert werden. Tatsächlich bildeten die unter Verwendung dieses Modells erzielten Resultate die Grundlage für die Aufnahme von parenteraler Injektion von IFN-&agr; zur Behandlung von menschlichen Krebsarten. Somit starben in allen Versuchen, die im Rahmen dieser Studie durchgeführt wurden, alle unbehandelten Tiere und Tiere, die mit Kontrollpräparaten behandelt wurden, innerhalb von 10 bis 11 Tagen. Die Injektion von nur 4 oder 5 FLC-Zellen tötet Mäuse, sofern keine Behandlung verabreicht wird. Dahingegen sind manche Tiere, die mit murinem IFN-&agr; mittels Verabreichung über die Mundschleimhaut behandelt wurden, mehr als 100 Tage nach der Inokulation von 105 FLC stets am Leben und können als geheilt betrachtet werden.

Tatsächlich scheint, ausgehend von früheren Forschungsarbeiten, IFN-&agr;, das über die Mundschleimhaut verabreicht wird, wirksamer als parenteral verabreichtes Cyclophosphamid, 5-Fluoruracil oder Methotrexat zu sein, Mittel, die die Überlebensdauer bei Tieren, denen FLC injiziert wurde, um nur einige wenige Tage verlängern (Gresser et al., J. Natl. Cancer Inst. 80, 126–131 (1988)). Andere Wirkstoffe, wie Cisplatin, Vincristin, Doxorubicin, Bleomycin oder Etoposid, sind gegen diesen Tumor wirkungslos (Gresser et al., J. Natl. Cancer Inst. 80, 126–131 (1988)).

In ähnlicher Weise scheint IFN-&agr;, das über die Mundschleimhaut verabreicht wurde, wirksamer gegen FLC zu sein als andere Cytokine wie IL-1&bgr;, IL-2 und TNF-&agr;, die systemisch verabreicht werden und in diesem Modell nur sehr geringe Aktivität aufweisen.

Frühere Forschungsarbeiten zeigten, dass parenteral verabreichtes IFN einer der aktivsten Antitumor-Wirkstoffe in diesem Modell ist und dass IFN-Therapie sogar wirksam ist, wenn begonnen wird, nachdem Tumormetastasen bereits in der Leber vorhanden sind (Gresser et al., Int. J. Cancer 39, 789–792 (1987)). Die vorliegenden Resultate zeigen, dass IFN-Verabreichung über die Mundschleimhaut gleich wirksam oder sogar wirksamer ist.

Tägliche Injektionen von IFN-&agr;, verabreicht zusammen mit einer einzelnen Dosis an Cyclophosphamid, erhöhte das Überleben von Lymphom-tragenden AKR-Mäusen im Vergleich zu Tieren, die mit einem der Mittel alleine behandelt wurden, deutlich, wenn die Therapie begonnen wurde, nachdem das Lymphom diagnostiziert worden war (Gresser et al., Eur. J. Cancer 14, 97–99 (1978)). Es wurde auch bereits über eine erfolgreiche Kombinationstherapie unter Verwendung von IFN-&agr;Z&bgr; und BCNU, cis-DDP (Cisplatin), Methotrexat, Adriamycin und &agr;-Difluormethylornithin bei verschiedenen präklinischen Tiertumormodellen berichtet. Über Kombinationstherapie mit 5-Fluoruracil (5-FU) und IFN wurde auch bereits berichtet, dass sie für die Behandlung von metastasierendem Kolonkrebs bei Menschen von Nutzen ist (Ernstoff et al., Journal of Clinical Oncology 7, 1764–1765 (1989)). Es gibt jedoch auch andere Studien, die von einer reduzierten Antitumor-Aktivität berichteten, wenn IFN-Therapie mit der Verwendung von Cyclophosphamid (Marquet et al., Int. J. Cancer 31, 223–226 (1983); Lee et al., Biochem. Pharmacol. 33, 4339–3443 (1984)), Adriamycin (Blackwill et al., Cancer Res. 44, 904–908 (1984)) oder 5-FU (Marquet et al. 109, 156–158 (1985)) kombiniert wurde, d.h. mit exakt denselben Wirkstoffen, für die gezeigt wurde, dass sie eine positive Wirkung haben, wenn sie in Kombination mit parenteraler IFN-Therapie verwendet werden. Kombinationen zwischen IFN und anderen chemotherapeutischen Mitteln können leicht unter Verwendung von hierin beschriebenen Verfahren getestet werden.

Kombinierte Interleukin-1-(IL-1-) und IFN-&agr;/&bgr;-Therapie resultiert in einer synergistischen Antitumor-Wirkung in Mäusen, denen FLC injiziert werden (Belardelli et al., Int. J. Cancer 49, 274–278 (1991)). Dieselbe Behandlung übt auch eine ausgeprägte Antitumor-Wirkung gegen eine metastasierende Variante (p11-R-Eb) des Eb-Lymphoms, gegen das jedes Mittel alleine wirkungslos ist, aus (Gabriele et al., Invasion Metastasis 13 (174–162 (1993)). Von allen getesteten Cytokinen wurde für IL-1 erkannt, dass es das wirksamste ist, wenn es mit parenteraler Typ-I-IFN-Therapie kombiniert wird.

Kombinationstherapie mit dem Angiogeneseinhibitor AGM-1470 [(Chloracetyl)carbaminsäure (3R-(3&agr;,4&agr;(2R*,3R*),5&bgr;,6&bgr;))-5-methoxy-4-(2-methyl-3-(3-methoxy-2-butenyl)oxiranyl)-1-oxaspiro(2.5)oct-6-yl-ester], zusammen mit IFN-&agr;/&bgr; verabreicht, führte zu einer deutlich erhöhten Antitumor-Wirkung im Vergleich zu jedem Mittel alleine (Brem et al., J. Pediatric Surgery 28, 1253–1257 (1993)).

Auch wurde gezeigt, dass Hyperthermie die Antitumor-Wirkung von IFN-&agr;/&bgr; gegen das Lewis-Lungenkarzinom steigert (Yerushalmi et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 169, 413–415 (1982)). Für Argininbutyrat wurde auch gezeigt, dass es die Antitumor-Wirkung von IFN-&agr; potenziert (Chany & Cerutti, Int. J. Cancer 30, 489–493 (1982)). Ein Vergleich des Ausmaßes an Schutz, das erzielt wird, wenn ein gegebener Typ und eine gegebene Dosis an IFN über die Mundschleimhaut verabreicht wird, mit den Resultaten, die nach systemischer Verabreichung (ip-Injektion) erzielt wurden, zeigte, dass parenterale Verabreichung von IFN in manchen Fällen geringfügig wirksamer und in anderen Fällen nicht wirksamer als die Verabreichung über die Mundschleimhaut war.

2. Diskussion der antiviralen Aktivität

Auch wenn antivirale Aktivität im Serum von Tieren nach in/or-Verabreichung von 125I IFN-&agr; 1–8, Mu IFN-&agr;/&bgr; und Mu IFN-&agr; nicht detektiert werden konnte, wurde nichtsdestoweniger ein statistisch signifikantes Ausmaß an Schutz gegen eine Infektion mit einer letalen Dosis an EMCV in diesen Tieren beobachtet (Tabelle 1).

Die Resultate der Erfinder, die in einem gut definierten, präklinischen Modell von akuter Virusinfektion erzielt wurden, lieferten einen eindeutigen Beweis, der den "Beweis des Prinzips" für die Verwendung von hoch dosiertem, über die Schleimhaut verabreichtem IFN bei der Therapie von akuten systemischen Virusinfektionen in Menschen untermauert und zeigt, dass sowohl ein natürliches Gemisch von mehreren IFN-&agr;-Subtypen als auch ein einzelner rekombinanter IFN-&agr;-Isotyp (beispielsweise Mu IFN-&agr;) statistisch signifikante antivirale Aktivität in diesem Modell ausübt. Natürliches Mu IFN-&agr;/&bgr; und Hu IFN-&agr; 1–8 schienen gleich wirksam zu sein, wenn sie über die Mundschleimhaut verabreicht wurden. Rekombinantes Mu IFN-&bgr; und Mu IFN-&ggr; zeigten auch ähnliche Antivirus-Aktivität.

Ein Vergleich des Ausmaßes an Schutz, das erzielt wurde, wenn ein bestimmter Typ und eine bestimmte Dosis an IFN über die Mundschleimhaut verabreicht wurde, mit den Resultaten, die nach systemischer Verabreichung (ip-Injektion) erzielt wurden, zeigte, dass parenterale Verabreichung in manchen Fällen geringfügig wirksamer und in anderen Fällen nicht wirksamer als die Verabreichung über die Mundschleimhaut war.

3. Allgemeine Diskussion

Die Resultate der Biomarker-Pilotstudie zeigen sehr eindeutig, dass keiner der drei getesteten Biomarker (MHC-Klasse-I-Antigen, Ly6-A/E-Antigen und 2'-5'-Oligoadenylatsynthetaseaktivität) die sehr stark ausgeprägte, biologische Aktivität (beispielsweise antitumorale und antivirale Aktivität) zu Tage bringt, die IFN-&agr;, verabreicht über die Mundschleimhaut, zeigt.

Der Gegensatz zwischen der stark ausgeprägten Steigerung der Expression aller drei IFN-induzierten Proteine, die in allen drei Versuchen beobachtet werden konnte, die nach der ip-Injektion von nur 20 IE an IFN-&agr; durchgeführt wurden, und keiner nachweisbaren Wirkung nach der Verabreichung von bis zu 20.000 IE an IFN-&agr; über die Mundschleimhaut ist erstaunlich.

Auch wenn die Erfinder die Möglichkeit nicht ausschließen können, dass eine Wirkung auf den einen oder den anderen Biomarker zu einem früheren oder dazwischenliegenden Zeitpunkt beobachtet werden hätte können, scheint dies unwahrscheinlich, da IFN auf die Transkription der Gene, die für diese Proteine kodieren, Einfluss nimmt und somit nicht erwartet werden würde, eine Wirkung von einem dieser Biomarker vor einigen Stunden nach der IFN-Behandlung zu sehen.

Und auch wenn die Erfinder die Möglichkeit ebenfalls nicht ausschließen können, dass eine systemische Wirkung auf eines der anderen zahlreichen, IFN-induzierten Proteine nach der Behandlung mit IFN-&agr; über die Mundschleimhaut beobachtet werden hätte können, ist dies wiederum unwahrscheinlich, da dies eine differenzielle Regulierung der Expression bestimmter IFN-induzierter Gene voraussetzen würde. Es ist jedoch auf alle Fälle möglich, dass eine Wirkung auf einen IFN-Biomarker nach der Verabreichung von IFN-&agr; über die Mundschleimhaut lokal beobachtet werden kann, beispielsweise in nasalen Lymphozyten.

In Übereinstimmung mit dem Ausbleiben einer nachweisbaren Wirkung auf die untersuchten Biomarker wurde keine übereinstimmende Wirkung auf irgendeinen der hämatologischen oder Blutchemie-Parameter beobachtet, die im Laufe der Mundschleimhaut-IFN-Therapie überwacht wurden, auch nicht in Tieren, die mit bis zu 20.000 IE an IFN-&agr; behandelt worden waren.

Die Resultate der Studie zur Pharmakokinetik und Bioaktivität zeigen sehr eindeutig, dass eine statistisch signifikante, antivirale Wirkung nach der Verabreichung einer einzelnen Dosis an radioaktiv markiertem Hu IFN-&agr; 1–8 über die Mundschleimhaut unter Bedingungen, unter denen kein zirkulierendes IFN im peripheren Blut nachgewiesen werden kann, unter Verwendung von Detektionsverfahren, die um eine Größenordnung empfindlicher als jene davor verwendeten sind, erzielt werden kann. In Übereinstimmung mit diesen Resultaten schien das Ausmaß der antiviralen Wirkung, die vom über die Mundschleimhaut verabreichten IFN ausgeübt wurde, einem klassischen Dosis-Antwort-Verhältnis zu entsprechen.

Leicht detektierbare Konzentrationen an radioaktiv markiertem Material wurden sowohl in Vollblut als auch in Serum von Tieren nach Verabreichung über die Mundschleimhaut von 125I-markiertem IFN-&agr; 1–8 gefunden. Diese Resultate stehen im Gegensatz zu den Resultaten aus früheren Studien, die kein IFN im Serum von Tieren detektieren konnten, sogar nach der oralen Verabreichung von großen Mengen an unmarkiertem IFN nicht. Das radioaktive Material, das sowohl in Vollblut als auch in Serum nach Verabreichung über die Mundschleimhaut detektiert wurde, war jedoch biologisch inaktiv. Darüber hinaus zeigten die Resultate der SDS-PAGE-Analyse, dass dieses Material ein geringes Molekulargewicht aufwies, und spiegelten wahrscheinlich die Absorption von Abbauprodukten nach dem Verdau von IFN im Magen und im Dünndarm wider. Eine Analyse der Gewebeverteilung von radioaktiv markiertem Material nach der Verabreichung über die Mundschleimhaut zeigte deutlich höhere Konzentrationen an Radioaktivität im Magen als in irgendeinem der anderen getesteten Organe. Die Resultate der Erfinder zeigen eindeutig, dass, obwohl biologisch aktives IFN nach Verabreichung über die Mundschleimhaut nicht absorbiert wurde, diese Behandlung nichtsdestoweniger eine statistisch signifikante Antitumor- und Antivirus-Aktivität in vivo ausübt.

Ohne hier eine Einschränkung auf irgendeinen vorgeschlagenen Mechanismus für die beobachtete positive Wirkung zu beabsichtigen, lassen die Resultate der Erfinder darauf schließen, dass über die Mundschleimhaut verabreichtes IFN seine Wirkungen gegen Tumorzellen oder gegen Viren über einen zur Zeit nicht definierten, neuen Mechanismus ausübt, der keine direkte Wirkung von exogen verabreichtem IFN oder die Einführung von endogenem IFN einbindet. Diese Annahme untermauert das Fehlen von nachweisbaren Konzentrationen an IFN oder den drei getesteten Biomarkern im Blutkreislauf. Es scheint, dass dieser Mechanismus zumindest teilweise durch Stimulation des reichlich vorhandenen Lymphgewebes, das den nasopharyngealen und oralen Hohlraum umgibt, funktionieren kann. Da die Erfinder zeigten, dass über die Mundschleimhaut verabreichtes IFN in seiner Wirksamkeit mit systemisch verabreichtem IFN zumindest vergleichbar ist, liefern ihre Resultate eine starke Grundlage für die Verabreichung von IFN über die Mundschleimhaut im Rahmen der Behandlung von Krebs. Dies könnte für die klinische Verwendung von IFN wichtige Auswirkungen haben.


Anspruch[de]
Verwendung von Interferon zur Herstellung eines Medikaments für Kontakt über die Mundschleimhaut, um Wirts-Abwehrmechanismen oder eine Immunantwort bei einem Menschen mit einem Krebsleiden zu stimulieren, sodass das Leiden behandelt wird, worin das Medikament eine stimulierende Menge an Interferon umfasst, worin diese Menge größer als 20 × 106 IE Interferon ist und eine pathologische Reaktion induziert, wenn sie parenteral verabreicht wird, worin das Medikament eine einzelne wirksame, nicht-toxische Dosis des Interferons umfasst oder das Medikament mehrere kleinere Dosen des Interferons umfasst, die ausreichen, um eine Abwehr- oder Immunantwortstimulation beim Wirt hervorzurufen, die jener einer einzelnen Dosis entspricht. Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das Medikament für kontinuierliche Verabreichung einer Wirts-Abwehr- oder -Immunantwort-stimulierenden, nichttoxischen Dosis über eine ausreichende Zeitspanne hinweg sorgt, um Abwehrmechanismen- oder Immunantwortstimulation beim Wirt hervorzurufen, die jener einer einzelnen Dosis entspricht. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, worin das Medikament ein Interferon und einen Interferon-Induktor umfasst. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Medikament 20 × 106 IE bis etwa 1.000 × 106 IE Interferon in Einheitsdosierungsform umfasst. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Medikament ein weiteres Therapeutikum zur gleichzeitigen, getrennten oder darauffolgenden Therapie umfasst. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Therapeutikum aus der aus zytostatischen, Antikrebs-, antiangiogenen und antiviralen Mitteln bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Interferon ein Interferon vom Typ I ist. Verwendung nach Anspruch 7, worin das Interferon aus der aus IFN-&agr;, IFN-&bgr;, IFN-&ohgr;, Consensus-IFN und Gemischen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Verwendung nach Anspruch 8, worin das Interferon vom Typ I IFN-&agr; ist. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Interferon ein Interferon vom Typ II ist. Verwendung nach Anspruch 10, worin das Interferon vom Typ II IFN-&ggr; ist. Verwendung nach Anspruch 7 oder 10, worin das Interferon rekombinantes Material ist.






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