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PURIFIKATION VON VIRUSPRÄPARATEN - Dokument DE69929612T2
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69929612T2 02.11.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001062325
Titel PURIFIKATION VON VIRUSPRÄPARATEN
Anmelder Cantab Pharmaceuticals Research Ltd., Cambridge, GB
Erfinder JOHNSTON, Denis, Michael, Cambridge CB4 4NY, GB;
O'KEEFFE, Simon, Roderic, Saffron Walden Essex CB11 4DN, GB;
SLATER, Kenneth, Nigel, Sutton Coldfield West Midlands B72 1LE, GB
Vertreter LEINWEBER & ZIMMERMANN, 80331 München
DE-Aktenzeichen 69929612
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 05.03.1999
EP-Aktenzeichen 999379415
WO-Anmeldetag 05.03.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/GB99/00669
WO-Veröffentlichungsnummer 1999045104
WO-Veröffentlichungsdatum 10.09.1999
EP-Offenlegungsdatum 27.12.2000
EP date of grant 25.01.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 02.11.2006
IPC-Hauptklasse C12N 7/02(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC additional class A61K 39/245  (2006.01)  A,  L,  N,  20051017,  B,  H,  EP

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Herstellung und Reinigung von Viren und die Ernte und Reinigung von Viruspräparaten aus virusinfizierten Zellkulturen, beispielsweise für experimentelle und therapeutische Zwecke, z.B. zur Herstellung pharmazeutischer Formulierungen wie etwa Virusvakzinen. In speziellen Aspekten betrifft die Erfindung Verfahren und Anordnungen für die Herstellung von Präparaten aus Herpesviren. Andere Aspekte der Erfindung werden aus der nachstehenden Beschreibung ersichtlich.

Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik

Mehrere Verfahren sind zur Herstellung von Lebendviruspräparaten, z.B. Herpesvirus-Präparaten, als Vakzinen und zu anderen Zwecken bekannt.

Die US 3.985.615 (Osaka Res Foundation: T. Kubo et al.) beschreibt beispielsweise die Herstellung von Lebend-Varizellavirus zur Verwendung als Vakzine durch Kultivierung, die das Überimpfen in Meerschweinchen-Primärembryonalgewebezellen umfasst. Die US 5.024.836 (Merck: WJ McAleer et al.) betrifft die Herstellung von darauf basierenden lyophilisierten Vakzinenpräparaten.

Die DD-209.738 (Cent Cerc Bioprep: IV Patrascu) veranschaulicht die Herstellung eines anderen Herpesvirus-Typs zur Verwendung als Vakzine gegen die Marek'sche Krankheit, der durch (a) Kultivieren spezifischer, pathogenfreier Hühnerembryonalzellen auf Dextranmikroperlen; (b) Inokulieren von Puten-Herpesvirusstamm FC-126 (Klon 1, IIIb) in die Kultur bei 80 % Konfluenz; (c) Sammeln der infizierten Zellen in SPGA-Medium (Saccharose, Phosphat, Glutamat, Rinderalbuminfraktion V), wenn die zytopathische Wirkung 80 % beträgt; (d) Aussetzen der Suspension gegenüber drei Ultraschallimpulsen von 1-minütiger Dauer in 2-Minuten-Intervallen und Zentrifugieren der Suspension, um eine erste Ausbeute an Vakzine zu erhalten; (e) Resuspendieren des Sediments in SPGA-Medium und Wiederholen von Schritt (d), um eine zweite Ausbeute an Vakzine zu erhalten (um die Vakzinenausbeute um beinahe 20 % zu erhöhen); (f) Einfrieren der kombinierten Vakzinen bei –100 °C vor der Bestimmung des Virustiters; und (g) Verdünnen mit SPGA-Medium und Gefriertrocknen hergestellt wird.

Die JP06234659-A (ZH Handai Biseibutsubyo Kenkyukai) beschreibt in einem Beispiel die Herstellung von Herpesvirusvakzine an menschlichen diploiden Fibroblasten-MRC-5-Zellen, kultiviert in MEM-Medium bei 37 °C; umfassend die Inokulation von Varicellavirus-Oka-Stamm-Impfgut-Virus mit einer MOI von 0,03 in MRC-5-Zellen und das Kultivieren bei 37 °C, 2 Tage lang. Das Virus wird dann in einer Lösung suspendiert, die 6,4 g NaCl, 0,16 g KCl, 2,3 g Na2HPO4, 12H2O, 0,16 g KH2PO4, 50,0 g Saccharose, 1,0 g Na-L-Glutamat, 2,0 g Gelatine, 25,0 g Gelatine-Hydrolysat und 0,1 g EDA-3Na pro Liter enthält.

Die EP 0.573.107, die US 5.360.736 und die US 5.607.852 (Merck: PA Friedman et al.) beschreiben Verfahren zur Herstellung von Varizella-Zoster-Virus-Lebendvakzinen, einschließlich eines Verfahrens zur Herstellung einer abgeschwächten, zellfreien Varicella-Zoster-Virus- (VZV-) Lebendvakzine, das die folgenden Schritte umfasst: (a) das Kultivieren von VZV-Infektions-anfälligen Zellen, ausgewählt aus menschlichen diploiden Zellen, bis zur Konfluenz in Monolayer-Kultur unter Bedingungen ausreichend hoher Nährstoffkonzentration, um einen hohen Grad an Zellreplikation zu erzielen, und unter Zufuhr eines nicht metabolisierbaren Disaccharids; (b) das Infizieren der gemäß Schritt (a) kultivierten Zellen möglichst nahe dem Konfluenzpunkt mit einer praktisch durchführbaren Infektionsmultiplizität von VZV-infizierten Zellen; (c) das Halten der VZV-infizierten Kultur in einem Zustand hoher Ernährung über einen Zeitraum von etwa 22-96 h hinweg und das Ernten zum Zeitpunkt des Maxumums der infektiösen VZV-Produktion; (d) das Waschen der VZV-infizierten Kultur mit einer physiologischen Lösung, die gegebenenfalls ein lysosomotropes Mittel wie Ammoniumchlorid oder Chloroquin enthält, vor dem Ernten der VZV-infizierten Zellen; (e) das Ernten der VZV-infizierten Zellen in ein Mindestvolumen einer stabilisierenden Lösung und entweder den Aufschluss der Zellen unmittelbar danach oder das Einfrieren der Zellen für späteren Zellaufschluss; (f) den Aufschluss der VZV-infizierten Zellen, um gegebenenfalls zellassoziiertes VZV freizusetzen, und das Entfernen von Zelltrümmern, um ein zellfreies VZV-Präparat bereitzustellen. Das Verfahren offenbart die Verwendung von Zelldichten bis zu etwa 500.000 Zellen/cm2 in herkömmlichen Kulturgefäßen. Das Verfahren wird für die Massenproduktion von Lebendvakzinen vorgeschlagen. Geeignetes Nährmedium zum Züchten von Zellen in Monolayer-Kultur in dieser Verbindung wird als eines beschrieben, das im Wesentlichen aus SFRE-2-Medium, ergänzt mit zwischen 0,2 mg/ml und 0,4 mg/ml Sojabohnenflüssigkeit, besteht, wobei die Zellen aus MRC-5-Zellen, WI-38-Zellen und Vero-Zellen ausgewählt werden.

Die WO 92/05263 (Immunology Ltd: SC Inglis et al.) und die WO 94/21807 (Cantab Pharmaceuticals Research: Inglis et al.) sind Beispiele für die Bereitstellung von rekombinanten Zellen und Kulturverfahren zur Herstellung von genetisch deaktiviertem Herpesvirus wie Herpes-Simplex-Virus zur Verwendung als Vakzine.

Es ist bekannt, dass sich Herpes-Simplex-Virus an Zelloberflächen-Heparansulfat binden kann (E. Lycke et al., J. Gen Virol 72, 1131–1137 (1991)).

Für Viren wurde darüber hinaus gezeigt, dass sie sich an sulfonierte Polysaccharide wie Dextransulfat, Heparin- und Heparansulfat binden (M. Baba et al., PNAS 85, 6132–6136 (1988); E. Lycke et al., s.o.; und H. Mitsuya et al., Science 240, 646–649 (1988)). Auch ist bekannt, dass sie Affinitätsbindung und Reinigung von Katzen-Herpesvirus an einem sulfonierten Derivat von perlenförmiger, regenerierter Cellulose mit einer Teilchengröße von 80 &mgr;m und einer Porenstruktur, von der angenommen wird, dass sie Viruspartikel abweist, durchführen (P.F. O'Neil und E.S. Balkovic, Bio-Technology 11(2), 173–178 (1993)).

Es bleibt wünschenswert, Verfahren zur Behandlung von Herpesvirus-hältigen Präparaten bereitzustellen, insbesondere weitere Reinigungsverfahren, die in der Lage sind, zur Herstellung infektiöser Viruspräparate mit guter Ausbeute und Reinheit, z.B. jene, die in Vakzinen einzusetzen sind, beizutragen.

ZUSAMMENFASSUNG UND BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Gemäß einem Aspekt der Erfindung können Herpesvirus-Präparate auf nützliche Weise durch Affinitätsreinigung an einer Festphase (Affinitätsbindungsreagens), die Materialien mit Affinität zu Heparin kompetitiv binden kann, gereinigt werden. Die Erfindung ist beispielsweise besonders gut an infektiösen Präparaten menschlicher Herpesviren wie Herpes-Simplex-Virus (HSV), z.B. HSV vom Typ 2, das beim Züchten in Kultur stark dazu neigen kann, zellassoziiert zu bleiben, anwendbar. Das das Virus tragende Affinitätsreagens, das aus einer Trägerflüssigkeit aufgebracht werden kann, die Salz (z.B. Natriumchlorid oder ein anderes, pharmazeutisch annehmbares Salz über etwa 0,4 M) enthält oder Heparin oder ein anderes, sulfatiertes oder sulfoniertes Polysaccharid (z.B. im Bereich von etwa 10–250, wie beispielsweise 50, &mgr;g/ml) enthält, kann dann in geeigneter Weise gewaschen werden, und das Virus kann in aktiv infektiöser Form durch Elution, z.B. mit hochkonzentrierter Salzlösung oder mit sulfatiertem oder sulfoniertem Polysaccharid, gewonnen werden.

Beispiele für zur Verwendung in diesem Zusammenhang geeignete Festphasen umfassen eine Heparin-tragende Festphase und Festphasen mit ähnlicher Bindungsfunktionalität, z.B. vorzugsweise mit einer sulfatierten (oder sulfonierten) Polysaccharid-Bindungsfunktionalität. Geeignete Affinitätsbindungsreagenzien können Bindungsgruppen tragen, die Sulfat oder Sulfonat zusammen mit nichtionischen polaren Gruppen enthalten. Die sulfatierten Polysaccharide enthalten beispielsweise Sulfatgruppen und Hydroxygruppen. Beispiele für Festphasen, die sulfatiertes Polysaccharid tragen, umfassen Dextransulfat oder Heparinsulfat. Vorzugsweise können die sulfatierten oder sulfonierten Gruppen an Seitenketten, z.B. Polymerseitenketten, in Bezug auf das Material der Festphase getragen werden und können somit auch andere Gruppen als Harze und vernetzte Polymerperlen sein, die direkt mit solchen sauren Gruppen derivatisiert wurden. Festphasen, die andere sulfathältige oder sulfonathältige Bindungsreagenzien als jene, die bereits erwähnt wurden, tragen, wie z.B. Disulfon- und Harnstoff-Copolymere oder Protaminsulfat, können verwendet werden.

In einem weiteren Aspekt der Erfindung umfasst ein bevorzugtes Mittel zur Freisetzung von Herpesvirus aus Zellkulturen von virusinfizierten Zellen, z.B. Vero-Zellen, Dextransulfat. Ein Beispiel für ein Dextransulfat-Präparat, das zur Verwendung in dieser Erfindung geeignet ist, weist beispielsweise ein Molekulargewicht von etwa 5.000 auf, wobei jedoch zahlreiche verschiedene Präparate ausgewählt werden können.

Ein Beispiel für eine geeignete Form von Heparin-tragender Festphase für den Affinitätsreinigungsschritt umfasst Pharmacia Heparin HP-Säulenchromatographiematerial (basierend auf hochvernetztem Agarosegel) (z.B. mit einem Durchmesser von etwa 34 &mgr;m), das bei Pharmacia Biotech in Form von HiTrapTM- vorbereiteten Säulen erhältlich ist. Zahlreiche andere Festphasenpräparate, die von Heparin oder Heparinsulfat abgeleitet sind, können auch als geeignet in Betracht gezogen werden.

Ein weiteres und zur Zeit bevorzugtes Beispiel für ein Affinitätsbindungsreagens zur Verwendung in der Erfindung trägt Polyacrylamidseitenketten, die mit Sulfoisobutylgruppen substituiert sind, und umfasst z.B. Gruppierungen wie -CO-NH-C(CH3)2-CH2SO3-. Ein geeignetes und bevorzugtes Beispiel für solch ein Affinitätsreagens ist beispielsweise im Handel bei Merck (Darmstadt, Deutschland) unter der Namen FractogelTM EMD SO3 650 (M) erhältlich und basiert auf Polyacrylamidperlen, die derivatisiert wurden, um, daran kovalent gebunden, Polyacrylamidseitenketten bereitzustellen, in denen zahlreiche der Amidgruppen durch Sulphoisobutylgruppen substituiert sind. Ein weiteres Beispiel für ein nützliches Affinitätsbindungsreagens ist ein Präparat aus Sephacryl- (TM: Pharmacia) Perlen mit Dextransulfatgruppen von etwa 10^6 MG, tentakelförmig daran angebunden, d.h. dass die Gruppen daran kovalent gebunden sind und von der Oberfläche der Perlen vorstehen.

Somit können Herpesvirus-Präparate durch Affinitätsreinigung an einer Heparin-tragenden Festphase oder einer Festphase, die eine Sulfat oder Sulfonat umfassende Bindungsgruppe trägt, vorzugsweise mit einer sulfatierten Polysaccharid-Bindungsfunktionalität, d.h. eine Festphase, die Materialien mit Affinität für Heparin kompetitiv binden kann, auf nützliche Weise gereinigt werden. Beispiele für solche Festphasen sind jene, die Polysaccharid, z.B. Dextransulfat oder Heparan- (Heparin-) Sulfat, tragen. Alternativ dazu können Festphasen, die andere sulfathältige Bindungsmittel wie Biphenyldisulfonsäure-Harnstoff-Copolymere oder Protaminsulfat tragen, verwendet werden.

Die Affinitätsreinigung kann beispielsweise unter Verwendung eines Kochsalzlösungsgradienten-Eluenten, z.B. von 0,1 M bis 1,5 M gepufferter NaCl, durchgeführt werden. Alternativ dazu kann das Virusmaterial in relativ hohen Salzkonzentrationen, z.B. etwa 0,8 M, oder in Gegenwart von Heparin oder Dextransulfat verwendet werden, und das Verfahren kann einen Waschschritt bei etwa 0,7 M NaCl umfassen, gefolgt von einem Elutionsschritt bei etwa 1,5 M NaCl. Häufig ist es nicht erforderlich, ein salzreiches Viruspräparat vor dem Auftragen auf die Heparinsäule zu dialysieren. Die exakten Salzkonzentrationen selbst sind oft nicht maßgeblich und können entsprechend den Details der anderen Reagenzien und Bedingungen leicht eingestellt und optimiert werden.

Die Affinitätsreinigung kann typischerweise an einem Viruspräparat durchgeführt werden, das aus einer Kultur von geeignet infizierten Wirtszellen wie Vero-Zellen gewonnen wurde. Das anfängliche Ernten der Viren aus der Kultur erfolgt ohne nennenswerten Zellbruch unter Verwendung von Elution durch Heparin- oder Dextransulfat oder einem entsprechenden Mittel oder unter Verwendung von Elution mit Kochsalzlösung.

Es kann praktisch sein, solch ein anfänglich geerntetes Viruspräparat durch ein Membranfilter zu filtrieren, z.B. durch ein etwa 5-&mgr;m-Membranfilter oder feiner, um vor der Affinitätsreinigung eine geklärte Virussuspension zu erhalten.

Unter Anwendung von Beispielen der Erfindung, z.B. wie nachstehend beschrieben, ist es möglich, Virusfraktionen zu bilden, die nützlich reduzierte-Konzentrationen von DNA und Protein in Bezug auf den Virustiter enthalten.

Das Virusprodukt der Affinitätsreinigung kann, sofern erwünscht, jeglichen weiteren ausgewählten Reinigungsschritten unterzogen werden. Besonders nützlich kann es sein, um einen Filtersterilisierungsschritt, z.B. mit einem Feinporenfilter in der Größenordnung von etwa 0,22 &mgr;m Porengröße, einzubinden.

In zur Zeit bevorzugten Beispielen der vorliegenden Erfindung kann Affinitätsreinigung am Produkt einer Zellkultur, die mit einem Herpesvirus infiziert ist, nach vorangehender Behandlung der Kultur durch eine Ernte-Inkubation mit einem Polysaccharidsulfat, z.B. mit Dextransulfat oder Heparinsulfatlösung, um eine Virussuspension zu erhalten, durchgeführt werden. Die Polysaccharidsulfatlösung kann mit der Zellkultur, z.B. bei einer Konzentration in der Größenordnung von etwa 50 &mgr;g/ml für Heparinsulfat oder etwa 100 &mgr;g/ml für Dextransulfat, z.B. in pH7-Citratpuffer, über eine Kontaktzeitspanne von etwa drei Stunden hinweg kontaktiert werden, um eine Flüssigkeit zu erlangen, die einen nützlichen Virusgehalt und einen im Vergleich zum Produkt aus dem Ultraschallaufschluss (z.B.) sehr stark reduzierten Gehalt an Zellen oder Zelltrümmern enthält. Dieses Verfahren kann beispielsweise besonders gut einsetzbar sein, um eine verbesserte Ausbeute an Virus für die Herstellung von Lebendvirusvakzinen zu erhalten.

Alternativ dazu, jedoch nach dem aktuellen Stand weniger bevorzugt, kann hypertonische wässrige Salzlösung in dieser Phase verwendet werden, z.B. Natriumchlorid, Natriumsulfat, Kaliumchlorid und dergleichen. Vorzugsweise kann solch eine Salzlösung Natriumchlorid bei einer Konzentration von beispielsweise etwa 0,8 bis 0,9 M oder darüber umfassen. Wird Natriumsulfat verwendet, so kann die Konzentration vorzugsweise etwa 0,4 M oder mehr betragen. Andere Salze können, sofern erwünscht, bei einer ähnlichen Osmolarität oder Ionenstärke wie im Fall der oben genannten Konzentrationen verwendet werden. Das Virus kann häufig einer Salzkonzentration von 1 M oder 2 M standhalten, doch in jedem Fall wird bevorzugt, nicht weit über die angegebene Konzentration hinaus zu gehen, sodass überschüssiges zelluläres Protein in der Kochsalzlösung vermieden wird. Puffer und andere Bestandteile können in geeigneter Weise gemäß der normalen Praxis im Umgang mit den betroffenen Viren ausgewählt werden.

Die Ernte-Inkubation kann unter leichtem Rühren durchgeführt werden und erfolgt in solcher Weise, dass kein oder nur minimaler Zellaufschluss eingebunden ist. Die mittels Ernte-Inkubation zu behandelnde Kultur kann beispielsweise eine Monolayer-Kultur oder eine Mikroträgerkultur oder eine Rollflaschenkultur sein.

Das Ernte-Polysaccharidsulfat, z.B. Dextransulfat, oder die Salzlösung, kann gepuffert und bei einem pH und einer Temperatur gehalten werden, die als solche für die Kultur der virusinfizierten Zellen geeignet sind, z.B. bei einem pH von etwa 7 mit Citratpuffer und vorteilhafterweise bei einer Temperatur von etwa 34 °C für Herpesvirus wie z.B. Herpes-Simplex-Virus.

Die Kontaktdauer zwischen den kultivierten Zellen und der Ernteflüssigkeit ist nicht besonders maßgeblich und kann beispielsweise im Bereich von etwa 2–24 h liegen. In Verbindung mit bestimmten Beispielen wurde erkannt, dass beispielsweise etwa 4 Stunden Kontaktdauer zu bevorzugen ist, da dies eine gute Ausbeute mit annehmbar niedrigen Konzentrationen von zellulärem Protein liefern kann.

Nach dem Kontakt zwischen den kultivierten infizierten Zellen und der Ernteflüssigkeit kann die Flüssigkeit, die die geernteten Viruspartikel enthält, durch Dekantieren oder jedes andere geeignete Verfahren abgetrennt werden: Die kultivierten Zellen selbst können an die Oberfläche, auf der sie kultiviert wurden, gebunden bleiben und können nach der Abtrennung der Ernteflüssigkeit verworfen werden.

Die Ernteflüssigkeit kann anschließend, sofern erwünscht, durch Filtration und/oder Zentrifugation behandelt werden, um übrige Zellen zu entfernen.

Sollte es erwünscht sein, das Medium, in dem das geerntete Viruspräparat enthalten wurde, zu wechseln, so kann dies durch Verdünnung oder Diafiltration, z.B. auf etwa isotonische Konzentration, z.B. auf etwa 138 mM in gepuffertem Natriumchlorid, erfolgen.

Gemäß einem weiteren Merkmal, das in einem Verfahren gemäß der Erfindung angewandt werden kann, kann das auf diese Weise geerntete Viruspräparat mit Nucleaseenzym entweder vor (oder weniger bevorzugt nach) der Affinitätsreinigung behandelt werden, um jeglichen Gehalt an kontaminierender Nucleinsäure auf ein annehmbares Niveau zu reduzieren.

Die virushältige Flüssigkeit kann beispielsweise mit BenzonaseTM-Nucleaseenzym behandelt werden, um freie Nucleinsäuren (vor allem DNA, und üblicherweise auch RNA) auf bis zu etwa 50 Einheiten/ml in Gegenwart von etwa 2–10 mM Magnesiumionen, jeweils etwa 1 h lang bei etwa 4 °C bis Raumtemperatur h, abzubauen.

Die Konzentration an Nucleaseenzym und anderen Proteinen kann dann beispielsweise entweder durch den hierin beschriebenen Affinitätsreinigungsschritt oder auf andere Weise, z.B. durch Diafiltration gegen einen geeigneten Formulierungspuffer durch eine Membran mit einer Ausschlussgrenze von 500 kD, verringert werden.

Nach solchen Behandlungen kann das geerntete Virus in eine erwünschte Trägerflüssigkeit transferiert und eingefroren, gefriergetrocknet/lyophilisiert oder auf beliebige andere geeignete Weise stabilisiert werden. Im Allgemeinen kann das Herpesvirus zur Verwendung als Vakzine mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Arzneimittelträger formuliert und gegebenenfalls sterilisiert und eingefroren oder gefriergetrocknet, z.B. bei etwa –80 °C eingefroren, werden. Somit kann die Erfindung zur Herstellung stabilisierter Vakzinen, die infektiöses Herpesvirus, wie z.B. menschliches Herpes-Simplex-Virus, z.B. HSV vom Typ 2, z.B. in Form einer genetisch deaktivierten Mutante eines solchen Virus, enthält, verwendet werden.

Verfahren gemäß den Beispielen der Erfindung können einen besonderen Vorteil in Verbindung mit stark zellassoziierten Viren bieten, d.h. mit jenen Viren, die einen besonders hohen Grad an Zellassoziation in Kultur aufweisen, beispielsweise Herpes-Simplex-Virus vom Typ 2 (HSV-2), Rinderherpesvirus (BHV), Putenherpesvirus und Varicella-Zoster-Virus (VZV), manchmal auch Pseudorabies-Virus.

Die Erfindung kann unter Durchführung jeglicher geeigneter Detailanpassungen, wie dies für Fachleute ersichtlich ist, für Herpesviren verschiedener Typen angewandt werden, einschließlich beispielsweise Wildtyp-Herpes-Simplex-Virus und genetisch deaktivierter Herpesviren wie Herpes-Simplex-Virus und beispielsweise auch anderer Herpesviren, wie sie in den hierin zitierten Dokumenten angeführt werden.

Die durch die Anwendung von hierin beschriebenen Verarbeitungsschritten erhaltenen Viruspräparate können weiter verarbeitet und beispielsweise zusammen mit an sich bekannten Bestandteilen von Virusvakzinen Teile von pharmazeutischen Zusammensetzungen sein.

Die Erfindung wird anhand des folgenden Beispiels näher beschrieben und veranschaulicht.

BEISPIEL:

Ein Verfahren gemäß einem Beispiel der Erfindung zum Ernten und Reinigen von Viruspartikeln kann eine Kultur von Vero-Zellen verwenden, die mit HSV-2 (z.B. einer gH-deletierten Mutante von HSV2, wie in der WO 94/21807 für zur Verwendung als Vakzine beschrieben) infiziert sind und im Wesentlichen auf bekannte Weise in herkömmlichem Kulturmedium, das in Rollflaschen mit etwa 100 ml Medium pro Flasche enthalten ist, gezüchtet wurden. Das Kulturmedium, der Zelltyp und die Kulturbedingungen können beispielsweise wie folgt festgelegt sein:

Die Vero-Zellen können mit 2 × 107 Zellen pro Rollflasche überimpft werden. Die Kultivieung kann unter Verwendung von DMEM-Medium mit 4,5 g/l Glucose ohne Natriumpyruvat und mit Glutamax-1TM (L-Alanyl-L-glutamin), 862 mg/l, erfolgen. Inkubation kann beispielsweise bei etwa 37 °C und etwa 120 h lang (5 Tage lang) durchgeführt werden. Konfluente Zellkulturen können dann mit HSV-2 mit einer Infektionsmultiplizität von etwa 0,01 durch Verdünnen des Virus in DMEM auf eine Konzentration, von der 1 ml zu jeder Rollflasche zugesetzt wird, infiziert werden, wobei die Flasche anschließend in die Roll-Inkubationsvorrichtung bei etwa 34–37 °C zurückgegeben wird. Wird eine zytopathische Wirkung von 80 bis 100 % beobachtet, z.B. 65–72 h nach Infektion, so können die Rollflaschen als für die Virusernte bereit angesehen und behandelt werden.

Das Kulturmedium kann aus jeder Flasche dekantiert und durch 10 ml pro Flasche einer gepufferten Erntelösung, die 0,01 M Natriumcitrat, pH 7,0, und entweder etwa 50 &mgr;g/ml Heparinsulfat oder etwa 100 &mgr;g/ml Dextransulfat enthält, ersetzt werden. Die Zellen in der Rollflasche in Kontakt mit dieser gepufferten Erntelösung können gerollt und bei etwa 34 °C etwa 4 h lang inkubiert werden.

Die kultivierten Zellen selbst in der Rollflasche können im Grunde an der Flaschenoberfläche gebunden bleiben und können nach Abtrennen der Flüssigkeit, die die geernteten Viruspartikel enthält, verworfen werden.

Die Flüssigkeit in der Flasche, die die gepufferte Erntelösung und Material aus der Zellkultur in Suspension einschließlich des Virus umfasst, kann mittels einer Pipette entfernt und bei etwa 3.000 U/min in einer Sorvall-RT6000TM-Zentrifuge etwa 10 min lang (z.B. bei RCFmax von etwa 1876) zentrifugiert werden. Die Zellen im Pellet und jene, die in der Flasche zurückbleiben, werden (unter geeigneten Virus-Sicherheitsbedingungen) verworfen, und der Überstand wird durch die Pipette zur nächsten Stufe übertragen, die kontinuierliche Durchflusszentrifugation sein kann.

Vorfiltrieren kann z.B. mit einem Filter durchgeführt werden, das eine Porengröße im Bereich von 0,8–5 &eegr;m (nicht maßgeblich) aufweist, um vor der Affinitätsreinigung eine geklärte Virussuspension zu ergeben. Die Überstandsflüssigkeit vom Zentrifugieren kann auf eine Endkonzentration (in Bezug auf Natriumionen) von 138 mM verdünnt oder diafiltriert werden.

(In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann, sofern erwünscht, die verdünnte Flüssigkeit gegebenenfalls mit BenzonaseTM-Nucleaseenzym behandelt werden, um freie Nucleinsäuren (das zur Zeit sehr stark bevorzugte Enzym weist DNase-Aktivität auf und wird üblicherweise auch, wie BenzonaseTM, RNase-Aktivität aufweisen) auf bis zu etwa 50 Einheiten/ml in Gegenwart von etwa 2–10 mM Magnesiumionen, z. B. bis zu etwa 1 h lang bei einer Temperatur von etwa 4 °C bis zu Raumtemperatur, abzubauen. Es kommt jedoch auch häufig vor, dass der Affinitätsreinigungsschritt den Gehalt von DNA im Material ausreichend reduziert, sodass ein separater DNase-Behandlungsschritt nicht mehr erforderlich ist. Darüber hinaus ist, wenn Benzonase oder ein ähnliches Enzym verwendet wird, in Bezug auf die Affinität des Enzyms für Heparin und Heparinsäulen und ähnliche Materialien gewisse Vorsicht angebracht, und es ist in solch einem Fall wünschenswert, die Bedingungen so festzulegen, dass das endgültige Viruseluat aus der Affinitätssäule im Wesentlichen frei von Benzonase-Enzym ist.)

Die virushältige Flüssigkeit als Zwischenprodukt kann an Pharmacia Heparin HP-Säulenchromatographiematerial (basierend auf hochvernetztem Agarosegel; z.B. mit einem Durchmesser von etwa 34 &mgr;m), das bei Pharmacia Biotech in Form von fertigen HiTrapTM-Säulen erhältlich ist, gereinigt werden. Die Zufuhrrate für das Virus kann beispielsweise pro 5 ml Säulenmaterial etwa 300 ml mit einer Viruskonzentration von etwa 8 × 106 pfu/ml, zugeführt mit einer Durchflussgeschwindigkeit von etwa 1,3 ml/min, betragen. Unter Verwendung dieser Form von Säule in einem Beispiel für diesen Reinigungsschritt mit einem Kochsalzlösungsgradienten, der bei etwa 138 mM NaCl beginnt und bis zu 1,5 M NaCl z.B. über etwa 10 Säulenvolumina ansteigt, trat viraler Durchbruch im Eluat nach etwa 230 min Durchfluss auf, einem Zeitpunkt, zu dem 3,5 × 109 pfu die Säule bereits passiert hatten und etwa 1,2 × 108 pfu im Eluat aufgetreten waren. Es wird angenommen, dass theoretisch bis zu etwa 103 pfu/ml, und praktisch bis zu etwa 1–2 × 109 pfu/ml, Virus an diesem Adsorptionssäulenmaterial untergebracht werden können. Alternativ dazu kann das Affinitätsreagens Perlen von FractogelTM EMD SO3 650 M von Merck (Darmstadt) wie zuvor beschrieben sein, verwendet in im Allgemeinen gleicher Weise, z.B. kann das Virus in einer Trägerflüssigkeit, die z.B. etwa 0,8 M Natriumchlorid oder 50 &mgr;g/ml Heparin enthält, eingesetzt und nach dem Waschen mit einem Eluenten, der 1,5 M Natriumchlorid enthält, eluiert werden.

In einem weiteren Beispiel von diesem Schritt wurde ein HSV-2-Viruspräparat, das aus Vero-Zellkultur in Heparin (MonoporinTM injizierbares Heparin mit pharmazeutischer Reinheit, niedermolekular, 50 &mgr;g/ml in Phosphat pH 7, 10 mM und NaCl, 138 mM) freigesetzt wurde, bei etwa 3.000 U/min (c.1000 g) 10 min lang zentrifugiert und anschließend durch ein 5-&mgr;m-Filter filtriert. Eine Heparinsäule wie bereits erwähnt wurde durch Waschen mit 5 Säulenvolumina von phosphatgepufferter Kochsalzlösung hergestellt. Etwa 100 ml Virusfiltrat (etwa 7.107 pfu/ml) wurden auf die Säule geladen. Nach Waschen mit 5–10 Säulenvolumina an gepufferter 0,7 M Kochsalzlösung wurde das Virus Fraktion für Fraktion mit gepufferter 1,5 M Kochsalzlösung eluiert, und die Fraktionen, die den bei Absorption bei 280 nm auftretenden Peak enthielten, wurden gesammelt. Das resultierende Produkt wies (pro 107 pfu Virus) weniger als 2 ng DNA und weniger als 1 &mgr;g Protein auf und wurde mit einer Konzentration von etwa 2 × 109 pfu/ml gesammelt. Es konnte auf isotonische Konzentration bei etwa 108 pfu/ml verdünnt und eingefroren oder auf andere Weise gelagert oder verwendet werden.

Es zeigt sich, dass eine gute Wiederfindung des Virus aus der Säule erzielt werden kann.

In bestimmten (zur Zeit weniger bevorzugten) Zusammenhängen der Verwendung kann als ein optionaler weiterer Reinigungsschritt, sofern erwünscht, die virushältige Lösung als Zwischenprodukt tangentialer Kreuzstromfiltration (Diafiltration), z.B. unter Verwendung eines Filters/einer Membran mit einer Ausschlussgrenze von 500 kD in einem FiltronTM oder einer anderen tangentialen Kreuzstromvorrichtung unter Verwendung einer Umlaufrate von 1.000 ml/min, einer Filtrationsrate von 100 ml/min und einer Rückspülung von 100 ml Natriumcitrat, 0,01 M, pH 7,25, das 138 mM Natriumchlorid enthielt, unterzogen werden.

Der Filterrückstand aus dem Kreuzstrom-Ultrafiltrationsschritt kann gegebenenfalls, sofern erwünscht, durch Diafiltration gegen 5–10 Volumina von Citrat-/Kochsalzlösungspuffer behandelt werden, und der Filterrückstand kann schließlich 0,2 &mgr;m (sterilisierender) Filtration, der gegebenenfalls Filtration mit einem Filter von etwa 0,45 &mgr;m bis 5 &mgr;m vorangeht, unter Verwendung desselben Puffers unterzogen werden. Sofern erwünscht kann dieser Schritt verwendet werden, um die das Viruspräparat enthaltende Flüssigkeit auf 20 mg/ml in einem geeigneten Stabilisator, wie z.B. einem stabilisierendem Protein, z.B. menschlichem Serumalbumin bei etwa 20 mg/ml, zu bringen. Manchmal kann es nützlich sein, die Filter mit einer Flüssigkeit vorzuwaschen, die denselben Stabilisator in demselben Puffer enthält, bevor die Filter verwendet werden, um das Viruspräparat zu bilden.

Das resultierende Produkt kann in Form einer Suspension von Viruspartikeln in Kochsalzlösungspuffer und Stabilisator wie stabilisierendem Protein, in der die Konzentration von Rest-DNA zufrieden stellend gering ist, erhalten werden.

Die Ausbeute aus Verfahren wie jenen, die soeben beschrieben wurden, wurde z.B. im Vergleich mit Verfahren, die Ultraschall-Zellaufschluss, um Viruspartikeln freizusetzen, gefolgt von Abtrennung von Viruspartikeln von Zelltrümmern einbanden, als ausreichend gut beurteilt.

Die Erfindung kann beispielsweise in einer bevorzugten Ausführungsform, die gemäß dem oben beschriebenen Beispiel durchgeführt wird, zum Kultivieren und Ernten von genetisch deaktiviertem HSV-2-Virus zur Verwendung als Vakzine in nützlicher Weise eingesetzt werden, wobei dieses Virus eine Deletion in Bezug auf das gH-Gen, das für die Produktion von neuen infektiösen Viruspartikeln wesentlich ist, aufweist und in einer Zelllinie kultiviert werden kann, die auf Vero-Zellen basiert, die rekombinant hergestellt wurden und in der Lage sind, das virale gH-Gen zu exprimieren, das im viralen Genom fehlt, wie beispielsweise in den Beschreibungen der WO 92/05263 und der WO 94/21807 beschrieben wird (siehe auch A. Forrester et al., J. Virol. 66, 341–348 (1992), sowie H.E. Farrell et al., J. Virol. 68, 927–932 (1994) und C. McLean et al., J. Infect. Dis. 170, 1100–1109 (1994)).


Anspruch[de]
Verfahren zur Reinigung eines Herpesvirus-Präparats, z.B. eines Präparats von kultiviertem und infektiösem menschlichem Herpes-Simplex-Virus (HSV) Typ 2, umfassend:

(a) das Kultivieren von Wirtszellen, die mit dem Virus infiziert sind,

(b) das Ernten des Virus aus der Kultur ohne wesentlichen Zellbruch mittels Elution unter Verwendung eines Eluenten, der in der Lage ist, Virus aus den kultivierten infizierten Zellen freizusetzen,

(c) das Kontaktieren des virushältigen, zu reinigenden Eluats mit einem Affinitätsbindungsreagens, das eine Festphase umfasst, die eine Sulfat- oder Sulfonatumfassende Bindungsgruppe trägt, die Materialien mit Affinität zu Heparin binden kann, um dadurch das Virus an das Affinitätsbindungsreagens zu binden,

(d) das Waschen des Affinitätsbindungsreagens, das das Virus trägt, und

(e) das Eluieren des Virus aus dem Bindungsreagens.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Eluent, der in der Lage ist, Virus aus der Kultur freizusetzen, Salzlösung enthält. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Eluent, der in der Lage ist, Virus aus der Kultur freizusetzen, Heparin oder Heparinsulfat enthält. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend den weiteren Schritt des anschließenden Formulierens des Herpesvirus mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Arzneimittelträger und gegebenenfalls den Schritt des Sterilisierens und Einfrierens oder Gefriertrocknens des Präparats. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Affinitätsbindungsreagens sulfathältige Bindungsgruppen, z.B. Bindungsgruppen, die Sulfat und nichtionische polare Gruppen enthalten, aufweist. Verfahren nach Anspruch 5, worin das Affinitätsbindungsreagens sulfatierte Polysaccharidgruppen, z.B. Heparin- oder Dextransulfatgruppen, aufweist. Verfahren nach Anspruch 5, worin das Affinitätsbindungsreagens Polyacrylamidseitenketten, die mit Sulfoisobutylgruppen substituiert sind, trägt. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Virus auf das Affinitätsreagens aus einer Flüssigkeit, die entweder Natriumchlorid oder ein anderes pharmazeutisch annehmbares Salz in einer Konzentration über etwa 0,4 M oder ein sulfatiertes oder sulfonatiertes Polysaccharid enthält, aufgetragen wird und die Elution mit einem Eluenten, der entweder einen sulfatierten oder sulfonatierten Polysaccharid-Eluenten enthält, oder einem Salzlösungs-Eluenten durchgeführt wird. Verfahren nach Anspruch 1 oder 8, worin das in Schritt (c) verwendete Affinitätsreagens nach einem der Ansprüche 5 bis 7 definiert ist. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Herstellung einer Vakzine, die infektiöses Herpesvirus, z.B. Herpes-Simplex-Virus Typ 2, enthält.






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