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Dokumentenidentifikation DE69929745T2 23.11.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001041141
Titel Neuer Bakteriophage, Verfahren zur Isolierung und dafür geeignetes universales Wachstumsmedium
Anmelder Council of Scientific and Industrial Research, New Delhi, IN
Erfinder Agrawal, Dr., Pushpa, Chandigarh - 160 036, IN;
Soni, Vishal, Chandigarh - 160 036, IN
Vertreter v. Füner Ebbinghaus Finck Hano, 81541 München
DE-Aktenzeichen 69929745
Vertragsstaaten DE, FR, GB
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 30.03.1999
EP-Aktenzeichen 993024264
EP-Offenlegungsdatum 04.10.2000
EP date of grant 08.02.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 23.11.2006
IPC-Hauptklasse C12N 7/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 1/20(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/74(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/79(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 1/21(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12P 1/06(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 1/14(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   
IPC additional class C12R 1/04  (2006.01)  A,  L,  N,  20051017,  B,  H,  EP

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft einen isolierten Bakteriophagen und ein Verfahren zur Herstellung des Bakteriophagen, der als Werkzeug für die Untersuchung der biologischen, biochemischen, physiologischen und genetischen Eigenschaften von Actinomycetes und anderer Organismen in Frage kommt. Der erfindungsgemäß erhaltene Bakteriophage ist besonders geeignet für die Kennzeichnung antibiotischer Biosynthesewege und ähnlicher primärer und sekundärer Stoffwechselwege. Der Bakteriophage des erfindungsgemäßen Verfahrens kommt auch für die Untersuchung mehrerer anderer genetischer und physiologischer Wege in Frage. Außerdem kann er zur Erzeugung von Mutationen bei den Stoffwechselwegen von Bakterien und nach einer gewissen spezifischen Veränderung wie z.B. nach Klonung in geeignete Mobilisierungsvektoren zur Untersuchung der Stoffwechselwege anderer Mikroorganismen und Pflanzen verwendet werden. Mutationen können praktisch an jedem beliebigen Lokus der Bakterien erzeugt werden. Die Ergebnisse der oben erwähnten Veränderungen bzw. Mutationen können zur Erzeugung neuer Stoffwechselprodukte oder zur Expression neuer physiologisch aktiver Verbindungen oder neuer Eigenschaften im selben Wirt oder in heterologen Wirten führen.

Hintergrund der Erfindung

Der Ausdruck "Bakteriophage bzw. Phage" bedeutet in der vorliegenden Anmeldung ein Virus oder Viren, welche Bakterin infizieren. Nach der Infektion kann das Virus neue Nachkommenpartikel erzeugen oder es kann im Bakteriengenom "schweigend" verbleiben. Unter einem "Lysogen" versteht man hier ein Bakterium, das einen Bakteriophagen aufweist, ohne von diesem geschädigt zu werden. Unter einem "Plaque" versteht man einen trüben oder klaren Fleck, der durch Lyse der durch einen Bakteriophagen infizierten Zellen erzeugt wird. Unter einem "Prophagen" versteht man hier einen Bakteriophagen, der in einer Bakterienzelle im lysogenen Zustand aufrechterhalten wird. Unter einem "konfluenten Rasen" versteht man ein gleichmäßiges Wachstum des Organismus auf einer Agarplatte. Unter einem "Phagemid" versteht man hier einen Plasmidvektor, der einen Teil der Phagen-DNA trägt. Unter dem Ausdruck "Restriktionsenzym" versteht man hier eine Endonuclease, welche die durch ihre Erkennungssequenz definierten DNA-Abschnitte schneidet. Unter "Auxotroph" versteht man einen im Hinblick auf die Synthese eines oder mehrerer Zucker oder Aminosäuren defektiven Bakterienstamm. Unter der "Restriktionsbarriere" versteht man ein Verteidigungssystem des Wirts, welches die Bakterien vor Eindringlingen schützt, indem es deren DNA spaltet. Unter "Klonung" versteht man hier das Verfahren zur Erzeugung rekombinanter DNA. Unter dem Begriff "genetisches Werkzeug" versteht man hier ein System, bei dem die DNA als Werkzeug verwendet wird. Unter "Mutation" versteht man hier eine Veränderung in der Basenabfolge der DNA eines Organismus. Diese Veränderung kann durch Insertion, Deletion oder Modifizierung der DNA-Basen verursacht werden. Unter "Transposon" versteht man hier ein genetisches Element, welches die Informationen enthält, die seinen Einbau in verschiedene Abschnitte im Wirtsgenom ermöglichen. Unter "Genom" versteht man hier die Gesamtheit aller Gene eines Virus, einer Zelle, eines Bakteriums oder eines lebenden Organismus.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Isolierung eines neuen Bakteriophagen aus dem Stamm PA 136 von Saccharomonospora aus Bodenproben und dessen Reinigung. Der erfindungsgemäße Saccharomonospora-Stamm ist gekennzeichnet durch das Vorliegen einer einzigen lateral angeordneten, weißen Spore, durch Meso-Diaminopimelinsäure, Arabinose und Galactose als Gesamtzucker, jedoch ohne Mykolsäure, und durch Fettsäuren als Hauptkomponenten, und zwar C16-Iso und -Antiso-Fettsäuren. Weitere Eigenschaften dieses Stammes sind: Wachstum auf Hypoxanthin, Hypoxanthin + 0,3 % Glucose, Tributyrin, Xylit, Thalliumacetat, Thalliumacetat + 0,1 % Glucose, Propanol, Butanol-1,3-diol, D-Fucose, Salicin, Arabinose, L-Asparagin, Phenylalanin, L-Serin und Na-Benzoat. Der Stamm gedeiht in einem Temperaturbereich von 20 bis 55°C auf einer Agarplatte bei einem pH-Bereich von 5,5 bis 9,0. Er ist Katalase-positiv und produziert extrazelluläre Enzyme: Lipase (C14), Leucinarylamidase, Valinarylamidase, Cysteinarylamidase, Trypsin, Chemotrypsin, saure Phosphatase, Naphthol-As-B1-phosphohydrolase, &agr;-Glucosidase und &bgr;-Glucosidase. Die Gesamtzelle hat folgende chemische Zusammensetzung: Meso-di-aminopimelinsäure, Arabinose, Galactose, Phosphatidylglycerin, Di-phosphatidylglycerin, Phosphatidylethanolamin, Hydroxyphosphatidylethanolamin und Phosphatidylinositglycolipide. Es liegt nicht identifizierte Gruppen von Phospholipiden enthaltender Zucker vor. Die Gesamtfettsäuren sind: Als Hauptkomponenten C16-Iso- und Antiso-Fettsäuren verzweigter und geradkettiger C-Verbindungen. Saccharose wird nicht verwertet. Der Stamm produziert in den meisten Fällen ein diffusionsfähiges grünes, orangefarbenes oder gelbes Pigment. Manchmal produziert der Stamm PA136 von Saccharomonospora überhaupt kein Pigment. Gelegentlich ist das Pigment nicht-diffusionsfähig. Die von PA136 von Saccharomonospora produzierten Pigmente sind jedoch wasserlöslich. Unlöslich sind sie in Ether, Ethanol, Methanol, Butanol, Isopropanol, Benzol, Ethylacetat, Chloroform und Aceton, teilweise löslich in Phenol. Das vom Stamm produzierte grüne Pigment ist eine kennzeichnende Eigenschaft der Gattung Saccharomonospora. Der Stamm PA136 von Saccharomonospora unterliegt nach 5- bis 6-tägiger Inkubation auf einer Kulturplatte der Autolyse, was dann bei detaillierter Analyse zur Isolierung eines Bakteriophagen unter der Bezeichnung PIS136 führt. Dieser temperente Bakteriophage weist einen weiten Wirtsbereich unter grampositiven Bakterien auf und erzeugt bei 2 bis 3 % aller infizierter Zellen Lysogene. Der Phage PIS136 hat ein DNA-Genom von ca. 90 kb, wobei der Gehalt an GC (Guanidin und Cytosin) 69 bis 71 mol-% beträgt. Das Genom dieses Phagen ist teilweise methyliert und entbehrt der Erkennungsabschnitte für viele Restriktionsenzyme. Das Phagengenom, das durch Transposition Random-Mutationen zu erzeugen vermag, zeigt auch das Phänomen der Geninversion. Des Phänomens der Geninversion kann man sich bedienen, um den Wirtsbereich des Phagen im Hinblick auf heterologe und konditionale Genexpression zu steuern. Der Phage wurde als Lysogen des Stammes PA136 von Saccharomonospora bei der Microbial Type Culture Collection, Institute of Microbial Technology, Chandigarh hinterlegt und trägt die Zugangsnummer MTCC A0001, wobei "A" für Actinomycetes steht und die Hinterlegungsnummer DSM 12317 bei der DSMZ-DEUTSCHEN SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH, bei der er am 16. Juli 1998 hinterlegt wurde, trägt. Aufgrund seiner einzigartigen Eigenschaften weist dieser Phage enorme Bedeutung als genetisches Werkzeug auf und kann in unterschiedlicher Weise als Transposon für die Erzeugung von Mutanten, als gattungsübergreifender Klonungsvektor, für die Untersuchung von Stoffwechselwegen, als Reporterphage, für die konditionale Genexpression oder sogar für die Aktivierung schweigender Gene usw. verwendet werden.

Bakteriophagen bzw. Phagen, d.h. Bakterienviren, sind die einfachsten aller Lebewesen. Sie sind die natürlichen Objekte für die Erforschung des Lebens auf dem Molekularniveau. Phagen haben eine Reihe von regulatorischen Mechanismen entwickelt, um eine wirksame Produktion von Nachkommenpartikeln im Verlaufe ihrer Entwicklung zu sichern. Im allgemeinen kommt es jedoch bei ca. 1 % der Zellen, die von temperenten Phagen infiziert werden, zur Lysogenie, d.h. dann wenn das Phagengenom in das Wirtsgenom eingebaut wird. Die Lysogene sind gegen Superinfektion immun.

Aus industriell verwendbaren und medizinisch bedeutsamen Bakterien wie Streptomyces sp., Corynebacterium sp., Lactococcus lactis, Mycobacteria, Escherichia coli, Salmonella und Staphylococcus sp. usw. werden zahlreiche Phagen isoliert.

Ca. 70 % der bekannten und natürlich vorkommenden Antibiotika werden von Vertretern der Gattung Streptomyces produziert. Bei den meisten Klonungsverfahren bei verschiedenen Arten von Streptomyces werden Vektoren auf Plasmidbasis verwendet, die zur autonomen Replikation befähigt sind (Rao, R.N., Richardson, M.A. und Kuhtoss, S. 1987, in Methods in Enzymology. 153: 166-198; Hopwood, D.A., Bibb, M.J., Chater, K.F. und Kieser, T., 1987, in Methods in Enzymology. 153: 116-165).

Gleichzeitig wurde der einen relativ breiten Wirtsbereich aufweisende temperente Bakteriophage ∅C31, welcher lediglich Streptomyces sp. und die verwandte Gattung Streptoverticillium sp. infiziert, als vielseitig verwendbarer Klonungsvektor entwickelt (Chater, K.F., 1986, In The Bacteria, Bd. IX. Queener, S.W. und Day, L.E. (ed), London: Academic Press, SS. 119-158; Kobler, L., Schwertfirm, G., Schmieger, H., Bolotin, A. und Sladkova, I., 1991 FEMS Microbiology Letters, 8: 347-354; Bruton, C.J., Guthrie, E.P. und Charter, K.F., 1991, Bio/Technology, 9: 652-656). 1991, Kuhtoss, S., Richardson, M. und Rao, R.N. (Gene, 97: 143-146) entwickelten einen Schaukelvektor, der sich das abschnittspezifische Rekombinationssystem des Phagen ∅C31 zunutze macht. Diese Vektoren ermöglichen es, dass die geklonte DNA in eine Wirtszelle beständig eingefügt wird. McHenny, M.A. und Baltz, R.H. (Journal of Bacteriology, 1988, 170: 2276-2282) beanspruchen die Entwicklung eines Transduktionssystems für mehrere Arten von Streptomyces und verwandte Gattungen unter Einsatz des Phagen FP43. Dieses System versagte jedoch bei dem sehr wichtigen Stamm Streptomyces hygroscopicus 10-22. So verwendeten Zhou, X., Deng, Z., Hopwood, D.A. und T. Kieser, (1994 Journal of Bacteriology, 176: 2096-2099) einen neuen Phagen, und zwar ∅HAU3, der einen relativ breiten Wirtsbereich innerhalb der Gattung Streptomyces aufweist und entwickelten einen Phagemiden zur Untersuchung der Molekularbiologie des Stammes Streptomyces hygroscopicus 10-22).

Phagen eines weiteren, für industrielle Zwecke bedeutenden Organismus, und zwar von Lactococcus lactis, wurden auch zur Vektorentwicklung benutzt (Kok, J., Van der Vossen, J.M.B.M. und G. Venema, 1984, Applied environmental Microbiology, 48: 726-731; Van der Vossen, J.M.B.M., Van der Lelie, D. und Venema, G., 1987, Applied Environmental Micro-biology, 53: 2452-2457). Auch wurden Versuche unternommen, um den Phagen L5 von Mykobakterien in einem geeigneten Vektor zu entwickeln, um die Untersuchung der Molekularbiologie von Mykobakterien zu erleichtern (Lee, M.H., Pascopella, L., Wu, M.K., Jacobs, W.R. und G.F. Hatfull, 1993 Molecular Microbiology, 7: 407-417). Trotz all dieser Untersuchungen hat die Anwendung der Molekulartechnik bisher noch nicht zu entscheidenden Ergebnissen bei Programmen zur Entwicklung industriell verwendbarer Stämme bzw. bei der Entwicklung von Hybriden oder neuen Antibiotika geführt. Keiner der bisher in der Literatur beschriebenen Phagen von grampositiven Bakterien hat die Eigenschaft, ein Transposon abzugeben.

Ein Transposon hat die Eigenschaft, sich in willkürlich gewählten Abschnitten in das Wirtsgenom einzufügen. Aufgrund ihrer Insertionseigenschaften können Transposone zur Verbesserung der Erzeugung sekundärer Metabolite und zur Konstruktion von Stämmen verwendet werden, die Hybride oder neue sekundäre Metabolite bilden. Transposone werden auch für den Genbruch und für die Klonung von generellen Regulatorgenen insgesamt, für die Wege sekundärer Metabolite und für starke bzw. Regulatorpromotoren verwendet. Sie könnten auch zur Blockierung konkurrierender bzw. unnötiger Wege zur Erzielung einer effektiveren Produktion sekundärer Metabolite verwendet werden (Hahn, D.R., Solenberg, P.J., McHenny, M.A. und R.H. Baltz, 1991, Journal of Industrial Microbiology, 7: 229-234).

Die vorliegende Erfindung beruht somit auf dem Bedarf nach Entwicklung eines Systems, mit dessen Hilfe die Molekularbiologie der Klasse der grampositiven Bakterien, die eine große Zahl von Organismen, wie z.B. Arten von Amycolatopsis, Corynebacterium, Mycobacteria, Nocardia, Micromonospora, Rhodococcus, Streptomyces usw. umfasst, die sowohl industriell als auch medizinisch von Bedeutung sind, untersucht werden kann. Gegenwärtig ist kein von einem Mehrfachtransposon bzw. einem Mehrfachphagen vermittelter Vektor bzw. ein entsprechendes generalisiertes Transduktionssystem zugänglich, mit dessen Hilfe die Genetik und die Molekularbiologie dieser Organismen problemlos untersucht werden könnte. Außerdem sind die meisten der genannten Organismen für die Industrie von sehr großer Bedeutung, da sie Antibiotika, Enzyme, bioaktive kleine Peptide, Glutaminsäure und viele andere Aminosäuren als sekundäre Stoffwechselprodukte erzeugen. Die Steuerung dieser Stoffwechselwege ist äußerst kompliziert, da für die Biosynthese mehrere Zwischenprodukte und Precursor-Verbindungen erforderlich sind. Im Allgemeinen stehen die sekundären Stoffwechselwege innerhalb eines Organismus insofern in einer Wechselbeziehung zueinander, als sie entweder dasselbe Precursormolekül verwenden oder man eine intermediäre Verbindung des anderen Stoffwechselweges als Precursor verwendet. Dies kann zu einer Verminderung der Produktion an erwünschtem Endprodukt bei einem der Stoffwechselwege führen verglichen mit einem verwandten Stoffwechselweg. Da bei natürlichen Isolaten die erzeugte Menge sehr gering ist, ist die Gewinnung hohe Mengen produzierender Stämme ein Hauptziel der Industrie. Außerdem produzieren die meisten natürlichen Isolate mehr als einen sekundären Metaboliten, wobei die Anwesenheit einer anderen Verbindung oft unerwünscht ist. So kann ein Bakteriophage, der die Eigenschaft besitzt, die Produktion unerwünschter Verbindungen durch Mutation einzustellen, dazu verwendet werden, die Umleitung einer Precursorverbindung von einem Stoffwechselweg zu einem anderen, was häufig einen begrenzenden Faktor darstellt, zu stoppen, was für die Industrie von sehr großer Bedeutung ist. Die Eigenschaft der Geninversion beim erfindungsgemäß beschriebenen Bakteriophagen bzw. Phagen kann dazu verwendet werden, die Probleme zu überwinden, die dann entstehen, wenn das intermediäre Produkt eines Stoffwechselweges das Precursormolekül eines anderen Stoffwechselweges darstellt. Das Verfahren besteht nun darin, dass das invertierende Fragment in einem der Biosynthesewege so geklont wird, dass dann, wenn das Invertierungsfragment in der einen Ausrichtung vorliegt, der Stoffwechselweg normal funktioniert, in der anderen Ausrichtung die Biosynthese jedoch an der Stelle, wo das Inversionsfragement eingefügt wird, gestoppt wird. Der andere Teil des Stoffwechselweges, der normal funktioniert, kann jedoch die Akkumulierung intermediärer Produkte ermöglichen, die von einem anderen Biosyntheseweg verwertet werden. Da der Inversionsprozess von außen gesteuert werden kann, ist es möglich, die Biosynthesewege nach Bedarf zu modifizieren. Der erfindungsgemäß beschriebene Bakteriophage hat somit umwälzende Wirkung insbesondere für die Industriezweige, die an der großtechnischen Herstellung von durch Mikroorganismen erzeugten wertvollen sekundären Metaboliten beteiligt sind. Dieser Phage infiziert auch Mykobakterien, wodurch Mutanten derselben erhalten werden können. Diese können als Lebendimpfstoffe verwendet werden. Die vorliegende Erfindung bietet somit die Möglichkeit über einen Transposon-Phagen zu verfügen, der als generalisiertes Transduktionssystem für eine Reihe von Gattungen von grampositiven Bakterien verwendet werden kann.

Bei der Herstellung des Bakteriophagen ist die Wahl des Wachstumsmediums von entscheidender Bedeutung. Es werden dabei verschiedene bekannte Medien verwendet:

  • (1) Luria Bertani (LB), das pro 1000 ml 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g NaCl enthält,
  • (2) Hefeextrakt: Malzextrakt pro 1000 ml: 2 g Hefeextrakt, 4 g Malzextrakt und 10 g Glucose,
  • (3) Tryptische Sojabouillon pro 1000 ml: 17 g Pankreas-Spaltprodukt von Casein, 3 g Papain-Spaltprodukt von Sojamehl, 5 g NaCl, 2,5 g zweibasiges Kaliumphosphat und 2,5 g Dextrose und
  • (4) Bennett's Medium, das pro 1000 ml folgende Komponenten enthält: 1 g Hefeextrakt, 1 g Fleischextrakt, 2 g Pankreas-Spaltprodukt von Casein und 10 g Dextrose. Diese bekannten Medien wurden getestet und es wurde festgestellt, dass keines dieser Medien die Freisetzung großer Mengen an Phagenpartikeln begünstigt.

Die Komponenten der oben aufgeführten bekannten Medien sind nicht leicht assimilierbar und begünstigen nicht in erheblichem Maße den lytischen Zyklus des Phagen. Außerdem entbehren alle oben genannten Medien der Spurenelemente, die für das Wachstum von Lebewesen von besonderer Bedeutung sind, was schließlich den lytischen Zyklus des Bakteriophagen beeinflussen kann. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Wachstumsmedium, das unter anderem für Pilze und Bakterien und insbesondere für den Stamm Saccharomonospora PA 136, der ein Lysogen des Phagen PIS 136 darstellt, geeignet ist.

Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Herstellung eines Bakteriophagen, der als genetisches Werkzeug für die Untersuchung der biologischen, biochemischen, physiologischen und genetischen Eigenschaften einer großen Zahl von Gattungen der Actinomycetes und anderer grampositiver Bakterien geeignet ist. Das Verfahren umfasst die Stufen der Isolierung und Reinigung eines neuen temperenten Bakteriophagen (bzw. Phagen) aus dem Stamm Saccharomonospora PA136, wobei der Phage bzw. sein Bakteriophage als genetisches Werkzeug zur Untersuchung der Molekularbiologie und anderer Eigenschaften einer großen Zahl von grampositiven Bakterien verwendet werden kann. Der Stamm Saccharomonospora PA136 ist ein Lysogen und nach der Lyse ergibt dieser einen mutagenen Bakteriophagen mit weitem Wirtsbereich, und zwar PIS136.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des oben beschriebenen Bakteriophagen bzw. des Phagen als Transposon für die Erzeugung von Random-Mutationen in einem weiten Bereich von Bakterien oder in einem anderen geeigneten Wirt.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des invertierbaren Fragments des in einen geeigneten Vektor geklonten Phagen zur Steuerung bzw. Regulierung der sekundären Stoffwechselwege entweder des Wirtsstammes oder eines heterologen Wirtes. Der Phage PIS 136 kann die Restriktionsbarrieren vieler Actinomycetenstämme überwinden und sich selbst als Lysogen etablieren, indem er sich an willkürlich gewählten Abschnitten der Wirtsgenome einfügt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt somit einen aus Saccharomonospora isolierten Bakteriophagen (Zugangsnummer DSM 12317) mit ca. 90 Kilobasenpaaren eines langen, doppelsträngige DNA aufweisenden Genoms mit einem Guanidin- und Cytosingehalt von 69-71 mol-% bereit. Der erfindungsgemäße Bakteriophage kommt als Werkzeug für die Untersuchung der biologi-schen, biochemischen, physiologischen und genetischen Eigenschaften von Actinomyceten und anderen Organismen in Frage.

Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Isolierung eines Bakteriophagen als Werkzeug für die Untersuchung biologischer, biochemischer, physiologischer und genetischer Eigenschaften von Actinomycetes und anderen Organismen, das die Inkubation eines bei der DSMZ-Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH unter der Zugangsnummer DSM 12317 (Indische Zugangsnummer MTCC A0001) hinterlegten Stammes von Saccharomonospora in einem Nährmedium bis zur Erreichung des Autolysestadiums, die Isolierung und Reinigung eines Bakteriophagen aus diesem Medium umfasst, der in der lysierten Kultur mit üblichen Methoden erzeugt wird, bereit. Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren außerdem noch das Aufbrechen der Proteinhülle des isolierten Bakteriophagen mit bekannten Methoden unter nachfolgender Rückgewinnung des Bakteriophagen durch übliche Ausfällungstechniken.

Der Bakteriophage kann in einem beliebigen Medium bei einem pH von 7,0 bis 7,5 gezüchtet werden, das unterschiedliche Mengen an Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trypton, Tryptose, Pepton, Proteosepepton, Malzextrakt, Glucose, Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, Fe(III)-Ammonoiumcitrat und Cobaltchlorid enthält. Das bevorzugte Medium umfasst jedoch Rinderextrakt, Tryptose, Peptonproteose, Hefeextrakt, Glucose, Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, Fe(III)-Ammoniumcitrat, Cobaltchlorid bei pH 7,2 in den nachfolgend konkret beschriebenen Mengen.

Die Inkubation während 3-6 Tagen unterstützt die Freisetzung des Bakteriophagen in das Medium. Die besten Ergebnisse werden jedoch ab dem fünften Tag erzielt.

Bei bestimmten Ausführungsformen kann der Bakteriophage durch ein modifiziertes Verfahren nach Yamamoto et al., 1970 und Smorawinska et al., 1988 (Yamamoto, K.R.; Alberts, B.M. Benzinger, R. Lawhorne, L. und Trieber, G., 1970, Virology, 40: 734-744; Smorawinska, M., Denis, F., Dery, C.V., Magny, P. und Brzenski, R., 1988, Journal of General Microbiology, 134: 1773-1778) gereinigt werden.

Die Erfindung erstreckt sich außerdem auf einen Klonungsvektor, der die DNA des Bakteriophagen enthält, und kann ein Plasmid umfassen.

Der erfindungsgemäße Bakteriophage kann zur Erzeugung von Mutationen in den Stoffwechselwegen von Bakterien und nach einer gewissen spezifischen Abänderung, wie z.B. nach Klonung in geeigneten Mobilisierungsvektoren auch zur Untersuchung der Stoffwechselwege anderer Mikroorganismen und Pflanzen verwendet werden. Die Ergebnisse der oben erwähnten Abänderungen bzw. Mutationen können zur Erzeugung neuer Stoffwechselprodukte bzw. zur Expression neuer physiologisch aktiver Verbindungen führen oder die pathogenen Eigenschaften eines Organismus verändern, wobei jedoch die immunogenen Eigenschaften aufrechterhalten werden, welche den Organismus dazu befähigen, dass er als Lebendimpfstoffstamm oder zur Expression neuer Eigenschaften im selben Wirt oder in heterologen Wirten verwendet werden kann.

Das Nährmedium für die Durchführung der vorliegenden Erfindung kann durch Mischen geeigneter Mengen der nachfolgenden chemischen Stoffe und komplexer Medienkomponenten wie Fleischextrakt oder Lab Lamco, Hefeextrakt, Tryptose, Proteosepepton, lösliche Stärke, Dextrose und Spuren von Cobaltchlorid oder Cobaltnitrat und Fe(III)-Ammoniumcitrat hergestellt werden. Die fertige Zubereitung, gelöst in doppelt destilliertem Wasser, hat dann bei Raumtemperatur einen pH von ca. 6,0 bis 6,6. Dieses Medium wirkt dann nach Einstellung des pH auf einen Bereich von 7,0 bis 7,2 unter Verwendung von 1N NaOH als Universalmedium für das Wachstum einer großen Zahl von Gattungen der Actinomycetes, anderer grampositiver Bakterien, bestimmter gramnegativer Bakterien und mehrerer Gruppen von Pilzen. Insbesondere erwies es sich als ausgezeichnetes Medium für das Wachstum des Stammes Saccharomonospora PA 136.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Nährmedium ein Gemisch aus Makronährstoffen, Mikronährstoffen und Spurenelementen in den nachfolgend genannten Mengen, wobei der Rest auf doppelt destilliertes Wasser entfällt:

  • A. Makronährstoffe in Form assimilierbarer C-Quellen wie

    1. Lab Lamco oder Fleischextrakt, 8-12 g

    2. Stärke, 1-2 g

    3. Dextrose, 10-12 g und

    auch in Form assimilierbarerr N-Quellen wie

    1. Proteosepepton, 1-3 g

    2. Tryptose, 1-3 g
  • B. Mikronährstoffe, ausgewählt unter Hefeextrakt, 1-3 g, und
  • C. Spurenelemte, ausgewählt unter:

    1. Cobaltchlorid oder -nitrat, 5-10 mg

    2. Fe(III)-Ammoniumcitrat, 5-10 mg

    3. Magnesiumsulfat oder -chlorid, 0-10 mM

    4. Calciumchlorid oder -nitrat, 0-10 mM.

    auf 1000 ml doppelt destilliertes Wasser.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung:

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst im Einzelnen folgende Schritte:

Isolierung des Saccharomonospora-Stammes

Aus einem aktiven Komposthaufen in Northumberland, einer Grafschaft im Vereinigten Königreich, und aus Tokio (Japan) wurden 6 bis 18 Zoll unterhalb der Oberfläche Bodenproben entnommen. Diese wurden zuerst an der Luft bei Raumtemperatur getrocknet, um die Organismen abzutöten, die trocknungsempfindlich sind, und dann bei ca. 100°C erhitzt und auf Raumtemperatur abgekühlt.

Ein Gramm jeder der gesammelten und wie oben vorbehandelten Proben wurde in sterilem Wasser suspendiert und verwirbelt. 1 ml jeder Suspension wurde dann in einem üblichen Medium plattiert, das das Natriumsalz der Huminsäure, CaCO3, Fe(II)-Sulfat und KCl, MgSO4, Na2HPO4 in destilliertem Wasser bei einem pH über 7,0 enthielt und mit Cycloheximid, Nystatin, Nalidixinsäure, Penicillin G und Polymyxin B supplementiert wurde.

Die Platten wurden dann während 2 bis 5 Wochen inkubiert. Jede Kolonie der betreffenden Platte wurde dann auf ein Medium überimpft, das abgemessene Mengen an Fleischextrakt, Tryptose, Hefeextrakt, Proteosepepton, Dextrose, Calciumnitrat oder Calciumchlorid, Magnesiumchlorid oder Magnesiumsulfat, Spuren von Fe(III)-Ammoniumcitrat, Spuren von Cobaltchlorid oder Cobaltnitrat und löslicher Stärke in destilliertem Wasser enthielt, und zwar unter Aufrechterhaltung des pH des Mediums in einem Bereich zwischen 6,0 und 8,5. Die Kulturplatten wurden dann inkubiert, wonach die grüne Pigmente produzierenden Kolonien in einem neuen Medium, das weiter unten näher beschrieben wird, gereinigt wurden.

Identifizierung des Stammes

Alle grünes Pigment produzierenden Kolonien wurden auf das genannte neue Medium unter Verwendung von McCartney's-Flaschen erneut ausgebracht. Eine Probe jedes Isolats wurde dann in Glycerin konserviert, wobei man das Medium bei einer Temperatur von unter –20°C einsetzte.

Die auf diese Weise erhaltenen, grünes Pigment produzierenden Kolonien wurden nach üblichen Verfahren wie nach morphologischen Eigenschaften, Verwertung von Substraten wie C- und N-Quelle, Produktion extrazellulärer Enzyme und chemische Zusammensetzung der Gesamtzelle (chemotaxonomisch) identifiziert. Die Anwesenheit einer einzigen lateral angeordneten weißgefärbten Spore, von Mesodiaminopimelinsäure, Arabinose und Galactose als Gesamtzucker, jedoch ohne Mykolsäure, und mit dem Hauptanteil an C16-Iso- und -Anisofettsäuren bewies, dass es sich bei dem Stamm um einen Vertreter der Gruppe der Actinomycetes handelt. Der Stamm PA136 wurde als Art der Gattung Saccharomonospora identifiziert.

Es wurde festgestellt, dass die Kulturen, welche grünes Pigment produzieren, nach 5- bis 6-tägiger Inkubation zu lysieren begannen. Die Überimpfung von Zellen aus dem lysierten Bereich in frisches Medium führte zum Wachstum desselben Organismus, der ebenfalls lysierte. Dieser Versuch wurde mehrmals wiederholt, wobei jedes Mal das gleiche Ergebnis erzielt wurde. Die Ergebnisse legten nahe, dass die Lyse nicht zu 100 % erfolgt und der Grund für die Lyse erblich ist.

Das Phänomen der Autolyse bzw. der induzierten Lyse, wie sie oben beschrieben wurde, wurde auch in der Flüssigkultur beobachtet, wobei sich die Freisetzung des Bakteriophagen als Ursache für die Lyse herausstellte.

Isolierung und Reinigung des Phagen

Es wurde beobachtet, dass der Stamm Saccharomonospora PA136 nach 3-6-tägiger Inkubation auf einer Kulturplatte lysierte, wobei diese Platte folgende Medien umfasste:

  • 1. Medium mit folgenden Komponenten: Fleischextrakt, Hefeextrakt, Tryptose, Proteosepepton, Dextrose, Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, Agar und destilliertes Wasser auf 1000 ml bei einem pH von 6,8 bis 7,5.
  • 2. Tryptisches Sojaagar/Bouillon, die Pankreas-Spaltprodukt von Sojamehl, K2HPO4 Dextrose, Agar und doppelt destilliertes Wasser auf 1000 ml bei einem pH von 6,8 bis 7,5 enthielt.
  • 3. Hefeextrakt-Malzextrakt-Medium, das Hefeextrakt, Malzextrakt, Glucose, Agar und doppelt destilliertes Wasser auf 1000 ml bei einem pH von 6,8 bis 7,5 enthielt.

    Die Lyse der Kultur in einer Platte wurde bis zur Inkubationstemperatur von 55°C beobachtet.

    Alle drei oben aufgeführten Medien können sowohl für die Autolyse als auch für die Induktion verwendet werden.
  • 4. Das neue Medium, das weiter unten näher beschrieben werden wird, wurde mit 5-6 Ösen der aktiv wachsenden Kultur von PA136 beimpft und bei ca. 25°C während ca. 36 bis 40 Stunden inkubiert und dann zur Beimpfung eines Mediums in industriellem Maßstab verwendet. Die Impfdichte lag zwischen 5 und 10 % und die Kultur wurde zwischen 25 und 30°C gezüchtet. Diese Kultur lysierte nach 4- bis 5-tägiger Inkubation entweder bei 25°C bis 30°C oder durch Anheben der Temperatur von 39°C auf 42°C während 30 Minuten bis 6 Stunden.
  • 5. Gemäß einem weiteren Versuch wurde eine 2 Tage alte Kultur der Einwirkung von UV-Licht mit kurzer Wellenlänge während ca. 10 bis 40 Sekunden ausgesetzt und dann zur Beimpfung von 300 ml Medium (1000 ml-Kolben) verwendet. Diese Kultur lysierte schneller als eine, die nicht dem UV-Licht ausgesetzt war. Dauerte die Bestrahlung länger als 40 Sekunden, d.h. 60 Sekunden, waren für die Erreichung des lytischen Stadiums 7 bis 10 Tage erforderlich, da das anfängliche Wachstum nur äußerst schwach war.

Aus jeder der autolysierten oder induzierten Kulturen konnte der ursprüngliche Stamm PA 136 wieder zurückgewonnen werden und der Phage PIS136 konnte gereinigt werden.

Der Phage wurde nach dem üblichen Verfahren von Yamamoto et al., 1970, und Smorawinska et al., 1988 (Yamamoto, K.R.; Alberts, B.M., Benzinger, R., Lawhorne, L. und Treiber, G., 1970, Rapid bacteriophage sedimentation in the presence of polyethylen-glycol and its application to large scale virus purification, Virology, 40: 734-744; Smorawinska, M., Denis, F., Dery, C.V., Magny, P. und Brzenski, R., 1988. Characterization of SE-3, a virulent bacteriophage of Saccharopolyspora erythraea, Journal of General Microbiology, 134: 1773-1778), unter geringer Modifizierung gereinigt, wobei letztere darin bestand, dass bei 35.000 Upm während ca. vier Stunden pelletiert wurde.

In den Ansprüchen 10-14 wird ein Verfahren beansprucht, bei dem die Ausfällung des Polynucleotids in Anwesenheit von 0,25 M NaCl und einer Lösung von 0,15 M NaCl und 0,015 M Tri-Na-Citrat bei 4°C in Anwesenheit von Ethanol durchgeführt wird.

Die weitere elektronenmikroskopische Kennzeichnung des Bakteriophagen erfolgte nach dem üblichen Verfahren, z.B. durch Negativfärbung unter Verwendung von Phosphorwolframsäure bei neutralem pH.

Der Bakteriophage weist keine Stellen für die mit * markierten Restriktionsenzyme auf, ist jedoch gegenüber den nachfolgend angeführten Restriktionsenzymen empfindlich:

*Ava I, *Ase I, BamHI, *Bgl II, *Dpn I, *Dra I, EcoRI, *Hind III, *EcoR V, Kpn I, *Pst I, *Xba I, *Xho I, BstE II, Bst X I, Alu I, Sau3A I, Sph I (hitzebeständig), Sfi I, Cla I, Nco I, MlU I, Sac I, Sac II, Sca I, Sal I, Sma I, Stu I, Pvu II, Xma I, Nhe I, Spe I, SnaB I, Not I, Xmn I, Msp I, Hpa II, Mbo I, Hae III, Hha I, *Nsi I, Nar I, Age I, BstN I (das sind die Standardbezeichnungen, die weltweit verwendet werden. Diese Produkte werden von unterschiedlichen Firmen unter den üblichen Bezeichnungen, wie hier beschrieben, vertrieben).

Der Phage bzw. Bakteriophage infiziert die folgenden Stämme von Actinomycetes: Streptomyces albusG (D.A. Hopwood), Streptomyces albus (Sal I-defektive Mitante) (D.A. Hopwood), S. albunaceus, S. achromogenes subsp., achromogenes (DSM 40028), S. coelicolor A3 (2) (D.A. Hopwood), S. coelicolor &PHgr;C31 empfindliche Mutante, (D.A. Hopwood), S, clavuligerus (NRRL-B 3585), S. canescens (ISP 5001), S. galileus (K. Dharmalingam), S. hygroscopicus (ISP 5578), S. lividans (D.A. Hopwood), S. varsoviensis (DSM 40346), S. vastus (DSM 40309), S. vinaceus (DSM 40257), Saccharopolyspora erythreus (NRRL-B 5616), Saccharothrix aerocolonigenes (DSM 40034), Streptoverticillium albireticuli (DSM 40051), Microtetraspora inositola (DSM 43189), Micromonospora pusilla (IFO 14684), Actinomadura madurae (IFO 14623), Amycolatopsis mediterranei (ATCC 27643), A. mediterranei (ATCC 21789), A. mediterranei (ATCC 21271), A. mediterranei(13685), Nocardia amarae (Gordona amarae), Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium smegnatis und Bacillus subtilis.

Gewinnung der Phagen-DNA

Das Standardverfahren zur Herstellung von Phagen-DNA wurde entsprechend dem Phagen PIS136 modifiziert: Die Behandlung mit ProteinaseK und SDS (Na-dodesyl-sulfat) wurde mit &bgr;-Mercaptoethanol und Triton X-100 supplementiert. Über längere Zeit wurde in einem Temperaturbereich von 37-53°C inkubiert. Die Empfindlichkeit der Phagen-DNA gegenüber Restriktionsenzymen und gegenüber Methylierung erfolgte nach dem üblichen Verfahren.

Der Wirtsbereich des Bakteriophagen PIS136 wurde nach Standardverfahren entweder durch Serienverdünnung des Phagenpräparats unter Auftüpfeln auf den Rasen der Teststämme oder durch Infektion einer Einzelzellkultur, von Sporen oder Myzelen der Teststämme geprüft. Die Anwesenheit einer lytischen Zone bzw. Plaque-Bildung zeigten, dass ein konkreter Stamm gegenüber dem Phagen empfindlich ist.

Zur Erzeugung des Lysogens aus den Stämmen, welche Sporen produzierten, bediente man sich des von Hopwood et al., 1985 (Hopwood, D.A., Bibb, M.J., Chater, K.F., Kieser, T., Bruton, C.J., Kieser, H.M., Lydiate, D.J., Smith, C.P., Ward, J.M. und Schrempf, H., 1985, Genetic manipulation of Streptomyces: A. laboratory manual. The John Innes Foundation, Vereinigtes Königreich) beschriebenen Verfahrens. Zur Isolierung der Lysogene aus nicht sporenbildenden Stämmen wurden die Zellen aus dem lysierten Bereich gesammelt, in einem sterilen Phagenpuffer suspendiert und auf ein neues Nährmedium (wie oben beschrieben) ausgebracht. Die heranwachsenden Kolonien wurden auf die Anwesenheit des Bakteriophagen nach Standardmethoden wie Southern-Hybridisierung unter Verwendung der DNA des Phagen PIS136 als Sonde oder durch Auftüpfeln der vermuteten Lysogene auf den Rasen eines phagenempfindlichen Stammes und nachfolgende Beobachtung der Lysezone um die aufgetüpfelten Zellen getestet.

Die auf diese Weise erhaltenen Lysogene wurden auf veränderte Eigenschaften hin, auf Mutationen im Substratverwertungsweg, auf den Verlust der Pigmentproduktion oder im Hinblick auf die Sporenbildung nach der Standardmethode getestet, beschrieben von Hopwood et al., 1985 (Hopwood, D.A., Bibb, M.J., Chater, K.F., Kieser, T., Bruton, C.J., Kieser, H.M., Lydiate, D.H., Smith, C.P., Ward, J.M. und Schrempf, H., 1985, Genetic manipulation of Streptomyces: A Laboratory manual. The John Innes foundation, Vereinigtes Königreich). Die Lysogene, die sich im Hinblick auf die Verwertung eines oder mehrerer getesteter Substrate als defektiv erwiesen, wurden ferner durch Southern-Hybridisierung unter Verwendung der Gesamtphagen-DNA als Sonde auf die Anwesenheit des Bakteriophagen geprüft.

Das Originallysogen Saccharomonospora PA136 produziert ein grünes Pigment. Aus dem Stamm Saccharomonospora PA136, welcher das ursprüngliche grüne Pigment produziert, wurden jedoch auch gelbes Pigment oder überhaupt kein Pigment produzierende Varianten erzielt. Diese Variantenstämme unterliegen auch der Autolyse und produzieren den Phagen PIS136. Die Lysate des gelbes Pigment oder überhaupt kein Pigment produzierenden Varianten und der aus diesen Lysaten gereinigte Phage PIS136 zeigten einen relativ schmalen Wirtsbereich verglichen mit dem des Phagenpräparats aus dem grünes Pigment produzierenden Lysat. Durch Spaltung der Phagen-DNA durch mehrere Restriktionsenzyme konnte ferner festgestellt werden, dass eine Region des Phagen-DNA ihre Orientierung verändert und diese Veränderung auf der Inversion eines der DNA-Fragmente beruht. Die Inversion der Phagen-DNA bzw. des Polynucleotidfragments scheint die Ursache für den verminderten Wirtsbereich zu sein, den Phagenpräparate zeigen, die aus gelbes Pigment oder überhaupt kein Pigment produzierenden Varianten erhalten wurden.

Eigenschaften der Stämme Saccharomonospora PA136

Verwertung folgender Verbindungen: (a) NaCl; (b) Hypoxanthin; (c) Hypoxanthin + 0,3 % Glucose; (d) Tributyrin; (e) Xylit; (f) Thalliumacetat; (g) Thalliumacetat + 0,1 % Glucose; (h) Propanol; (i) Butanol-1,3-diol; (j) D-Fucose; (k) Salicin; (1) Arabinose; (m) L-Asparagin; (n) Phenylalanin und (p) Na-Benzoat.

Wachstum bei 20-55°C auf einer Agarplatte. Wachstum in einem pH-Bereich von 5,5 bis 9,0. Katalase-positiv. Produktion folgender extrazellulärer Enzyme: (a) Lipase (C14); (b) Leucinarylamidase; (c) Valinarylamidase; (d) Cysteinarylamidase; (e) Trypsin; (f) Chemotrypsin; (g) Saure Phosphatase; (h) Naphthol-As-B1-Phosphorhydrolase; (i) &agr;-Glucosidase; (j) &bgr;-Glucosidase.

Die chemische Zusammensetzung der Gesamtzelle umfasst Mesodi-aminopimelinsäure, Arabinose, Galactose, Phosphatidylglycerin, Diphosphatidylglycerin, Phosphatidylethanolamin, Hydroxyphosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositglycolipide und Zucker mit einer nichtidentifizierte Gruppe von Phospholipiden.

Es liegt ein Hauptanteil an C16-Iso und -Antiso-Fettsäuren verzweigt- und geradkettiger C-Verbindungen vor. Saccharose wird nicht verwertet. Es wird jeweils eine einzige lateral angeordnete weiße Spore gebildet. Meist wird diffundierbares Pigment gebildet, das grün, orange oder gelb ist. Manchmal produziert der Stamm Saccharomonospora PA136 überhaupt kein Pigment. Gegebenenfalls ist das Pigment auch nicht diffundierbar. Die vom Stamm Saccharomonospora PA136 produzierten Pigmente sind jedoch wasserlöslich. Die Pigmente sind unlöslich in Ether, Ethanol, Methanol, Butanol, Isopropanol, Benzol, Ethylacetat, Chloroform und Aceton, jedoch teilweise löslich in Phenol.

Aufgrund der Eigenschaften wie Meso-diaminopimelinsäure, vorwiegender Anteil an C16-Iso- und -Antiso-Fettsäuren sowie Arabinose und Galactose als wichtigster Zucker wurde der grünes Pigment produzierende Stamm als Art der Gattung Saccharomonospora identifiziert.

Das für die Inkubation und die Reinigung der Kolonien verwendete Wachstumsmedium wurde durch Mischen geeigneter Mengen der nachfolgenden chemischen Stoffe und komplexer Medienkomponenten, ausgewählt unter Rinderextrakt oder Lab Lamco, Hefeextrakt, Tryptose, Peptonproteose, lösliche Stärke, Dextrose und Spuren von Cobaltchlorid oder Cobaltnitrat und Fe(III)-Ammoniumcitrat, hergestellt. Die Zubereitung hat nach ihrer Herstellung und Lösung in doppelt destilliertem Wasser bei Raumtemperatur einen pH von ca. 6,0 bis 6,6. Dieses Medium wirkt, wenn es als solches verwendet wird, bzw. nach Einstellung des pH auf 7,0-7,2 unter Verwendung von 1 N NaOH als Universalmedium für das Wachstum einer großen Zahl von Gattungen der Actinomycetes, weiterer grampositiver Bakterien, beliebiger gramnegativer Bakterien und bei mehreren Gruppen von Pilzen. Das Wachstumsmedium ist ein Universalwachstumsmedium, das besonders geeignet ist für anspruchsvolle Organismen der Gattungen Actinomadura, Amycolatopsis, Anthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Rhodococcus, Streptomyces, Streptoverticillium, Saccharomonospora, Microtetraspora, Micromonospora, Nocardia, Nocardiodes, für langsam und schnell wachsende Mycobacteria, die Gattungen Bacillus, Escherichia und Pseudomonas sowie für mehrere andere langsam wachsende, jedoch noch nicht identifizierte Actinomyceten und mehrere Gruppen von Pilzen. Im Kontext der vorliegenden Erfindung wird das Medium jedoch insbesondere im Hinblick auf seine Eignung als Wachstumsmedium für Saccharomonospora-Stämme beschrieben.

Das Verfahren zur Herstellung des Wachstumsmediums umfasst das Mischen von A, B und C, d.h. der Makronährstoffe, Mikronährstoffe und Spurenelemente in den nachfolgend genannten Mengen:

  • A. Makronährstoffe in Form assimilierbarer C-Quellen wie

    1. Lab Lamco oder Fleischextrakt, 8-12 g

    2. Stärke, 1-2 g

    3. Dextrose, 10-12 g und

    auch in Form assimilierbarer N-Quellen wie

    1. Proteosepepton, 1-3 g

    2. Tryptose, 1-3 g
  • B. Mikronährstoffe, ausgewählt unter

    Hefeextrakt, 1-3 g, und
  • C. Spurenelemente, ausgewählt unter:

    1. Cobaltchlorid oder -nitrat, 5-10 mg

    2. Fe(III)-Ammoniumcitrat, 5-10 mg

    3. Magnesiumsulfat oder -chlorid, 0-10 mM

    4. Calciumchlorid oder -nitrat, 0-10 mM,

    auf 1000 ml doppelt destilliertes Wasser.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung enthält das Medium Makronährstoffe wie Kohlenstoff in Form von Lab Lamco oder Fleischextrakt, Stärke und Dextrose, Stickstoff in Form von Proteosepepton und Tryptose, Mikronährstoffe wie Vitamine in Form von Hefeextrakt, Spurenelemente wie Cobaltchlorid oder Cobaltnitrat und Fe(III)-Ammoniumcitrat und doppelt destilliertes Wasser. Gegebenenfalls können gereinigtes Agar, Calcium und Magnesium zugesetzt werden.

Einer der wichtigsten Aspekte bei der Herstellung des Wachstumsmediums ist die Zugabe einer Extra-C-Quelle zum Medium. Es ist allgemein bekannt, dass Glucose in den Stoffwechselweg eintritt, ohne modifiziert zu werden, so dass es für die meisten Organismen ein bevorzugtes C-Substrat darstellt, weil es auch sehr rasch verwertet wird. Hohe Glucosekonzentrationen im Medium üben jedoch eine negative Wirkung aus, da Glucose die Osmolarität des Mediums verändert. Die Glucose/Dextrose-Konzentration im Medium wird auch durch Autoklavieren sowie durch lange Inkubation beeinflusst. Viele Actinomycetes-Gattungen wachsen sehr langsam, so dass eine zusätzliche C-Quelle erforderlich ist, welche die Glucose/Dextrose nur langsam und konstant über längere Zeit freisetzt. Als zusätzliche C-Quelle wurde im Hinblick auf die Eigenschaften von Actinomycetes und einiger Pilze Stärke gewählt, da die meisten oben angeführten Organismen Stärke verwerten, wenn auch nur langsam. Ein weiterer wichtiger Aspekt besteht im Zusatz von Spurenelementen wie Cobalt und Eisen. Die entscheidende Rolle, welche Spurenelemente beim Wachstum von Organismen spielen, ist eine allgemein anerkannte Tatsache. Keines der oben aufgeführten Medien weist jedoch Spurenelemente als Teil ihrer Komponente auf.

Die einzelnen Makro- und Mikronährstoffe des erfindungsgemäßen Mediums liegen in folgender Konzentration vor: Makronährstoffe: Lab Lamco, 8-10 g oder Fleischextrakt, 10-12 g, Proteosepepton, 1-3 g, Tryptose, 1-3 g, Dextrose, 10-12 g, lösliche Stärke, 1-2 g, die Mikronährstoffe sind Hefeextrakt, 1-3 g und die Spurenelemente sind Cobaltchlorid oder -nitrat, 5-10 mg, Fe(III)-Ammoniumcitrat, 5-10 mg, Magnesiumsulfat oder Magnesiumchlorid, 5-10 mM, Calciumchlorid oder Calciumnitrat, 5-10 mM, doppelt destilliertes Wasser auf 1000 ml und pH 6,8-7,2. Die Zugabe von Calcium- und Magnesiumionen ist fakultativ, d.h. ihre An- oder Abwesenheit hat auf das Wachstum des jeweiligen Organismus keine besondere Auswirkung.

In Tabelle 1 wird das tryptische Soja-Bouillonmedium mit anderen Zusatzstoffen verglichen, im Wesentlichen im Hinblick auf das Wachstum von PA136 unter nachfolgender Lyse. Der Phage wird aus der lysierten Kultur von Saccharomonospora Stamm PA 136 gereinigt. Das neue Medium ermöglicht die Durchführung der Lyse innerhalb von 96 Stunden. Das TSB-Medium nimmt 144 Stunden in Anspruch und selbst dann noch ist die Lyse unvollständig. Die unvollständige Lyse führt zu einer geringen Phagenausbeute.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in den nachfolgenden Beispielen illustriert, schränkt den Umfang der vorliegenden Anmeldung jedoch nicht ein.

Beispiel 1:

Zehn Gramm Bodenproben wurden aus einer Tiefe von 15 Zoll unterhalb der Oberfläche eines aktiven Komposthaufens aus Northumberland, einer Grafschaft im Vereinigten Königreich, sowie aus Tokio (Japan) entnommen. Die Proben wurden zuerst 8 Tage lang bei Raumtemperatur luftgetrocknet, um trocknungsempfindliche Organismen abzutöten, dann 1 Stunde lang bei 110°C erwärmt und wieder auf Raumtemperatur abgekühlt. Ein Gramm der gesammelten und wie oben beschrieben vorbehandelten Probe wurde in sterilem Wasser suspendiert und verwirbelt. 1 ml dieser Suspension wurde dann auf Platten mit einem Medium ausgebracht, das das Na-Salz der Huminsäure, 10 g, CaCO3, 0,02 g, Fe(II)-Sulfat, 0,01 g, KCl, 1,7 g, MgSO4, 0,05 g, (Na)2HPO4, 0,5 g, in destilliertem Wasser bei pH 7,2 enthielt, und mit Cycloheximid, 50 &mgr;g/ml und Nystatin, 50 &mgr;g/ml, Nalidixinsäure, 20 &mgr;g/ml, Penicillin G 0,8 &mgr;g/ml und Polymyxin B 4 &mgr;g/ml supplementiert. Die 21 verwendeten Platten wurden dann bei einer Temperatur zwischen 25°C und 55°C (drei Platten jeweils bei einer Temperaturdifferenz von 5°C), während einer Zeitdauer im Bereich von 2-5 Wochen inkubiert. Jede Kolonie der jeweiligen Platte wurde dann auf ein Medium überimpft, das Fleischextrakt, 12 g, Tryptose, 2 g, Hefeextrakt, 2 g, Proteosepepton, 2 g, Dextrose, 10 g, Calciumnitrat oder Calciumchlorid, 10 mM, Magnesiumchlorid oder Magnesiumsulfat, 10 mN, Fe(II)-Ammoniumcitrat, 5 mg, Cobaltchlorid oder Cobaltnitrat, 5 mg und lösliche Stärke, 10 mg in 1000 ml destilliertem Wasser enthielt, wobei der pH des Mediums bei 7,2 gehalten wurde. Die Kulturplatten wurden dann bei 30°C inkubiert, wonach die grüne Pigmente produzierenden Kolonien auf dem obigen Medium gereinigt wurden. Alle grüne Pigmente produzierenden Kolonien wurden dann auf das obige Medium, das Gegenstand einer parallelen Anmeldung ist, in einer Petrischale oder auf Schrägagar unter Verwendung von McCartney's-Flaschen überimpft. Eine Probe jedes Isolats wurde dann in Glycerin konserviert, wobei man das Medium bei einer Temperatur von unter –20°C einsetzte. C. Die auf diese Weise erhaltenen, grünes Pigment produzierenden Kolonien wurden nach üblichen Verfahren wie nach morphologischen Eigenschaften, Verwertung von Substraten wie C- und N-Quelle, Produktion extrazellulärer Enzyme und chemische Zusammensetzung der Gesamtzelle (chemotaxonomisch) identifiziert. Die Anwesenheit einer einzigen, lateral angeordneten weißgefärbten Spore, von Mesodiaminopimelinsäure, Arabinose und Galactose als Gesamtzucker, jedoch ohne Mykolsäure, und mit dem Hauptanteil an C16-Iso- und -Anisofettsäuren bewies, dass es sich bei dem Stamm um einen Vertreter der Gruppe der Actinomycetes handelt, wobei der Stamm als einer Art der Gattung Saccharomonospora zugehörig bezeichnet wurde.

Beispiel 2

Der Phage PIS 136 wurde wie folgt isoliert:

Der Stamm Saccharomonospora PA136, wie er oben erhalten wurde, wurde in dem obigen Medium an 5 aufeinander folgenden Tagen gezüchtet, bei 30°C inkubiert und danach bei 200 Upm geschüttelt. Nach den 5 Tagen wurde die Kultur bei 39°C 4 Stunden lang inkubiert. Diese Inkubation ermöglichte die Lyse der Kultur. Das auf diese Weise erhaltene Lysat wurde mit Chloroform (Endkonzentration 3 %) behandelt. Das Chloroform tötet die restlichen nichtlysierten lebenden Bakterien ab und unterstützt die Lyse halblysierter Zellen. Dem auf diese Weise erhaltenen Lysat wurde Natriumchlorid bis zur Endkonzentration von 0,05 mol zugesetzt, wonach durch langsames Schütteln gelöst und in Eis während 1 Stunde inkubiert wurde. Das Gemisch wurde dann bei 8000 g 30 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, wonach der Überstand gesammelt wurde. Dem auf diese Weise erhaltenen Überstand wurde Polyethylenglycol 8000 bis zu einer Endkonzentration von 10 % zugesetzt, wonach bis zur Vervollständigung bei sehr geringer Geschwindigkeit, um jede Schädigung der Phagenpartikel zu vermeiden, gelöst wurde. Diese Suspension wurde dann 17 bis 18 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Das auf diese Weise erhaltene Präzipitat wurde bei 10.000 g während 25 Minuten bei 4°C pelletiert, in einen Phagenpuffer suspendiert und 24 Stunden bei 4°C stehen gelassen. Nach erneutem Rühren der Suspension wurde eine gleiche Menge Chloroform zugesetzt, sorgfältig, jedoch langsam gerührt, um das Polyethylenglycol und die Pigmente auszufällen, wonach bei 4°C 8 Stunden lang inkubiert wurde. Die auf diese Weise erhaltene Suspension wurde dann erneut bei 14.000 Upm bei 4°C 15 Minuten lang zentrifugiert, wonach die obere wässrige Phase in einem frischen Zentrifugenröhrchen gesammelt wurde und das Verfahren anschließend wiederholt wurde. Die auf diese Weise erhaltene wässrige Phase wurde in einem Glyceringradienten, der 3 ml 40%-iges Glycerin und 4 ml 5 %-iges Glycerin (die Verdünnungen erfolgten im Phagenpuffer) enthielt und mit 3 ml Phagensuspension gereinigt. Die Pelletierung erfolgte bei 35.000 Upm 4,5 Stunden lang bei 4°C in einem Standard-SW41-Rotor. Die auf diese Weise erhaltenen Pellets enthielten den Phagen, der dann erneut im Phagenpuffer suspendiert wurde. Die wie oben beschrieben erhaltenen Glycerinpellets wurden unter Verwendung eines Gradienten aus Cäsiumchloridlösungen, die im Phagenpuffer erhalten wurden, gereinigt. Der Stufengradient wurde in einem Zentrifugenröhrchen aus drei 2 ml-Lösungen mit einer Dichte von jeweils 1,360, 1,490 und 1,600 g cm–3 hergestellt. Die vorgängig als wässrige Phase erhaltene Phagensuspension wurde oben auf die Gradientenlösung aufgegeben. Der Gradient wurde bei 30.000 U/min 4,5 Stunden lang bei 16°C zentrifugiert. Der Phase wurde dann zwischen 1600 und 1490 einer Bandenanalyse unterworfen, dann durch Durchstechen der Seite des Röhrchens entfernt und im Phagenpuffer verdünnt. Die Phagensuspension wurde dann gegen den Phagenpuffer, der 25 mM Tris.HCl, 10 mM Magnesiumsulfat und 10 mM Calciumnitrat oder -chlorid enthielt, bei einem pH von 7,5 und einer Temperatur von 4°C während 24 Stunden dialysiert und dann für weitere Untersuchungen verwendet. Die Transmissionselektronenmikroskopie bestätigte die Anwesenheit eines Bakteriophagen mit einem hexagonalen Kopf und einem langen kontraktilen Schwanz im Lysat sowie in den Pellets, die durch Glycerin-Gradientenreinigung oder durch Cäsiumchlorid-Gradientenreinigung erhalten wurde.

Beispiel 3

Zur Untersuchung des Wirtsbereichs wurden die Sporen produzierenden Bakterienteststämme (s. Tabelle 1) in einem Medium gezüchtet, das folgende Komponenten enthielt:

Hefeextrakt, 2 g, Malzextrakt, 10 g, Glucose, 4 g, Calciumcarbonat, 2,0 g, Agar, 1,2 % und 1000 ml doppelt destilliertes Wasser, bei pH 7,2. Die Platten wurden dann bei 25-30°C bis zur Sporenbildung inkubiert. Die Sporen wurden im Phagenpuffer gesammelt, und zwar durch Kratzen auf der sporenbildenden Oberfläche, und dann durch Verwirbeln gemischt, wonach die Suspension durch sterile nichtabsorbierende Baumwolle filtriert wurde. Es wurde festgestellt, dass 0,2 ml einer leicht trüben Lösung einen konfluenten Rasen erzeugten. In einem anderen sterilen Röhrchen wurden 0,2 ml der Sporensuspension durch Zugabe von 750 &mgr;l Phagenpuffer und 50 &mgr;l 1 × 109 pbE/ml Phagensuspension (pbE = plaquebildende Einheit) weiter verdünnt. Nach leichtem, jedoch sorgfältigem Rühren, wurde die gesamte Suspension 1 Stunde lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach einstündiger Inkubation wurden 2 ml des in der parallelen Anmeldung beschriebenen, 0,3 % Agar enthaltenden Mediums sowie 10 mM Calciumnitrat und Magnesiumchlorid zugesetzt, leicht gerührt und dann auf vorgetrocknetes Medium aufgegeben. Die Mediumtemperatur lag unter 95°C und die Suspension wurde gleichmäßig auf der Platte verteilt. Die Platte wurde dann eine Stunde lang stehen gelassen und dann bei 25-30°C inkubiert. Die Anwesenheit klarer oder trüber Flecken bzw. Plaques war ein Indiz für die Anwesenheit des Phagen, was bestätigte, dass der Bakterienteststamm gegen die Phageninfektion enpfindlich ist. Man kann auch die Sporen vor ihrer Infektion mit dem Phagen keimen lassen.

Beispiel 4

Zur Erzeugung von Lysogenen wurden 10-20 &mgr;l der in Beispiel 2 erhaltenen Phagensuspension bzw. des Phagenlysates auf den Rasen des zu testenden Stammes durch Betupfen auf getüpfelt. Nach vollständiger Trocknung der Suspension wurde der aufgetüpfelte Bereich markiert, wonach man die Sporenbildung abwartete (sofern der Teststamm Sporen bildete) bzw. während 5-6 Tagen inkubiert. Die Sporen- bzw. Myzelsuspension wurde dann im Phagenpuffer verdünnt, um zu einzelnen Kolonien zu gelangen. Diese wurden dann entweder auf dem Rasen des empfindlichen Stammes bzw. Teststammes replika-plattiert oder einzeln auf eine vorbeimpfte Platte aufgetüpfelt. Danach ließ man die Platten wachsen und jede eine Lysezone bildende Kolonie war dann Gegenstand für weitere Tests als Lysogen. Einige Lysogene erwiesen sich auch als auxotroph und entbehrten des Vermögens zur Synthese von Zuckern oder Aminosäuren, wie z.B. von Lactose, Galactose, Glucose, Arginin, Methionin, Tyrosin, Leucin usw. Die beobachtete Auxotrophie beruhte auf einer Mutation der Stoffwechselwege für Zucker und Aminosäuren, die durch den Phagen PIS136 verursacht war. Mutationen in mehr als einem Weg bestätigen, dass der Phage PIS136 in das Wirtsgenom an willkürlichen Abschnitten aufgenommen wurde. Das Vermögen zur Mutation und Random-Transposition zeigten deutlich Streptomyces coelicolor, Streptomyces albis und Mycobacterium fortuitum.

Beispiel 5:

Die DNA des Phagen PIS136 wurde nach einer Standardmethode zur Phagen-DNA-Reinigung gereinigt, jedoch unter Abänderung zur Anpassung an den Phagen PIS136. Die ca. 1 × 109 Phagenpartikel pro ml enthaltende Phagensuspension wurde mit einer EDTA (Ethylendiamino-tetra-essigsäure)-Lösung gemischt, um eine Endkonzentration von 50 mM zu erzielen. Diese Suspension wurde dann mit einer Endkonzentration von ProteinaseK von 100 &mgr;g/ml, &bgr;-Mercaptoethanol, 14 mM, und 0,5 % SDS gemischt und bei 37°C während 2 Stunden inkubiert. Nach der Zugabe von Triton X100 bis zu einer Endkonzentration von 1 % wurde die Lösung 30 Minuten bei 53°C inkubiert. Diesem Gemisch wurde SSC (NaCl, 3 M, und TriNatriumCitrat, 0,3 M) bis zu einer Endkonzentration von 1X zugesetzt, wonach das Gemisch 30 Minuten bei 65°C inkubiert wurde. Nach langsamer Abkühlung auf Raumtemperatur wurde NaCl bis zu einer Endkonzentration von 0,25 M zugesetzt. Nach sorgfältigem Rühren wurde ein gleiches Volumen TE-gesättigtes Phenol (Tris HCl pH 8,0, 10 mM, und EDTA pH 8,0, 1 mM) zugesetzt. Nach sorgfältigem Rühren der Lösung wurde bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert, wonach die obere wässrige Schicht gesammelt wurde. Die Grenzschicht wurde noch einmal mit TE extrahiert, wonach der Prozess der Phenolbehandlung wiederholt wurde. Die wässrige Schicht wurde mit zwei Chloroformbehandlungen weiter gereinigt, wonach dann die Phagen-DNA mit dem zweifachen Volumen an kaltem abs. Ethanol ausgefällt wurde. Nach zwei Wäschen in 70 %-igem Ethanol bei Raumtemperatur wurde das erhaltene Pellet getrocknet und im TE-Puffer gelöst. Die auf diese Weise erhaltene Phagen-DNA wurde für weitere Untersuchungen verwendet, bei denen die DNA mit insgesamt 45 unterschiedlichen Restriktionsenzymen, Methylase-empfindliche eingeschlossen, gespalten wurden. Die einzelnen von den Restriktionsenzymen MspI, HPaII, Sau3Al, Mbol, erzeugten DNA-Bandenmuster zeigen, dass die PIS136-DNA methyliert ist.

Beispiel 6:

Zum Nachweis der Aufnahme des Phagen PIS136 in die Chromosomen der vermuteten, in Beispiel 4 erzeugten Lysogene und der Gesamt-DNA aus dem Stamm Saccharomonospora und anderer Lysogene wurde nach der Standardmethode von Hopwood et al. (Hopwood, D.A., Bibb, M.J., Chater, K.F., Kieser, T., Bruton, C.J., Kieser, H.M., Lydiate, D.J., Smith, C.P., Ward, J.M. und H. Schrempf, 1985, Genetic manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual. Publ. The John Innes Foundation, Norwich, Vereinigtes Königreich) gearbeitet. In allen Fällen wurde die DNA von jenen Restriktionsenzymen gespalten, die innerhalb des Phagengenoms schneiden. Die DNA-Banden wurden auf einem Agarosegel getrennt und auf eine Nylonmembran mit bekannten Methoden transferiert. Danach wurde die Southern-Hybridisierung nach einer veröffentlichten Standardmethode durchgeführt. Als Probe wurde die Gesamt-DNA des Phagen PIS 136 oder eines der Fragmente von PIS 136 verwendet. Das Vorliegen der Hybridisierungsbande der PIS136-DNA zeigt, dass der Phage PIS136 in die Genome der vermuteten Lysogene anderer Wirtsstämme sowie in Saccharomonospora PA136 aufgenommen wurde.

Beispiel 7

Das Inversionsvermögen der DNA des Phagen PIS136 wurde durch Isolieren der Phagen-DNA getrennt von den Lysaten der gelben und grünen Varianten von Saccharomonospora PA136 geprüft. Diese beiden DNA-Präparate wurden dann der Restriktionsspaltung durch ClaI, NcoI und PvuII unterworfen, wonach die erhaltenen DNA-Fragmente auf einem Agarosegel getrennt wurden. Danach wurden sie auf eine Nylonmembran nach der Standardmethode transferiert. Anschließend erfolgte die Southern-Hybridisierung unter Verwendung der Gesamtphagen-DNA als Probe. Ein ClaI-Fragment des weiß gefärbten Phagen von ca. 3,8 kb war durch zwei Fragmente von von ca. 2 kb und 1,8 kb in den von der weiß gefärbten Variante erzeugten Phagen repräsentiert. Dieses Ergebnis zeigt, dass nach Inversion in eine andere Richtung das 3,8 kb-ClaI-Fragment einen zusätzlichen Locus für das Enzym ClAI erworben hat. Da die ClaI-Fragmente der beiden Typen des Phagenpräparats zu 100 % homolog sind, sind die von den Varianten des Stammes Saccharomonospora PA136 produzierten Phagen, welche gelbes und grünes Pigment erzeugen, identisch.

Beispiel 8

Unter Verwendung des Bakteriophagen bzw. Phagen wurden Mutanten bei antibiotischen Stoffwechselwegen, wie z.B. bei Rifamycin und Actinorhodin erzeugt. 10 &mgr;l des Phagenpräparats (4,5 × 108 plaquebildende Einheiten pro ml) wurden auf den Rasen von Streptomyces coelicolor (für Actinorhodin) und Amycolatopsis mediterranei (für Rifamycin) auf getüpfelt und bei 30°C während fünf Tagen inkubiert. Isolierte Kolonien, die auf dem aufgetüpfelten Bereich gediehen, wurden in einer Platte aus frischem Medium gereinigt und 3-5 Tage wachsen gelassen. Aus den isolierten Kolonien wurde im Phagenpuffer eine Sporen- oder Myzelsuspension hergestellt und danach auf frische Platten ausgebracht, welche das erfindungsgemäße Nährmedium enthielten, um einzelne Kolonien zu erzielen. Willkürlich ausgewählte Kolonien wurden dann auf Lysogenie, Mutation in den Stoffwechselwegen durch Southern-Hybridisierung und auf die Erzeugung von Stoffwechselprodukten geprüft. Es wurden mehrere Lysogene erhalten, die Mutationen in antibiotischen Stoffwechselwegen zeigten. Mehrere andere erhaltene Mutanten erwiesen sich hinsichtlich der Aminosäurebiosynthese als defektiv.

Beispiel 9

Zur Bestätigung, dass das genetische Material des Phagen-PIS mit einem Protein überzogen ist, wurde ein mit Glycerin gereinigtes Phagenpräparat mit einem ein Protein aufbringenden Puffer bei folgender Endkonzentration der einzelnen Komponenten gemischt: Tris-Puffer, pH 6,8-15,6 mM, Glycerin, 2,5 %, Na-Dodesylsulfat, 0,5 %, und Bromphenolblau, 0,0125 %. Die Proben wurden dann 15 Minuten lang in einem Bad aus kochendem Wasser erhitzt, dann schockartig in Eiswasser 10 Minuten lang abgeschreckt und bei 13.000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert. Die Proben wurden dann auf 14 %-iges Polyacrylamidgel aufgebracht, wonach die Proteine in einem Laufpuffer aufgetrennt wurden, der folgende Komponenten enthielt: Tris-Base, 3 g/l, Glycin, 14,4 g/l und Na-Dodesylsulfat, 0,1 %. Der pH des Gellaufpuffers lag bei 8,3. Das Gel wurde in einer wässrigen Lösung angefärbt, die auf 100 ml folgende Komponenten enthielt: Methanol, 50 ml, Essigsäure, 10 ml, Coomassie Brilliant Blau R250, 0,25 g, und Wasser, 40 ml. Die Anfärbung erfolgte während 2 Stunden bei 42°C. Das Gel wurde dann unter mehrmaliger Abänderung der Lösung entfärbt, die auf 100 ml folgende Komponenten enthielt: Methanol, 10 ml, Essigsäure, 5 ml und Wasser 85 ml. Die Gesamtproteinbeschichtung des Phagen wird durch 9 Banden mit annäherndem Molekulargewicht von 60, 57, 42, 36, 30, 29, 22, 20 und 14 Kilodalton dargestellt, wobei das Protein mit 60 bzw. 57 Kilodalton das Hauptprotein der Phagenbeschichtung darstellt und in sehr hoher Konzentration vorliegt.

Beispiel 10:

Die Molekulargröße des genetischen Material des Phagen, das eine doppelsträngige DNA darstellt, wurde unter Verwendung von vier Restriktionsenzymen berechnet: NotI, NheI, SnaBI und ScaI. Die DNA-Fragmente, die durch Spaltung des genetischen Materials des Phagen PIS 136 mit den vier Restriktionsenzymen bei unterschiedlicher Permitation und Kombination erhalten wurden, wurden entweder auf einem normalen Agarosegel oder durch Pulse Field-Gelelectrophorese unter Einstellung der Laufbedingungen auf 1,5 V/cm2 des Gels während 15 Stunden bei 14°C und dann bei 2 V/cn2 während 3 Stunden unter einem Winkel von 120° und bei einer Umschaltzeit von 5 bis 60 Sekunden bei linear ansteigender Variablen aufgetrennt. Das Gel wurde dann in Ethidiumbromid angefärbt, wonach das Molekulargewicht mit Standardmolekulargewichtsmarkern berechnet wurde. Die Molekulargröße der PIS 136-DNA betrug ca. 90 kb. Das Guanidin:Cytosin-Verhältnis des PIS 136-Genoms wurde mit Standardmethoden gemessen, die aus dem Stand der Technik bekannt und belegt sind. Es betrug 69-71 Mol-%. Der Bakteriophage PIS 136 ist resistent gegenüber mehreren Restriktionsenzymen, bei denen man meinen möchte, dass das hohe Guanidin:Cytosin-Verhältnis einen sensiblen Locus gewährleisten würde.

Beispiel 11

Der Phage PIS 136 wurde aus den Lysogenen von Amycolatopsis mediterranei nach Induktion mit UV-Licht isoliert und gereinigt, um festzustellen, dass bestimmte andere Actinomycetes-Stämme auch als Wirt für das Studium der Phagenbiologie in Frage kommen. Die Reinigung des Phagen erfolgte wie in Beispiel 2. Lysogene von Amycolatopsis mediterranei wurden wie in Beispiel 4 erzeugt. Die Ergebnisse zeigen, dass Amycolatopsis mediterranei als alternativer Wirt für die Vermehrung und genetische Studien am Phagen in Frage kommt. Diese Studien umfassen das Wachstum des Bakteriophagen im Wirt, den Rezeptor für den Phagen, der den Eintritt des Phagen in den Wirt ermöglicht, die Faktoren, welche es dem Phagen ermöglichen, sich im Wirt festzusetzen usw. Die Abänderung dieser Faktoren kann die Erweiterung des Wirtsbereichs des Phagen unterstützen, wodurch seine Verwendbarkeit als Vektorsystem oder genetisches Werkzeug erhöht wird. Da der Stamm Amycolatopsis mediterranei das wichtige Antibiotikum Rifamycin und seine Analoga produziert, kann man ausgehend vom Stand der Technik den Stoffwechselweg der Antibiotika und auch die Wirkung der Blockierung der Funktion eines bestimmten Gens für den Stoffwechselweg bei der Produktion eines Antibiotikums studieren. Ferner kann man den Phagen PIS 136 verwenden, um viele andere antibiotische Stoffwechselwege zu blockieren, die gewöhnlich parallel zu einem in der Literatur beschriebenen Stoffwechselweg ablaufen, und ein Durchschnittsfachmann auf dem vorliegenden Gebiet kann diese Versuche durchführen. Der Stand der Technik kann auf beliebige andere Organismen übertragen werden, für die man den Phagen PIS 136 oder seine Derivate, die man nach einem gut dokumentierten Standardverfahren erzeugen kann, als Wirt verwenden kann. Alle oben beschriebenen Methoden kommen für die Antibiotikaproduktion in Frage. In vielen Fällen können auf diese Weise mehrere neue Metabolite erhalten werden.

Beispiel 12

In diesem Beispiel werden die Eigenschaften von Amycolatopsis mediterranei-Lysogenen für die Antibiotikaproduktion untersucht und mit einem Antibiotikum verglichen, das vom Nicht-Lysogen erzeugt wurde. Das Beispiel zeigt, dass der Phage PIS 136 tatsächlich die Antibiotikaproduktion modifiziert. Nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Methode wurden mehrere Lysogene des Stammes Amycolatopsis mediterranei erzeugt. Die Lysogene wuchsen in einem bekannten Medium folgender Zusammensetzung (in g/l): Sojabohnenmehl (entfettet), 5,0; Calciumcarbonat, 9,0, pH 7,2; (nach Autoklavierung) filtersterilisiertes Na-Barbiturat, 1,5: Dextrose, 50,0: Kaliumdihydrogenphosphat, 3,0; Ammoniumsulfat, 7,0; Magnesiumsulfat, 1,0; Kupfersulfat, 3,3 mg; Fe(II)-Sulfat, 10,0 mg; Mangansulfat, 4,0 mg; Zinksulfat, 50,0 mg. 500 ml-Kolben mit 50 ml Medium wurden mit einer 2 Tage alten Kultur beimpft und bei 30°C und 200 Upm inkubiert. Für jedes Lysogen wurden 5 Kolben beimpft. Die Kolben wurden innerhalb eines 2 Tage-Invervalls entfernt bzw. dann, wenn sich das Medium von fast farblos in einzelne Gelb- bzw. Rot-Schattierungen verfärbte. Die Zellen und weitere Komponenten des Mediums wurden durch Zentrifugieren bei 4°C entfernt. Der pH des Überstandes wurde auf 2,2 bzw. ca. 2,0 mit Hilfe von 6 M Schwefelsäure eingestellt. Die Bouillon wurde dann mit 0,2 Volumina Ethylacetat extrahiert. Die Extraktion wurde viermal wiederholt. Sämtlich Ethylacetatextrakte wurden miteinander gemischt und auf das Endvolumen von 1,5 ml bei 30°C eingeengt. Die Fermentationsprodukte wurden auf fluoriszierenden, mit Kieselerde beschichteten Dünnschichtchromatographie-Platten aufgetrennt. Die Emerck-Zahl betrug 1,05554, wobei folgende Lösungsmittelsysteme verwendet wurden: Chloroform 6: Methanol 6: Wasser 1 und Chloroform 6: Methanol 6: Wasser 1: Ammoniak 1. Die Platten wurden dann unter kurz- und langwelligem UV-Licht sichtbar gemacht. Einige der von den Lysogenen produzierten Metabolite unterschieden sich von den von der nicht-lysogenen Kontrolle produzierten. Diese Metabolite zeigten entweder andere Fluoreszenzeigenschaften oder, falls die Fluoreszenz dieselbe war wie bei der Kontrolle, zeigten sich sehr deutliche Unterschiede in ihrer relativen Mobilität, wenn man sie dünnschichtchromatographisch untersuchte, wie dies 1 zeigt.

Beispiel 13:

Die Fermentation einiger Lysogene wurde wiederholt, um zu zeigen, dass der Phage PIS 136 die Antibiotikumproduktion durch Abänderung des Locus für die Aufnahme in den Wirt beeinflussen kann. Das Verfahren zur Extraktion der Fermentationsprodukte und ihre Analyse entsprechen Beispiel 12. Zwei von den von den Lysogenen produzierten Metaboliten unterschieden sich von der früheren Charge. Die Analyse der DNA der Lysogene zeigt deutlich, dass der Phage PIS 136 seine Position im Verlaufe der Fermentation verändert hat und diese Positionsänderung des Phagen innerhalb des Wirtsgenoms eine tiefgreifende Wirkung auf den antibiotischen Biosyntheseweg zu haben scheint. Die Wirkung auf die Biosynthese ist deutlich sichtbar, da die produzierten Metabolite sich von der früheren Charge unterscheiden. Die Positionsänderung des Phagen lässt sich durch die transposogene Natur des Phagengenoms erklären. Möglicherweise ist der Phage während der Replikation zur Positionsänderung und Verschiebung zu einem neuen Locus befähigt, wodurch unterschiedliche Gruppen von Genen beeinflusst werden. Dieser Eigenschaft des Phagen kann sich jeder Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bedienen, um Mutationen zu erzeugen, die von Nutzen sind bei der Verbesserung der Antibiotikabiosynthese, bei der Produktion von hybriden Antibiotika und von neuen Metaboliten. Die Mutationen, die für die Untersuchung der allgemeinen Biologie und Physiologie jedes Organismus, für den der Phage PIS 136 oder seine Derivate in Frage kommt, geeignet sind, werden konstruiert unter Anwendung dere zugänglichen Techniken wie Polymerasekettenreaktion oder Klonung des ganzen Phagen in einen neuen Vektor oder in bereits zugängliche Vektoren oder eines Fragments des Phagengenoms in einen Vektor oder die nackte DNA an sich und können als Wirt verwendet werden.

Beispiel 14

Lysogene von Streptomyces coelicolor wurden auf unterschiedlich mutierte Phänotypen geprüft. Der Stamm Streptomyces coelicolor produziert das blau pigmentierte Antibiotikum Actinorhodin und ein weiteres rot pigmentiertes Antibiotikum. Die Farbproduktion ist somit ein direktes Indiz für die Antibiotikaproduktion. Außerdem produziert der Stamm Sporen von grauer Farbe. Jede Mutation, entweder auf dem antibiotischen Stoffwechselweg oder auf dem Stoffwechselweg der Sporenbildung bedeutet eine Änderung in der Färbung des Pigments oder des nichtsporenbildenden Myzels oder in den weißen Sporen. Außerdem kann der Stamm Streptomyces coelicolor auf einem 34 %-ige Saccharose enthaltenden Medium wachsen. Die Lysogene von Streptomyces coelicolor wurden wie in Beispiel 4 beschrieben erhalten. Nach Bestätigung der Aufnahme des Phagen PIS 136 in das Wirtschromosom nach einem beliebigen bekannten Verfahren bzw. gemäß Beispiel 2 wurden die Mutanteneigenschaften der Lysogene entsprechend dem Stand der Technik geprüft. Eine Gruppe von Mutanten produzierte überhaupt kein Pigment und die Sporen waren weiß. Eine andere Mutantengruppe, die weit schneller als das als Kontrolle dienende Nicht-Lysogen wuchs, entbehrte ebenfalls eines Pigments. Eine weitere bildete überhaupt kein Pigment, aber eine überaus große Zahl von grauen Sporen. Eine Mutantengruppe produzierte weder Pigment noch Sporen. Eine weitere Mutantengruppe produzierte kein Pigment, jedoch Sporen, die nur in geringer Zahl vorhanden und von weißer Farbe waren. Eine weitere Gruppe von Lysogenen gedieh nicht in 34 %-iger Saccharose enthaltendem Medium, was für eine Mutation in der Zellwand oder im Saccharosestoffwechselweg sprach. Das Sporenbildungsvermögen änderte sich auch in aus dem Stand der Technik bekannten spezifischen Sporenbildungsmedium nicht. Das Einsetzen der Sporenbildung ist für die Antibiotikaproduktion von äußerst großer Bedeutung. Bei Verwendung des Phagen PIS 136 kann man daher in jedem Wirt, den der Phage PIS 136 infiziert, Mutanten erzeugen. Dies ermöglicht die Untersuchung der Regulation des antibiotischen Biosyntheseweges oder eines beliebigen anderen Stoffwechselweges, der sonst schwer zu untersuchen wäre.

Beispiel 15

Der Einfluss des Phagen PIS 136 auf die Untersuchung pathogener Organismen kann auf verschiedene Weise erfolgen. Im vorliegenden Beispiel wurden nach der in Beispiel 4 beschriebenen Methode Lysogene von Mycobacterium fortuitium erzeugt. Die Lysogenie wurde nach üblichen Verfahren und nach der in Beispiel 6 beschriebenen Methode bestätigt. Die Mutanteneigenschaften wurden entsprechend den Methoden, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, geprüft. Einige der Lysogene hatten die Eigenschaft zur Segmentierung verloren und waren myzelial geworden. Da die Sptierung mehrere biochemische Veränderungen in der Zelle umfasst, sind myzeliale Mykobakterien vermutlich nicht pathogen. Ferner sind diese Mutanten auch für die Aufdeckung der biochemischen Stoffwechselwege geeignet, die die Hauptrolle bei der Septierung spielen, sowie für die Feststellung des Signals, das die Zelle zur Septierung veranlasst. Man kann somit den Mechanismus der Pathogenität dieser pathogenen Organismen studieren, welche der Phage PIS 136 infiziert. Auch ist es möglich, Mutanten zu finden, welche die Pathogenität verloren haben, jedoch lange genug überleben, um eine Immunreaktion auszulösen. Derartige Stämme können als Impfstoffe verwendet werden, was aus dem Stand der Technik gut bekannt ist. Der Phage PIS 136 kann in die Zelle aufgenommen werden, welche er infiziert, und kann daher als Werkzeug zur Identifizierung der Mutante verwendet werden sowie zur Identifizierung des Gens, in dem es zur Mutation gekommen ist. Die Verwendung des Transposons als Signaturmarkierung zur Identifizierung von Mutanten ist aus dem Stand der Technik gut bekannt. Bisher wurde jedoch noch nie ein Bakteriophage als Signaturzielsystem verwendet, um das pathogene Wachstum in einem Wirt zu untersuchen.

Herstellung des Mediums Beispiel 16:

Die nachfolgend genannten Medienkomponenten und Chemikalien von Analysequalität wurden bei Raumtemperatur miteinander gemischt: Fleischextrakt, 10 g, Hefeextrakt, 2 g, Proteosepepton, 2 g, Tryptose, 2 g, Dextrose, 10 g, lösliche Stärke, 1 g, Cobaltchlorid, 5 mg, Fe(III)-Ammoniumcitrat, 5 mg, doppelt destilliertes Wasser, 1000 ml, Agar, 11 g, pH 7,0. Das Medium wurde unter einem Dampfdruck von 20 psi 20 Minuten lang sterilisiert. Dieses Medium unterstützte das Wachstum von Actinomadura sp., Amycolatopsis sp., Arthrobacter sp., Brevibacterium sp., Corynebacterium sp., Rhodococcus sp., einer großen Zahl von Streptomyces sp., Saccharomonospora sp., Saccharopolyspora sp., Miocrobispora sp., Microtetraspora sp., Micromonospora sp., Nocardia sp., Nocardiodes sp. und Streptosporangium sp., Streptococcus sp., Staphylococcus sp., Bacillus sp., Escherichia sp., Pseudomonas sp. und von mehreren Gruppen von Pilzen. Mykobakterien gediehen nicht sehr gut in diesem Medium. Nach Wachstum während zwei Wochen zeigten einige Arten von Streptomyces, Microbispora und Microtetraspora nur geringe Sporenbildung, die meisten der oben aufgeführten Stämme bildeten jedoch überhaupt keine Sporen und zeigten nach 3-tägiger Inkubation ein gutes myzeliales Wachstum, was zeigt, dass das Medium für alle Actinomycetes und andere Gruppen von Bakterien und Pilzen sehr geeignet ist. Die Art von Saccharomonospora gedieh in diesem Medium bei Temperaturen von bis zu 55°C gut.

Beispiel 17

Die Zusammensetzung des Mediums war Folgende: Fleischextrakt, 12 g, Hefeextrakt, 2 g, Proteosepepton, 2 g, Tryptose, 2 g, Dextrose, 10 g, Cobaltchlorid, 5 mg, Fe(III)-ammoniumcitrat, 5 mg, doppelt destilliertes Wasser auf 1000 ml, Agar, 11 g, pH 7,0. Das Medium wurde unter einem Dampfdruck von 20 psi 20 Minuten lang sterilisiert. Die langsam wachsenden Arten von Actinomadura, Streptosporangium, Microbispora und Microtetraspora gediehen nur schwach verglichen mit einer Mediumzusammensetzung, die mit 10 g/1000 ml Fleischextrakt und Stärke, wie oben beschrieben, ergänzt wurde.

Beispiel 18

Die Zusammensetzung des Mediums war Folgende Fleischextrakt, 12 g, Hefeextrakt, 2 g, Proteosepepton, 2 g, Tryptose, 2 g, Dextrose, 10 g, Cobaltchlorid, 5 mg, Fe(III)-ammoniumcitrat, 5 mg, doppelt destilliertes Wasser auf 1000 ml, Agar, 11 g, pH 7,0. Das Medium wurde unter einem Dampfdruck von 20 psi 20 Minuten lang sterilisiert. Unter Beibehaltung der restlichen Medienkomponenten, wie oben beschrieben, wurde Dextrose durch 1 % V/V Glycerin als Endkonzentration ersetzt und es wurden 1,0 g Citronensäure zugesetzt. Der Ersatz und die Zugabe erleichterten das Wachstum eines großen Bereichs rasch wachsender Mykobakterien und zumindest eines langsam wachsenden Mycobacteriums, und zwar von M. bovis BCG Bacillus Calmette Guerin).

Vorteile der vorliegenden Erfindung und des Mediums:

Der entsprechend den Beispielen erhaltene Bakteriophage hat folgende Vorteile:

  • 1. Der Bakteriophage bzw. seine DNA kann im Gegensatz zu fast allen von anderen Autoren beschriebenen Bakteriophagen eine ganze Reihe von Mikroorganismen infizieren.
  • 2. Der erfindungsgemäße Bakteriophage bzw. seine DNA können spezifisch für Infektion von Gattungen der Actinomycetes verwendet werden.
  • 3. Der Bakteriophage kann zur Erzeugung von Randommutationen bei einem weiten Bereich von Mikroorganismen verwendet werden, und zwar selbst bei Mikroorganismen, bei denen die klassischen Methoden nicht greifen.
  • 4. Der erfindungsgemäß beschriebene Bakteriophage kann zur Erzeugung von Mutationen in spezifischen Stoffwechselwegen zur Gewinnung neuer Verbindungen verwendet werden.
  • 5. Der Bakteriophage kann auch zur Mobilisierung von aus einem Organismus in einen anderen und auch zur spezifischen Platzierung in einer großen Zahl von Organismen, einschließlich Pflanzen, verwendet werden.
  • 6. Der Bakteriophage kann auch zur vorübergehenden Blockierung eines Stoffwechselweges verwendet werden. Dies ermöglicht die Akkumulierung des intermediären Stoffwechselproduktes im System, das dann von einem anderen funktionellen Stoffwechselweg verwertet wird. Dieser Prozess führt zur Akkumulierung neuer Stoffwechselprodukte.
  • 7. Der Phage oder seine DNA kann auch zur Erzeugung von Mutationen in pathogenen Organismen wie Mykobakaterien zur Produktion von Impfstämmen verwendet werden.
  • 8. Das Medium unterstützt das Wachstum mehrerer Gruppen von Pilzen einschließlich der anspruchsvollen Basidiomyceten. Das Medium verkürzt die Wachstumsdauer und da es die Sporenbildung nicht unterstützt, ist es geeignet, wann immer eine große Myzelkultur erforderlich ist.
  • 9. Die erfindungsgemäße Mediumzusammensetzung ist eine synergistische Zusammensetzung, was ein schnelleres Wachstum einer großen Zahl von Organismen begünstigt, Sporenbildung verhindert und einer relativ hohen Wachstumstemperatur standhält, ohne dass das Wachstumsmuster beeinträchtigt würde. Nach gewissen Modifizierungen, wie sie in den Beispielen 18 und 19 erläutert werden, können auch anspruchsvolle Organismen wie Mykobakterien auf diese Weise leicht gezüchtet werden.


Anspruch[de]
Aus Saccharomonospora isolierter Bakteriophage mit ca. 90 Kilobasen-Paaren eines langen, doppelsträngige DNA aufweisenden Genoms mit einem Guanidin- und Cytosingehalt von 69-71 mol-%, wobei Saccharomonospora unter der Zugangsnummer DSM 12317 hinterlegt ist. Bakteriophage nach Anspruch 1, der Gattungen der Actinomycetes in der Hauptsache mit hohem Guanidin- und Cytosingehalt in ihrem Genom infiziert. Bakteriophage nach Anspruch 1, der Bacillus subtilis und ähnliche Stämme infiziert. Zelle, welche die DNA des Bakteriophagen nach Anspruch 1 umfasst. Zelle nach Anspruch 4, wobei diese eine Zelle von Saccharomonospora ist. Klonungsvektor, der das DNA-Molekül nach Anspruch 1 umfasst. Klonungsvektor nach Anspruch 6, wobei dieser ein Plasmid umfasst. Zellen, die den Klonungsvektor nach Anspruch 6 umfassen, wobei die Zellen unter Escherichia coli, Streptomyces amycolata, Mycobacteria und Bacillus ausgewählt sind. Verfahren zur Isolierung eines Bakteriophagen nach Anspruch 1 als Werkzeug für die Untersuchung biologischer, biochemischer, physiologischer und genetischer Eigenschaften von Actinomycetes und anderen Organismen, das die Inkubation des bei DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH unter der Zugangsnummer DSM 12317 (Indische Zugangsnummer MTCC A0001) hinterlegten Stammes von Saccharomonospora in einem Nährmedium bis zur Erreichung des Autolysestadiums, die Isolierung und Reinigung eines Bakteriophagen aus diesem Medium umfasst, der in der lysierten Kultur mit üblichen Methoden erzeugt wird. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das für die Inkubation des Stammes verwendete Nährmedium ausgewählt wird unter (a) Tryptisches Sojaagar, (b) Hefeextrakt, (c) Malzextraktmedium und (d) einem Medium, das Makro- und Mikronährstoffe und Spurenelemente in den unten angegebenen Mengen enthält:

A. Makronährstoffe in Form assimilierbarer C-Quellen wie

i. Lab-lamco oder Fleischextrakt, 8-12 g

ii. Stärke, 1-2 g

iii. Dextrose, 10-12 g und

auch in Form assimilierbarer N-Quellen wie

i. Proteosepepton, 1-3 g

ii. Tryptose, 1-3 g;

B. Mikronährstoffe, ausgewählt unter Hefeextrakt, 1-3 g, und

C. Spurenelemente, ausgewählt unter

i. Cobaltchlorid oder -nitrat, 5-10 mg

ii. Fe(III)-Ammoniumcitrat, 5-10 mg

iii. Magnesiumsulfat oder -chlorid, 0-10 mM

iv. Calciumchlorid oder – nitrat, 0-10 mM,

auf 1000 ml doppelt destilliertes Wasser.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die Inkubation während 3-6 Tagen durchgeführt wird. Verfahren nach Anspruch 9, das außerdem noch das Aufbrechen der Proteinhülle des isolierten Bakteriophagen mit bekannten Methoden unter nachfolgender Gewinnung des Polynucleotids durch übliche Ausfällungstechniken umfasst. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem das Aufbrechen der Proteinhülle durch Behandlung des Bakteriophagen mit proteolytischen Enzymen wie Proteinase K oder Pronase und einem ionischen oder nichtionischen Detergens, ausgewählt unter Na-Dodecylsulfat und Octoxynol, &agr;-[4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl]-&ohgr;-hydroxypoly(oxy-1,2-ethandiyl) und Octylphenoxypolyethaoxyethanol (Triton X-100), supplementiert mit &bgr;-Mercaptoethanol, erfolgt. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Ausfällung des Polynucleotids in Anwesenheit von 0,25 M NaCl und einer Lösung von 0,15 M NaCl und 0,015 M Trinatriumcitrat bei 4°C in Anwesenheit von Ethanol durchgeführt wird. Verwendung eines Bakteriophagen nach Anspruch 1 oder eines Klonungsvektors nach Anspruch 6 zur Erzeugung neuer Antibiotika durch Veränderung der antibiotischen Synthesewege. Verwendung eines Bakteriophagen nach Anspruch 1 oder eines Klonungsvektors nach Anspruch 6 für die Erzeugung von Impfstoffstämmen beliebiger pathogener Organismen, die gegenüber dem Bakteriophagen nach Anspruch 1 empfindlich sind. Verwendung nach Anspruch 16, bei dem der Organismus ein Mycobacterium ist. Verwendung nach Anspruch 16, bei dem der verwendete Bakteriophage ein Transposon ist. Verwendung nach Anspruch 15, bei dem die Synthesewege ausgewählt werden unter dem Rifamycin-Biosyntheseweg, dem Actinorhodin-Biosyntheseweg und anderen Biosynthesewegen in Organismen, die der Phage nach Anspruch 1 infizieren kann.






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