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Dokumentenidentifikation DE60209757T2 23.11.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001385497
Titel PRÄVENTION ODER BEHANDLUNG VON BRUST-, PROSTATA- UND/ODER GEBÄRMUTTERHALSKREBS MIT N,N-DIMETHYLGLYCIN
Anmelder Foodscience Corp., Essex Junction, Vt., US
Erfinder KENDALL, V., Roger, Westford, VT 05494, US
Vertreter Anwaltskanzlei Gulde Hengelhaupt Ziebig & Schneider, 10179 Berlin
DE-Aktenzeichen 60209757
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 19.04.2002
EP-Aktenzeichen 027642511
WO-Anmeldetag 19.04.2002
PCT-Aktenzeichen PCT/US02/12425
WO-Veröffentlichungsnummer 2002085345
WO-Veröffentlichungsdatum 31.10.2002
EP-Offenlegungsdatum 04.02.2004
EP date of grant 08.03.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 23.11.2006
IPC-Hauptklasse A61K 31/198(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61P 35/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61P 35/04(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft die Verwendung von N,N-Dimethylglycin (DMG) zur Prävention oder Behandlung von Brust-, Prostata- und/oder Gebärmutterhalskrebs beim Menschen und anderen tierischen Lebewesen.

Bei Dimethylglycin handelt es sich um einen intermediären Metaboliten und um eine Aminosäure, der/die in geringen Mengen in zahlreichen Lebensmitteln zu finden ist und im Körper ausgehend von Cholin erzeugt wird. DMG ist eine endogene Verbindung, und die Substanz wird durch ein Enzymsystem im Körper wirksam in Metaboliten umgewandelt, die entweder vom Körper selbst verwendet oder sicher aus dem Körper ausgeschieden werden.

In den vergangenen Jahren wurden umfangreiche Forschungsarbeiten über die physiologischen Wirkungen und den möglichen gesundheitlichen Nutzen von N,N-Dimethylglycin durchgeführt.

Betrachtet man frühere Arbeiten, so offenbart US-Patent Nr. 4 385 068 die Behandlung bestrahlter Tier mit einem Derivat der Verbindung, um die Auswirkung von übermäßiger Strahlung auf das Immunsystem zu lindern. US-Patent Nr. 4 994 492 offenbart die Behandlung eines Melanomtumors durch die Verabreichung von N,N-Dimethylglycin oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes desselben.

Die Literatur ist voll mit Artikeln, die den Begriff "Vitamin B-15" verwenden. Der Begriff "Vitamin-B-15" wird häufig fälschlicherweise auf N,N-Dimethylglycin bezogen; der Begriff "B-15" ist jedoch ungenau und verschiedene Marken haben völlig unterschiedliche Zusammensetzungen. Umfangreiche Forschungsarbeiten wurden insbesondere in der Sowjetunion über eine Substanz durchgeführt, die die russischen Forscher als Calciumpangamat (das Calciumsalz der Pangamsäure) bezeichnen. Calciumpangamat wird ebenfalls als "Vitamin B-15" bezeichnet.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Nun wurde gefunden, dass DMG bei der Behandlung, Hemmung und Prävention von Gebärmutterhals-, Brust- und Prostatakrebs wirksam ist.

Ein Aspekt der Erfindung betrifft die Hemmung der Metastasierung von Gebärmutterhals-, Brust- und Prostatakrebs durch Verabreichung einer die Metastasierung hemmenden Menge N,N-Dimethylglycin oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes desselben an einen Patienten mit Gebärmutterhals-, Brust- und/oder Prostatakrebs.

Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft die Hemmung der Bildung von Gebärmutterhals-, Brust- und Prostatakrebszellen bei einem Patienten oder die Verringerung der Gefahr von Gebärmutterhals-, Brust- und Prostatakrebs bei einem Patienten durch Verabreichung von N,N-Dimethylglycin oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes desselben an einen Patienten, bei dem ein Risiko für Gebärmutterhals-, Brust- und Prostatakrebs besteht.

Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft die Behandlung von Gebärmutterhals-, Brust- und Prostatakrebs, umfassend die Verabreichung von N,N-Dimethylglycin oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes desselben an einen Patienten mit Gebärmutterhals-, Brust- oder Prostatakrebs.

N,N-Dimethylglycin ist eine Verbindung mit der Formel:

DMG oder ein pharmakologisch annehmbares Salzes desselben kann zur Behandlung, Prävention oder Hemmung von Gebärmutterhals-, Brust- oder Prostatakrebs verwendet werden. DMG oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz desselben kann auch bei der Prävention, der Behandlung oder der Eindämmung der Metastasierung von Gebärmutterhals-, Brust- und/oder Prostatakrebs hilfreich sein. Die Anwendbarkeit von DMG bei der Krebsimmuntherapie wird sowohl bei experimentellen Verfahren in in vitro-Zellkulturen als auch bei in vivo-Tierexperimenten demonstriert, bei denen gezeigt wurde, dass DMG gegen die Ausbreitung und Proliferation von Krebszellen wirksam ist.

In den Industrieländern ist Krebs die zweite Todesursache nach den Herzerkrankungen. In zahlreichen Ländern überwiegt Brust-, Gebärmutterhals- und Prostatakrebs. Krebs ist das Ergebnis einer unkontrollierten lokalen Zellvermehrung mit Invasion normaler benachbarter Strukturen. Es kommt zur Bildung von Metastasen, wenn sich der Krebs über den Blutkreislauf oder die Lymphknoten oder in einer Körperhöhlung ausbreitet. In den Vereinigten Staaten ist Brustkrebs der häufigste der normalen Krebsarten bei den Frauen. Es gibt verschiedene Arten von Brustkrebs, aber der häufigste Typ, das Duktuskarzinom, entsteht in den Wänden der Brustdrüsengänge.

Eine andere Art, das lobuläre Karzinom, entsteht in den Lobuli. In einigen Fällen kann Brustkrebs sich auch auf andere Körperteile ausbreiten, wie etwa die Lymphknoten, üblicherweise diejenigen unter dem Arm. Falls und sobald er andere Körperteile befällt, wird er "metastatische Erkrankung" oder "Fernmetastasen" genannt. Die meisten Brustkrebspatienten sind Frauen, aber auch beim Mann kann Brustkrebs vorkommen, z.B. mit 1 % der Häufigkeit des weiblichen Brustkrebses. Domestizierte Säuger wie etwa Hunde, Pferde usw. sind genauso empfänglich für Brustkrebs.

Brustkrebs beim Menschen, auch als Mammakarzinom (und hiermit im Text austauschbar verwendet) bekannt, ist eine Erkrankung, die durch verschiedene Faktoren verursacht sein kann, wie etwa ionisierende Strahlung, Ernährung, Familienanamnese oder Einwirkung genetischer Mutagene.

Prostatakrebs ist die häufigste Malignität, die erwachsene Männer in der Bevölkerung befällt. Er wird pro Jahr bei über 150 000 Männern in der USA diagnostiziert. Bei der Prostata handelt es sich um eine 20 Gramm schwere Drüse, die sich am unteren Teil der Blase befindet und die Harnröhre umschließt, bestehend aus fünf Lappen, dem hinteren, vorderen, mittleren, rechten und linken lateralen Lappen. Da die Prostata eine Drüse ist, wird diese häufigste Krebsart Adenokarzinom genannt.

In den Vereinigten Staaten wird jedes Jahr bei etwa 15 000 Frauen Krebs des Gebärmutterhalses, auch Gebärmutterhalskrebs genannt, diagnostiziert. Wie bei den meisten Krebsarten wird er nach dem Körperteil benannt, in dem er zuerst entsteht. Gebärmutterhalskrebse werden auch nach dem Zelltyp benannt, in dem sie entstehen. Die meisten Gebärmutterhalskrebse sind Plattenepithelkarzinom. Plattenepithelzellen sind dünne, flache Zellen, die die Oberfläche des Gebärmutterhalses bilden.

Wenn sich der Krebs auf andere Körperteile ausbreitet, so weist der neue Tumor die selben abnormen Zellen und denselben Namen wie der ursprüngliche (primäre) Krebs auf. Breitet sich beispielsweise Gebärmutterhalskrebs auf die Knochen aus, dann sind die Krebszellen in den Knochen Gebärmutterhalskrebszellen. Die Erkrankung wird metastatischer Gebärmutterhalskrebs genannt.

Zur Behandlung der vorliegenden Erfindung gehört die Verabreichung von DMG oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes desselben an einen Patienten, darunter – aber nicht beschränkt auf – Säuger, einschließlich Menschen. Zu geeigneten Wirten für die erfindungsgemäßen Aspekte der Prävention und Hemmung gehören solche mit genetischer Disposition für die Familienanamnese und/oder die Einwirkung beim Menschen krebsauslösender Agenzien (d.h. Strahlung, Mutagene usw.) für den betreffenden Krebs, also Prostata-, Brust- und/oder Gebärmutterhalskrebs. Die Hemmung der Mutagenese kann selbstverständlich auch bei Wirten erreicht werden, die bereits einen solchen Krebs haben.

Zu einem Aspekt dieser Erfindung gehört die Verabreichung an einen Patienten, z.B. einen Menschen, bei dem Gebärmutterhals-, Brust- und/oder Prostatakrebs diagnostiziert worden ist. Bevorzugt sollte der Tumor noch keine Metastasen gebildet haben. DMG sollte sobald wie möglich verabreicht werden, auch wenn der Krebs oder vermutete Krebs nicht vollständig gekennzeichnet worden ist. Klinische Erfahrungen zeigen, dass die meisten anderen medikamentösen Therapien durch DMG im Allgemeinen nicht gestört werden und unabhängig vom Alter, dem Geschlecht, der Krebsart, oder dem allgemeinen Befinden an den Patienten gegeben werden kann, entweder auf oralem Wege oder intravenös. Man kann erwarten, dass DMG auch den Immunstatus von Krebspatienten mit Gebärmutterhals-, Brust- und Prostatakrebs innerhalb von 10 Tagen verbessert. Positive Anhaltspunkte für eine wirkungsvolle Behandlung gegen Gebärmutterhals-, Brust- und/oder Prostatakrebs sollten bereits in 14–28 Tagen vorliegen.

Das bei der vorliegenden Erfindung verwendete DMG kann gemäß herkömmlicher Methoden der Galenik aufbereitet werden, um Heilmittel zur Verabreichung an Patienten herzustellen, z.B. Säugetiere, darunter Menschen und z.B. andere tierische Lebewesen, die hierin erwähnt sind,.

Das bei der vorliegenden Erfindung verwendete DMG kann in einer Mischung mit herkömmlichen Arzneimittelträgern Anwendung finden, d.h., pharmazeutisch annehmbaren organischen oder anorganischen Trägersubstanzen zur parenteralen, enteralen (z.B. oralen) Applikation, die nicht in schädlicher Weise mit dem Wirkstoff reagieren. Zu den geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Trägern gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Wasser, Salzlösungen, Alkohole, Gummiarabikum, Pflanzenöle, Benzylalkohole, Polyethylenglycole, Gelatine, Kohlenhydrate wie etwa Lactose, Amylose oder Stärke, Magnesiumstearat, Talk, Kieselsäure, dickflüssige Paraffine, Parfümöle, Fettsäuremonoglyceride und -diglyceride, Pentaerythritfettsäureester, Hydroxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidone, usw.. Die pharmazeutische Zubereitung kann sterilisiert werden und, falls gewünscht, mit Hilfsstoffen gemischt werden, z.B. mit Gleitmitteln, Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Benetzungsmitteln, Emulgatoren, Salzen zur Beeinflussung des osmotischen Drucks, Puffern, färbenden, geschmacksbildenden und/oder aromatischen Substanzen und dergleichen, die nicht in schädlicher Weise mit dem Wirkstoff reagieren. Falls gewünscht, können sie auch mit anderen Wirkstoffen kombiniert werden.

Zur parenteralen Anwendung sind insbesondere injizierbare, sterile Lösungen, bevorzugt ölige oder wässrige Lösungen sowie Suspensionen, Emulsionen, oder Implantate geeignet. Ampullen sind zweckmäßige Einheitsdosierungen.

Zur enteralen Anwendung sind insbesondere Tabletten, Dragees, Flüssigkeiten, Tropfen oder Kapseln geeignet.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch brauchbare Formen von N,N-Dimethylglycin, wie hierin offenbart, wie etwa pharmazeutisch annehmbare Salze und Prodrugs von N,N-Dimethylglycin. Zu den pharmazeutisch annehmbaren Salzen gehören solche, in denen die Hauptverbindung als Base fungiert, zum Beispiel Hydrochloride, Methansulfonate, Camphersulfonate, sowie solche, für die die Hauptverbindung als Säure fungiert, zum Beispiel Natrium-, Chloridsalze usw..

Bei Verwendung zur Behandlung oder Hemmung von Metastasen von Gebärmutterhals-, Brust- und Prostatakrebs werden die Verbindungen der Erfindung im Allgemeinen in einer Einheitsdosierungsform, umfassend 1–500 mg/kg/Tag, bevorzugt 20–200 mg/kg/Tag, und meistbevorzugt 50–100 mg/kg/Tag, in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger gegeben. Die tägliche Dosis der erfindungsgemäßen Verbindung liegt bei Verwendung zur Prävention von Metastasen oder zur Prävention der Bildung von Gebärmutterhals-, Brust- und Prostatakrebs im Allgemeinen bei etwa 1–500 mg/kg/Tag, bevorzugt bei 10–100 mg/kg/Tag und meistbevorzugt bei 20–50 mg/kg/Tag. Bei der Behandlung oder Hemmung von Metastasen sind die Dosiswerte im Allgemeinen höher als die Dosiswerte bei der Prävention. Wird eine Remission bei Gebärmutterhals-, Brust- und Prostatakrebs diagnostiziert, können die Dosiswerte auf die Dosiswerte der Prävention verringert werden. Bei oraler Verabreichung kann die Dosierung in Form einer einzelnen oder geteilten Dosierung alle 2–24 Stunden, bevorzugt alle 4 Stunden verabreicht werden; bei intraperitonealer oder intramuskulärer Verabreichung sollte anfangs täglich verabreicht werden, und danach regelmäßig, bevorzugt wenigstens alle drei Tage.

Wie erwähnt, kann DMG gleichzeitig oder abwechselnd mit anderen therapeutischen Behandlungen verabreicht werden, die üblicherweise bei der Krebstherapie angewandt werden, wie z.B. Bestrahlung, Operation, Chemotherapie sowie andere annehmbare Therapien, die die Tumorbelastung verringern sollen.

Selbstverständlich kann die tatsächliche bevorzugte Menge Wirkstoff im speziellen Fall gemäß den bestimmten formulierten Zusammensetzungen, der Art der Anwendung und der besonderen Lage sowie dem zu behandelnden Organismus variieren. Die Dosierungen für einen gegebenen Wirt können mit Hilfe üblicher Überlegungen bestimmt werden, z.B. einem üblichen Vergleich der verschiedenen Wirkungen der Prüfverbindungen mit einem bekannten Mittel, z.B. mit Hilfe eines geeigneten herkömmlichen pharmakologischen Protokolls.

Ohne weiter in Einzelheiten zu gehen, kann angenommen werden, dass der Fachmann unter Hinzuziehen der vorangegangenen Beschreibung die vorliegende Erfindung in vollem Umfang nutzen kann. Die nachfolgenden bevorzugten speziellen Ausführungsformen sind daher lediglich als beschreibend zu betrachten und schränken den übrigen Offenbarungsgehalt in keiner Weise ein.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1 – Dosis-Wirkungs-Effekte der IgG-Sekretionsspiegel bei mit Dimethylglycin (DMG) behandelten V2E9-Zellen

2 – Dosis-Wirkungs-Effekte von Dimethylglycin (DMG) auf die TNF&agr;-Sekretion bei der stimulierten (LPS) THP-1-Zelllinie

3 – Dosis-Wirkungs-Effekte von Dimethylglycin (DMG) auf die IL-1-Sekretion bei der U-937-Zellinie

4 – Dosis-Wirkungs-Effekte von Dimethylglycin (DMG) auf die IL-2-Sekretion bei der Jurkat-E6-1-Zellline

5 – Dosis-Wirkungs-Effekte von Dimethylglycin (DMG) auf die IL-2-Sekretion bei der EL-4-Zelllinie

6 – Dosis-Wirkungs-Effekte von Dimethylglycin (DMG) auf die IL-6-Sekretion bei der LS174T-Zelllinie

7 – Dosis-Wirkungs-Effekte von Dimethylglycin (DMG) auf die TNF &agr;-Sekretion in mononukleären Zellen des peripheren Blutes

8 – Dosis-Wirkungs-Effekte von Dimethylglycin (DMG) auf die IL-1-Sekretion bei mononukleären Zellen von peripherem Blut

9 – Dosis-Wirkungs-Effekte von Dimethylglycin (DMG) auf die IL-2-Sekretion bei mononukleären Zellen von peripherem Blut

10 – Hemmwirkung von Dimethylglycin (DMG)-behandelten und stimulierten (PMA und Ionomycin) Cytokin produzierenden Zelllinien auf die Proliferation von A375.S2-Melanomzellen, wie beim gemeinsamen Kultivieren beobachtet.

11 – Hemmwirkung von mit Dimethylglycin (DMG) behandelten und stimulierten (PMA und Ionomycin) Cytokin produzierenden Zelllinien auf die Proliferation von B16-Melanomzellen, wie beim gemeinsamen Kultivieren beobachtet.

12 – Hemmwirkung der mit Dimethylglycin (DMG) behandelten und stimulierten (PMA und Ionomycin) Jurkat-E6-1-Zelllinie auf die Proliferation von Hs 294T-Melanomzellen, wie beim gemeinsamen Kultivieren beobachtet.

13 – Hemmwirkung von mit Dimethylglycin (DMG) behandelten mononukleären Zellen von peripherem Blut (PBMC) auf die Proliferation von A375.S2-Melanomzellen, wie beim gemeinsamen Kultivieren beobachtet.

14 – Hemmwirkung von mit Dimethylglycin (DMG) behandelten mononukleären Zellen von peripherem Blut (PBMC) auf die Proliferation von Hs 294T- Melanomzellen, wie beim gemeinsamen Kultivieren beobachtet.

15 – Hemmwirkung von Cytokin produzierenden Zelllinien auf die Proliferation von mit Dimethylglycin (DMG) behandelten A375.S2-Melanomzellen, wie beim gemeinsamen Kultivieren beobachtet.

16 – Hemmwirkung von naiven Cytokin produzierenden Zelllinien auf die Proliferation von mit Dimethylglycin (DMG) behandelten B16-Melanomzellen, wie beim gemeinsamen Kultivieren beobachtet.

17 – Hemmwirkung der mit Dimethylglycin (DMG) behandelten Jurkat-E6-1-Zelllinie auf die Proliferation von MCF-7-Brustkrebszellen, wie beim gemeinsamen Kultivieren beobachtet.

18 – Hemmwirkung der mit Dimethylglycin (DMG)-behandelten Jurkat E6-1-Zelllinie auf die Proliferation der T47D-Brustkrebszelllinie, wie beim gemeinsamen Kultivieren beobachtet.

19 – Hemmwirkung von mit Dimethylglycin (DMG) behandelten mononukleären Zellen von peripherem Blut (PBMC) auf die Proliferation der MCF-7-Brustkrebszelllinie, wie beim gemeinsamen Kultivieren beobachtet.

20 – Hemmwirkung von mit Dimethylglycin (DMG) behandelten mononukleären Zellen von peripherem Blut (PBMC) auf die Proliferation der T47D-Brustkrebszelllinie, wie beim gemeinsamen Kultivieren beobachtet.

21 – Dosisabhängige Wirkung von DMG auf die Zytotoxizität von Maus-B16-Melanomzellen.

22 – Dosisabhängige Wirkung von DMG auf die Zytotoxizität humaner Caski-Gebärmutterhalskarzinomzellen.

23 – Dosisabhängige Wirkung von DMG auf die Zytotoxizität humaner Caski-Gebärmutterhalskarzinomzellen.

24 – Dosisabhängige Wirkung von DMG auf die Zytotoxizität humaner SiHa-Gebärmutterhalskarzinomzellen.

25 – Dosisabhängige Wirkung von DMG auf die Zytotoxizität humaner SiHa-Gebärmutterhalskarzinomzellen.

26 – Dosisabhängige Wirkung von DMG auf die Zytotoxizität von prostatischen Adenokarzinomzellen.

Im Vorstehenden und in den nachfolgenden Beispielen sind alle Temperaturangaben unkorrigiert in Grad Celsius angegeben, und falls nichts anderes angegeben ist, sind alle Teile- und Prozentangaben gewichtsbezogen.

Beispiele

Ein Proliferationsassay wurde entwickelt, um die Fähigkeit der mit DMG behandelten Cytokin produzierenden Zellen zur Hemmung des Wachstums von Melanom-Zelllinien, Brustkrebs-Zelllinien, einer Prostatakrebs-Zelllinie sowie Gebärmutterhalskrebs-Zelllinien zu bestimmen. Die Cytokin-Bioassays unter Verwendung von Zellproliferationsassays wurden durchgeführt, um die Modulation der inflammatorischen Cytokin-Produktion durch DMG zu bestimmen. Cytokinbioassays sind in der Fachwelt wohlbekannt. (Thorpe R: Developments in Biological Standardization 1999, 97:61–71 und Mire-Sluis AR: Journal of Immunological Methods 1995, 187 (2):191–199).

Die Zelllinien und murines B16 als Indikatorzellen wurden zur Beobachtung der modulierenden Wirkung von DMG eingesetzt. Die optimale Zellzahl pro Vertiefung für jede Zelllinie wurde nach einem Titrationsassay bestimmt. Stimulierte und unstimulierte Cytokin produzierende Zelllinien (Jurkat E6-1, EL-4, MG-63 und U-937) wurden vor dem Kultivieren mit den Krebszelllinien 24 Stunden lang mit DMG behandelt. Humane Melanom-Zelllinien A375.S2, HS294T; Melanom-Zelllinien B16.F10 der Maus; humane Brustkrebs-Zelllinien MCF-7, BT-20, und T47D; humane Prostata-Zelllinie PC-3 und humane Gebärmutterhals-Zelllinien Caski und SiHa wurden zur Bestimmung der Wirkung von DMG verwendet.

Die vorhergehenden Beispiele können mit gleichem Erfolg wiederholt werden, indem man die allgemein oder speziell beschriebenen Beschichtungen dieser Erfindung durch die in den vorhergehenden Beispielen eingesetzten ersetzt.

Material und Methoden Zelllinien und Zellkulturen

Bei den in der Studie verwendeten Zelllinien handelt es sich um V2E9, THP-1, L-929, U-937, A375.S2, Jurkat E6-1, EL-4, CTLL-2, HT-2, LS174T, 7TD1, MG-63, B16 und Hs 294T. Die Merkmale jeder Zelllinie, darunter die Cytokin-Produktion und/oder -Sensibilität, sind in Tabelle 1 gezeigt.

Alle Zelllinien mit Ausnahme von V2E9 wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) bezogen. Bei V2E9 handelt es sich um ein B-Zellen-Hybridom, das hauptsächlich Maus-IgG gegen die &bgr;1-Subunit von Hühner-Intergrin sezerniert. V2E9-Zellen werden in Ex-Cell-610-Medium (JRH Biosciences) gezüchtet, ergänzt mit 0% oder 10% fötalem Rinderserum (FBS, Gibco BRL) und 1 % Antibiotic-Antimycotic (Gibco BRL). Alle anderen Zelllinien wurden gemäß den ATCC-Empfehlungen unter Berücksichtigung der Medien und der entsprechenden Ergänzungen kultiviert. CTLL-2 und HT-2 sind Cytokin abhängige Zelllinien, die die Zugabe von IL-2 erfordern, wogegen 7TD1 die Zugabe von IL-6 erfordert. Sämtliche Zelllinien wurden bei 37°C in einem luftbefeuchteten Inkubator mit 5% CO2 gezüchtet, mit Ausnahme der Maus-EL-4-Thymomzellen, die 10% CO2 erfordern. V2E9-Zellen wurden so angepasst, dass sie vor den Hybridom-Experimenten in serumfreien Medien allmählich wachsen.

Isolierung von mononukleären Zellen peripheren Blutes (PBMC)

Heparinisiertes peripheres Blut von gesunden Freiwilligen zur Kontrolle wurde entnommen und bei Raumtemperatur (RT) auf Polysucrose-Natriumdiatrizoat (Histopaque 1077, Sigma Chemical Co.) in konischen 15 ml-Röhrchen geschichtet. Diese wurden bei 400 × g 30 Minuten lang zentrifugiert. Die mononukleären Zellen wurden entnommen und in 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Nach 10-minütigem Zentrifugieren bei 250 × g wurde die Salzlösung (PBS) dekantiert und der Waschvorgang wiederholt. Die Zellen wurden in einem Hämozytometer gezählt und auf 2·106 Zellen/ml eingestellt. Diese Zellen wurden später in den Cytokin-Bioassays, beim gemeinsamen Kultivieren sowie in der Durchflusszytometrie verwendet.

Herstellung von Dimethylglycin (DMG)

DMG wurde als 1 M-Lösung durch Lösen von 1,03 g der freien DMG-Base (MG 103,1) in 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (pH 7,4) hergestellt. Diese Lösung wurde unter Verwendung eines 0,22 &mgr; Acrodisc-Filters (Gelman Sciences) filtersterilisiert. Verdünnungsreihen von DMG wurden hergestellt, die von 1 pM bis 1 M reichten. Laut einführender Studien sollte die Aktivität von DMG zwischen 1 mM und 500 mM liegen; daher wurde bei allen Zellkulturen 1 mM bis 100 mM DMG eingesetzt.

Modulation der Antikörper-Produktion in V2E9-Hybridomzellen

Die in serumfreien Medien angepassten V2E9-Zellen wurden geerntet, gezählt und in 24-Loch-Platten in Ex-cell-610-Medium in einer Konzentration von 5106 Zellen/ml überführt. Einhundert &mgr;l zunehmender DMG-Konzentrationen wurden in die Vertiefungen gegeben. Neunhundert &mgr;l des Ex-cell-Mediums wurden zugegeben, um das Gesamtvolumen in jeder Vertiefung auf 2000 &mgr;l zu bringen. Die behandelten V2E9-Zellen und die Kontrollen wurden 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Überstände wurden aus den Vertiefungen entfernt und mittels ELISA zur Bestimmung der IgG-Werte untersucht.

Enzymvermittelter Immunassay zur IgG-Quantifizierung in V2E9-Hybridomen

Affinitätsgereinigte Ziegenantikörper gegen Maus-IgG (Cappel, Organaon Teknika Corp.) wurden in PBS (pH 7,4) auf eine Konzentration von 0,1 &mgr;g/&mgr;l verdünnt. 96-Loch-ELISA-Platten (Coming) wurden mit 100 &mgr;l dieser gepufferten Suspension 1 Stunde bei 37°C beschichtet. Nach einer Stunde wurden die Platten eine weitere Stunde bei Raumtemperatur (RT) luftgetrocknet. Danach wurden die Platten zweimal mit PBS gewaschen. Als nächstes wurden die Platten mit frisch hergestelltem Blotto (Magermilch in PBS) 60 Minuten lang bei 37°C blockiert. Die Platten wurden zweimal mit PBS abgespült und getrocknet. Einhundert &mgr;l der Überstände aus den Vertiefungen der Behandlung und Kontrollen wurden zu den Platten gegeben und eine Stunde bei 37°C zum Inkubieren belassen. Nach der Inkubation wurden die Platten zweimal mit Blotto und PBS gewaschen. Einhundert &mgr;l des Peroxidase-Konjugats von affinitätsgereinigtem Ziegenantikörper gegen Maus-IgG (Cappel, Organaon Teknika Corp.), 1:100 verdünnt in PBS, wurden in jede Vertiefung gegeben. Die Platten wurden 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert und danach viermal mit Blotto und zweimal mit PBS gewaschen. Frischer Farbentwickler [24,3 ml einer 0,1 M Citronensäure (Sigma), 25,7 ml einer 0,2 M Na2HPO4 (Fisher Scientific), 50 ml destilliertes Wasser, 40 mg o-Phenylendiamin (Sigma) und 40 &mgr;l 30% H2O2 (Fisher Scientific)] wurden in jede Vertiefung (100 &mgr;l/Vertiefung) gegeben und 20 Minuten lang im Dunkeln bei RT reagieren lassen. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 50 &mgr;l 2,5 M H2SO4 zu jeder Vertiefung zum Stillstand gebracht. Die Platten wurden mit Hilfe eines BIO-RAD-Benchmark-Microplate-Readers bei 490 nm ausgelesen.

Modulation der Cytokin-Produktion in Zelllinien (Cytokin-Bioassays)

Cytokin-Bioassays unter Verwendung von Zellproliferationsassays wurden durchgeführt, um die Modulation der inflammatorischen Cytokinproduktion durch DMG (House – Development in biological Standardization 1999 (97) 13–19) bewerten. Die Überstände aus der Cytokin produzierenden Zelllinie (unbehandelte Kontrolle und DMG-behandelt) wurden zu den Responder-Zelllinien gegeben, die für dieses Cytokin spezifisch sind. Proliferation oder Hemmung dieser Responder-/Indikatorzellen gibt die Menge Cytokin an, die von den Erzeuger-Zelllinien sezerniert wird. Die optimale Zahl an Zellen/Vertiefung für jede Zelllinie wurde nach einem Titrationsassay bestimmt. Sämtliche Suspensions-Erzeuger-Zelllinien wie etwa THP-1, Jurkat E6-1, EL-4 und U-937 wurden in einer Konzentration of 5106 Zellen/Vertiefung auf 48-Loch-Platten ausplattiert, während die anhaftenden Erzeuger-Zelllinien wie etwa LS174T in einer Konzentration von 5105 Zellen/Vertiefung ausplattiert wurden. Die Suspensions-Responder-Zelllinien (CTLL-2 und 7TD-1) wurden in einer Konzentration von 1·106 Zellen/Vertiefung in einer 96-Loch-Platte, während die anhaftenden Responder-Zelllinien (L-929 und A375.S2) in einer Konzentration von 3·104 Zellen/Vertiefung bzw. 4·104 Zellen/Vertiefung ausplattiert wurden. THP-1 Zellen, die Tumornekrosefaktor alpha (TNF&agr;) bei Stimulierung mit Lipopolysaccharid (LPS) sezernieren, wurden in einem luftbefeuchteten Inkubator mit 5% CO2 mit zunehmenden Konzentrationen von DMG für eine Zeitdauer von 24 Stunden bei 37°C behandelt. Die Überstände von diesen Zellen wurden danach zur Indikator-Zelllinie (L-929) gegeben, die sensitiv gegen TNF&agr; ist. L-929 Zellen wurden anschließend 24 Stunden lang bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 inkubiert. Nach der Inkubation wurde eine MTS-PMS-Lösung (Cell Titer 96 Aqueous Kit, Promega, Madison, WI) in jede Vertiefung wie vom Hersteller (31) empfohlen gegeben. Die Erfassung der Proliferation oder Hemmung geschieht mit einem kolometrischen Assaysystem unter Verwendung des neuartigen Tetrazolium-Reagens, MTS, das über den alternierenden Elektronenakzeptor PMS (Phenazinmethosulfat) in den Mitochondrien lebender Zellen zu einem wasserlöslichen Formazan-Farbstoff reduziert wird. Die Proben wurden nach 4 Stunden mit Hilfe eines BIO-RAD-Benchmark-Microplate-Readers bei 490 nm abgelesen. Die Menge der produzierten Farbe ist direkt proportional zur Anzahl lebensfähiger Zellen. Die Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt und drei bis sechs Mal für jedes Cytokin wiederholt. Ebenso wurden die U-937 Zellen, die konstitutiv Interleukin-1 (IL-1) sezernieren, mit DMG behandelt und die Überstände zur sensitiven Zelllinie A375.S2 gegeben. Auch die Jurkat E6-1- und EL-4-Maus-Thymom-Zellen, die bei Stimulierung mit Ionomycin und Phorbolmyristat-acetat (PMA) IL-2 sezernieren, wurden mit DMG behandelt und die Überstände zur Responder-Zelllinie CTLL-2 gegeben. Schließlich wurden die LS174T-Colon-Adenokarzinom-Zellen, die konstitutiv IL-6 sezernieren, mit DMG behandelt und die Überstände zur Responder 7TD1-Zelllinie gegeben. Modulation der Cytokin-Produktion in mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC)

Die Modulation der inflammatorischen Cytokin-Produktion in mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) durch DMG wurde unter Verwendung von Cytokin-Bioassays bestimmt. Überstände von mit DMG behandelten und unbehandelten PBMC, die bei Stimulierung mit Mitogenen (PMA und/oder Ionomycin) Cytokin produzieren (Erzeuger), wurden zur Responder-Zelllinie gegeben, die spezifisch für das entsprechende Cytokin ist. Proliferation oder Hemmung dieser Indikatorzellen gibt die Menge Cytokin an, die von den Erzeuger-Zelllinien sezerniert wird. Die optimale Zahl an Zellen/Vertiefung für jede Zelllinie wurde nach einem Titrationsassay bestimmt. Die PBMCs wurden in 48-Loch-Platten in einer Konzentration von 5105 Zellen/Vertiefung ausplattiert. Die beim Nachweis von IL-2 verwendete Responder-Zelllinie CTLL-2 wurde in einer Konzentration von 1 106 Zellen/Vertiefung in eine 96-Loch-Platte gegeben. Die anhaftenden Responder-Zelllinien L-929, die zum Nachweis von TNF&agr; dient, und A375.S2, die zum Nachweis von IL-1 dient, wurden in einer Konzentration von 3104 Zellen/Vertiefung bzw. 4104 Zellen/Vertiefung ausplattiert. Die PBMCs wurden mit PMA und Ionomycin zur Produktion von TNF&agr;, IL-1 und IL-2 stimuliert und 24 Stunden lang bei 37°C in einem luftbefeuchteten Inkubator mit 5% CO2 mit zunehmenden Konzentrationen an DMG behandelt. Die Überstände dieser Zellen wurden anschließend zu den Indikator-Zelllinien gegeben; L929: sensitiv gegen TNF&agr;, CTLL-2: ihre Proliferation ist IL-2-abhängig, bzw. A375.82: sensitiv gegen IL-1. Diese Indikator-Zelllinien wurden 24 Stunden lang bei 37°C in einem luftbefeuchteten Inkubator mit 5% CO2 inkubiert. Nach der Inkubation wurde eine MTS-PMS-Lösung (Cell Titer 96 Aqueous Kit, Promega, Madison, WI) in jede Vertiefung wie vom Hersteller (31) empfohlen gegeben. Die Erfassung der Proliferation oder Hemmung geschieht mit einem kolometrischen Assaysystem unter Verwendung des neuartigen Tetrazolium-Reagens, MTS, das über den alternierenden Elektronenakzeptor PMS (Phenazinmethosulfat) in den Mitochondrien lebender Zellen zu einem wasserlöslichen Formazan-Farbstoff reduziert wird. Die Proben wurden 4 Stunden lang mit Hilfe eines BIO-RAD-Benchmark-Microplate-Readers bei 490 nm abgelesen. Die Menge der produzierten Farbe ist direkt proportional zur Anzahl lebensfähiger Zellen. Die Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt und drei bis sechs Mal für jedes Cytokin wiederholt.

Modulation der Brust-, Gebärmutterhals und Prostata-Zellproliferation beim gemeinsamen Kultivieren mit DMG-behandelten, Cytokin produzierenden Zelllinien und mit DMG-behandelten PBMC

Ein Proliferationsassay wurde entwickelt, um die Fähigkeit der mit DMG behandelten Cytokin produzierenden Zellen zu bestimmen, das Wachstum der humanen Brustkrebs-Zelllinien MCF-7, BT20 und T47D, der humanen Prostata Zelllinie PC-3, der humanen Caski- und SiHa-Gebärmutterhalskrebs-Zelllinien sowie Melanom-Zelllinien zu hemmen. Drei Melanom-Zelllinien, humane A375.S2 und Hs294T sowie murine B16 als Indikator-Zellen wurden eingesetzt, um die modulierende Wirkung von DMG zu beobachten. Die optimale Anzahl Zellen/Vertiefung für jede Zelllinie wurde nach einem Titrationsassay bestimmt. Stimulierte und unstimulierte Cytokin produzierende Zelllinien (Jurkat E6-1, EL4, MG-63 und U-937) wurden vor dem Kultivieren mit den Melanomzellen 24 Stunden lang mit DMG behandelt. Auch PBMC wurden mit DMG behandelt und mit den Melanomzellen kultiviert. Um die genaue Bedeutung von DMG bei der vermittelten Melanom-Hemmung abzuschätzen, wurden die Melanom-Zellen (B16 und A375.S2) vor dem Kultivieren der Cytokin produzierenden Zellen für eine Dauer von 24 Stunden mit DMG vorbehandelt.

Modulation der inflammatorischen Cytokin-Produktion in Zelllinien

Anschließend wurde DMG auf seine Fähigkeit untersucht, die Cytokinexpression in monozytischen und lymphozytischen Zelllinien zu modulieren. Die Ergebnisse der Cytokinbioassays (26) zeigten, dass die inflammatorischen Cytokinspiegel durch DMG auf dosisabhängige Weise signifikant erhöht wurden. Einhundert mM DMG erhöhten die TNF&agr;-Spiegel signifikant um 7% über den Spiegel der Baseline-Kontrolle wie durch die Proliferation des L-929-Sensitiven (2) gemessen. Behandlungen mit 10 mM und 100 mM DMG erhöhten bei U-937-Zellen, die IL-1 konstitutiv sezernieren, die IL-1-Sekretionsspiegel. Diese Zunahme bei IL-1 wird durch eine Abnahme bei der Proliferation der sensitiven A375.S2-Zellen (3) nachgewiesen. DMG-Behandlungen mit 10 mM und 100 mM führten zu einem signifikanten Anstieg von 4,5% bzw. 6,5%. Vergleichbare Ergebnisse wurden auch erhalten bei Jurkat E6-1- und EL-4-Zellen, die IL-2 sezernieren. Die Überstände der DMG-behandelten Jurkat-E6-1- und EL-4-Zellsuspensionen induzierten erhöhte Proliferationsraten bei der CTLL-2-Zelllinie, was auf gesteigerte IL-2-Sekretionsspiegel hinweist. Die signifikante Zunahme der IL-2-Spiegel bei den Jurkat E6-1- und EL-4-Überständen wurden bei der Behandlung mit 100 mM DMG beobachtet, was zu einer Zunahme der Proliferation von CTLL-2 um 10% und 6% führte, während die Behandlung mit 10 mM DMG eine Erhöhung der IL-2- Sekretion in diesen beiden Zelllinien um 3% und 2,5% (4 und 5) ergab. Ebenso wurden die IL-6-Produktionsspiegel in LS174T in Gegenwart von 100 mM DMG (6) signifikant um 7% erhöht.

Modulation der Cytokinexpression in mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC)

PMBC wurden mit PMA und Ionomycin stimuliert und zur Analyse der Spiegel der inflammatorischen Cytokine mit variierenden Dosen DMG versetzt. Die Ergebnisse der Cytokinbioassays (79) zeigen die Wirkung von DMG bei der Erhöhung der inflammatorischen Cytokinsekretion in dosisabhängiger Weise. Bei einer Konzentration von 100 mM DMG, nahm TNF&agr; signifikant um 9% gegenüber der stimulierten Baseline-Kontrolle zu, wie durch die erhöhte Proliferation der L-929-Indikatorzellen (7) gemessen. Auch die IL-1- und IL-2-Expressionsstärke wurde in PBMC in Gegenwart von 100 mM DMG signifikant um 8% bzw.10% erhöht, wie durch die Wachstumsrate der A375.S2- und HT-2-Responder-Zelllinie beobachtet.

Modulation der Tumorzellproliferation durch DMG

Da DMG die inflammatorische Cytokinproduktion in Zelllinien und in PBMC (29) moduliert, wurde die Verbindung hinsichtlich ihrer Fähigkeit untersucht, indirekt das Wachstum der Melanom-Zelllinien zu beeinflussen. In dieser Studie wurden Cytokin produzierende Zellen (Jurkat EB-1, EL-4, U-937 und MG-63) mit Ionomycin und Phorbol-myristat-acetat (PMA) stimuliert, mit DMG behandelt und mit den Melanom-Zelllinien (A375.S2, Hs 294T und B16) gemeinsam kultiviert. Die 1021 zeigen die Wirkung dieser Zelllinien bei der Hemmung der Melanom-Zelllinien. DMG verbessert die IL-2-Sekretion in Jurkat E6-1, die zu einer erhöhten Hemmung der Melanomzellen um 8% gegenüber der stimulierten Baseline-Kontrolle führte. Mit DMG behandeltes U-937 exprimierte mehr IL-1, was sich durch eine 30%ige Abnahme bei der Proliferation der sensitiven A375.S2-Zellen zeigte. MG-63, die bei Stimulierung IFN-&bgr; produzieren, zeigten ebenfalls erhöhte Werte der Melanom-Hemmung. Eine ähnliche Hemmwirkung wurde bei der B16- und der Hs 294T-Melanom-Zelllinie beobachtet, die gemeinsam mit DMG-behandelten Jurkat E6-1-, EL-4- und U-937-Zelllinien kultiviert wurden.

Um nachzuweisen, ob die cytokinabhängige Melanom-Hemung auch durch PBMC erzeugt wird, wurden diese Zellen mit Ionomycin und PMA stimuliert und anschließend mit zunehmenden Konzentrationen von DMG behandelt, gefolgt von Cokultivieren mit A375.S2- und Hs 294T-Melanom-Zellen. Signifikante dosisabhängige Abschwächungen der A375.S2-Proliferation wurden in DMG-behandelten PBMC nachgewiesen. Mit 100 mM DMG behandeltes PBMC führte zu einer signifikanten Proliferationsabnahme beim Wachstum der Melanomzellen um 17% gegenüber der stimulierten Baseline-Kontrolle. 14 stellt die dosisabhängige Wirkung von DMG bei der Verstärkung der Melanom-Hemmung durch PBMC dar, wobei eine signifikante Hemmwirkung von 13% gegenüber der Kontrolle bei einem Wert von 100 mM DMG beobachtet wurde.

Es wurden Studien unter Vorbehandlung der Melanom-Zelllinien mit DMG durchgeführt, um die Art der durch Cytokin produzierende Zellen induzierten Hemmung des Melanomwachstums zu verstehen. Diese Verminderung der Wachstumsrate könnte zunächst ein Ergebnis der erhöhten Produktion inflammatorischen Cytokins oder ein dualer Effekt sein, der auf dem Zell-Zell-Kontakt und der Expression von Oberflächenfaktoren sowie Cytokinen beruht.

Die Fähigkeit der Cytokin produzierenden Zellen, die Melanomzellen-Hemmung auch ohne direkte DMG-Behandlung zu erleichtern, ist in den 1516 gezeigt. Die Fähigkeit, Melanomzellen abzutöten, ist ein Hinweis auf den Zell-Zell-Kontakt und/oder die Expression von Oberflächenfaktoren. Spezies-Spezifität bei der Hemmung des Melanomwachstums wurde in 16 beobachtet. Maus-EL-4-Thymomzellen, die IL-2 sezernieren, hemmen Maus-B16-Melanomzellen signifikanter als die ebenfalls IL-2 produzierenden humanen Jurkat E-6.

Die humanen Brustkrebs-Zelllinien MCF-7, BT-20 und T47D, die humanen Prostatakrebs-Zelllinie PC-3, die humanen Caski- und SiHa-Gebärmutterhalskrebs-Zelllinien und drei Melanom-Zelllinien, humane A375.S2 und Hs 294T und murine B16, wurden bei den Cokultur-Experimenten eingesetzt. Die DMG-behandelte humane Jurkat E6-1-Zelllinie zeigte eine ähnliche signifikante Fähigkeit zur Hemmung von Brustkrebszellen wie bei Melanomzellen (17 und 18).

Beispiel I

Die Jurkat E6-1-Zelllinie wurde vor dem Kultivieren mit der humanen Duktus-Adenokarzinom-Zelllinie T47D 24 Stunden lang mit DMG behandelt. Die Hemmung der T47D-Zellen folgte einer typischen dosisabhängigen Wirkung (18).

Beispiel II

Die Jurkat E6-1-Zelllinie wurde vor dem Kultivieren mit der Mammakarzinom-Zelllinie MCF-7 24 Stunden lang mit DMG behandelt. Die Hemmung der MCF-7-Zellen folgte einer typisch dosisabhängigen Wirkung (17).

Beispiel III

DMG-behandelte, stimulierte PMBC wurden gemeinsam mit der MCF-7-Zelllinie kultiviert. DMG-behandelte PMBC zeigten eine Dosis-Wirkungs-Hemmung der Zelllinien (19).

Beispiel IV

DMG-behandelte, stimulierte PMBC wurde gemeinsam mit der T47D-Zelllinie kultiviert. DMG-behandelte PMBC zeigten eine Dosis-Wirkungs-Hemmung der Zelllinien (20).

Beispiel V

Die Jurkat-E6-1-Zelllinie wurde vor dem Kultivieren mit Caski, einer humanen zervikalen Zelllinie, 24 Stunden lang mit DMG behandelt. Die DMG-behandelte humane Jurkat-E6-1-Zelllinie zeigte eine Dosis-Wirkungs-Hemmung der Zelllinien (2223).

Beispiel VI

Die Jurkat-E6-1-Zelllinie wurde vor dem Kultivieren mit SiHa, einer humanen zervikalen Zelllinie, 24 Stunden lang mit DMG behandelt. Die DMG-behandelte humane Jurkat-E6-1-Zelllinie zeigte eine Dosis-Wirkungs-Hemmung der Zelllinien (2426).

Beispiel VII

DMG-behandelte, stimulierte PMBC wurden gemeinsam mit der prostatischen Adenokarzinom-Zelllinie PC-3 kultiviert. DMG-behandelte PMBC zeigten eine Dosis-Wirkungs-Hemmung der Zelllinien (26).


Anspruch[de]
Verwendung von N,N-Dimethylglycin oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes desselben für die Herstellung eines Medikaments zur Hemmung von Metastasen von Gebärmutterhals-, Brust- oder Prostatakrebs bei einem Patienten. Verwendung nach Anspruch 1 für die systemische oder orale Verabreichung. Verwendung nach Anspruch 1 für die Verabreichung in einer Menge von 1 bis 500 mg/kg/Tag, vorzugsweise in einer Menge von 20 bis 200 mg/kg/Tag. Verwendung von N,N-Dimethylglycin oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes desselben für die Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Bildung von Gebärmutterhals-, Brust- oder Prostatakrebszellen bei einem Patienten oder zur Verringerung der Gefahr von Gebärmutterhals-, Brust- oder Prostatakrebs bei einem Patienten, bei dem ein Risiko für Gebärmutterhals-, Brust- oder Prostatakrebs besteht. Verwendung nach Anspruch 4 für die Verabreichung an einen Patienten, bei dem kein Krebs vorliegt. Verwendung nach Anspruch 1 oder 4 für die Verabreichung im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger. Verwendung nach Anspruch 4 für die systemische oder orale Verabreichung. Verwendung nach Anspruch 4 für die Verabreichung von N,N-Dimethylglycin in einer Menge von 1 bis 500 mg/kg/Tag, vorzugsweise in einer Menge von 10 bis 100 mg/kg/Tag. Verwendung von N,N-Dimethylglycin oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes desselben für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Gebärmutterhals-, Brust- oder Prostatakrebs bei einem Patienten. Verwendung nach Anspruch 9 für die systemische oder orale Verabreichung. Verwendung nach Anspruch 9 für die Verabreichung in einer Menge von 1 bis 500 mg/kg/Tag, vorzugsweise in einer Menge von 20 bis 200 mg/kg/Tag.






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