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Dokumentenidentifikation DE69931053T2 23.11.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001105466
Titel VERFAHREN ZUR REINIGUNG VON MENSCHLICHEN, DEM PAPILLOMAVIRUS ÄHNLICHEN PARTIKELN.
Anmelder Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., US
Erfinder COOK, C., James, Rahway, NJ 07065, US
Vertreter Abitz & Partner, 81679 München
DE-Aktenzeichen 69931053
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 10.08.1999
EP-Aktenzeichen 999409501
WO-Anmeldetag 10.08.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/US99/17930
WO-Veröffentlichungsnummer 2000009671
WO-Veröffentlichungsdatum 24.02.2000
EP-Offenlegungsdatum 13.06.2001
EP date of grant 26.04.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 23.11.2006
IPC-Hauptklasse C12N 7/02(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61K 39/12(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Papillomavirus (HPV) ähnlichen Teilchen (VLPs), welche als Vakzin-Komponente verwendet werden können.

Hintergrund der Erfindung

Papillomavirus-Infektionen treten bei einer Vielzahl von Lebewesen, einschließlich von Menschen, Schafen, Hunden, Katzen, Kaninchen, Affen, Schlangen und Rindern, auf. Papillomaviren infizieren Epithelzellen, wobei sie im allgemeinen gutartige epitheliale oder fibroepitheliale Tumore an der Infektionsstelle induzieren. Papillomaviren sind spezies-spezifische infektiöse Agenzien; ein Human-Papillomavirus kann kein nicht-menschliches Lebewesen infizieren.

Papillomaviren können auf Grundlage des Wirts, den sie infizieren, in verschiedene Gruppen eingeteilt werden. Human-Papillomaviren (HPV) werden weiterhin auf der Grundlage von DNA-Sequenzhomologie in mehr als 70 Typen eingeteilt (hinsichtlich eines Überblicks siehe Papillomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (Hrsg.), CRC Press, Inc., 1990). Papillomavirus-Typen scheinen insofern typspezifische Immunogene darzustellen als eine neutralisierende Immunität gegen Infektion durch einen Typ von Papillomavirus keine Immunität gegen einen anderen Typ von Papillomavirus verleiht.

Papillomaviren sind kleine (50-60 nm), nicht von einer Hülle umgebene, ikosaedrische DNA-Viren, welche für bis zu acht frühe und zwei späte Gene codieren. Die offenen Leserahmen (ORF) der Virusgenome werden als E1 bis E7 und L1 und L2 bezeichnet, wobei "E" früh bedeutet und "L" spät bedeutet. L1 und L2 codieren für Virus-Kapsidproteine. Die frühen (E) Gene sind mit Funktionen wie viraler Replikation und zellulärer Transformation assoziiert.

Das L1-Protein ist das Haupt-Kapsidprotein und besitzt ein Molekulargewicht von 55-60 kD. Das L2-Protein ist ein weniger häufiges Kapsidprotein, welches ein vorausgesagtes Molekulargewicht von 55-60 kD und ein scheinbares Molekulargewicht von 75-100 kD, wie mittels Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt, aufweist. Immunologische Daten legen nahe, daß sich der größte Teil des L2-Proteins innerhalb des L1-Proteins befindet. Die L2-Proteine sind bei verschiedenen Papillomaviren hochkonserviert, insbesondere die 10 basischen Aminosäuren am C-Terminus. Der L1-ORF ist bei verschiedenen Papillomaviren hochkonserviert.

Rekombinantes L1-Protein wurde in einer Vielfalt von Wirten hergestellt und unter geeigneten Bedingungen assembliert es von selbst zu virusähnlichen Teilchen (VLPs), entweder alleine oder in Kombination mit L2. VLPs sind Kandidaten für ein kommerzielles Vakzin. Um jedoch in einem Human-Vakzin von Nutzen zu sein, müssen die VLPs hoch gereinigt und frei von Wirtszellkontaminationen sein. In der Vergangenheit wurde Querstrom-Ultrafiltration in einem Diafiltrationsmodus zur Entfernung kontaminierender Biomoleküle verwendet. Dieses Verfahren führte jedoch zum proteolytischen Abbau des HPV-L1. Es wäre wünschenswert, ein L1-Protein-Reinigungsverfahren zur Verfügung zu haben, welches zu einem hochreinen, nicht-abgebauten Produkt führt.

WO-A-9531532 offenbart die Herstellung und Reinigung von VLPs, die L1- und L2-Proteine enthalten, erwähnt jedoch nicht die Verwendung von Hydroxylapatit.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von rekombinanten, Papillomavirus (HPV) ähnlichen Teilchen (VLPs), umfassend die Schritte: Kontaktieren eines teilweise gereinigten, VLP-enthaltenden Zell-Lysats mit einem Hydroxylapatit-Medium in einer Chromatographie-Säule in 1,25 M NaCl unter solchen Bedingungen, dass die VLPs an das Hydroxylapatit-Medium binden, und Eluieren der gebundenen VLPs mit einer Lösung, die Phosphat-Anionen umfasst, und Gewinnen der eluierten VLPs.

Das Reinigungsverfahren kann bei VLPs eingesetzt werden, welche im wesentlichen aus L1-Protein bestehen, und kann auch bei VLPs eingesetzt werden, welche L1- und L2-Proteine umfassen. Darüber hinaus kann es bei VLPs eingesetzt werden, welche chimär sind, d.h. L1-Protein und ein L2-Fusionsprotein enthalten. Im allgemeinen sind für Vakzinzwecke VLPs bevorzugt, die nur L1-Proteine enthalten.

Das Verfahren ist auf VLPs von praktisch jedem Stamm von Papillomavirus anwendbar. Es ist bevorzugt, dass ein Human-Papillomavirus (HPV) verwendet wird. Bevorzugte Stämme von HPV sind diejenigen, welche bekanntermaßen die schwerwiegendsten Erkrankungen und Krankheitszustände verursachen, einschließlich: HPV Typ 6a, HPV Typ 6b, HPV Typ 11, HPV Typ 16, HPV Typ 18, HPV Typ 31, HPV Typ 33 und HPV Typ 45.

Im allgemeinen wird eine Wirtszelle mit einem Vektor transformiert, der für L1- oder L1- und L2-Proteine oder L1-Protein und L2-Fusionsprotein codiert.

Wie in der Beschreibung und den Ansprüchen durchgehend verwendet, bedeutet der Begriff "L2-Fusionsprotein", dass die für das L2-Protein codierende DNA funktionsfähig mit einer weiteren DNA, codierend für ein weiteres Protein von HPV, wie z.B. E1, E2, E3, E4, E5, E6 oder E7, verknüpft wurde. Der L2-Anteil des Fusionsproteins kann die volle Länge haben oder Deletionen und/oder Verkürzungen aufweisen. Beispiele sind in der parallel eingereichten und ebenfalls anhängigen vorläufigen US-Patentanmeldung S.N. 60/096,638 (Vertreter-Aktenzeichen 20276PV) zu finden.

Die Wirtszelle kann jede Wirtszelle sein, die leicht kultiviert wird, wie im Stand der Technik bekannt, einschließlich Hefe (Saccharomyces cerevisiae), Insektenzellen, Bakterien- oder Säugerzellen. Hefezellen sind besonders bevorzugt.

Der Vektor kann auch andere Elemente enthalten, wie im Stand der Technik bekannt, z.B. Transkriptions- und Translations-Steuerungselemente und/oder Markergene. Die exprimierten L1-, L1- und L2-Proteine, oder L1-Proteine und L2-Fusionsproteine werden spontan zu VLPs assemblieren. Wirtszellen werden typischerweise lysiert und das Zell-Lysat wird dann teilweise gereinigt.

Der partielle Reinigungsschritt kann üblicherweise eingesetzte Reinigungsschritte umfassen und wird nicht als kritischer Schritt bei dieser Erfindung betrachtet. Beispielsweise kann das Zell-Lysat einem Mikrofiltrationsverfahren und mindestens einem Chromatographieschritt, wie z.B. Kationenaustauschchromatographie, unterworfen werden.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass ein Chromatographieschritt, bei dem Hydroxylapatit als Säulenmedium verwendet wird, gefolgt von Elution mit einer Pufferlösung, die ein Phosphat-Anion enthält, ein großes Maß an Verunreinigungen aus einem teilweise gereinigten Zell-Lysat entfernt. Speziell wurde festgestellt, dass die meisten verunreinigenden Biomoleküle, einschließlich DNA, Lipide und Proteine, aus dem Lysat entfernt werden.

Gemäß dieser Erfindung ist die endgereinigte VLP-Präparation im allgemeinen mindestens zu 75 % rein, bevorzugt mindestens zu 80 % rein und bevorzugter mindestens zu 90 % rein, wie gemessen mit dem SDS/PAGE-Assay.

Praktisch jedes im Handel erhältliche Hydroxylapatit-Säulenmaterial kann in dieser Erfindung verwendet werden. Es ist bevorzugt, einen keramischen Hydroxylapatit zu verwenden, mit einer Teilchengröße von etwa 20-50 &mgr;m und etwa 800 Å Porengröße. Ein solcher im Handel erhältlicher Hydroxylapatit wird von BioRad als "Keramischer Hydroxylapatit, Typ II" vertrieben. Andere sind jedoch ebenfalls wirksam.

Bei der Vorbereitung des Chromatographieschritts des Reinigungsverfahrens wird empfohlen, dass die Säulenbeschickung in einem Puffer mit einem pH-Wert von 6-8 und vorzugsweise etwa 7 vorliegt. Ein bevorzugter Puffer ist 50 mM MOPS [3-(N-Morpholino)propansulfonsäure] bei einem pH-Wert von 7,0, der auch 1,25 M NaCl enthält.

Andere Puffersysteme, welche ebenfalls eingesetzt werden können, sind für einen Durchschnittsfachmann ersichtlich und schließen ein: MES [2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure]; BIS-TRIS [Bis-(2-hydroxyethyl)amino]tris-(hydroxymethyl)methan]; ADA [N-2-Acetamidoiminodiessigsäure, Mononatriumsalz]; ACES (N-2-Acetamido-2-aminoethansulfonsäure]; PIPES [Piperazin-N,N'-bis(2-ethansulfonsäure)]; MOPSO [3-N-Morpholino)-2-hydroxypropansulfonsäure]; BIS-TRIS PROPAN [1,3-Bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]propan]; BES [N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure]; TES [N-Tris-(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure und 2-2([2-Hydroxy-1,1-bis(hydroxymethyl)ethyl)amino]ethansulfonsäure]; HEPES [N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure]; DIPSO [3-N,N-Bis(2-hydroxyethyl)amino)-2-hydroxypropansulfonsäure]; TAPSO [3-N-Tris(hydroxymethyl)methylamino]-2-hydroxypropansulfonsäure]; TRIS [Tris(hydroxymethyl)aminomethan]; HEPPSO [N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-[2-hydroxypropansulfonsäure)]; POPSO [(Piperazin-N,N'-bis[hydroxypropansulfonsäure)]; EPPS [N-[2-Hydroxyethyl]-piperazin-N'-[3-propansulfonsäure und HEPPS]; TEA [Triethanolamin]; TRICINE [N[Tris-(hydroxymethyl)methyl]glycin]; BICINE [N,N-Bis-(2-hydroxyethyl]glycin]; TAPS [3-{[Tris-(hydroxymethyl)methyl]amino}propansulfonsäure]; Imidazol; HEPPS [N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-3-propansulfonsäure]; Glycinamid, Salzsäure, Glycylglycin, Citrat, Acetat und Succinatpuffer.

Die teilweise gereinigten VLPs in der gepufferten Lösung lässt man mit dem Hydroxylapatit-Medium unter Bedingungen in Kontakt kommen, welche den VLPs die Bindung an das Hydroxylapatit erlauben. Diese Bedingungen umfassen einen breiten Temperaturbereich, Raumtemperatur ist bevorzugt. Die Durchflussrate kann ebenfalls stark variieren und ein bevorzugter Bereich ist etwa 90 cm/h.

Nachdem die VLPs an das Hydroxylapatit gebunden sind, ist der nächste Schritt die Gewinnung der gereinigten VLPs von dem Hydroxylapatit mit einem Elutionspuffer. Eine bevorzugte Elutionspuffer-Lösung enthält ein Phosphat-Anion, wie z.B. eine Natrium- oder Kaliumphosphatlösung. Bevorzugte molare Bereiche sind von etwa 0,05 M bis etwa 1 M, wobei etwa 0,2 M bevorzugt sind. Der pH-Wert des Elutionspuffers sollte im Bereich von etwa pH 6-8 liegen, wobei ein pH von etwa 7 bevorzugt ist.

Weitere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen:

  • (a) kein Erfordernis für spezielle Chromatographieausrüstung und -techniken;
  • (b) das Verfahren ist schnell, erfordert keine Pufferaustausche und
  • (c) das Verfahren ergibt eine ausgezeichnete Ausbeute an HPV-L1.

Die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele sind zur besseren Erläuterung der Erfindung angegeben.

BEISPIELE BEISPIEL 1 Herstellung von teilweise gereinigtem Lysat

Hefezellen, die zur Expression von VLPs transformiert worden waren, wurden geerntet und zur Lagerung bei –70° C eingefroren. Die gefrorene Hefezellsuspension wurde aus der Lagerung entnommen und etwa 3 h lang bei Raumtemperatur, gefolgt von etwa 18 h bei 4° C, aufgetaut. BENZONASE® (Nycomed Pharma A/S, Kopenhagen, Dänemark) (2,8 × 105 Einheiten/ml und 0,21 mg Protein/ml) wurde der Zellsuspension bis zu einer Endkonzentration von 750 Einheiten pro Gramm Nasszellgewicht zugegeben und in einem Experiment auf 335 Einheiten pro Gramm Nasszellgewicht verringert. Die Zellen wurden 15 Minuten lang gerührt, dann mittels zwei Passagen durch einen sterilisierten APV Gaulin 30CD-Homogenisator bei einem Kammerdruck von 14.500 bis 16.000 psi aufgebrochen, was zu einem 95 %igen Zellaufbruch führte. Das verbleibende Lysat wurde 18 h lang bei 4° C sanft gerührt.

Klärung durch Mikrofiltration.

Das Zell-Lysat wurde durch Querstrom-Mikrofiltration in einem Diafiltrationsmodus wie folgt geklärt. Das Lysat wurde in einen sterilen Verfahrenstank einem Einlass- und Auslassöffnungen von 1 Zoll Durchmesser eingebracht. Der Mikrofilter war eine Hohlfaser-Filterkartusche von 0,65 Mikron Porengröße und einer Oberfläche von 5 Quadratfuß (A/G Technologies #CFP-6-D-8A, Needham, MA), untergebracht in einem A/G Technologies FlexStand® Benchtop Pilot Hohlfasersystem. Das Retentat wurde mit 3 Volumina Diafiltrationspuffer (unten) diafiltriert, um das geklärte Lysat zu ergeben. Der Diafiltrationspuffer war 0,2 M (Na+) MOPS, pH 7,0 + 0,4 M NaCl.

Chromatographie von geklärtem Lysat.

Das geklärte Lysat wurde mittels Säulenchromatographie unter Verwendung des starken Kationenaustausch-Chromatographieharzes POROS® 50HS (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA), in eine Chromatographiesäule gepackt, fraktioniert. Die Säule wurde mit 0,5 N NaOH vor der Verwendung sterilisiert. Die Säule wurde mit HPV-Diafiltrationspuffer [0,2 M (Na+) MOPS, pH 7,0 + 0,4 M NaCl] bei Raumtemperatur äquilibriert. Das kalte (4° C) geklärte Lysat wurde mit 125 ml/Minute auf die Säule gepumpt und die Säule wurde mit 8 Säulenvolumina von HPV-Säulenpuffer A [0,05 M (Na+) MOPS, pH 7,0 + 0,5 NaCl)] mit Raumtemperatur mit 125 ml/Minute mit einem linearen Gradienten von 100 % HPV-Säulenpuffer A bis 100 % HPV-Säulenpuffer B [0,05 M (Na+) MOPS, pH 7,0 + 1,5 M NaCl] gewaschen. Der gesamte Säulengradient betrug 10 Säulenvolumina und wurde in 10 gleichvolumigen Fraktionen gesammelt. Nach dem Gradienten wurde die Säule mit zwei Säulenvolumina von HPV-Säulenpuffer B mit Raumtemperatur mit 125 ml/Minute gewaschen, welche in zwei zusätzlichen Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen wurden in sterilen 2-Liter-Plastikflaschen gesammelt und bei 4° C gelagert. Fraktionen, welche den letzten UV-Absorptionspeak (A280nm und A230nm) in dem Gradienten enthielten, wurden vereinigt und unter Verwendung einer MILLIPAK-200-Einmalfiltereinheit (Millipore, Bedford, MA) filtriert und bei 4° C gelagert.

BEISPIEL 2 Hydroxylapatit-Chromatographie

Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Eine Chromatographiesäule (13 mm ID × 36 mm), gepackt mit keramischem Hydroxylapatit, Typ II (BioRad Katalog-Nr. 7320081, Hercules, CA), wurde in 50 mM MOPS, pH 7,0 + 1,25 M NaCl voräquilibriert. Die teilweise gereinigte HPV-Lösung aus Beispiel 1 wurde mit einer linearen Flussrate von 90 cm/h auf die Säule aufgebracht. Nachdem die Probenauftragung vollständig war, wurde die Säule mit 8 Säulenvolumina Voräquilibrierungspuffer gewaschen, bis die optische Dichte des Säulenausflusses nahezu Null war. Das HPV-Vakzin-Produkt wurde mit einem linearen Gradienten von 0 % bis 100 % Elutionspuffer (0,2 M Natriumphosphat, pH 7,0 + 1,25 M NaCl) ebenfalls bei einer linearen Flussrate von 90 cm/h eluiert. Das Gesamtvolumen des Gradienten betrug vier Säulenvolumina. Fraktionen, welche das Vakzin-Produkt enthielten, wurden mittels RIA und Bradford-Protein-Assay identifiziert. Die Proteinkonzentration des Produkts betrug 100 &mgr;g/ml.

Assays:

Bradford-Protein-Assays wurden unter Verwendung von Coomassie Plus Assay Reagent (Pierce, Rockford, IL) unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) als Standard durchgeführt. Lowry-Protein-Assays wurden nach dem Verfahren von Lowry et al., 1951, J. Biol. Chem. 193: 265-270, unter Verwendung von BSA als Eichstandard durchgeführt. Antigen wurde mittels eines mehrschichtigen ELISA-Assays unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der ein Konformationsepitop auf dem VLP erkannte, nachgewiesen. Mikrotiterplatten wurden mit polyklonalen Anti-HPV-VLP-Ziegenantikörpern beschichtet. Standard und Testproben wurden mit PBS, enthaltend 1 % Gew./Vol. BSA, 0,1 % TWEEN-20 und 0,1 % Natriumazid, verdünnt und den Mulden zugegeben, wo Antigen durch die plattengebundenen Antikörper eingefangen wurde. Monoklonaler Anti-HPV L1-VLP-Antikörper (Chemicon, Temecula, CA) wurde den Mulden zugegeben, um das von den plattengebundenen Antikörpern eingefangene Antigen zu binden. Die monoklonalen Anti-HPV-VLP-Antikörper wurden mit Hilfe von an Meerrettichperoxidase konjugierten Anti-Maus-IgG-Antikörpern nachgewiesen. Ein chromogenes Substrat für Meerrettichperoxidase, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (Pierce), wurde zugegeben und die Extinktion bei 450 nm war proportional zu der Konzentration von L1-VLP in der Probe.

Die dynamische Kapazität der Säule für das Vakzin-Produkt betrug 2,9 mg pro ml Harz gemäß Bradford und 4,6 mg pro ml Harz gemäß RIA. Die Ausbeute bei diesem Schritt war 90 % gemäß Bradford-Protein-Assay oder 82 % gemäß RIA, wenn die Säule mit 100 % Kapazität beladen wurde. Die Ausbeute fiel auf 63 % gemäß Bradford und 50 % gemäß RIA, wenn die Säule mit 8 % Kapazität beladen wurde.

BEISPIEL 3 Entfernung anderer Biomoleküle

Eine HPV11-L1-Probe, im wesentlichen wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben präpariert, wurde hinsichtlich der Anwesenheit von DNA unter Verwendung eines PCR-basierten Assays untersucht. Die Ergebnisse, welche in der folgenden Tabelle präsentiert werden, zeigen an, dass dieses Chromatographieverfahren bei der Entfernung kontaminierender DNA aus dem Endprodukt hoch wirksam ist.

BEISPIEL 4 Reinigung eines chimären VLP Reinigung von chimären HPV Typ 16-L1/L2mini/E2-VLPs Konstruktion des modifizierten L2-Gens YP3-Vektor (Minimal-L2)

Dieser Vektor enthält die codierenden Sequenzen für die aminoterminalen 69 Aminosäuren und die carboxyterminalen 84 Aminosäuren (AS) von HPV16-L2, welche im Leserahmen mit einem synthetischen Polylinker fusioniert sind, der nur einmal vorkommende Not I-, Sac I- und Xho I-Restriktionsenzymstellen einführt und zur Insertion eines Glutaminsäurerests und der Mutation eines Serinrests zu Glutaminsäure führt.

PCR-Primer (Midland Certified Reagents) wurden konstruiert, um L2-Sequenzen aus dem nativen L2-Gen, das in dem Vektor pGal110 HPV16-L1+L2, enthalten ist, zu amplifizieren.

Die Primer I (5'-CTT CCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGC-3'; SEQ-ID-Nr. 1) und C (5'-CTC GAG CTC GCG GCC GCC TGT ACC CGA CCC-3'; SEQ-ID-Nr. 2) amplifizierten eine 265-bp-Sequenz, welche für die aminoterminalen 69 AS und 23 bp stromaufwärts untranslatierter Sequenz, einschließlich einer Sma I-Restriktionsenzymstelle, codierte. Der Primer C modifizierte und verlängerte die für den Aminoterminus von L2 codierende Region und fügte Not I-, Sac I- und Xho I-Restriktionsenzymstellen stromabwärts der L2-codierenden Sequenzen hinzu.

Die Primer A (5'-GCG GCC GCG AGC TCG AGG GTT ATA TTC CTG CAA ATA CAA-3'; SEQ-ID-Nr. 3), C und D (5'-CCC TCC AGA TCT CTA GGC AGC CAA AGA GAC ATC TG-3'; SEQ-ID-Nr. 4) amplifizierten eine 285-bp-Sequenz, codierend für die carboxyterminalen 84 As von L2 plus 6 bp, welche eine BgI II-Restriktionsenzymstelle hinzufügten. Der Primer A fügte auch eine 17-bp-Sequenz, enthaltend Not I-, Sac I- und Xho I-Stellen, stromaufwärts der L2-codierenden Sequenz hinzu.

Das minimale L2-Expressionskonstrukt wurde mittels der durch die Primer A und C hinzugefügten komplementären Sequenzen assembliert. Die isolierten DNA-Produkte der obigen I/C- und A/D-Amplifizierungsreaktionen wurden beide in einer PCR-Reaktion verwendet, welche I- und D-Oligos als Amplifizierungsprimer einschloss. Zur Erleichterung der Verknüpfung der Fragmente über ihre komplementäre 17-bp-Sequenz wurden drei PCR-Zyklen mit einer Verschmelzungstemperatur bei 37° C, gefolgt von 15 Zyklen bei 57° C, durchgeführt. Das resultierende Amplifizierungsprodukt wurde in pcrScript (Stratagene, LaJolla) "blunt-end" ligiert und in XL-1 Blue-MRF-Zellen (Stratagene, La Jolla) transformiert. Positive Klone wurden mittels PCR unter Verwendung der Primer I und D identifiziert und durch Restriktionsverdauungsanalyse bestätigt. Die Konstruktion wurde dann durch automatische Sequenzanalyse verifiziert (Perkin Elmer, Inc., Foster City, CA).

Plasmid-DNA aus einem geeigneten Isolat wurde dann mit Sma I und Bgl II verdaut; ein Fragment von etwa 0,5 Kilobasenpaaren (kb) wurde gelgereinigt und mit dem 14 kb langen Sma I- und Bgl II-pGAL110-HPV16-L1-Vektorfragment ligiert. Kompetente DH5-E. coli-Zellen (Gibco BRL, Rockville, MD) wurden mit der Ligierungsmischung transformiert und Transformanten auf LB-Ampicillinplatten selektioniert (Remel, Lenexa, KS). Die Klone wurden zunächst mittels PCR gescreent, wobei die Primer D und I zur Amplifizierung von Abschnitten von L2 eingesetzt wurden; geeignete Klone wurden dann mittels Restriktionsverdauungsanalyse bestätigt. Ein Kandidatenklon YP3#1 wurde mittels Sequenzanalyse wie oben verifiziert.

YP3#1 wurde dann als das Gerüstkonstrukt eingesetzt, in welches Gene, die für die offenen Leserahmen von HPV16-E1, -E2 oder -E7 codierten, inseriert wurden.

Insertion von HPV E-Protein-codierenden Genen

Das Gen, welches für HPV16-E2 codierte, wurde mittels PCR-Amplifizierung einer HPV16-positiven klinischen Probe erhalten, welches dann direkt in den Subklonierungsvektor pCRII (Stratagene, La Jolla, CA) inseriert und die Sequenz wie oben verifiziert wurde. Die E2-Gensequenz wurde dann in folgender Weise modifiziert:

  • 1) Xho I-, Nae I-, Not I-enthaltende DNA-Sequenzen im Leserahmen wurden dem aminoterminalen Abschnitt von E2 hinzugefügt. Zusätzlich wurden Not I-, Nae I- und Xho I-enthaltende Sequenzen dem carboxyterminalen Abschnitt von E2 hinzugefügt, um die Insertion innerhalb von E2 an den Not I-, Xho I-Stellen zu erleichtern.
  • 2) Die DNA-Sequenzen wurden mittels PCR-Mutagenese verändert, um für Alaninreste an den Resten Glutaminsäure 39 und Isoleucin 73 zu codieren. Dies wurde vorgesehen, um die E2-Proteinfunktion zu inaktivieren.

Das oben beschriebene modifizierte HPV16-E2-Gen wurde mit Not I, Xho I verdaut und mit gleichermaßen verdautem Vektor YP3#1 ligiert. Transformanten, welche die korrekt inserierten E2-Sequenzen enthielten, wurden mittels PCR selektioniert und die Sequenz wurde verifiziert.

Dieselbe Strategie wurde für die Gene verfolgt, welche für HPV16-E1 und HPV16-E7 codierten. Für E1 wurde Glycin 482 zu Asparaginsäure verändert; für E7 wurden Cystein 24 und Glutaminsäure 26 beide zu Glycin verändert, um die Proteinfunktion zu inaktivieren. Die resultierenden Konstrukte wurden dann eingesetzt, um Hefe zur Expressionsanalyse zu transformieren.

BEISPIEL 5 Identifizierung und Züchtung von Hefe welche chimäre VLPs exprimierte

Plasmid-DNA von YP3#1 und die oben beschriebenen Derivate wurden zur Transformation von Saccharomyces cerevisiae (MATa, leu2-04, prb1::HIS3, mnn9::URA3, cir°) nach dem Sphäroplasten-Verfahren (Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933) eingesetzt. Transformierte Sphäroplasten wurden auf selektivem (leucin-minus) Medium (Remel, Lenexa, KS) ausplattiert. Klone wurden mittels zweier Durchgänge von Einzelkolonieselektion isoliert. Kleine Flüssigkulturen von Kandidatenklonen wurden auf eine hohe Zelldichte im Medium gezüchtet, das Galactose enthielt. Rohextrakte wurden durch heftiges Schütteln mit Glasperlen, gefolgt von Zentrifugation, hergestellt. Die geklärten Extrakte wurden hinsichtlich Expression von L1, der L2-Komponente und VLPs mittels verschiedener Verfahren, einschließlich SDS-PAGE, ELISA, Immunoblots und EIA, unter Verwendung monoklonaler Antikörper oder monospezifischer polyklonaler Antiseren, welche L1 oder L2 oder die amino- oder carboxyterminalen Enden von L2 oder L1-VLPs oder E1 oder E2 oder E7 oder irgendein anderes Protein oder Peptid in Fusion mit dem modifizierten L2 erkennen, analysiert. Klone, welche die L2-Komponente exprimierten und VLPs bildeten, wurden für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Ein-Liter- oder 16-Liter-Kulturen ausgewählter Klone wurden in galactose-enthaltendem Medium für die großmaßstäbliche Präparation chimärer VLPs gezüchtet.

Zellpellets wurden bei –70° C eingefroren gelagert. Eingefrorene Zellen (Nassgewicht = 148 g) wurden aufgetaut und in 740 ml "Aufbruchpuffer" (200 mM MOPS, pH 7, 1 mM CaCl2) resuspendiert, um eine etwa 20 %ige (Gew./Vol.) Aufschlämmung zu ergeben. Die Nuklease BENZONASE® (Nycomed Pharma) wurde auf 750 Einheiten/g Nasszellgewicht zugegeben. Die Zellaufschlämmung wurde bei einem Druck von etwa 19.000 psi mit fünf Durchgängen in einem M110-Y Microfluidizer (Microfluidics Corp., Newton, MA) aufgebrochen. Die Zellaufschlämmung wurde gewonnen und während des Aufbruchs auf Eis gehalten. Ein Hämatocrit-Assay zeigte > 80 % Aufbruch an.

Das gealterte Zell-Lysat wurde mittels Mikrofiltration durch eine Hohlfaserkartusche (A/G Technologies) von 0,65 Mikron Porengröße unter Verwendung eines Tangentialstrom-Mikrofiltrationsgeräts, das im Diafiltrationsmodus betrieben wurde, geklärt. Das Lysat wurde mit drei Volumina 0,25 M Natriumcitrat, 0,2 M MOPS, pH 7,0, diafiltriert. Antigen passierte die Membran und wurde im Permeat gewonnen.

Die diafiltrierte 0,65-mm-Permeat-Fraktion (3,9 l) wurde auf eine 325-ml-Säule (11,2 cm ID × 3,3 cm) von POROS®50HS-Harz (Perseptive Biosystems, Cambridge, MA), äquilibriert in 200 mM MOPS, pH 7, 250 mM Natriumcitrat, aufgetragen. Die Säule wurde mit 8 Volumina von 50 mM MOPS, 0,5 M NaCl, 5 mM Natriumphosphat, pH 7, gewaschen und mit 10 Volumen eines linearen Gradienten von 0,5 bis 1,5 M NaCl im gleichen Puffer eluiert. Durchfluss- und Wasch-Fraktionen wurden in einem Volumen gesammelt, während 1-Volumen-Fraktionen während der Elution gesammelt wurden. Säulenfraktionen wurden mittels Westernblots und SDS-PAGE mit koloidalem Coomassie-Nachweis analysiert. Die Fraktionen, die überwiegend p55-Protein enthielten, wurden vereinigt.

Der 50HS-Pool wurde hinsichtlich Gesamtprotein mittels BCA-Assay (Pierce) analysiert. Bezogen auf das Gesamtprotein (168 mg) wurde eine Säule von keramischem Hydroxylapatit (HA) Typ II (Bio-Rad) gegossen, um 1 ml Harz/2 mg Protein zu ergeben. Diese Säule hatte 2,6 cm ID × 15,7 cm. Die Säule wurde in 50 mM MOPS, pH 7, 1,25 M NaCl, 5 mM Natriumphosphat äquilibriert. Der 50HS-Pool (770 ml) wurde bei 0,22 mm filtriert und auf die HA-Säule mit einer Flussgeschwindigkeit von 113 cm/h aufgetragen. Der Durchfluss wurde in einem Volumen gesammelt. Die HA-Säule wurde mit 5 Volumina Äquilibrierungspuffer gewaschen und mit 8 Volumen eines linearen Gradienten von 5 bis 200 mM Natriumphosphat, pH 7, in 1,25 M NaCl eluiert. Fraktionen, die während der Elution gesammelt worden waren, wurden mittels Westernblots und SDS-PAGE mit kolloidalem Coomassie-Nachweis analysiert. Fraktionen, die eine vergleichbare Reinheit und Anreicherung von L1-Protein zeigten, wurden vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden steril durch eine 0,22-mm-Membran filtriert und bei 4° C gelagert.

Verfahrensrückstände und Produkt wurden hinsichtlich HPV16-L1 unter Verwendung eines spezifischen EIA und hinsichtlich Protein mittels BCA-Assay analysiert. Die Ausbeute an gereinigtem Endprodukt war 27 mg Protein mit einer spezifischen Aktivität von 1,00 mg L1/mg Protein. Elektronenmikroskopie bestätigte die Anwesenheit intakter VLP-Teilchen mit einem mittleren Durchmesser von 32 nm. Für die SDS-PAGE-Reinheitsanalyse wurde ein Aliquot des Endprodukts mittels TCA-Fällung konzentriert und mittels Westernblots und SDS-PAGE mit Nachweis von kolloidalem Coomassie analysiert. Eine quantitative Bestimmung von L1 erfolgte unter Verwendung eines Auftrags von 2,5 mg und die Hefekontaminationen wurden bei 20,0 mg Auftrag quantitativ bestimmt. Das L1-Protein wurde mittels Densitometrie befunden, zu > 94 % homogen zu sein. Eine gemeinsame Reinigung von L1 und L2mini/E2 wurde durch spezifische Immunoblot-Analyse von Verfahrensfraktionen demonstriert.


Anspruch[de]
Verfahren zur Reinigung von rekombinanten, Papillomavirus ähnlichen Teilchen (VLPs), umfassend:

a) Kontaktieren eines teilweise gereinigten, VLP-enthaltenden Zell-Lysats mit einem Hydroxylapatit-Medium in einer Chromatographie-Säule in 1,25 M NaCl unter solchen Bedingungen, dass die VLPs an das Hydroxylapatit-Medium binden;

b) Eluieren der gebundenen VLPs mit einer Lösung, die Phosphat-Anionen umfasst; und

c) Gewinnen der eluierten VLPs.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die VLPs im Wesentlichen aus L1-Protein bestehen. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die VLPs VLPs des humanen Papillomavirus (HPV) sind. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die VLPs aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus: HPV Typ 6a, HPV Typ 6b, HPV Typ 11, HPV Typ 16, HPV Typ 18, HPV Typ 31, HPV Typ 33 und HPV Typ 45. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die eluierten VLPs zu mindestens 75 % rein sind. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die eluierten VLPs zu mindestens 90 % rein sind. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die VLPs L1-Protein und ein L2-Fusionsprotein umfassen, bei dem das L2-Protein funktionsfähig mit einem HPV-E1-, -E2-, -E3-, -E4-, -E5-, -E6- oder -E7-Protein verknüpft ist. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das L2-Fusionsprotein einen L2-Abschnitt aufweist, der geringer ist als die vollständige Länge. Verfahren zur Herstellung eines gereinigten VLP-Produkts von humanem Papillomavirus, das für die Verwendung in einem menschlichen Impfstoff geeignet ist, umfassend:

a) teilweises Reinigen eines Zell-Lysats, wobei das Zell-Lysat von Hefezellen stammt, die transformiert wurden, um HPV-L1-VLPs zu exprimieren;

b) Kontaktieren des teilweise gereinigten, VLP-enthaltenden Zell-Lysats mit einem Hydroxylapatit-Medium in einer Chromatographiesäule in 1,25 M NaCl, unter solchen Bedingungen, dass die VLPs an das Hydroxylapatit-Medium binden;

c) Eluieren der gebundenen VLPs mit einer Lösung, die Phosphat-Anionen umfasst; und

d) Gewinnen der eluierten VLPs.






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