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Dokumentenidentifikation DE102005021241B3 16.11.2006
Titel Verfahren zur Herstellung von organischen Verbindungen
Anmelder Technische Universität München, 80333 München, DE
Erfinder Havel, Jan, Dipl.-Biol., 80807 München, DE;
Weuster-Botz, Dirk, Prof. Dr.-Ing., 85221 Dachau, DE
Vertreter PFENNING MEINIG & PARTNER GbR, 80339 München
DE-Anmeldedatum 09.05.2005
DE-Aktenzeichen 102005021241
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 16.11.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 16.11.2006
IPC-Hauptklasse C12P 1/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, DE
IPC-Nebenklasse C12P 7/22(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   C12P 7/62(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   
Zusammenfassung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Biosynthese organischer Verbindungen sowie Verwendungen derartiger erfindungsgemäßer Verfahren. Derartige Verfahren werden beispielsweise im Bereich der Herstellung von Feinchemikalien, Arzneistoffen, Agrochemikalien und/oder Lebensmittelzusatzstoffen benötigt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden phototrophe Mikroorganismen unter autotrophen Bedingungen unter Belichtung kultiviert und angezogen. Die autotroph angezogenen Mikroorganismen werden mit dem Edukt sowie einem durch die autotroph angezogenen Mikroorganismen verwertbaren Reduktionsmittel oder Cofaktor gemischt und das Edukt wird zum Produkt durch die photoautotroph angezogenen Mikroorganismen als Biokatalysatoren ohne Lichtzufuhr oder unter für phototrophes Wachstum der Mikroorganismen nicht ausreichender Belichtung umgesetzt.

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Biosynthese organischer Verbindungen sowie Verwendungen derartiger erfindungsgemäßer Verfahren. Derartige Verfahren werden beispielsweise im Bereich der Herstellung von Feinchemikalien, Arzneistoffen, Agrochemikalien und/oder Lebensmittelzusatzstoffen benötigt. Feinchemikalien sind dabei Chemikalien, die in einer Menge um oder unter 10.000 Jahrestonnen hergestellt werden.

Zur Herstellung von Chemikalien, insbesondere Feinchemikalien, existieren nach dem Stand der Technik verschiedene Verfahren. Hierzu gehört zum einen die chemisch katalysierte Synthese sowie die enzymatisch katalysierte Synthese. Auch mittels Ganzzellkatalysen ist eine Synthese chiraler Verbindungen möglich, wobei es hier jedoch aufgrund toxischer Effekte von Substraten und Produkten zu einer Inaktivierung des Biokatalysators kommen kann. Desweiteren kann es zu einer intrazellulären Akkumulation des Produktes kommen, falls das gewünschte Produkt nicht effektiv genug aus der Zelle geschleust wird. In diesem Bereich wird auch mit gentechnisch veränderten Organismen experimentiert, die jedoch spezielle Hygienemaßnahmen und zusätzliche kostenaufwendige technische Sicherheitseinrichtungen erfordern.

Nakamura et al. „Recent developments in asymmetric reduction of ketones with biocatalysts", Tetrahedron: Asymmetry 14.18 (2003): 2659–2681, verwendete bereits den photoautotrophen Organismus Synechococcus PCC7942 zur photokatalytischen, asymmetrischen Reduktion von Ketonen. Die bisherige Kenntnis dieses Organismus geht davon aus, dass dieser für die stoffliche Umsetzung von Ketonen zu Alkoholen obligat phototroph ist, d.h. beleuchtet werden muss. Problematisch an einer derartigen Umsetzungsreaktion ist, dass der Organismus lediglich in hoher Verdünnung kultiviert werden kann, da er in dem Reaktor belichtet werden muss. Denn abhängig von der Konzentration des Organismus ist die Eindringtiefe des Lichts nur sehr gering. Bei für eine Synthese relevanten Konzentrationen beträgt sie oft nur wenige Millimeter oder Zentimeter. Dies erfordert eine komplizierte, aufwendige und teure Reaktortechnik, z.B. Rohrreaktoren oder Flächenreaktoren, da eine ausreichende Belichtung im ganzen Volumen des Reaktors gewährleistet werden muss. Dies limitiert die Raum-Zeit-Ausbeute bei gleichzeitiger Unterschreitung toxischer Edukt-Produkt-Konzentrationen.

Die EP 1 593 743 A1 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Produkten mit lebenden Bakterien oder Zellen in zweiphasigen Systemen. Dabei werden Mikroorganismen für die stereospezifische Reduktion mit Glucose als Cosubstrat vorgeschlagen, beispielsweise auch phototrophe Mikroorganismen. Auch in Bioscience Biotechnology and Biochemistry 64 (2000), 2099–2103 offenbart die Verwendung photoautotropher chloreller Kulturen zur Reduktion von Ketoestern. Dabei werden den belichteten Zellen außer den Edukten weiterhin Zusätze, wie beispielsweise Glucose zugemischt, um die Bereitstellung von reduzierten Coenzymen zu verbessern. In Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 31 (2004), 19–24 wird die Reduktion von Kampferquinonen durch Cyanobakterien beschrieben. Im Dunkeln ist die Reduktionsleistung geringer als unter Belichtung, wobei weiterhin die Stereoselektivität reduziert war.

In BIOSIS Prev 199497468036 ist die Fermentation von Glycogen zu Ethanol, Acetat etc. durch ein Cyanobakterium offenbart, wobei diese Fermentation auch stattfindet, wenn das Cyanobakterium anaerob im Dunkeln gehalten wird. Die Fermentation begann jeweils unmittelbar nachdem die Cyanobakterien in anaerobe Umgebung unter Lichtausschluss überführt wurden.

In Biotechnology Letters 10 (1988), 731–736 ist die enantioselektive Reduktion von Acetyldimethylphenylsilan durch Grünalgen und Cyanobakterien in glucosehaltigem Puffer offenbart.

Die EP 1 041 154 A1 zeigt die Biosynthese organischer Verbindungen durch photosynthetische Bakterien auch ohne Belichtung. Die Synthese verläuft jedoch ohne Belichtung langsamer als unter Belichtung.

Die EP 0 596 490 A2 zeigt die stereoselektive Reduktion von Ketonen durch eine Vielzahl von Mikroorganismen, wie beispielsweise Rhodococcus oder auch Rhodopseudomonas.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Biosynthese organischer Verbindungen aus einem zugegebenen Edukt zur Verfügung zu stellen, das das gewünschte Produkt in ausreichender Reinheit, kosteneffizient und sicherheitstechnisch unproblematisch zur Verfügung stellt.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie seine Verwendung werden in den weiteren Ansprüchen gegeben.

Entscheidender Ansatzpunkt der vorliegenden Erfindung ist, dass erkannt wurde, dass entgegen den wissenschaftlichen und sonstigen Erwartungen phototrophe Zellen auch in weitgehender oder vollständiger Dunkelheit eine Cofaktorregenerierung bei externer Zugabe eines geeigneten Reduktionsmittels durchführen können. Denn die vorherrschende Lehrmeinung besagte bisher, dass photoautotrophen Organismen die Fähigkeit fehlt, organische Kohlenstoffquellen zum Wachstum zu nutzen. Überraschenderweise hat es sich herausgestellt, dass viele phototrophen Organismen, auch obligat phototrophe Organismen, sehr wohl in der Lage sind, auch ohne Lichtzufuhr bzw. ohne eine für photoautotrophes Wachstum in Teilen oder innerhalb der gesamten Kultur nicht ausreichende Lichtzufuhr eine Regeneration der Cofaktoren bei asymmetrischen Synthesen und dergleichen durchzuführen. Unter Licht wird hier wie im folgenden elektromagnetische Strahlung vom ultravioletten Bereich (UV) bis zum infraroten Bereich (IR), insbesondere jedoch im sichtbaren Bereich (VIS) bzw. zwischen 300 nm und 750 nm Wellenlänge verstanden.

Diese Erkenntnis liegt der vorliegenden Erfindung zugrunde, gemäß der phototrophe Mikroorganismen, vorteilhafterweise unter photoautotrophen Bedingungen, unter Belichtung, kultiviert und angezogen werden. Die so kultivierten phototrophen Mikroorganismen können dann aufkonzentriert und anschließend in einem Reaktor, beispielsweise einem herkömmlichen geschlossenen Rührkesselreaktor zur Umsetzung eines Eduktes in ein Produkt unter gleichzeitiger Zugabe eines Reduktionsmittels, beispielsweise organischem Kohlenstoff, eingesetzt werden. Die so hergestellten Zellen dienen als Ganzzellkatalysatoren für die gewünschte chemische Reaktion.

Dabei hat sich überraschenderweise gezeigt, dass die Reaktion selbst im Dunkeln durchgeführt werden kann, was es ermöglicht, die Zellkonzentration erheblich zu erhöhen und so erheblich höhere Produktausbeuten zu erzielen. Es hat sich gezeigt, dass auch bei asymmetrischen Synthesen der Enantiomerenüberschuss weitgehend von der Lichtanwesenheit unabhängig ist. Die Produktbildungskapazitäten bewegen sich dabei in der gleichen Größenordnung wie von herkömmlichen Produktionsorganismen. Die asymmetrische Umsetzung von beispielsweise perfluorierten Aromaten wird jedoch mit einer deutlich überlegenen Produktbildungskapazität gegenüber industriellen Produktionsstämmen ermöglicht. Sie liegen dort sogar mindestens 3- bis 105-fach höher im Vergleich zu rekombinanten Industriestämmen mit überexprimierten Alkoholdehydrogenasen. Durch die hohen Enantiomerenüberschüsse wird eine industrielle Nutzung und die Produktaufarbeitung vereinfacht.

Damit ist erstmals die Nutzung von phototrophen Organismen zur Synthese in beliebigen Reaktionsräumen, insbesondere jedoch auch in Standardrührkesseln ohne nennenswerte für die Lichtreaktion erforderliche Lichtzufuhr möglich. Die Produktbildungskapazitäten der phototrophen Organismen bewegen sich dabei in zumindest der gleichen Größenordnung wie bei herkömmlichen optimierten Produktionsorganismen.

Die Verwendung der phototrophen Organismen ermöglicht es, bei der Anzucht mit einer reinen Salzlösung zu arbeiten. Eine Kontamination mit obligat heterotrophen Organismen wird dadurch weitestgehend verhindert. Die Verwendung der phototrophen Organismen ermöglicht es außerdem, auf Kohlendioxid als Kohlenstoffquelle zurückzugreifen, das ubiquitär ist und beispielsweise auch aus Industrieabgasen genutzt werden kann. Durch die positive Kohlenstoffbilanz des vorliegenden Verfahrens wird auch zur Reduktion von Treibhausgasen beigetragen.

Bei geeigneter Anzucht der Organismen kommt es ab einem bestimmten Beschattungsgrad, d.h. einer bestimmten Zelldichte im Kulturmedium, zu einer Akkumulation von Speicherstärke und einer Abnahme der Teilungsrate der Mikroorganismen. Derart angezogene Zellen eignen sich besonders als Biokatalysatoren, da diese auf die gespeicherte Glucose zurückgreifen können und die externe Zugabe des Reduktionsmittels, beispielsweise Glucose, zumindest teilweise verringert werden kann.

Als Reduktionsmittel bzw. Cosubstrate, können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren alle bekannten organischen Kohlenstoffquellen eingesetzt werden. Dies sind insbesondere Hexosen, Disaccharide und Polysaccharide. Insbesondere geeignet ist Fructose, Saccharose oder Glycerine sowie alle Alkohole, die von Oxidoreduktasen akzeptiert werden, beispielsweise Isopropanol.

Generell lässt sich feststellen, dass die Gruppe der phototrophen Organismen und vor allem der Mikroalgen eine bisher kaum erschlossene Organismengruppe darstellen. Es wird geschätzt, dass es in diesem Bereich 200.000 bis mehrere Millionen unterschiedliche Gattungen gibt. Darunter sind bislang 2.000 unterschiedliche Cyanobakterienarten, die in 150 Gattungen unterschieden werden. Dies ist eine überragend große unerschlossene Quelle für biotechnologisch relevante Produktionsorganismen. Diese bisher unerschlossenen Potentiale sind geeignet für asymmetrische Reduktionen, für die Herstellung von Arzneimittel sowie für die Herstellung völlig neuer Substanzklassen in der Feinchemikalienproduktion. Die Umweltverträglichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens spricht für eine zukünftige breite Nutzung der vorgeschlagenen Biotransformationsverfahren.

Das vorgeschlagene Verfahren eignet sich insbesondere für asymmetrische Synthesen mit hohem Reinheitsgrad und hoher Ausbeute, insbesondere zur Herstellung chiraler Moleküle. Besonders geeignete Syntheseprodukte sind chirale Alkohole, chirale Carbonsäurederivate, chirale Ester, chirale Ether, chirale Amide, chirale Hydrazine bzw. alle optisch aktiven Kohlenstoffverbindungen. Dadurch, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ein ausreichend hoher Enantiomerenüberschuss ermöglicht wird, ist eine industrielle Nutzung und vereinfachte Produktaufarbeitung möglich.

Als Mikroorganismen kommen phototrophe Organismen zum Einsatz. Besonders vorteilhafterweise werden phototrophe einzellige Mikroorganismen verwendet, wie beispielsweise phototrophe Prokaryonten, insbesondere mit der Fähigkeit zum zyklischen Elektronentransport. Eine besonders vorteilhaft zu verwendende Gruppe von Mikroorganismen sind die Cyanobakterien, für die sich ein Substrat- bzw. Eduktspektrum von Pentanal, Hexanal, Heptanal, Octanal, Butanon, Hexan-2-on, Octan-2-on, Octan-3-on, Octan-4-on, Nonan-2-on, Undecan-2-on, trans-Oct-2-enal, 2,6-Dimethylhept-5-enal, Geranial, 6-Mehtyl-hept-5-en-2-on, trans-Geranylaceton, Cyclopentanon, 3,5,5-Trimethylcyclohexanon, 2,2,6-Triethylcyclohexanon, Menthon und Ketopantolacton ergibt. Über O-Demethylation ist auch eine Biotransformation von Codein zu Morphin möglich. Auch die Biotransformation von 2,4,6-Trinitrotoluene zur Sprengstoffentsorgung oder die enantio- oder regioselektive Spaltung von Epoxygruppen ist mit diesen Organismen möglich.

Eine weitere Gruppe der anaeroben, phototrophen Bakterien sind die Rhodospirillales, zu denen die Schwefelpurpurbakterien, die schwefelfreien Purpurbakterien, die grünen Schwefelbakterien und die Chloroflexus-Gruppe gehört. Für diese ist der Benzoatabbau, beispielsweise mit Rhodopseudomonas palustris, oder auch die Reduktion von Adenylylsulfat und 3'-Phosphoadenylylsulfat möglich.

Auch die einzelligen Mikroalgen, wie Chlorophyta (Grünalgen), Rhodophyta (Rotalgen) und Chrysophyta (Goldbraune Algen) können erfindungsgemäß eingesetzt werden, beispielsweise zur Umsetzung von Benzaldehyd, 2-,3-, und 4-Monochlorobenzaldehyde, 2,3-, 2,4-, und 3,4-Dichlorobenzaldehyde, 2-, 3- oder 4-Methoxybenzaldehyde sowie Vanillin.

Erfindungsgemäß erfolgt die Umsetzung im Reaktor ohne Licht unter aeroben oder anaeroben Bedingungen, vorteilhafterweise jedoch unter anaeroben Bedingungen. Dadurch ist es in verschiedenen Fällen möglich, die Reaktionsprodukte im Behälter zu sammeln.

Im folgenden werden einige Beispiele erfindungsgemäßer Verfahrensführungen gegeben.

Es zeigen

1 Synechococcus PCC 7942-Kulturen nach der Umsetzung von Pentafluoroacetophenon unter verschiedenen Lichtbedingungen;

2 die Produktbildungskapazität von Synechococcus PCC 7942 für (S)-(–)-1-(Pentafluorophenyl)ethanol;

3 die Produktbildungskapazität von Nostoc muscorum für (S)-(–)-1-(Pentafluorophenyl)ethanol;

4 die Produktbildungskapazität von Nostoc commune für (S)-(–)-1-(Pentafluorophenyl)ethanol;

5 die Produktbildungskapazität von Nostoc muscorum für 4-Chlor-Phenylethanol;

6 die Produktbildungskapazität von Anabaena variabilis für 3-(S)-Hydroxy-3-Phenyl-Propionsäureethylester;

7 die Produktbildungskapazität von Synechococcus PCC 7942 für 3-(S)-Hydroxy-3-Phenyl-Propionsäureethylester; und

8 die Produktbildungskapazität von Synechococcus PCC 7942 für 4-Cl-3-(S)-Hydroxy-buttersäureethylester.

Bei 1 entsprechen die Erläuterungen in Druckschrift unter den Gläsern den handschriftlichen Beschriftungen und sind von keiner weiteren Bedeutung.

Im folgenden werden die Anzuchtbedingungen und die Bedingungen während der Katalyse (Biotransformation) für die einzelnen Figuren beschrieben. Die Anzucht der Zellen erfolgte jeweils unter kontinuierlicher Beleuchtung mit 75 PAR [&mgr;Em–2s–1] mit artifiziellem Sonnenlicht aus einer Kombination von zwei Spezialleuchtstoffröhren, 250 ml BG-11 Medium (Rippka et al., 1979) in einem Blasensäulenreaktor mit 10 nL/h Luft + 5% CO2 bei einer Anzuchtzeit 14 Tage bei 20 °C.

Die Biotransformation erfolgte in den 4, 7 und 8 in 1 ml Cyanobakterienkultur aus der Anzucht (ca. 1–2,8 g/L BTM je nach Stamm). Die Kulturreaktoren wurden mit 10 mM an Edukt, mit oder ohne 10 g/L Glucose im Mikroreaktorsystem beimpft und für 48h, 600 Upm, 20 °C, bei 0 (dunkel) oder 26 (hell) PAR inkubiert.

Bei den restlichen Figuren erfolgte die Biotransformation in einer 1 ml Cyanobakterienkultur aus der Anzucht (ca. 1–2,8 g/L BTM je nach Stamm). Die Kulturreaktoren wurden mit 10 mM an Edukt, mit oder ohne 10 g/L Glucose im Mikroreaktorsystem beimpft und für 216 h, 600 Upm, 20 °C, bei 0 (dunkel) oder 26 (hell) PAR inkubiert.

1 zeigt Kulturen (Glasflaschen) von Synechococcus PCC 7942, die bei Licht (hell) oder im Dunkeln (dunkel) unter Zugabe von Glucose als Reduktionsmittel oder ohne Glucose als Reduktionsmittel Pentafluoroacetophenon, ein perfluorierter Aromat zu dem korrespondierenden S-Alkohol umsetzen.

Für diese Reaktion ist es Stand der Technik, dass diese bei Licht durchgeführt werden muss, da Synechococcus PCC 7942 als obligat phototropher Organismus beschrieben wird. Wie zu erkennen ist, führt im Hellen die Reaktion zu einer deutlichen chromatischen Veränderung (Aufhellung), die mit einer Zellabtötung einhergeht. Die Organismen sind also bei der photobiokatalytischen Prozessführung (im Licht) nicht wiederverwendbar.

In 1 ist zu sehen, dass diejenigen Kulturen, die ohne Licht (dunkel) zur Biokatalyse eingesetzt wurden, keine derartige chromatische Veränderung zeigen und folglich weitaus stabilere Biokatalysatoren darstellen.

In 2 sind Vergleichsversuche dargestellt, die mit dem obligat phototrophen Cyanobakterium Synechococcus PCC 7942 durchgeführt wurden. Dabei wurde die S-Alkoholkonzentration an Pentafluoroacetophenon nach 9 Tagen Reaktionszeit bestimmt. Es ist zu erkennen, dass die Produktkonzentration und die Produktbildungskapazität bei rein dunkel gehaltenen Synechococcus PCC 7942 niedrig sind. Dasselbe gilt für die Synechococcus PCC 7942-Kultur, die im Hellen (+/– Glukose) gehalten wird. Die Enantiomerüberschüsse (in %ee) betragen jedoch einheitlich über 99%.

Bei der Synechococcus PCC 7942-Kultur, die im Hellen angezogen wurde und anschließend unter Glucosezugabe im Dunkeln zur Umsetzung des Pentafluoroacetophenons eingesetzt wurde, ergibt sich eine sehr hohe Produktkonzentration und eine sehr hohe Produktbildungskapazität mit hohem Enantiomerenüberschuss von über 99%. Dieser Enantiomerenüberschuss ist dabei unabhängig von den eingestellten Bedingungen. Obwohl bei obligat phototrophen Organismen wie Synechococcus PCC 7942 nicht mit irgendeiner Wirkung zugegebener Glucose gerechnet werden kann, führt der externe Zusatz von Glucose als Reduktionsmittel zum Medium zu einer deutlichen Zunahme von 367% in der Produktbildungskapazität bezogen auf die Photokatalyse.

Die Umsetzung von Pentafluoroacetophenon nach 9 Tagen Reaktionszeit durch das Cyanobakterium Nostoc muscorum, das als obligat phototropher Organismus bekannt ist, ist in 3 dargestellt. Hier ist zu erkennen, dass auch im Dunkeln eine Produktbildungskapazität und Produktkonzentration erzielt wird, die derjenigen der Lichtreaktion vergleichbar ist. Der Enantiomerenüberschuss bewegt sich in gleicher Größenordnung wie bei der Lichtreaktion. Dies zeigt, dass überraschenderweise diese Cyanobakterien doch zu einer Dunkelsynthese des S-Alkohols des Pentafluoroacetophenons fähig sind.

Die 4 zeigt die Produktbildungskapazität und den Enantiomerenüberschuss nach 9 Tagen Reaktionszeit des Cyanobakteriums Nostoc commune für die Umsetzung von Pentafluoroacetophenon zu seinem S-Alkohol. Hier ist die Produktbildungskapazität im Dunkeln um 12 gegenüber der Lichtreaktion gesteigert. Der Enantiomerenüberschuss beträgt in gleicher Weise wie bei der Lichtreaktion 98%.

Mit diesen Beispielen ist verdeutlicht worden, dass die Produktbildungskapazitäten von phototrophen Organismen gegen herkömmlich gentechnisch verbesserten oder optimierten Produktionsstämmen mit überexprimierten Alkoholdehydrogenasen bei der asymmetrischen Reduktion von Pentafluoroacetophenon zu seinem S-Alkohol überlegen sind. Überraschenderweise gilt dies für die Dunkelreaktion und nicht nur für die Photobiokatalyse.

Im folgenden wird eine Tabelle mit dem Vergleich der Produktbildungskapazitäten (PBK) von phototrophen Organismen bei der asymmetrischen Umsetzung von Pentafluoroacetophenon dargestellt. Zum Vergleich kamen dabei rekombinante Stämme von Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae sowie die nicht gentechnisch veränderten Cyanobakterienstämme Synechococcus PCC 7942, Nostoc commune, Nostoc muscorum und Anabaena variabilis.

5 zeigt die Produktbildungskapazität und die Produktkonzentration sowie den Enantiomerenüberschuss nach 9 Tagen Reaktionszeit des Cyanobakteriums Nostoc muscorum für die Umsetzung 4-Chloracetophenon zu 4-Chlor-Phenylethanol. Unabhängig ob Licht- oder Dunkelreaktion vorliegt, sind die Enantiomerenüberschüsse durchweg oberhalb 90%. Erstaunlicherweise ergibt sich eine maximale Produktkonzentration und Produktbildungskapazität, wenn die zuvor angezogenen Nostoc muscorum in einer Dunkelreaktion unter Zugabe von Glucose und dem Edukt 4-Chlor-Acetophenon dieses umsetzen. Gegenüber der Lichtreaktion ohne Glucose aber auch gegenüber der Lichtreaktion mit Zugabe von Glucose ist die Produktbildungskapazität bei der Dunkelreaktion unter Zugabe von Glucose noch weiter gesteigert.

6 zeigt die enantiomersehektive Synthese von 3-(S)-Hydroxy-3-Phenyl-Propionsäureethylester durch das Cyanobakterium Anabaena variabilis. Auch hier liegt der Enantiomerenüberschuss nach 9 Tagen Reaktionszeit bei über 97% in allen möglichen Verfahrensführungen. Die Produktbildungskapazität ist dabei etwas geringer im Falle der Dunkelreaktion unter Zugabe von Glucose verglichen mit der Lichtreaktion ohne Zugabe von Glucose. Es zeigt sich jedoch, dass auch diese Reaktion durch Anabaena variabilis mit einer ausreichenden Produktbildungskapazität durchgeführt werden kann. Da, wie oben beschrieben, die Dunkelreaktion bei einer erheblich höheren Konzentration der Zellen möglich ist, kann insgesamt der Batch-Prozess dennoch weit effektiver geführt werden als bei einem herkömmlichen durchgängig zu beleuchtenden Reaktor für die Lichtreaktion.

7 zeigt wiederum die Umsetzung von Ethylbenzoylacetat, in diesem Falle durch Synechococcus PCC 7942 nach zwei Tagen Reaktionszeit. Der Enantiomerenüberschuss liegt sowohl bei der Hellreaktion als auch bei der Dunkelreaktion oberhalb 97%. Zwar ist die Produktbildungskapazität bei der Ganzzellbiokatalyse ohne Licht niedriger als bei der Ganzzellbiokatalyse mit Licht, dennoch ist eine Produktbildungskapazität von immer noch 85% der Biokatalyseleistung zu verzeichnen. Da die Versuche im vorliegenden Falle bei gleichen Konzentrationen der Zellen durchgeführt wurden, d.h. bei Zellkonzentrationen, die für die Hellreaktion optimal waren, ist davon auszugehen, dass bei einer Dunkelreaktion nach Aufkonzentration der Zellen eine erheblich verbesserte Produktkonzentration erzielbar ist.

8 zeigt die Produktbildungskapazität von Synechococcus PCC 7942 für die Umsetzung von Ethyl-4-Chloracetoacetat zu 4-Cl-3-(S)-Hydroxybuttersäureethylester nach einer Reaktionszeit von zwei Tagen. Auch zeigt sich, dass der Enantiomerenüberschuss oberhalb 90% liegt, bei der Dunkelreaktion jedoch mit einem Verlust an Produktbildungskapazität zu rechnen ist. Dies wird jedoch aufgewogen durch die Möglichkeit, die Dunkelreaktion bei erheblich höheren Zellkonzentrationen durchzuführen.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass für alle untersuchten Organismen eindeutig nachgewiesen werden konnte, dass phototrophe Organismen auch ohne Lichtzufuhr in der Lage sind, asymmetrische Reduktionen, beispielsweise von prochiralen Ketonen, durchzuführen. Dabei zeigen sie industriell relevante Enantiomerenüberschüsse, die weitgehend von der Lichtanwesenheit unabhängig sind. Die Produktbildungskapazitäten bewegen sich dabei in der gleichen Größenordnung wie von herkömmlichen Produktionsorganismen, die Umsetzung von perfluorierten Aromaten zeigt jedoch eine deutlich überlegene Produktbildungskapazität der phototrophen Organismen gegenüber den industriellen Produktionsstämmen.

Anhand der Beispiele konnte eindeutig gezeigt werden, dass phototrophe Organismen in der Lage sind, Vorstufen für pharmazeutisch relevante Produkte zu liefern. Die weit unerschlossenen Potentiale dieser Organismen für organische Synthesen, insbesondere für asymmetrische Reduktionen, der steigende Bedarf der Pharmahersteller für neue Substanzklassen in der Feinchemikalienproduktion und die Umweltverträglichkeit des beschriebenen Verfahrens sind überragende Gründe für eine zukünftige Breite Nutzung derartiger Biotransformationen.


Anspruch[de]
Verfahren zur Biosynthese organischer Verbindungen aus einem zugegebenen Edukt,

dadurch gekennzeichnet,

dass phototrophe Mikroorganismen unter Belichtung kultiviert und angezogen werden,

die so angezogenen Mikroorganismen, das Edukt sowie ein durch die so angezogenen Mikroorganismen verwertbares Reduktionsmittel bzw. Cosubstrat miteinander gemischt werden und

das Edukt zum Produkt durch die so angezogenen Mikroorganismen als Biokatalysatoren ohne Lichtzufuhr oder unter für phototrophes Wachstum der Mikroorganismen nicht ausreichender Belichtung umgesetzt wird.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die phototrophen Mikroorganismen unter autotrophen Bedingungen kultiviert und angezogen werden. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Anzucht und vor der Mischung mit dem Edukt und dem Reduktionsmittel die angezogenen Mikroorganismen auf konzentriert werden. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Reduktionsmittel oder Cosubstrat eine organische Kohlenstoffverbindung zugegeben wird. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als Reduktionsmittel oder Cosubstrat Hexosen, Disaccharide, Polysaccharide, insbesondere Fruktose, Saccharose, Glycerine und/oder Carbonsäuren, Aminosäuren, Alkohole, insbesondere Isopropanol, zugegeben werden. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismen gentechnisch unveränderte Mikroorganismen verwendet werden. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismen bezüglich ihrer äußeren Zellmembran, insbesondere bezüglich der membranintegralen Proteine der äußeren Zellmembran, insbesondere bezüglich ihres Glukosestoffwechsels, insbesondere bezüglich ihrer Glukosetransporter gentechnisch unveränderte Mikroorganismen verwendet werden. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als phototrophe Organismen obligat photoautotrophe Mikroorganismen oder phototrophe Mikroorganismen, die auch heterotroph wachsen können, verwendet werden. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als phototrophe Mikroorganismen phototrophe einzellige Organismen, insbesondere Euglenideae oder Clamydiae, oder insbesondere phototrophe Prokaryonten, insbesondere phototrophe Prokaryonten mit Fähigkeit zu zyklischem Elektronentransport, insbesondere Cyanobakterien verwendet werden. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als phototrophe Mikroorganismen Cyanobakterien, insbesondere Synechococcus PCC 7942, Nostoc commune, Nostoc muscorum, und/oder Anabaena variabilis verwendet werden. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet dass als phototrophe Mikroorganismen Chlorophyta, insbesondere Chlorella minutissima, Nannochloris atomus oder Dunaliella parva, Rhodophyta, insbesondere Porphyridium purpureum, und/oder Chrysophyta, insbesondere Isochrysis galbana, verwendet werden. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung des Eduktes unter anaeroben Bedingungen erfolgt. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung des Edukts zum Produkt in einem Behälterreaktor oder in einem Rührkesselreaktor erfolgt. Verwendung eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Biosynthese organischer Verbindungen, insbesondere aliphatischer oder zyklischer Kohlenwasserstoffe, Alkohole, Ketone, Carbonsäuren, Ester, Ether, Aromate, die jeweils Heteroatome aufweisen können, Amine, Amide, Hydrazine, Sulfide oder Sulfone. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die organischen Verbindungen fluoriert oder perfluoriert sind. Verwendung nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche zur stereoselektiven Synthese. Verwendung nach einem der drei vorhergehenden Ansprüche zur asymmetrischen Biosynthese. Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 17 zur Synthese chiraler organischer Verbindungen aus prochiralen Edukten. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung von Feinchemikalien, Arzneimitteln, Agrochemikalien und/oder Lebensmittelzusatzstoffen.






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