PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69835268T2 23.11.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000921198
Titel VERFAHREN ZUM ENZYMATISCHEN NACHWEIS EINES VERZUCKERUNGSPROTEINS
Anmelder ARKRAY, Inc., Kyoto, JP
Erfinder ISHIMARU, Ltd., Kaori-Kyoto Daiichi Kagaku Co., Kyoto-shi,Kyoto 601-8045, JP;
OOISHI, Ltd., Katsutaka-Kyoto Daiichi Kagaku Co., Kyoto-shi,Kyoto 601-8045, JP;
FUKUYA, Ltd., Hiroshi-Kyoto Daiichi Kagaku Co., Kyoto-shi,Kyoto 601-8045, JP;
OKAMURA, Ltd., Akihiko-Kyoto Daiichi Kagaku Co., Kyoto-shi,Kyoto 601-8045, JP
Vertreter Grünecker, Kinkeldey, Stockmair & Schwanhäusser, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69835268
Vertragsstaaten DE, FR, GB, IT
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 24.04.1998
EP-Aktenzeichen 989176789
WO-Anmeldetag 24.04.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/JP98/01904
WO-Veröffentlichungsnummer 1998048043
WO-Veröffentlichungsdatum 29.10.1998
EP-Offenlegungsdatum 09.06.1999
EP date of grant 19.07.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 23.11.2006
IPC-Hauptklasse C12Q 1/26(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 9/62(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12Q 1/37(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Messen eines glykierten Proteins unter Verwendung von Fructosylaminosäureoxidase (hierin nachstehend als "FAOD" bezeichnet). Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren, das zum Messen eines glykierten Proteins mit größerer Genauigkeit und hoher Empfindlichkeit befähigt ist und in einfacher Weise auf die klinische Untersuchung (oder die klinische diagnostische Prüfung) usw. anwendbar ist, und sie bezieht sich auch auf eine Protease, die geeigneterweise für ein solches Messverfahren verwendbar ist.

Stand der Technik

Ein glykiertes Protein ist eine Substanz, die durch die nicht-enzymatische und irreversible Bindung der Aminogruppe einer ein Protein aufbauenden Aminosäure mit der Aldehydgruppe eines reduzierenden Zuckers, wie Aldose, hergestellt wird. Eine solche nichtenzymatische und irreversible Bindungsreaktion wird auch als "Amadori-Umlagerung" bezeichnet, und daher kann das vorstehend genannte glykierte Protein in einigen Fällen auch als "Amadori-Verbindung" bezeichnet werden.

Die Bildungsrate des glykierten Proteins hängt allgemein von der Konzentration des Proteins und des reduzierenden Zuckers als Ausgangsmaterialien zum Herstellen des vorstehenden glykierten Proteins, der Kontaktzeit zwischen diesen Ausgangsmaterialien und der Temperatur zur Zeit der Glykierungsreaktion ab. Natürlich wird mit der Erhöhung der Menge des vorstehenden Proteins und des reduzierenden Zuckers, mit der Erhöhung der Kontaktzeit zwischen ihnen oder der Temperaturerhöhung (innerhalb eines Bereiches derart, dass das Protein nicht denaturiert wird) die Bildungsrate des glykierten Proteins als Reaktionsprodukt erhöht, und die Menge des Reaktionsprodukts wird ebenfalls erhöht.

Da sich andererseits in einem lebenden Organismus (oder "in vivo") die Konzentration des glykierten Proteins abhängig von der Halbwertszeit des Proteins als Ausgangsmaterial für die vorstehende Glykierungsreaktion ändert, können verschiedene Arten von Information über den lebenden Organismus durch Messen der Konzentration des glykierten Proteins erhalten werden.

Unter den vorstehend genannten glykierten Proteinen wird z.B. ein Fructosylaminderivat, hergestellt durch die Glykierung von Hämoglobin in Blut, als "Glykohämoglobin" bezeichnet, ein durch die Glykierung von Albumin hergestelltes Produkt wird als "Glykoalbumin" bezeichnet, und ein Derivat (mit reduzierender Fähigkeit), hergestellt durch die Glykierung von Protein in Blut, wird als "Fructosamin" bezeichnet.

Da die Konzentration dieser glykierten Proteinderivate in Blut die mittlere Konzentration von Blutzucker in einem lebenden Organismus für einen bestimmten Zeitraum in der Vergangenheit widerspiegelt, kann der gemessene Wert der Konzentration des vorstehenden glykierten Proteinderivats in Blut ein signifikanter Indikator für die Diagnose des Symptoms von Diabetes und der Überwachung oder der Kontrolle eines solchen Symptoms sein. Demgemäß ist es auch unter einem klinischen Gesichtspunkt sehr nützlich, ein Verfahren zum Messen der Konzentration des glykierten Proteins in Blut zu etablieren.

Bisher ist es bekannt gewesen, dass ein glykiertes Protein in einer Probe (oder einem Prüfpräparat) gemessen werden kann, z.B. indem eine Oxidoreduktase auf das glykierte Protein einwirken gelassen und die Menge des in dieser Reaktion verbrauchten Sauerstoffs oder die Menge des Produkts (wie Wasserstoffperoxid) auf der Grundlage der Wirkung der Oxidoreduktase gemessen wird (es können z.B. die japanische Patentveröffentlichung (JP-B; "Kokoku") Hei-5-33997 (d.h. 33997/1993), JP-B Hei-6-65300 und die japanischen Offenlegungsschriften (JP-A; "Kokai") Hei-2-195900, JP-A Hei-3-155780, JP-A Hei-4-4874, JP-A Hei-5-192193, JP-A Hei-6-46846, JP-A Hei-7-289253, JP-A Hei-8-154672 und JP-A Hei-8-336386 genannt werden).

Darüber hinaus ist ein Verfahren zum Messen eines glykierten Proteins zum Zweck der Diagnose von Diabetes bekannt (es können JP-A Hei-2-195899, JP-A Hei-2-195900, JP-A Hei-5-192193 entsprechend der europäischen Patentveröffentlichung EP 0526150A, JP-A Hei-6-46846 entsprechend EP 0576838A, JP-A Hei-7-289253, JP-A Hei-8-154672 und JP-A Hei-8-336386 genannt werden).

Im Allgemeinen wird eine enzymatische Reaktion unter Verwendung eines glykierten Proteins als Substrat durch die folgende Reaktionsgleichung wiedergegeben: (worin R1 einen Aldoserest eines reduzierenden Zuckers bedeutet und R2 einen Rest einer Aminosäure, eines Proteins oder eines Peptids bedeutet).

Als Enzym, das eine Reaktion unter Verwendung des vorstehenden glykierten Proteins als Substrat katalysiert, sind FAODs (Fructosylaminosäureoxidasen) aus verschiedenen Mikroorganismenarten bekannt. Unsere Forschungsgruppe hat bereit FAODs aus Mikroorganismen erhalten, die zu der Gattung Fusarium, zu der Gattung Gibberella, zu den Gattungen Penicillium usw. gehören, und hat gezeigt, dass diese FAODs zum Messen eines glykierten Proteins verwendbar sind (es können JP-A Hei-7-289253, JP-A Hei-8-154672 und JP-A Hei-8-336386 genannt werden).

Unter den vorstehend genannten verschiedenen Arten von FAODs haben die FAOD aus Fusarium oxysporum S-1F4 (hierin nachstehend als "FAOD-S" bezeichnet) und die FAOD aus Gibberella fujikuroi (hierin nachstehend als "FAOD-G" bezeichnet) eine Aktivität auf Fructosyllysin und/oder Fructosylpolylysin, und es ist daher festgestellt worden, dass diese Enzyme zum Messen von menschlichem Serum oder menschlichem glykiertem Albumin verwendbar sind (JP-A Hei-7-289253).

Demgemäß wird erwartet, dass, falls ein Verfahren zum Messen eines glykierten Proteins unter Verwendung dieser FAODs etabliert wird, das vorstehend genannte Verfahren unter Verwendung von FAOD auf eine allgemein verwendbare Untersuchungsvorrichtung anwendbar wird, und dass ein solches Messverfahren mit niedrigeren Kosten in einem kürzeren Zeitraum im Vergleich mit den herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden kann, wie ein Verfahren unter Verwendung von HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatografie) und ein Verfahren unter Verwendung von Antikörper. Ferner wird es in einem solchen Fall möglich, das glykierte Protein in einer Komponente eines lebenden Organismus unter Ausnutzung der Spezifität des vorstehenden FAOD-Enzyms genau zu messen, und daher wird die Messung des glykierten Proteins unter Verwendung des FAOD-Enzyms für die Reihenuntersuchung in einer ärztlichen Untersuchung oder einem kurativen Marker für Diabetiker in Betracht gezogen.

Bei der Messung eines glykierten Proteins unter Verwendung von FAOD ist es bevorzugt, dass das glykierte Protein als Substrat wirksam an die Substratbindungsstelle des FAOD als Enzym (oder Katalysator) gebunden wird. Um die Rate der enzymatischen Reaktion zu erhöhen, ist es demgemäß wichtig, das Substrat so zu konzipieren, dass es die Wirksamkeit der vorstehenden Bindung verstärkt. Der Grund hierfür ist, dass das FAOD eine Neigung derart hat, dass es eine höhere Aktivität auf ein glykiertes Peptid (mit einem niedrigeren Molekulargewicht als dasjenige von Protein) als die Aktivität auf ein glykiertes Protein hat, und eine noch höhere Aktivität auf eine glykierte Aminosäure (mit einem noch niedrigeren Molekulargewicht als dasjenige des Peptids) als die Aktivität auf ein glykiertes Peptid hat.

Mit Bezug auf FAOD ist es bekannt, dass die Reaktionsrate für das vorstehend genannte FAOD durch Umwandeln eines glykierten Proteins, das in einer Komponente eines lebenden Organismus vorhanden ist, in entsprechende kleine Fragmente (d.h. eine Abnahme des Molekulargewichts des Proteins) durch Verwendung einer Protease erhöht wird. Wie vorstehend beschrieben, ist es theoretisch möglich, eine Protease zu verwenden, die das glykierte Protein vollständig zu Aminosäuren verdaut oder fragmentiert, da die glykierten Aminosäuren im Hinblick auf die Affinität des Substrats zu FAOD am bevorzugtesten sind. Ein solches Verfahren hat jedoch ein Problem, dass es eine beträchtlich lange Zeit für die Fragmentierungsbehandlung des Proteins zu Aminosäuren erfordert. Demgemäß ist es bevorzugt, eine Protease zu verwenden, die selektiv das glykierte Protein an der Stelle einer in dem Protein vorhandenen glykierten Aminosäure spaltet, im Hinblick auf das Gleichgewicht zwischen der Affinität der FAOD mit dem Substrat und der für die Verdauung oder Fragmentierung erforderlichen Zeit.

Es gibt jedoch zahlreiche Arten von Proteasen, und die Größe oder Dimension des Substrats, die für die enzymatische Reaktion der FAOD geeignet ist, kann abhängig von der Art der mit der Protease zu kombinierenden FAOD variieren. Demgemäß unterliegen in der Praxis bevorzugte Kombinationen von Protease und FAOD beträchtlichen Beschränkungen.

In dem vorstehend genannten technischen Gebiet ist es bekannt, dass verschiedene Arten von Proteasen in Kombination mit bestimmten Arten von FAODs verwendbar sind, und solche Proteasen werden grob in Proteasen vom Endotyp und Proteasen vom Exotyp klassifiziert.

Die erstere Protease vom Endotyp ist ein Enzym, das ein Protein von seiner Innenseite her abbaut. Spezielle Beispiele davon umfassen Trypsin, &agr;-Chymotrypsin, Subtilisin, Proteinase K, Papain, Cathepsin B, Pepsin, Thermolysin, Protease XIV, Protease XVII, Protease XXI, Lysylendopeptidase, Prolether, Bromelain F usw.

Andererseits ist die letztere Protease vom Exotyp ein Enzym, das eine Peptidkette von ihrem Ende her sequenziell abbaut. Spezielle Beispiele davon umfassen Aminopeptidase, Carboxypeptidase usw.

EP 0 678 576 A, EP 0 709 457 A und Yoshida et al., Eur. J. Biochem. 242 (3), 499–505 (1996) beschreiben alle ein Verfahren zum Messen eines glykierten Proteins, indem FAOD auf eine ein glykiertes Protein enthaltende Probe wirken gelassen wird, worin das glykierte Protein mit einer Protease behandelt wird.

JP-A Hei-5-192193 beschreibt als Proteasen, die zum Messen eines glykierten Proteins verwendbar sind, Proteinase K, Pronase E, Ananin, Thermolysin, Subtilisin und Kuhpankreas-Proteasen. Tatsächlich wird die in JP-A Hei-5-192193 beschriebene Protease der Fragmentierungsbehandlung eines in einer Probe vorhandenen glykierten Proteins unterworfen und wird dann durch 30-minütige Inkubation bei 55°C inaktiviert. Der Grund für die Inaktivierung der Protease ist, die Fragmentierung von FAOD per se als Katalysator durch die Protease im Verlauf des nächsten Schritts der Reaktion zwischen dem glykierten Protein und der FAOD zu unterdrücken oder zu verhindern.

Falls die FAOD per se als Katalysator fragmentiert wird, wird natürlich die durch die Wirkung der FAOD auf das glykierte Protein verbrauchte Sauerstoffmenge oder die gebildete Wasserstoffperoxidmenge verringert, und als Ergebnis wird die Empfindlichkeit zum Nachweis des glykierten Proteins erniedrigt. Da eine solche Fragmentierung der FAOD auch eine Wirkung auf die Genauigkeit der Messergebnisse des glykierten Proteins per se hat, ist ferner die vorstehend genannte Inaktivierungsbehandlung der Protease allgemein als eine wesentliche Behandlung betrachtet worden, so lange die Protease in Kombination mit der FAOD verwendet wird.

Es ist jedoch nicht einfach, eine Protease, welche das vorstehend genannte Erfordernis (d.h. ihr bevorzugtes Anpassen an die FAOD) erfüllt, aus bekannten Proteasen auszuwählen. So lehrt z.B. JP-B Hei-5-33997 keine spezifische Protease, und JP-A Hei-5-192193 beschreibt lediglich Proteasen (Protease K, Protease E), die in Kombination mit Ketoaminoxidase zu verwenden sind, die aus der Gattung Debliomyces erhalten worden ist.

So wurde gemäß den Versuchen der Erfinder der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass, wenn ein in einer Probe vorhandenes glykiertes Protein tatsächlich mit der in der vorstehenden JP-A Hei-5-192193 beschriebenen Protease behandelt wird, die Protease dann durch 30-minütiges Erwärmen auf 55°C inaktiviert wurde, und die FAOD mit dem erhaltenen Produkt umgesetzt wurde, die Wasserstoffperoxidmenge als Reaktionsprodukt oder die verbrauchte Sauerstoffmenge in der Reaktion gering ist und als Ergebnis die Nachweisempfindlichkeit unzureichend ist.

Proteasen können nicht nur durch Wärmedenaturierung durch Erwärmen sondern auch durch die Zugabe eines Inhibitors inaktiviert werden. Es gibt jedoch einige Kombinationen einer Protease und eines Inhibitors, welche die Protease nicht vollständig inaktivieren können (d.h. worin noch ein bestimmter Grad von Proteaseaktivität zurückbleibt).

Die vorgenannte Inaktivierung der Protease basiert auf dem Phänomen, dass der Inhibitor an das aktive Zentrum der Protease bindet, an welche das Substrat zu binden ist. Um den Inhibitor an das aktive Zentrum der Protease binden zu lassen, ist es notwendig, den Inhibitor zu dem Reaktionssystem nach der Vervollständigung der Proteasereaktion zuzusetzen und dann nach der Zugabe des Inhibitors eine Reaktion bei einer bestimmten Temperatur für eine bestimmte Zeit ablaufen zu lassen. Demgemäß erhöht sich die für die gesamte Messung des glykierten Proteins erforderliche Zeit um die für die Inaktivierungsreaktion der Protease erforderliche Zeit.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum enzymatischen Messen eines glykierten Proteins bereitzustellen, das die im Stand der Technik aufgetretenen Probleme lösen kann, und ein Enzym bereitzustellen, das bevorzugt auf ein solches Messverfahren anwendbar ist.

Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Messen eines glykierten Proteins mit besserer Genauigkeit und höherer Empfindlichkeit bereitzustellen, und ein Enzym bereitzustellen, das bevorzugt auf ein solches Messverfahren anwendbar ist.

Beschreibung der Erfindung

Als Ergebnis intensiver Untersuchung haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass eine spezifische Protease eine gute Anpassung an eine FAOD ergibt, die zum Messen eines glykierten Proteins (wie glykiertes Albumin) in einer Komponente eines lebenden Organismus in verschiedenen Aspekten geeignet ist, wodurch das glykierte Protein mit Genauigkeit und hoher Empfindlichkeit gemessen werden kann, und dass eine solche Kombination sehr gut zum Lösen der vorstehend genannten Aufgabe geeignet ist.

Die hierin beschriebene Protease basiert auf der vorstehenden Feststellung und ist eine Protease, die zum Messen eines glykierten Proteins in einer Probe in Kombination mit FAOD (Fructosylaminosäureoxidase) zu verwenden ist.

Die vorstehende Erfindung stellt ein Verfahren zum Messen eines glykierten Proteins durch Einwirkenlassen von FAOD auf eine ein glykiertes Protein enthaltende Probe bereit, worin das glykierte Protein mit einer Protease unter saurer Bedingung behandelt wird.

Die vorstehende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Messen eines glykierten Proteins bereit, indem Protease und FAOD auf ein glykiertes Protein einwirken gelassen wird, worin eine Protease aus der Gattung Aspergillus als Protease verwendet wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1 ist eine grafische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Konzentration von glykiertem Albumin und der erhaltenen Extinktion (glykierte Albuminmessung-Albuminreagens) in dem hierin nachstehend folgenden Beispiel zeigt.

2 ist eine grafische Darstellung, welche die pH-Abhängigkeit der relativen Aktivität einer Protease (Optimum-pH von A. melleus BP-6277-Protease) in dem Beispiel zeigt.

3 ist eine grafische Darstellung, welche die Temperaturabhängigkeit der relativen Aktivität einer Protease (Temperaturabhängigkeit von A. melleus BP-6277-Protease) in dem Beispiel zeigt.

4 ist eine grafische Darstellung, welche die Ergebnisse der Messung von Glykierungsverhältnissen von HSA unter Verwendung einer im Handel erhältlichen Protease (Handelsbezeichnung: Sumizyme MP) in Kombination mit FAOD-S (Messung des Glykierungsverhältnisses mit Sumizyme MP/FAOD-S) in dem Beispiel zeigt.

5 ist eine grafische Darstellung, welche die Ergebnisse der Messung von Glykierungsverhältnissen von HSA unter Verwendung der in dem Beispiel erhaltenen Protease mit der FAOD-S (Messung der Glykierungsverhältnisse unter Verwendung von A. melleus BP-6277/FAOD-S) zeigt.

6 ist eine grafische Darstellung, welche die relativen Aktivitätswerte einer in dem Beispiel erhaltenen Säureprotease bei verschiedenen pH-Werten zeigt mit der Maßgabe, dass der Aktivitätswert der Säureprotease bei pH 5 (Optimum-pH) als "100" (Referenz) bezeichnet wird.

7 ist eine grafische Darstellung, welche die relativen Aktivitätswerte einer in dem Beispiel erhaltenen Säureprotease bei verschiedenen Temperaturen zeigt mit der Maßgabe, dass der Aktivitätswert der Säureprotease bei 50°C (Optimumtemperatur) als "100" bezeichnet wird.

8 ist eine grafische Darstellung, welche die Ergebnisse der Extinktionsmessung auf der Grundlage der FAOD-Reaktion mit Bezug auf verschiedene Glykierungsverhältnisse von HSA (menschliches Serumalbumin) in dem Beispiel zeigt.

Beste Ausführungsform zum Durchführen der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wird hierin nachstehend im Einzelnen mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen, wie erwünscht, beschrieben.

(Probe)

In dem Messverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, irgendeine Probe (oder ein Prüfpräparat), die ein glykiertes Protein (typischerweise eine von einem lebenden Organismus gebildete oder aus ihm entnommene Probe) enthält, zu verwenden. Spezielle Beispiele der Probe können solche Proben aus einem lebenden Organismus umfassen, wie Blut (Gesamtblut, Plasma oder Blutserum) und Urin.

Im Allgemeinen kann die Behandlung der vorstehend genannten Probe mit einer Protease gemäß einem von dem entsprechenden Lieferanten erhältlichen Instruktionshandbuchs durchgeführt werden. So ist es z.B. bevorzugt, die Probe mit der Protease in einem Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) etwa 30 Minuten bei 50°C in dem Fall des hierin nachstehend erscheinenden Sumizyme MP (Handelsbezeichnung, hergestellt von Sin Nippon Kagaku Kogyo Co. Ltd.) oder bei 37°C in dem Fall der Protease XIV (Handelsbezeichnung, hergestellt von Sigma Co.) als die vorstehend genannte Protease zu inkubieren.

(Protease)

In der vorliegenden Erfindung ist es im Hinblick auf den Erhalt einer guten Nachweisempfindlichkeit bevorzugt, die Protease zum Verdauen oder Fragmentieren eines glykierten Proteins in einer Probe in Übereinstimmung mit einer in Kombination damit zu verwendenden FAOD auszuwählen.

Als vorstehend genannte Protease ist es möglich, eine Art von Protease oder mehrere Arten von Proteasen in einer Kombination oder in einer Mischung davon zu verwenden. Derzeit ist es, wie erwünscht, auch möglich, mehrere Arten von Proteasen so zu verwenden, dass sie ein glykiertes Protein spezifischer fragmentieren und die Empfindlichkeit des Nachweises verstärken.

In der vorliegenden Erfindung kann bevorzugt eine Protease aus der Gattung Aspergillus im Hinblick auf die Einfachheit der genauen Messung des glykierten Proteins verwendet werden. Als Protease aus der Gattung Aspergillus kann insbesondere bevorzugt eine Protease aus Aspergillus melleus (hierin nachstehend als "A. melleus" bezeichnet) verwendet werden.

Bevorzugte Beispiele einer solchen Protease aus A. melleus können eine Protease aus einem speziellen A. melleus-Stamm (Name und Adresse der Hinterlegungsstelle: National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry; 1–3, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305–8566 JAPAN; Hinterlegungsdatum: 03. März 1998; Hinterlegungsnummer: FERM BP-6277) umfassen. Es ist durch die Untersuchung der Erfinder der vorliegenden Erfindung bestätigt worden, dass diese Protease im Wesentlichen die gleichen enzymatischen Charakteristiken wie diejenigen der nachstehend zu beschreibenden, im Handel erhältlichen Protease "Sumizyme MP" hat (der gleiche Grad der Anpassungseigenschaft an die FAOD oder der gleiche Aktivitätsgrad, wie in dem hierin nachstehend aufgeführten Beispiel 4 beschrieben).

Die vorstehend genannte Protease aus A. melleus umfasst solche mit einem Optimum-pH-Wert im basischen Bereich und solche mit einem Optimum-pH-Wert im sauren Bereich. Beide dieser Proteasetypen sind in der vorliegenden Erfindung verwendbar.

In ähnlicher Weise können spezielle Beispiele der von A. melleus gebildeten Protease, die bevorzugt in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, Sumizyme MP (Handelsbezeichnung, hergestellt von SHIN NIHON CHEMICAL CO., Japan) umfassen, welches auf dem Gebiet der Nahrungsmittelverarbeitung verwendet wird. Sumizyme MP wird als Enzym zur Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie verwendet, und es ist billig und kann in einer großen Menge geliefert werden. Demgemäß ist dieses Enzym in vorteilhafter Weise im Hinblick auf seine Anwendung auf klinische Untersuchung, wie Reihenuntersuchung, verwendbar.

Allgemein wird die Stelle eines glykierten Proteins, an welcher Glykierung auftritt, durch die Art des Proteins, spezieller durch die Art und Position (oder Stelle) von Aminosäuren, welche das Protein bilden, bestimmt. Wenn das vorstehend genannte Protein Albumin ist, ist seine Position, die am stärksten dazu neigt, glykiert zu werden, das Lysin in der Position 525, gezählt von der N-Endgruppe des Albumins, und in dem meisten glykierten Albumin wird das Lysin an der Position 525, gezählt von der N-Endgruppe, glykiert. Demgemäß würde, falls eine Protease, die bevorzugt dieses glykierte Lysin fragmentiert, verwendet wird, die Empfindlichkeit des Nachweises verbessert. Die vorstehend genannte Protease aus der Gattung Aspergillus, wie A. melleus (z.B. Sumizyme MP), kann bevorzugt auch unter einem solchen Gesichtspunkt verwendet werden.

Ferner ist es in der vorliegenden Erfindung bevorzugt, eine Protease zu verwenden, die in einfacher Weise unter Anwendung einer einfachen Behandlung nach ihrer Verwendung in der Proteasebehandlung inaktiviert werden kann. Spezielle Beispiele der einfachen Behandlung können eine pH-Änderung, Erwärmen, Zugabe eines Inhibitors usw. umfassen.

(Protease mit Optimum-pH im sauren Bereich)

In der vorliegenden Erfindung kann auch eine Protease mit einem Optimum-pH-Wert im sauren Bereich (d.h. ein pH-Wert kleiner als 7,0) verwendet werden, solange sie eine Charakteristik derart hat, dass sie die glykierte Aminosäure an der glykierten Stelle des glykierten Proteins wirksam fragmentieren oder spalten kann, die absolute verbrauchte Sauerstoffmenge in der Reaktion auf der Grundlage von FAOD oder die absolute Menge des dabei gebildeten Reaktionsprodukts (z.B. Wasserstoffperoxid) erhöhen kann und die Empfindlichkeit des Nachweises verstärken kann.

Wenn eine solche Protease mit einem Optimum-pH-Wert im sauren Bereich verwendet wird, ist es möglich, die Protease nach der Fragmentierung des glykierten Proteins durch einfaches Einstellen des pH-Werts auf den Optimum-pH-Wert der FAOD (im basischen pH-Bereich, z.B. pH = 8) zu inaktivieren. In einem solchen Fall kann demgemäß nach der Inaktivierung der Protease der Schritt der FAOD-Reaktion äußerst vereinfacht werden, und die Behandlung kann rasch durchgeführt werden. In dem Verfahren der Einstellung des pH-Werts kann jeder Schritt zum Inaktivieren der Protease durch Wärmedenaturierung oder der Zugabe eines Inhibitors weggelassen werden.

Spezielle Beispiele einer solchen Protease mit einem Optimum-pH-Wert im sauren Bereich können eine Protease mit einem Optimum-pH-Wert im sauren Bereich umfassen, die aus den Proteasen des vorstehend genannten A. melleus isoliert oder gereinigt werden kann.

(Inaktivierung der Protease)

Bei der Messung des glykierten Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung ist es z.B. möglich, die FAOD-Reaktion nach der Fragmentierungsbehandlung des glykierten Proteins durch Inaktivieren der Protease und Zusetzen der FAOD zu initiieren. Es ist bevorzugt, die vorstehend genannte Fragmentierungsbehandlung der FAOD mit der Protease durch Anwenden einer solchen Proteaseinaktivierung zu unterdrücken oder zu verhindern.

(FAOD)

In der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, eine Optimum-FAOD in Übereinstimmung mit der Art des glykierten Proteins als Analyt oder Target für die Messung auszuwählen, da die Glykierungsstelle durch die Beziehung mit der Komponente eines lebenden Organismus (z.B. Art und Position von Aminosäuren, welche das Protein bilden), bestimmt wird.

Spezielle Beispiele der in der vorliegenden Erfindung verwendbaren FAOD können solche umfassen, die durch Kultivieren von Mikroorganismen oder Bakterien, die zu der Gattung Fusarium, der Gattung Gibberella, der Gattung Penicillium, der Gattung Aspergillus usw. gehören, in Gegenwart von Fructosyllysin und/oder Fructosyl-N&agr;-Z-lysin induziert werden können. Solche FAOD kann z.B. durch das Verfahren erhalten werden, das in JP-A Hei-7-289253, JP-A Hei-8-154672, JP-A Hei-8-336386 usw. beschrieben ist.

In der vorliegenden Erfindung ist es unter den vorstehenden FAODs besonders bevorzugt, die FAOD-S aus Fusarium oxysporum S-1F4, vorstehend beschrieben, oder die FAOD-G aus Gibberella fujikuroi AKU 3802 (JP-A Hei-7-289253) im Hinblick auf ihre Aktivität auf Fructosyllysin und/oder Fructosylpolylysin als die Stellen in menschlichem Serum oder menschlichem glykiertem Albumin, die in einfacher Weise glykiert werden, zu verwenden.

(Titer von FAOD)

Der Titer der in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden FAOD kann bevorzugt durch das folgende Verfahren gemessen werden.

(1) Verfahren zum Messen von Wasserstoffperoxid als Reaktionsprodukt durch Kolorimetrie. A. Geschwindigkeitsverfahren

100 &mgr;l von 100 mM Fructosyl-N&agr;-Z-lysin (FZL)- 45 mM 4-Aminoantipyrin- 60 Einheiten/ml Peroxidaselösung und 100 &mgr;l 60 mM Phenollösung werden mit 1 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,0) und 50 &mgr;l einer Enzymlösung (von FAOD, deren Titer zu messen ist) vermischt, und dann wird destilliertes Wasser zu der erhaltenen Mischung so zugesetzt, dass sich ein Gesamtvolumen der Mischung von 3,0 ml ergibt.

Die erhaltene Lösung wird 2 Minuten bei 30°C inkubiert, und dann werden 50 &mgr;l 100 mM Fructosyl-N&agr;-Z-lysin (FZL-Lösung) dazu zugesetzt, und die erhaltene Mischung wird der Messung ihrer Extinktion bei 505 nm in Abhängigkeit von der Zeit unterworfen. Die Menge (Mikromol) Wasserstoffperoxid, die in einer Minute gebildet wird, wird unter Verwendung des molaren Absorptionskoeffizienten des Chinonfarbstoffs (5,16 × 103 M–1cm–1), der durch diese Reaktion gebildet wird, berechnet, und der erhaltene Wert wird als Einheit (U) der Enzymaktivität betrachtet.

B. Endpunktverfahren

In der gleichen Weise wie im vorstehenden "Verfahren A" wird das Substrat (FZL) zugesetzt, und die Inkubation wird 30 Minuten bei 30°C durchgeführt, und danach wird die erhaltene Mischung der Messung ihrer Extinktion bei 505 nm unterworfen. Dann wird die Enzymaktivität unter Verwendung einer Kalibrierungskurve berechnet, die vorher hergestellt worden ist.

(2) Verfahren zum Messen der Sauerstoffabsorption durch enzymatische Reaktion

1 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,0) und 50 &mgr;l einer Enzymlösung werden vermischt, und das Gesamtvolumen der Mischung wird unter Verwendung von destilliertem Wasser auf 3,0 ml eingestellt. Die erhaltene Mischung wird in eine Sauerstoff-Elektrodenzelle, hergestellt von Rank-Brothers Co., überführt.

Die vorstehend genannte Lösung in der Zelle wird bei 30°C so gerührt, dass ihre Temperatur und der darin aufgelöste Sauerstoff einen Gleichgewichtszustand erreichen, und danach werden 100 &mgr;l 50 mM FZL zu der erhaltenen Lösung zugesetzt, und die Absorption von Sauerstoff wird kontinuierlich unter Verwendung eines Aufzeichnungsgeräts gemessen, um so seine anfängliche Rate zu bestimmen. Durch Verwendung einer Standardkurve wird die in einer Minute absorbierte Sauerstoffmenge berechnet, und der erhaltene Wert wird als Enzymeinheit betrachtet.

(Verfahren zum Messen von glykiertem Protein)

In dem Verfahren zum Messen eines glykierten Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass, während ein glykiertes Protein in einer Probe mit der vorstehend genannten Protease so behandelt wird, dass ein Zustand des glykierten Proteins erhalten wird, mit welchem die FAOD zu reagieren vermag, oder nachdem das glykierte Protein mit einer Protease behandelt ist, die FAOD mit dem erhaltenen Reaktionsprodukt so umgesetzt wird, dass die Menge von verbrauchtem Sauerstoff in der vorstehenden FAOD-Substrat-Reaktion oder die Menge des durch die Reaktion gebildeten Reaktionsprodukts gemessen wird.

Die Reaktion des glykierten Proteins (oder des durch seine Behandlung mit Protease gebildeten Produkts) mit der FAOD ergibt Wasserstoffperoxid und Glucoson. Sowohl Wasserstoffperoxid als auch Glucoson können als FAOD-Reaktionsprodukt verwendet werden, welches ein in dem nachfolgenden Schritt zu messender Analyt ist. Das Verfahren zum Messen des FAOD-Reaktionsprodukts unterliegt keiner besonderen Beschränkung, kann aber ein Verfahren sein, das in geeigneter Weise aus bekannten Verfahren ausgewählt ist.

Die Menge des Wasserstoffperoxids kann quantitativ durch Anwenden jedes Verfahrens, das auf dem vorstehend genannten technischen Gebiet bekannt ist, bestimmt werden, wie das Kolorimetrieverfahren oder das Farbentwicklungsverfahren (z.B. ein Messverfahren unter Verwendung eines Chromogens, das zum Bilden eines Farbstoffs oder gefärbten Materials entsprechend seiner Zersetzung durch einen Katalysator mit Peroxidaseaktivität oder peroxidaseähnlicher Aktivität), ein Messverfahren unter Verwendung einer elektrochemischen Technik (z.B. ein Verfahren unter Verwendung einer Wasserstoffperoxidelektrode), ein Verfahren zum Messen der Aldehydmenge, gebildet aus Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Katalase und eines Alkohols.

In der vorliegenden Erfindung ist es z.B. möglich, quantitativ das glykierte Protein durch Verwendung einer Kalibrierungskurve zu bestimmen, die vorher durch Verwenden des vorstehend genannten Messverfahrens und von Proben, die bekannte Mengen des glykierten Proteins enthalten, hergestellt worden ist. Zu dieser Zeit ist es bevorzugt, dass die Aktivität der FAOD konstant ist. Eine Probe, die eine Komponente eines lebenden Organismus usw. enthält, kann, wie erwünscht, bevorzugt der Messung unterworfen werden, nachdem die Probe mit einer Pufferlösung verdünnt ist.

(Farbenentwicklungssystem)

Als Farbentwicklungssystem für das Kolorimetrieverfahren unter Verwendung von Wasserstoffperoxid ist es möglich, ein System zu verwenden, das ein gefärbtes Material durch Oxidationskondensation zwischen einem Kuppler, wie 4-Aminoantipyrin (4AA) und 3-Methyl-2-benzothiazolynonhydrazon (MBTH), und einem Chromogen, wie Phenol, in Gegenwart von Peroxidase bildet.

Beispiele des Chromogens können Phenolderivate, Anilinderivate, Toluidinderivate usw. umfassen. Spezielle Beispiele des Chromogens können N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin, N,N-Dimethylanilin, N,N-Diethylanilin, 2,4-Dichlorphenol, N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin, N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3,5-dimethylanilin (MAPS), N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylanilin (MAOS) usw. umfassen.

Ferner ist es auch möglich, als das vorstehend genannte Chromogen ein Farbentwicklungsreagens vom Leukotyp zu verwenden, welches eine Farbe durch seine Oxidation in Gegenwart von Peroxidase entwickelt. Spezielle Beispiele des Farbentwicklungsreagens können o-Dianisidin, o-Tolidin, 3,3-Diaminobenzidin, 3,3,5,5-Tetramethylbenzidin, N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4,4-bis(dimethylamino)biphenylamin (DA 64), 10-(Carboxymethylaminocarbonyl)-3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin (DA 67) usw. umfassen.

(Andere Messverfahren)

Zusätzlich zu dem vorstehend genannten Kolorimetrieverfahren kann auch ein Verfahren unter Verwendung von Fluoreszenz oder Chemilumineszenz verwendet werden, um das Wasserstoffperoxid unter Verwendung des Chromogens zu messen.

In dem Fluoreszenzverfahren (oder der Fluorimetrie) ist es möglich, eine Verbindung zu verwenden, die befähigt ist, Fluoreszenz durch ihre Oxidation zu ergeben, wie Homovanillinsäure, 4-Hydroxyphenylessigsäure, Tyramin, p-Kresol und ein Diacetylfluorescinderivat. In dem Chemilumineszenzverfahren ist es möglich, Peroxidase, Kaliumferricyanid, Hämin usw. als Katalysator zu verwenden, und Luminol, Lucigenin, Isoluminol, Pyrogallol usw. als Substrat zu verwenden.

Ferner ist es bei der vorstehend genannten Messung von Wasserstoffperoxid ebenfalls möglich, ein System zu verwenden, in welchem Katalase damit in Gegenwart eines Alkohols (wie Methanol) umgesetzt wird, und der erhaltene Aldehyd durch eine "Haunch"-Reaktion oder die vorstehend genannte Kondensationsreaktion unter Verwendung von MBTH behandelt wird, um eine Farbe zu entwickeln. Es ist möglich, dass der so hergestellte Aldehyd mit Aldehyddehydrogenase konjugiert wird, und die erhaltene Änderung von NAD (NADH) gemessen wird.

Andererseits kann ein bekanntes Aldosereagens, wie Diphenylamin, verwendet werden, um das Glucoson zu messen, das ein von Wasserstoffperoxid verschiedenes FAOD-Reaktionsprodukt ist.

(Messung unter Verwendung einer Elektrode)

Wenn das Wasserstoffperoxid als FAOD-Reaktionsprodukt durch Verwendung einer Elektrode gemessen wird, unterliegt das Material der Elektrode keiner besonderen Beschränkung, solange das Material mit Bezug auf das Wasserstoffperoxid Elektronen übertragen (liefern oder abziehen) kann. Bevorzugte Beispiele eines solchen Materials können Platin, Gold, Silber usw. umfassen. Die Messung unter Verwendung einer Elektrode kann durch ein in der Technik bekanntes Verfahren, wie Amperometrie, Potentiometrie und Coulometrie, durchgeführt werden.

Ferner ist es auch möglich, das glykierte Protein zu messen, indem ein elektronentransportierender Träger in der Reaktion als Zwischenprodukt zwischen der Elektrode und FAOD oder dem Substrat beteiligt gelassen wird, und Messen der Menge von elektrischem Oxidations-Reduktions-Strom oder der Elektrizitätsmenge. Der vorstehend genannte elektronentransportierende Träger kann jedes bekannte Material sein, das zum Transportieren von Elektronen befähigt ist, und spezielle Beispiele davon können Ferrocenderivate, Chinonderivate usw. umfassen.

Ferner ist es auch möglich, das glykierte Protein zu messen, indem ein elektronentransportierender Träger in der Reaktion als Zwischenprodukt zwischen der Elektrode und dem durch die FAOD-Reaktion gebildeten Wasserstoffperoxid beteiligt gelassen wird, und Messen der Menge des elektrischen Oxidations-Reduktions-Stroms oder der Elektrizitätsmenge.

Beispiele

Hierin nachstehend wird die vorliegende Erfindung im Einzelnen mit Bezug auf Beispiele beschrieben.

Beispiel 1 (Primäres Screening von Proteasen)

Als primäres Screening von Proteasen wurde ein glykiertes Protein unter Verwendung von jeder dieser Proteasen fragmentiert, und danach wurde das erhaltene Produkt mit FAOD-G als eine FAOD umgesetzt, und die Menge des erhaltenen Wasserstoffperoxids wurde gemessen.

(1) Materialien

Zu untersuchendes Enzym: In der hierin nachstehend aufgeführten Tabelle 1 beschriebene Proteasen

Substrat: Menschliches Serumalbumin (Handelsbezeichnung: Alb, hergestellt von SIGMA Co.)

Menschliches Serum (Serum, Bio Whittaker)

FAOD: FAOD-G (FAOD-G wurde aus Gibberella fujikuroi unter Verwendung des in JP-A Hei-7-289253 beschriebenen Verfahrens isoliert und gereinigt).

Chromogen: 4-Aminoantipyrin

N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin

Puffer: 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,0)

(2) Proteasebehandlung

500 &mgr;l menschliches Serumalbumin oder menschliches Serum, das unter Verwendung des vorstehenden 0,1 M Tris-HCl-Puffers (pH-Wert 8,0) so hergestellt worden war, dass seine Konzentration 5 % ergab, wurden mit 500 &mgr;l jeder der Proteasen vermischt, die unter Verwendung eines Puffers mit einem Optimum-pH-Wert für jede Protease so hergestellt worden waren, dass sich ein Wert von 10 U/ml ergab, und die erhaltene Mischung wurde 30 Minuten bei der Optimumtemperatur für jedes Enzym inkubiert und wurde dann 5 Minuten auf etwa 90°C erwärmt, um die Proteasereaktion zu stoppen.

(3) FAOD-Reaktion

Es wurde eine "FAOD-Reaktionsmischung" mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt.

Überstand von proteasebehandelter Lösung, erhalten in der vorstehenden Behand lung (2) 400 &mgr;l FAOD-G (3 U/ml) 10 &mgr;l 3 mM 4-Aminoantipyrin-Lösung 30 &mgr;l 3 mM N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin-Lösung 30 &mgr;l Peroxidase-Lösung (60 U/ml) 30 &mgr;l 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,0) 500 &mgr;l

Die FAOD-Reaktionsmischung mit der vorstehenden Zusammensetzung wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert, und ihre Extinktion wurde bei 555 nm gemessen. Ein Leerwert für jede Probe, d.h. die Extinktion auf der Grundlage einer kein FAOD enthaltenden Referenzlösung, wurde ebenfalls gemessen, und die Extinktion des Leerwerts wurde von der Extinktion jeder Probe abgezogen, die durch den vorstehenden Schritt erhalten wurde, um dadurch die tatsächlichen Extinktionswerte zu erhalten.

Gemäß den vorstehend beschriebenen Schritten wurde die durch die Reaktion jedes proteasebehandelten Produkts und der FAOD gebildete Wasserstoffperoxidmenge unter Verwendung ihrer Extinktion bestimmt, und um die Brauchbarkeit jeder Protease zu bewerten, wurde jeder gemessene Wert in die relative Aktivität im Vergleich mit dem Standardwert (100 %) umgewandelt, welcher die durch die Protease XIV-Behandlung erhaltene Extinktion war.

Die durch die vorstehend genannten Messungen erhaltenen Ergebnisse sind insgesamt in den folgenden Tabellen 1 und 2 gezeigt.

Auf der Grundlage dieser Ergebnisse des primären Screenings (Tabellen 1 und 2) wurden zehn Arten von Proteasen ausgewählt, da sie hauptsächlich eine hohe Extinktion für sowohl menschliche Serumalbuminsubstrate (HSA-Substrate) und menschliche Serumsubstrate ergaben.

Beispiel 2 (Sekundäres Screening von Proteasen)

In diesem Beispiel wurden die in Beispiel 1 ausgewählten zehn Arten von Proteasen mit Bezug auf die vorstehend genannten FAOD-S und FAOD-G als die FAOD einem sekundären Screening unterworfen. Das hierin verwendete FAOD-S wurde durch das in JP-A Hei-7-289253 beschriebene Verfahren isoliert und gereinigt.

In dem sekundären Screening wurde die Messung in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt mit der Ausnahme, dass die Menge der in einer Messung verwendeten FAOD-S auf 0,06 U (6 U/ml, 10 &mgr;l) geändert wurde.

Die in dem sekundären Screening erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 gezeigt.

Wie in der vorstehenden Tabelle 3 gezeigt, wurde festgestellt, dass sowohl die FAOD-S als auch die FAOD-G eine ähnliche Tendenz mit Bezug auf jede der Proteasen hatte. Demgemäß wurden als bevorzugteste Protease, die zum Messen des glykierten Albumins in Kombination mit der FAOD zu verwenden ist, Sumizyme MP und Protease XIV ausgewählt, die hohe Messwerte mit Bezug auf sowohl das menschliche Serumalbuminsubstrat (HSA-Substrat) als auch auf das menschliche Serumsubstrat ergaben.

Beispiel 3 (Messung von glykiertem Albumin unter Verwendung von Sumizyme MP und FAOD-G oder FAOD-S)

Menschliches Serumalbumin wurde mit einem Puffer so verdünnt, dass sich Konzentrationen von 0, 5, 10, 15, 20, 25 und 30 mg/ml ergaben, um dadurch zu messende Proben herzustellen. Dann wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 die Proben unter Verwendung von Sumizyme MP verdaut oder fragmentiert, dann wurde die FAOD-S oder die FAOD-G mit dem erhaltenen Produkt umgesetzt, und die Menge von in dieser Reaktion gebildetem Wasserstoffperoxid wurde ausgedrückt als seine Extinktion gemessen. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in 1 gezeigt.

In 1 zeigt die Ordinate die Extinktion bei 555 nm, und die Abszisse zeigt die Albuminkonzentration. Aus den in 1 gezeigten Ergebnissen wurde bestätigt, dass, wenn Sumizyme MP als Protease verwendet wurde, die Farbentwicklung auf der Grundlage der Wirkung der FAOD auf die vorstehend genannte Probe eine gute proportionale Beziehung bezüglich der Konzentration des glykierten Albumins zeigte, und daher war Sumizyme MP eine verwendbare Protease zum Messen des glykierten menschlichen Albumins.

Beispiel 4 (Verschiedene Untersuchungen an Protease aus A. melleus mit Optimum-pH-Wert im basischen Bereich)

Es wurden Untersuchungen mit Bezug auf die folgenden fünf Stämme von A. melleus durchgeführt, d.h. der Stamm A. melleus (Hinterlegungsnummer: FERM BP-6277) und von IFO (Institute for Fermentation Osaka) erhaltene Stämme.

A. melleus (Hinterlegungsnummer: FERM BP-6277)

A. melleus IFO 4339

A. melleus IFO 4420

A. melleus IFO 7541

A. melleus IFO 32035

(Renaturierung und Kultur von Stämmen)

Die vorstehend genannten fünf Stämme waren solche, die in gefriergetrocknetem Zustand in Ampullen gelagert worden waren, und sie wurden daher unter Verwendung von 200 &mgr;l einer Renaturierungslösung mit der folgenden Zusammensetzung renaturiert und wurden dann in eine GPYM-Schrägkultur mit der folgenden Zusammensetzung inokuliert. Jeder von ihnen wurde 2 Tage bei 30°C kultiviert, und es wurde dann festgestellt, dass sämtliche Stämme gewachsen waren. Die erhaltenen Schrägkulturen wurden bei 4°C gelagert. In dem Fall ihrer Kultivierung wurde jeder der Stämme in dem entsprechenden Kulturmedium unter Verwendung der so erhaltenen Schrägkulturen subkultiviert. Polypepton 0,5 % Hefeextrakt 0,3 % MgSO4·7H2O 0,1 %

(Die Mischung mit der vorstehenden Zusammensetzung wurde auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und wurde dann einer Autoklavbehandlung (20 Minuten bei 120°C) unterworfen). Glucose 1,0 % Pepton 0,5 % Hefeextrakt 0,3 % Malzextrakt 0,3 % Agar 2,0 %

(Die vorstehend genannten von Agar verschiedenen Komponenten wurden in destilliertem Wasser aufgelöst, und der pH-Wert der erhaltenen Mischung wurde auf 5,5 bis 6 eingestellt, und die Mischung wurde unter Verwendung eines Messzylinders (gewogen) gemessen, und dann wurde Agar zu der erhaltenen Mischung zugesetzt und wurde darin unter Verwendung eines Mikrowellenofens aufgelöst. Die erhaltene Zusammensetzung wurde in Prüfrohre so verteilt, dass sich eine Menge von 8 ml davon in jedem Prüfrohr ergab und wurde dann einer Autoklavbehandlung (20 Minuten bei 120°C) unterworfen. Dann wurde die Mischung erhärtet, während das Rohr sich im Schrägzustand befand.)

Danach wurde jeder Stamm in 10 ml eines PGYM-Mediums mit der folgenden Zusammensetzung inokuliert und wurde dann durch ein Schüttelkulturverfahren 2 Tage bei 30°C kultiviert. Dann wurde das erhaltene Produkt in 500 ml des gleichen Mediums überführt und wurde 2 Tage weiter kultiviert. Die Schüttelgeschwindigkeit betrug 111 Upm für beide Kulturschritte. Glucose 1,0 % Pepton 0,5 % Hefeextrakt 0,3 % Malzextrakt 0,3 %

(Die vorstehend genannten Komponenten wurden in destilliertem Wasser aufgelöst, und der pH-Wert der erhaltenen Mischung wurde auf 5,5 bis 6 eingestellt und wurde dann einer Autoklavbehandlung (20 Minuten bei 120°C) unterworfen).

Als Ergebnis der vorstehenden Kultivierung zeigte jeder der Stämme gutes Wachstum. Dann wurden Bakterienzellen durch Filtration gesammelt oder geerntet, und die Zellen wurden gewogen (Nassgewicht). Die so erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend gezeigt. A. melleus FERM BP-6277 20,6 g A. melleus IFO 4339 20,7 g A. melleus IFO 4420 11,1 g A. melleus IFO 7541 8,5 g A. melleus IFO 32035 16,3 g

Die Sumizyme MP-artige Protease wurde als extrazelluläres Enzym angesehen, und daher wurde der vorstehend erhaltene Kulturüberstand für die nachfolgende Untersuchung verwendet. Die gesammelten Zellen wurden bei –20°C gelagert.

(Teilweise Reinigung des Kulturüberstands)

100 ml des Kulturüberstands nach der Sammlung der Zellen, der durch den vorstehend genannten Schritt erhalten wurde, wurden konzentriert und teilweise durch Ausfällung unter Verwendung von Ammoniumsulfat gereinigt. Da das durch Screening auszuwählende Sumizyme MP in der Nähe des neutralen pH-Werts stabil war, und der pH-Wert des Kulturmediums am Ende der Kultur etwa 4,6 bis 5 betrug, wurde der pH-Wert während der Ausfällung unter Verwendung von Ammoniumsulfat auf 6 bis 6,5 gehalten. Das Ammoniumsulfat wurde unter Kühlen in einem Eisbad zugesetzt, und die erhaltene Mischung wurde nach der Zugabe von Ammoniumsulfat 1 Stunde bei 4°C gerührt. Nach dem Rühren wurde die erhaltene Mischung 40 Minuten bei 4°C und 10000 Upm zentrifugiert, um so die erhaltene Ausfällung zu sammeln, und die Ausfällung wurde in einer minimalen Menge destillierten Wassers aufgelöst und wurde bei 4°C über Nacht einer Dialyse unterworfen. Destilliertes Wasser wurde als äußere Lösung für die Dialyse verwendet.

Nach der Dialyse wurde die erhaltene innere Flüssigkeit in einem Mikrorohr zentrifugiert (4°C, 12000 Upm, 20 Minuten). Nach der Zentrifugation wurde der erhaltene Überstand gesammelt, und sein Volumen wurde gemessen. Die so erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend gezeigt. A. melleus FERM BP-6277 pH 4,8 → pH 6,264 A. melleus IFO 4339 pH 5 → pH 6,4 A. melleus IFO 4420 pH 5,068 → pH 6,008 A. melleus IFO 7541 pH 4,650 → 6,030 A. melleus IFO 32035 pH 4,967 → 6,000
A. melleus FERM BP-6277 1,6 ml A. melleus IFO 4339 3 ml A. melleus IFO 4420 2 ml A. melleus IFO 7541 3,8 ml A. melleus IFO 32035 2,2 ml

Wie durch die vorstehenden Ergebnisse gezeigt, wurde festgestellt, dass das Volumen des konzentrierten Kulturüberstands nach der Dialyse 1,6 bis 3,8 ml betrug. Im Vergleich mit seinem Volumen (100 ml) vor der Zugabe des Ammoniumsulfats war das Konzentrationsverhältnis das einige Zehnfache.

(Messung der Proteaseaktivität)

Die Proteaseaktivität von jedem der konzentrierten Kulturüberstände (fünf Arten von Proteasen), erhalten durch den vorstehend genannten Schritt, wurde gemessen. Zur Zeit der Messung der Proteaseaktivität wurden 20 &mgr;l des vorstehenden konzentrierten Kulturüberstands, 20 &mgr;l 5 gew.-%iges HSA (pH 8) als Substrat und 60 &mgr;l 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) vermischt, und die erhaltene Mischung wurde dann 30 Minuten bei 37°C der Reaktion unterworfen. Dann wurden 100 &mgr;l 0,6 M Trichloressigsäure (TCA) zugesetzt, und die erhaltene Mischung wurde 15 Minuten oder länger unter Kühlen in einem Eisbad stehen gelassen und wurde danach 10 Minuten einer Zentrifugation bei 4°C und 12000 Upm unterworfen, um Protein zu isolieren (TCA-Ausfällung).

Zu 25 &mgr;l des durch die vorstehend genannte TCA-Ausfällung erhaltenen Überstands wurden 125 &mgr;l Reagens-A und 1000 &mgr;l Reagens-B des Bio-Rad DC Protein-Assay-Kits (hergestellt von Bio-Rad Co.) zugesetzt und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurde die Extinktion des erhaltenen Produkts bei 750 nm gemessen, um die freie Aminosäure in dem vorstehenden Überstand zu messen. Um zu vermeiden, dass Aminosäure gezählt wurde, die ursprünglich in dem Kulturmedium als Proteaseaktivität zur Zeit der vorstehenden Messung der freien Aminosäure vorhanden gewesen war, wurde eine Probe, die null Minuten der Proteasereaktion unterworfen worden war, in der gleichen Weise wie bei der Behandlung von anderen Proben behandelt, und die erhaltene Probe wurde als Leerwertreferenz verwendet.

Als Ergebnis der vorstehenden Messung zeigten alle fünf Arten der konzentrierten Zellüberstände eine klare Farbentwicklung nach der 30-minütigen Reaktion, und die Anwesenheit von Proteaseaktivität wurde darin bestätigt.

Ferner wurden die so erhaltenen Ergebnisse mit der Menge von freier Aminosäure verglichen, gespalten durch Sumizyme MP, das so hergestellt worden war, dass sich eine Aktivität von 1 mg/ml (260 U/ml) ergab, wodurch die Aktivität jeder Protease bezüglich HSA grob berechnet wurde. Die so erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend gezeigt.

(Bestimmung des Optimum-pH von Protease)

Der Optimum-pH-Wert einer Protease wurde durch Ändern des pH-Werts des Puffers gemessen, der die Reaktionslösung zum Messen der in der vorstehenden "Proteaseaktivitätsmessung" zu verwendenden Reaktantlösung bildete.

Bezüglich des pH-Bereichs, der nicht mit dem 0,1 M Tris-HCl-Puffer abgedeckt werden konnte, wurden 0,1 M Kaliumphosphatpuffer und 0,1 M Glycin-NaOH-Puffer verwendet. Die Temperatur für die Reaktion wurde auf 37°C eingestellt. Die Proteaseaktivität wurde in einem pH-Bereich von 4 bis 13 gemessen. Der hierin verwendete pH-Wert wurde auf Intervalle von 0,5 mit Bezug auf den pH-Bereich von 7 bis 10 eingestellt, und die pH-Werte wurden mit Bezug auf den anderen pH-Bereich auf Intervalle von 1,0 eingestellt.

Als Ergebnis wurde bestätigt, dass jede der fünf Arten von Enzymen ihren Optimum-pH-Wert in einem pH-Bereich von 8 bis 9 hatten, der im Wesentlichen der gleiche war wie derjenige von Sumizyme MP. Die pH-Abhängigkeit der Protease von A. melleus FERM BP-6277 ist in der grafischen Darstellung von 2 gezeigt. In dieser grafischen Darstellung ist die Enzymaktivität ausgedrückt als relative Aktivität auf der Grundlage der Aktivität bei dem vorstehend genannten Optimum-pH-Wert als Standard (Aktivität bei dem Optimum-pH-Wert wird als "100" bezeichnet) gezeigt.

Ferner wurde eine Aktivitätsspitze auch in dem sauren Bereich beobachtet. Die Aktivität der "Säureprotease" war gleich oder höher als diejenige einer Schwachalkaliprotease. Falls diese Proteasen extrazelluläre Enzyme waren, und eine Protease mit der höchsten Aktivität bei dem pH-Wert des Kulturmediums in einer großen Menge abgesondert wurde, wurde erwartet, dass diese Situation mit hoher Wahrscheinlichkeit auftrat, da der pH-Wert des Mediums am Ende des Kultivierens stark zu dem sauren Bereich verschoben wurde.

Verschiedene Charakteristiken der Säureproteasen aus A. melleus wurden auch in den hierin nachstehend aufgeführten Beispielen bestätigt.

(Bestimmung der Optimumtemperatur von Protease)

Die Optimumtemperatur wurde bei einem festen pH-Wert des Puffers von 8,5 gemessen, wobei die Temperatur von 15 bis 70°C in Intervallen von 5°C geändert wurde. Ihre Aktivität wurde in der gleichen Weise wie bei der Messung der Proteaseaktivität gemessen, nachdem sie 30 Minuten einer Verdauungsreaktion unterworfen war.

Als Ergebnis der vorstehenden Messung wurde festgestellt, dass jede der fünf Arten von Enzymen eine Optimumtemperatur bei 45°C oder 50°C hatte. Die Temperaturabhängigkeit der Protease aus A. melleus FERM BP-6277 ist in der grafischen Darstellung von 3 gezeigt. In dieser grafischen Darstellung ist die Enzymaktivität ausgedrückt als relativer Aktivitätswert auf der Grundlage der Aktivität bei der Optimumtemperatur als Standard (Aktivität bei der Optimumtemperatur wird als "100" bezeichnet) gezeigt. Die vorstehend genannte Charakteristik ist sehr ähnlich zu derjenigen von "Sumizyme MP" (welches praktisch seine Wirkung in dem Bereich von 45 bis 50°C zeigt und seine Optimumtemperatur bei 50°C hat).

(Abschätzung des Molekulargewichts der Protease aus A. melleus FERM BP-6277)

Dann wurde die Protease aus A. melleus FERM BP-6277, deren Aktivität auf ein synthetisches Peptid ähnlich war zu derjenigen von "Sumizyme MP", der GPC (Gelfiltrationschromatografie) unterworfen. Superdex 200pg 16/60 wurde als Säule verwendet, und jede der erhaltenen Fraktionen wurde in Intervallen von 30 Sekunden gesammelt. Durch Messen der Proteaseaktivität jeder Fraktion wurde das Molekulargewicht der Protease unter Verwendung der Zeit entsprechend der Elution der Fraktion abgeschätzt. Säule: Superdex 200pg 16/60 (Pharmacia Co.) Elutionsmittel: 20 mM Tris-HCl-Puffer Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/min Temperatur: Raumtemperatur Detektor: UV (220 nm) injiziertes Volumen: 50 &mgr;l

Bei der Messung der Proteaseaktivität wurden unter Berücksichtigung des Verdünnungsverhältnisses usw. der Protease während des GPC-Verfahrens 80 &mgr;l jeder Fraktion zu 20 &mgr;l 0,5 gew.-%iger HSA zugesetzt und über Nacht bei 37°C der Reaktion unterworfen. Das Verfahren nach der Zugabe von TCA wurde in Übereinstimmung mit der vorstehend genannten "Proteaseaktivitätsmessung" durchgeführt.

Als Ergebnis zeigten unter den durch die GPC erhaltenen Fraktionen die Fraktionen Nr. 41 bis 43 eine hohe Aktivität, und daher wurde das Molekulargewicht der Protease aus diesem Stamm als 18382 bis 22130 angenommen.

(Messung des Glykierungsverhältnisses für HSA unter Verwendung von Sumizyme MP)

Dann wurde die Messung des Glykierungsverhältnisses für HSA versucht. Zuerst wurde das Glykierungsverhältnis unter Verwendung von Sumizyme MP gemessen. Jede HSA (SIGMA Co., menschliche Albuminfraktion V) mit den Glykierungsverhältnissen von 11,7, 22,5 und 26,0 % (das Glykierungsverhältnis wurde unter Verwendung von KDK GAA-2000 (HPLC-Verfahren), hergestellt von Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd.) so aufgelöst, dass sich eine Konzentration von 5 % (pH-Wert 8) ergab. Das HSA mit einem Glykierungsverhältnis von 11,7 % wurde mit einem gleichen Volumen von jeder der anderen zwei Arten von HSA so vermischt, dass HSA-Produkte mit den Glykierungsverhältnissen von 17,1 % und 18,85 % zur Benutzung hergestellt wurden.

Zu 200 &mgr;l 5 gew.-%iger HSA wurden 100 &mgr;m 0,1 M Tris-HCl-Puffer und 100 &mgr;l Sumizyme MP (10 mg/ml) zugesetzt, und dann wurde die erhaltene Mischung 4 Stunden bei 37°C der Proteasereaktion unterworfen. Danach wurde unter Verwendung der FAOD-S (0,5602 U/ml) ihre Aktivität unter Verwendung des folgenden 4AA-TOOS-Farbentwicklungssystems bestätigt. Lösung nach der Proteasereaktion 400 &mgr;l 0,1 M Tris-HCl-Puffer (ph 8,0) 410 &mgr;l 3 mM 4-Aminoantipyrin 30 &mgr;l 3 mM TOOS 30 &mgr;l 60 U/ml POD 30 &mgr;l 0,5602 U/ml FAOD-S 100 &mgr;l

Als Ergebnis der vorstehend genannten Messung, wie in der grafischen Darstellung von 4 gezeigt, wenn das vorstehende Messsystem unter Verwendung von "Sumizyme MP"/FAOD-S verwendet wurde, wird bestätigt, dass das Glykierungsverhältnis von HSA entsprechend einem Anstieg der Menge der Farbentwicklung erhöht war. Ferner wurde eine positive Korrelation zwischen dem Glykierungsverhältnis und der erhaltenen Extinktion erhalten, und daher wurde festgestellt, dass das Verfahren unter Verwendung dieses Messsystems für die Messung des Glykierungsverhältnisses von HSA verwendbar war.

(Messung des Glykierungsverhältnisses von HSA unter Verwendung von Protease aus A. melleus FERM BP-6277)

Dann wurden bezüglich der Protease A. melleus FERM BP-6277, die für die vorstehend genannte GPC-Messung des Glykierungsverhältnisses von HSA verwendet worden war, Versuche bezüglich der Messung des Glykierungsverhältnisses für HSA in der gleichen Weise durchgeführt wie diejenige unter Verwendung von "Sumizyme MP". Da festgestellt worden war, dass die Proteaseaktivität niedrig war, wurde jedoch die Reaktion durch Zugabe von 200 &mgr;l der Proteaselösung zu 200 &mgr;l 5 gew.-%igem HSA durchgeführt, und die Reaktionszeit betrug 5 Stunden.

In der gleichen Weise wie in dem Fall unter Verwendung von "Sumizyme MP" wurde die Farbentwicklung durch Verwendung der FAOD-S bestätigt. Wie in der grafischen Darstellung von 5 gezeigt, wurde als Ergebnis eine positive Korrelation wie bei der Untersuchung unter Verwendung von Sumizyme MP erhalten. Daher wurde bestätigt, dass die Protease aus A. melleus FERM BP-6277 für die Messung des Glykierungsverhältnisses von HSA in ähnlicher Weise wie in dem Fall von "Sumizyme MP" verwendbar war.

Die Kurve in 5 geht nicht durch den Ursprung. Gemäß der Kenntnis der Erfinder der vorliegenden Erfindung wurde angenommen, dass eine Verunreinigung in der Protease und der FAOD-S oder eine Komponente von HSA einer Reaktion unterworfen wurden und dass sie daher eine Pseudo-Farbentwicklung verursachten. Es wurde angenommen, dass die Kurve sich dem Ursprung nähern würde, wenn die Reinheit des Enzyms verbessert wäre.

Beispiel 5 (Abtrennung von Protease mit Optimum-pH im sauren Bereich)

In diesem Beispiel wurden A. melleus KDK 3001 (Hinterlegungsnummer: FERM BP-6277), der bei Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. aufbewahrt war, und vier Stämme von A. melleus (A. melleus IFO 4339, A. melleus IFO 4220, A. melleus IFO 7541 und A. melleus IFO 32035), erhalten von IFO (eingetragene Stiftung: Research Institute for Fermentation), als A. melleus verwendet.

Da die vorstehend genannten, von IFO erhaltenen vier Stämme in gefriergetrocknetem Zustand in Ampullen gelagert waren, wurde eine Renaturierungslösung gemäß der Anweisung des Lieferanten hergestellt. Jeder der vier Stämme wurde unter Verwendung von 200 &mgr;l der Renaturierungslösung renaturiert und wurde dann in eine GPYM-Schrägkultur inokuliert. Nachdem die so erhaltene Schrägkultur 2 Tage bei 30°C kultiviert war, wurde festgestellt, dass alle Stämme gewachsen waren. Die Zusammensetzung der hierin verwendeten GPYM-Schrägkultur war wie folgt: Glucose 1,0 % Pepton 0,5 % Hefeextrakt 0,3 % Malzextrakt 0,3 % Agar 2,0 %

  • (pH 5,5 bis 6,0, 20 Minuten bei 120°C mit einem Autoklav sterilisiert)

Jeder der Stämme (insgesamt fünf Arten von Stämmen) wurde in 10 ml eines GPYM-Mediums inokuliert und wurde dann 2 Tage bei 30°C durch ein Schüttelkulturverfahren kultiviert. Danach wurde der Stamm in 500 ml des gleichen Mediums überführt und wurde dann 2 Tage weiter kultiviert. Die Schüttelgeschwindigkeit betrug 111 Upm für jede der Kulturen.

Als Ergebnis der vorstehenden Kultur zeigten alle Stämme gutes Wachstums. Dann wurden die Bakterienzellen durch Filtration gesammelt, und dann wurden die Zellen gewogen (Nassgewicht). Da angenommen wurde, dass die Protease als Target ein extrazelluläres Enzym ist, wurde der durch das vorstehend genannte Verfahren erhaltene Überstand für die anschließende Untersuchung verwendet. Die Zusammensetzung der hierin verwendeten GPYM-Schrägkultur war wie folgt: Glucose 1,0 % Pepton 0,5 % Hefeextrakt 0,3 % Malzextrakt 0,3 %

  • (pH 5,5 bis 6,0, 20 Minuten bei 120°C mit einem Autoklav sterilisiert)

100 &mgr;l des Kulturüberstands nach der Sammlung der Bakterienzellen wurden konzentriert und durch Ausfällen unter Verwendung von Ammoniumsulfat teilweise gereinigt. Da Sumizyme MP (im Handel erhältlich), welches ein Enzym (in der Nahrungsmittelindustrie zu verwenden), isoliert und gereinigt aus A. melleus, stabil in der Nähe des neutralen pH-Werts war, und der pH-Wert des Kulturmediums am Ende des Kultivierens etwa 4,6 bis 5 betrug, wurde der pH-Wert während der Ammoniumsulfatausfällung bei 6 bis 6,5 gehalten.

In der Ammoniumsulfatausfällung wurde das Ammoniumsulfat unter Kühlen in einem Eisbad zugesetzt, und nach der Zugabe des Ammoniumsulfats wurde die Mischung 1 Stunde bei 4°C gerührt. Nach Beendigung des Rührens wurde die erhaltene Mischung 40 Minuten bei 4°C und 10000 Upm zentrifugiert, um das Präzipitat zu sammeln, und das erhaltene Präzipitat wurde in einem Minimumvolumen von destilliertem Wasser aufgelöst und gegen destilliertes Wasser über Nacht bei 4°C dialysiert (semipermeable Membran: Dialysemembran, hergestellt von Sanko Jun-yaku Co., Ltd.). Nach Vervollständigung der Dialyse wurde die erhaltene innere Flüssigkeit in einem Zentrifugenmikrorohr zentrifugiert (4°C, 12000 Upm, 20 Minuten). Nach der Zentrifugation wurde der erhaltene Überstand gesammelt.

Die Proteaseaktivität von jedem der konzentrierten Kulturüberstände wurde gemessen. Das vorstehend genannte "Sumizyme MP" war eine Schwachalkaliprotease mit einem Optimum-pH-Wert in der Nähe von 8. Entsprechend den Versuchen der Erfinder der vorliegenden Erfindung wurde jedoch erwartet, dass eine Protease mit einem Optimum-pH-Wert in dem sauren Bereich, verschieden von der Schwachalkaliprotease, vorhanden war, und daher wurde die Messung der Säureproteaseaktivität bestätigt.

Als Substrat für die Messung dieser Proteaseaktivität wurde 5 gew.-%iges HSA (pH 5) verwendet. 20 &mgr;l des vorstehend erhaltenen konzentrierten Kulturüberstands, 20 &mgr;l 5 gew.-%iges HSA und 60 &mgr;l 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 5) wurden miteinander vermischt, und die erhaltene Mischung wurde dann 30 Minuten bei 37°C der Reaktion unterworfen. Dann wurden 100 &mgr;l 0,6 M Trichloressigsäure (TCA) zu der erhaltenen Mischung zugesetzt, und die erhaltene Mischung wurde 15 Minuten oder länger unter Kühlen in einem Eisbad stehen gelassen, und wurde dann 10 Minuten bei 4°C und 12000 Upm der Zentrifugation unterworfen (TCA-Ausfällung). Unter Verwendung von 25 &mgr;l des erhaltenen Überstands, aus welchem Protein durch die TCA-Ausfällung entfernt worden war, wurde die Menge von freien Aminosäuren in dem Überstand unter Verwendung von im Handel erhältlichem Bio-Rad DC Protein-Assay-Kit (hergestellt von Bio-Rad Co.) gemessen. Der Kit wurde entsprechend den Instruktionen des Lieferanten verwendet. Um die Wirkung von in dem konzentrierten Kulturüberstand enthaltenen Aminosäuren zu vermeiden, wurde zur Zeit der Messung der freien Aminosäuren eine Probe, die durch Vermischen der vorstehenden drei Arten von Lösungen erhalten worden war und sofort danach die erhaltene Mischung der TCA-Ausfällung unterworfen worden war, als Leerwert (Referenz) verwendet.

Als Ergebnis zeigten alle fünf Arten von konzentriertem Kulturüberstand entsprechend den vorstehend genannten fünf Arten von Stämmen eine klare Farbentwicklung nach der vorstehenden 30-minütigen Reaktion, und somit war das Vorliegen der Proteaseaktivität bestätigt. Auf der Grundlage der Bestätigung dieser Proteaseaktivitäten wurde jeder der teilweise gereinigten konzentrierten Kulturüberstände als Proteaselösung für die nachfolgenden Untersuchungen verwendet.

Dann wurde unter den vorstehend genannten fünf Arten von Stämmen die Lösung, enthaltend die Protease aus dem Stamm A. melleus KDK 3001, der Messung ihres Optimum-pH-Werts unterworfen.

Bei der Messung des Optimum-pH-Werts wurden zuerst 5 gew.-%ige HSA-Lösungen mit einem pH-Wert von 1,6 und einem pH-Wert von 8 als Substratlösung unter Verwendung von 0,1 M Tris-HCl-Puffer hergestellt, dann wurden durch Vermischen dieser zwei Lösungen insgesamt 10 Arten von Substratlösungen mit pH-Werten in dem Bereich von pH 1,6 bis pH 6,8 hergestellt. Ferner wurde durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure zu der HSA-Lösung mit einem pH-Wert von 1,6 eine Substratlösung mit einem pH-Wert von 1 hergestellt.

20 &mgr;l von jeder der Substratlösungen, deren pH-Wert auf jeden der vorstehend genannten pH-Werte eingestellt worden war, 20 &mgr;l der Protease enthaltenden Lösung und 60 &mgr;l destilliertes Wasser wurden miteinander vermischt, und dann wurde die erhaltene Mischung 30 Minuten bei 37°C der Reaktion unterworfen. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wurde wieder unmittelbar vor der Reaktion (d.h. unmittelbar nach dem Vermischen der drei Lösungen) gemessen, und der pH-Wert der Reaktionsmischung wurde wieder zur Zeit der Proteasereaktion (unmittelbar nach dem Vermischen der drei Lösungen) gemessen. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass der pH-Wert der Reaktionsmischung in dem Bereich von 1,6 bis 6,5 lag.

Die Enzymaktivität wurde gemessen durch Entfernen von Protein unter Verwendung der TCA-Ausfällung und Messen der Menge von freien Aminosäuren in dem erhaltenen Überstand unter Verwendung von Bio-Rad DC Protein-Assay-Kit in der gleichen Weise wie bei der Messung der vorstehend genannten Proteaseaktivität.

Als Ergebnis wurde bestätigt, dass die Säureprotease aus A. melleus KDK 3001, wie in der grafischen Darstellung von 6 gezeigt, eine Protease war, die ihren Optimumbereich in dem Bereich zwischen pH 4,7 und pH 5,6 hatte und eine besonders hohe Aktivität bei pH 5 hatte.

Die Optimumtemperatur der Säureprotease aus A. melleus KDK 3001 wurde durch Festlegen des pH-Werts der Reaktionsmischung auf pH 5 und Ändern der Temperatur von 15 bis 70°C in Intervallen von 5°C gemessen. Nach der 30-minütigen Inkubation wurde die Proteaseaktivität in der gleichen Weise, wie vorstehend beschrieben, gemessen. Wie in der grafischen Darstellung von 7 gezeigt, war als Ergebnis die Protease praktisch in dem Bereich von 35°C bis 65°C wirksam und hatte eine hohe Aktivität in dem Bereich von 40 bis 50°C, und somit wurde festgestellt, dass die Protease ihre Optimumtemperatur in diesem Bereich hatte. Die Protease zeigte die höchste Aktivität, wenn die Temperatur 50°C betrug.

Um das Molekulargewicht der Protease grob zu bestimmen, wurde die Protease aus A. melleus KDK 3001 der GPC unterworfen. Superdex 200pg 16/60 (hergestellt von Pharmacia Co.) wurde als Säule verwendet, und Fraktionen wurden in Intervallen von 30 Sekunden gesammelt. Bei der GPC-Behandlung wurde durch Messen der Proteaseaktivität von jeder der gesammelten Fraktionen das Molekulargewicht der Protease durch Verwendung der Zeit entsprechend der Elution der Fraktion abgeschätzt. Die Messbedingungen für die hierin verwendete GPC waren wie folgt. Säule: Superdex 200pg 17/60 (hergestellt von Pharmacia Co.) Elutionsmittel: 20 mM Tris-HCl-Puffer Elutionsbedingung: 0,5 ml/min Temperatur: Raumtemperatur Nachweis: UV-Nachweis (220 nm) Volumen der injizierten Probe: 50 &mgr;l

Bei der Messung der Proteaseaktivität wurden im Hinblick auf die Verdünnung der Protease während des GPC-Verfahrens 80 &mgr;l jeder Fraktion zu 20 &mgr;l 0,5 gew.-%igem HSA zugesetzt, und die erhaltene Mischung wurde 24 Stunden bei 37°C der Reaktion unterworfen, und dann wurde ihre Proteaseaktivität in der gleichen Weise, wie vorstehend beschrieben, gemessen. Die Proteaseaktivität von jeder der durch die vorstehend genannte GPC erhaltenen Fraktionen wurde mit dem gleichen Messverfahren, wie vorstehend beschrieben, gemessen, und es wurde abgeschätzt, dass das Molekulargewicht der Protease aus diesem Stamm 18382 bis 22130 betrug.

Beispiel 6 (Messung von glykiertem Protein durch Verwendung von Säureprotease)

In diesem Beispiel wurde auf der Grundlage des Vorteils, dass die in Beispiel 5 erhaltene Protease ihren Optimum-pH-Wert im sauren Bereich hatte, während der Optimum-pH-Wert der FAOD 8 betrug, die Proteaseaktivität durch Einstellen des pH-Werts auf den Optimum-pH-Wert der FAOD (pH 8) nach der Proteasebehandlung ohne Erwärmen oder Zugeben eines Inhibitors inaktiviert.

Durch Verwendung einer Lösung, welche die Protease enthielt, die aus A. melleus KDK 3001 isoliert und gereinigt worden war, wurde menschliches Serumalbumin (HSA: Sigma Co., "ALUBUMIN HUMAN FRACTION V", und Bayer Co., "Albumin FrV") mit verschiedenen Glykierungsverhältnissen der Messung unterworfen. Die Glykierungsverhältnisse dieser HSA-Produkte betrugen 11,7 %, 22,5 % bzw. 26,0 %. Diese Glykierungsverhältnisse wurden vorher unter Verwendung von GAA-2000 (HPLC-Verfahren), hergestellt von Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd., gemessen.

In der nachfolgenden Messung des glykierten HSA unter Verwendung eines enzymatischen Verfahrens wurden die vorstehend genannten verschiedenen glykierten HSA-Produkte verwendet, nachdem sie auf eine Konzentration von 5 Gew.-% und einen pH-Wert von 5 eingestellt waren. Ferner wurden durch Vermischen von HSA-Proben mit verschiedenen Glykierungsverhältnissen auch Proben mit Glykierungsverhältnissen von 17,1 % und 18,85 % hergestellt. Unter Verwendung dieser fünf Arten von Proben mit verschiedenen Glykierungsverhältnissen wurde das glykierte HSA unter Verwendung der in Beispiel 5 erhaltenen Protease enthaltenden Lösung gemessen.

Da festgestellt worden war, dass die in Beispiel 5 erhaltene Proteaseaktivität niedrig war, wurden jedoch 200 &mgr;l der Protease enthaltenden Lösung von Beispiel 5 zu 200 &mgr;l 5 gew.-%igem HSA zugesetzt, um die Reaktion durchzuführen, und die Reaktionszeit betrug 5 Stunden. Nach der Reaktion unter Verwendung dieser Protease wurde die erhaltene Farbentwicklung durch Verwendung der FAOD (FAOD-S) bestätigt. Als FAOD wurde die FAOD-S, die gemäß JP-A Hei-7-289253 hergestellt worden war (0,5602 U/ml), verwendet.

Der Titer der in diesem Beispiel verwendeten FAOD wurde durch das vorstehend genannte Geschwindigkeitsverfahren gemessen. Die Zusammensetzung der erhaltenen Lösung des FAOD-Farbentwicklungssystems, das für die vorstehend genannte Titerbestimmung verwendet wurde, war wie folgt. Lösung nach der vorstehenden Proteasereaktion 400 &mgr;l 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) 410 &mgr;l 3 mM 4-Aminoantipyrin 30 &mgr;l 3 mM TOOS 30 &mgr;l 60 U/ml POD (Peroxidase) 30 &mgr;l 0,5602 U/ml FAOD-S 100 &mgr;l

Nachdem die FAOD-Farbentwicklungslösung mit der vorstehend genannten Zusammensetzung 30 Minuten bei 37°C inkubiert war, wurde ihre Extinktion bei 555 nm gemessen. Bezüglich jeder der vorstehenden Proben wurde auch ein Leerwert (d.h. die Extinktion der kein Substrat enthaltenden Referenzlösung) gemessen, und die Extinktion des Leerwerts wurde von der Extinktion jeder Probe, die in dem vorstehenden Schritt erhalten wurde, subtrahiert, wodurch die tatsächliche Extinktion erhalten wurde.

Wie in der grafischen Darstellung von 8 gezeigt, wurde als Ergebnis der vorstehenden Messung die Farbentwicklungsreaktion durch die FAOD entsprechend dem Glykierungsverhältnis des HSA hervorgerufen. Demgemäß wurde bestätigt, dass die in diesem Beispiel erhaltene Säureprotease in ausreichender Weise für die Messung eines glykierten Proteins in Kombination mit der FAOD verwendbar war.

Die Kurve in 8 geht nicht durch den Ursprung. Entsprechend der Kenntnis der Erfinder der vorliegenden Erfindung wurde angenommen, dass die entsprechende Farbentwicklung einer Verunreinigung in der Protease und FAOD oder einer hierin verwendeten Komponente von HSA zuzuschreiben war. Es wurde angenommen, dass sich die Kurve dem Ursprung annähern würde, wenn die Reinheit des Enzyms verbessert wäre.

Industrielle Anwendbarkeit

Wie hierin vorstehend beschrieben, wird gemäß der vorliegenden Beschreibung eine Protease bereitgestellt, die zum Messen eines glykierten Proteins in einer Probe in Kombination mit FAOD (Fructosylaminosäureoxidase) zu verwenden ist.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Messen eines glykierten Proteins bereit, indem FAOD auf eine ein glykiertes Protein enthaltende Probe einwirken gelassen wird, worin das glykierte Protein mit einer Protease unter saurer Bedingung behandelt wird.

Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Messen eines glykierten Proteins bereit, indem Protease und FAOD auf eine ein glykiertes Protein enthaltende Probe einwirken gelassen wird, worin eine Protease der Gattung Aspergillus als Protease verwendet wird.

In dem vorstehend genannten Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein glykiertes Protein in einer Komponente eines lebenden Organismus mit hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit gemessen werden durch Verwenden einer geeigneten Protease, die eine verwendbare enzymatische Wirkung in Kombination mit einer FAOD aufweist, die in geeigneter Weise zum Messen von glykiertem Albumin verwendbar ist. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Messen eines glykierten Proteins bereit, das zur Kontrolle und Verhinderung von Symptomen von Diabetes beitragen kann, und stellt auch eine Protease bereit, die in geeigneter Weise für ein solches Verfahren verwendbar ist.

Ferner wird gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unter Verwendung einer in einfacher Weise erhältlichen Protease, wie "Sumizyme MP" als die vorstehend genannte Protease, die vorliegende Erfindung auf die klinische Verwendung in breiterem Bereich anwendbar.

Darüber hinaus kann gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unter Verwendung einer Säureprotease die vorstehend genannte Protease in einfacher Weise und rasch durch Einstellen des pH-Werts inaktiviert werden, und daher wird die vorliegende Erfindung auf die klinische Untersuchung usw. in breiterem Bereich anwendbar.


Anspruch[de]
Verfahren zum Messen eines glykierten Proteins durch Einwirkenlassen von FAOD (Fructosylaminosäureoxidase) auf eine ein glykiertes Protein enthaltende Probe, worin das glykierte Protein mit einer Protease aus Aspergillus melleus unter saurer Bedingung behandelt wird. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Protease eine Protease aus Aspergillus melleus KDK3001 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-6277 ist. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die FAOD FAOD-S oder FAOD-G ist. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das glykierte Protein glykiertes Albumin ist. Verfahren zum Messen eines glykierten Proteins durch Einwirkenlassen einer Protease und von FAOD auf eine ein glykiertes Protein enthaltende Probe, worin eine Protease aus Aspergillus melleus als Protease verwendet wird. Verfahren gemäß Anspruch 5, worin eine Protease aus Aspergillus melleus KDK3001 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-6277 als Protease verwendet wird.






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com