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Dokumentenidentifikation DE60118397T2 07.12.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001305402
Titel KOMPLEX AUS DEN TEILEN DES HEPATITIS C VIRUS UND LIPOPROTEIN GERINGER DICHTE, VERFAHREN ZU SEINER HERSTELLUNG UND ANWENDUNGEN
Anmelder Bio Merieux, Marcy l'Etoile, FR;
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Paris, FR
Erfinder ANDRE, Patrice, F-69003 Lyon, FR;
LOTTEAU, Vincent, F-69390 Vourles, FR;
PARANHOS-BACCALA, Glaucia, F-69250 Lyon, FR;
KOMURIAN-PRADEL, Florence, F-69250 Poleymieux, FR
Vertreter BEETZ & PARTNER Patentanwälte, 80538 München
DE-Aktenzeichen 60118397
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, TR
Sprache des Dokument FR
EP-Anmeldetag 31.07.2001
EP-Aktenzeichen 019608538
WO-Anmeldetag 31.07.2001
PCT-Aktenzeichen PCT/FR01/02507
WO-Veröffentlichungsnummer 2002010353
WO-Veröffentlichungsdatum 07.02.2002
EP-Offenlegungsdatum 02.05.2003
EP date of grant 29.03.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 07.12.2006
IPC-Hauptklasse C12N 7/02(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse G01N 33/576(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 39/29(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12Q 1/68(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12Q 1/70(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61P 31/14(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 35/18(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Hepatitis C ist die Hauptursache für durch Transfusion erworbene Hepatitiserkrankungen. Hepatitis C kann auch auf anderen perkutanen Wegen übertragen werden, beispielsweise durch Drogeninjektion auf intravenösem Weg. Die Gefahr einer Kontamination der im Gesundheitswesen Tätigen ist allerdings vernachlässigbar gering.

Hepatitis C unterscheidet sich von den anderen Krankheitsformen der Leber, die mit Viren in Verbindung stehen, wie beispielsweise der Hepatitis A, B oder D. Die Infektionen durch das Hepatitis-C-Virus (HCV oder VHC) sind oft chronisch und haben sehr häufig als Folge Lebererkrankungen, wie beispielsweise Hepatitis, Zirrhose und Karzinom.

Obwohl die Gefahr einer Übertragung des Virus durch Transfusion auf Grund der Selektion der Blutspender zurückgegangen ist, bleibt die Häufigkeit von Hepatitis-C-Erkrankungen hoch. Derzeit sind weltweit ungefähr 170 Millionen Menschen chronisch mit HCV infiziert. Die Bevölkerungsgruppen mit hohem Risiko befinden sich hauptsächlich bei den Transfusionsempfängern und den Benutzern von intravenösen Drogen, aber es gibt asymptomatische Blutspender, die nicht diese Gruppen mit hohem Risiko angehören, und bei denen zirkulierende HCV-Antikörper gefunden wurden. Bei diesen Letztgenannten wurde der Weg der Infektion noch nicht identifiziert.

HCV war das erste hepatotrope Virus, das mit Hilfe der Techniken der Molekularbiologie isoliert wurde. Die Sequenzen des viralen Genoms wurden geklont, bevor das virale Partikel sichtbar gemacht wurde.

HCV ist ein Virus mit positiv einsträngiger RNA mit 9,5 kb, das sich durch eine komplementäre RNA-Kopie repliziert und dessen Produkt der Übersetzung ein Zwischenstoff eines einzigen Polyproteins mit ungefähr 3000 Aminosäuren ist. Das Ende 5' des HCV-Genoms entspricht einer nicht übersetzten Region, die an die Gene angrenzt, die für die Strukturproteine, das Core-Protein des Nukleokapsids und die beiden Hüllen-Glykoproteine, E1 und E2/NS1, codieren. Die nicht übersetzte Region 5' und das Core-Gen sind relativ gut in den verschiedenen Genotypen bewahrt, aber die Hüllenproteine E2 sind durch eine hypervariable Region, die von einem Isolat zu einem anderen Isolat unterschiedlich ist, codiert. Das Ende 3' des HCV-Genoms enthält die Gene, die für die Nichtstrukturproteine (NS) und für eine gut bewahrte nicht codierende Region 3' codieren.

Auf Grund seiner Genomorganisation und seiner vermutlichen Replikationsweise wurde HCV in eine neue Gattung der Familie der Flaviviridae, die Hepaciviren, eingeteilt.

Zahlreiche Techniken wurden entwickelt, um eine Infektion mit HCV zu diagnostizieren. Beispielsweise wurden immunologische Diagnosetests durchgeführt, um Antikörper zu erfassen, die gegen die HCV-Proteine in den Patientenseren gerichtet sind. Die Synthese von DNAc durch inverse Transkription der viralen RNA und Erweiterung durch PCR wurden ebenfalls eingesetzt, um das HCV-Genom zu erfassen, wie auch die indirekte Messung eines potentiell infektiösen Virus in den menschlichen Seren, die chronisch infiziert sind, oder in jenen von experimentell infizierten Schimpansen. Überdies wurden auf Basis des Klonens von Genen Hybridisierungstechniken mit einer DNA-Sonde entwickelt.

Es ist jedoch anerkannt, dass die bestehenden Diagnosetechniken zu wenig sensibel und/oder spezifisch und/Oder zu schwierig im Einsatz sind. Zum Beispiel ist es mit der Methode der Hybridisierung von Sonden nicht möglich, die Unterscheidung zwischen einem Virus mit geringer Infektionskraft und einem Virus mit hoher Infektionskraft zu machen. Es ist somit erforderlich, aber schwer durchführbar, das zu testende Virus einem Schimpansen zu injizieren und die hervorgerufene Infektion am Tier zu testen.

Es ist somit äußerst notwendig für die Volksgesundheit, spezifische, sensible und praktische Methoden zur Identifikation und Feststellung der Träger von HCV-Viren zu entwickeln. Eine der Lösungen könnte sein, ein sehr wirksames HCV-Kultursystem in vitro herzustellen, das es ermöglicht, eine Ausbreitung des Virus zu erhalten, insbesondere um seine Replikationsmechanismen zu studieren, neutralisierende Antikörper oder Antiviren zu testen, sowie um biologische Stoffe, Diagnosetests und Impfpräparate zu entwickeln. Obwohl nämlich die komplette HCV-Sequenz seit 1989 verfügbar ist (Q.L. Choo et al., Science 244, 359 (1989)), wurde das Verständnis des Lebenszyklus und der Replikationsweise von HCV auf Grund des Nichtvorhandenseins eines geeigneten Kultursystems in vitro verhindert. Ito et al. (J. Gen. Virol. 77; 1043–1054 (1996)) bewiesen die Beibehaltung der Replikation von HCV in Primärkulturen von menschlichen Hepatozyten, die von Patienten, die Träger des HCV-Virus waren, gewonnen wurden, bei denen die Krankheit chronisch vorhanden war, und nahmen einen Infektionsübergang an, aber Probleme im Zusammenhang mit der Ausbreitung des Virus bleiben bestehen (Unmöglichkeit einer langfristigen Kultur), und das entwickelte System ist durch die Notwendigkeit der Versorgung mit Humanleber und die Schwerfälligkeit der Technik begrenzt. Überdies besteht bis heute kein allgemeiner Konsens über den Tropismus von HCV, und es wurden noch nicht alle Zellrezeptoren für das Virus identifiziert.

Im Plasma von mit HCV infizierten Patienten werden Partikel gefunden, die die virale RNA enthalten und hinsichtlich der Dichte sehr heterogen sind. Diese Heterogenität der Dichte der Partikel, die die virale RNA enthalten, wird ihrer Verbindung mit Lipoproteinen in variablen Verhältnissen zugeschrieben (Thomsen et al., 1993, Med. Microbiol. Immunol. 182; 329–334). In der Beschreibung der vorliegenden Patentanmeldung nannten die Erfinder diese Hybridpartikel Lipoproteinvirale RNA-Partikel, abgekürzt LVPs (Lipo-Virus-Partikel). Die Verteilung jeder dieser Formen entlang eines Dichtegradienten variiert von einem Patienten zum anderen. Die vorhandenen Analysen der Partikel von geringer Dichte zeigen Dichten, die sich mit jenen der LDLs (Low Density Lipoproteins) und der VLDLs (Very Low Density Lipoproteins) decken. Die beschriebene Größe (50 nm) nähert sich den VLDLs an.

Die Natur der vorgenannten LVPs, die die virale RNA enthalten, ist bis heute nicht genau bekannt, aber die vorliegenden Erfinder zeigten zum ersten Mal auf, dass die LVPs mit Human-Immunglobulinen verbunden sind, und dass eben in diesen Fraktionen von LVPs mit gleicher oder geringerer Dichte als 1,063 g/ml, die mit Human-Immunglobulinen verbunden sind, mehrheitlich die RNA des HCV-Virus zu finden ist, im Gegensatz zu den bekannten Daten (Hijikata et al., J. Virol. (1993), 1953–1958). Hijikata et al. zeigten nämlich auf, dass keine Human-Immunglobuline in den Partikeln mit einer Dichte unter 1,06 g/ml vorhanden waren, und dass in diesen Partikeln mit dieser Dichte eine starke Infektionsneigung beim Schimpansen zu finden war. Diese experimentellen Daten könnten mindestens eine der Grundlagen zur Erklärung der Chronizität der Krankheit darstellen, die bis heute noch nicht vollkommen beleuchtet ist, und eröffnen zusätzlich Perspektiven für neue Kulturverfahren des HCV-Virus in vitro.

Auch betrifft die vorliegende Erfindung einen Komplex, bestehend aus LPVs in Kombination mit Human-Immunglobulinen, wobei der Komplex eine Dichte von weniger als 1,063 g/ml und vorzugsweise zwischen 1,0063 und 1,063 g/ml aufweist, wie durch Zentrifugation, beispielsweise an einem Natriumbromid-Gradienten, aufgezeigt.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des Komplexes aus LVPs in Kombination mit Human-Immunglobulinen (LVP/Ig), das darin besteht, eine Trennung pro Zentrifugationsgradient aus einer Entnahme von Plasma oder Serum eines Patienten durchzuführen, um eine Fraktion des Komplexes LVP/Ig mit einer Dichte unter 1,063 g/ml und vorzugsweise zwischen 1,0063 und 1,063 g/ml zu erhalten, dann eine Reinigung der Fraktion des Komplexes durch Protein A oder Anti-Human-Immunglobuline oder durch jedes andere Molekül durchzuführen, das die Human-Immunglobuline (an einen Träger, wie beispielsweise Kugeln oder Sepharose, gekoppelt) binden kann. Dieses Verfahren ermöglicht es, die Erstentnahme mit Komplex LVP/Ig „anzureichern", wobei die Lipoproteine beseitigt werden, die nicht dem Komplex LVP/Ig angehören.

Der erhaltene Komplex LVP/Ig, der vorzugsweise nach der Herstellungsart der Erfindung gereinigt wurde, ist für die Entwicklung eines Verfahrens zur Kultur eines HCV-Virus in vitro verwendbar. Eine große Zahl von Zellen besitzt nämlich auf ihrer Oberfläche einen Rezeptor des Fragments Fc der Immunglobuline, und es ist somit möglich, die virale RNA, die mit den Immunglobulinen verbunden ist, in diese permissiven Zellen über die Interaktion zwischen dem Fragment Fc der Immunglobuline und einem seiner Membranrezeptoren eindringen zu lassen und die Ausbreitung und Replikation des Virus HCV in vitro zu gewährleisten.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Kultur des HCV-Virus in vitro, bei dem in einem bestimmten Medium und unter geeigneten Bedingungen der Komplex LVP/Ig (der vorzugsweise nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigt wurde) und permissive Zellen, die an ihrer Oberfläche mindestens einen Rezeptortyp des Fragments Fc der Immunglobuline umfassen, oder permissive Zellen in Kontakt gebracht werden, die mindestens einen Rezeptor für ein Molekül mit der Fähigkeit, die Immunglobuline zu binden, ausdrücken, wobei die permissiven Zellen in der Lage sind, die Ausbreitung und Replikation des Virus HCV in vitro zu gewährleisten. Natürlich kann die Expression dieses oder dieser Rezeptoren entweder spontan oder insbesondere durch Transfektion induziert sein.

Unter den permissiven Zellen, die mindestens einen Rezeptortyp des Fragments Fc der Immunglobuline ausdrücken, können als nicht einschränkende Beispiele die mononukleären Zellen (Stammzellen, die dem Knochenmark entnommen wurden, Monoblasten, Promonozyten, Monozyten und Makrophagen, Zwischenzellen der Makrophagen, B-Lymphozyten, NK-Zellen, Hepatozyten, Dendritenzellen, Epithelialzellen, Zellen des Gefäßendothels, Mastozyten, Langerhanssche Zellen), die Synzytiotrophoblasten, die polynukleären Eosinophile, Basophile und Neutrophile, die Plättchen genannt werden.

Unter den permissiven Zellen, die mindestens einen Rezeptor für ein Molekül mit der Fähigkeit, Immunglobuline zu binden, ausdrücken, können die Erythrozyten und ihre Zwischenstoffe, die Makrophagen, die Monozyten, die polymorphonukleären Leukozyten (polynukleäre Eosinophile, Basophile und Neutrophile), die B-Lymphozyten und die Dendritenzellen genannt werden.

Die Makrophagen werden vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus Histiozyten, alveolaren Makrophagen, Makrophagen der Ratte und des Lymphgewebes, Kuppfer-Zellen, Osteoklasten, Synovialzellen des Typs A, Gewebsmakrophagen und den Zwischenzellen, von denen diese Zellen abgeleitet sind, besteht. Da das HCV-Virus hepatotrop ist, werden die Zellen von menschlichen oder tierischen Pirmärhepatozyten, die Zellen der Gruppe der Zelllinien des menschlichen oder tierischen Hepatokarzinoms und die Kuppfer-Zellen allgemein bevorzugt. Aber da gezeigt wurde, dass das HCV in der Lage ist, sich in den Lymphozyten auszubreiten und zu replizieren, sind die B-Lymphozyten auch bevorzugte permissive Zellen.

Wenn die permissiven Zellen Zellen von primären menschlichen oder tierischen Hepatozyten, Zellen der Gruppe der Zellreihen des menschlichen oder tierischen Hepatokarzinoms oder Kuppfer-Zellen sind, erfolgt die Infektion der Zellen mit dem HCV-Virus über die Interaktion zwischen dem Fragment Fc der Human-Immunglobuline und mindestens einem der Rezeptoren des Fragments Fc, das an der Oberfläche der permissiven Zellen vorhanden ist, aber auch über die Interaktion der LVPs, die Liganden für einen mit den Rezeptoren der Lipoproteine verbundenen Endozytoseweg sind, wie beispielsweise den LDL-Rezeptor und den LSR, die an der Oberfläche eben dieser permissiven Zellen vorhanden sind.

Der Begriff HCV-Virus bezieht sich auf jede virale Gattung, unter anderem die pathogenen Stämme für den Menschen, die gedämpften Stämme und die defektiven Stämme, die von diesen Stämmen abgeleitet sind. Es ist nämlich bekannt, dass die Viren mit RNA eine hohe Spontanmutationsrate aufweisen. Es können somit zahlreiche Stämme vorhanden sein, die mehr oder weniger virulent sein können. Es liegt im Bereich des Fachmanns, solche Stämme zu identifizieren, beispielsweise durch Homologie von Nukleinsequenzen und/oder Peptidsequenzen in Bezug auf einen Referenzstamm und/oder durch Identifikation eines Stammes oder eines Isolats in Bezug auf morphologische und/oder immunologische Kriterien.

Der Begriff Zellsystem „in vitro" bezieht sich auf Zellen, die in vitro repliziert wurden, und schließt somit die Primärkulturen, die Primärlinien und die von diesen Primärlinien abgeleiteten Linien ein. Da bekannt ist, dass induzierte oder spontane Änderungen in dem Karyotyp während der Lagerung oder dem Transfer auftreten können, können die von einer Referenzzelllinie abgeleiteten Zellen nicht genau mit den ursprünglichen Zellen oder Kulturen identisch sein, und die Erfindung schließt solche Varianten ein.

Der Begriff Zelllinie bezieht sich auf die hergestellten, immortalisierten und spontanen Linien. In der Praxis ist es für die Durchführung einer viralen Kultur von Interesse erforderlich, dass sich das Virus in vitro in einer Kultur ausbreiten kann, in der die Zellen in der Lage sind, sich ständig zu vervielfachen und so die Virenausbreitung zu ermöglichen. Die Zelllinie ist somit vorzugsweise eine hergestellte oder von einer Immortalisierung durch verschiedene Verfahren stammende Zelllinie. Dies kann durch die Herstellung einer stabilen, hergestellten, kontinuierlichen Linie durch Co-Kultivierung von permissiven Zellen mit tumorisierten permissiven Zellen derselben Natur erfolgen (i), die in der Lage sind, sich unbegrenzt zu vervielfachen und die Ausbreitung des Virus in der Kultur zu gewährleisten, wobei die Vireninjektion in der Kultur stattfindet, wobei mit dem Virus infizierte Primärzellen verwendet werden (ii), die dann mit tumorisierten permissiven Zellen co-kultiviert werden, die die Ausbreitung des Virus in der Kultur der so hergestellten Zelllinie sicherstellen, oder auch durch virale Infektion (iii) einer Zelllinie, beispielsweise einer immortalisierten Linie von B-Lymphozyten, beispielsweise mit dem Epstein-Barr-Virus.

Das geeignete Medium für die HCV-Kultur ist das Medium RPMI oder ein von dem Medium RPMI abgeleitetes Medium. Vorzugsweise wird das Medium RPMI 1640 ergänzt durch:

Penizillin 1

Streptomyzin 1

Glutamin 2 mM

SVF (Serum des Kalbsfötus) dekomplementiert 10 %.

Eventuell umfasst das vorgenannte Medium für die Kultur gewisser permissiver Zellen zusätzlich Beta-Mercaptoethanol 50 &mgr;M.

Es werden mehrere Durchgänge der so infizierten permissiven Zellen durchgeführt und das Vorhandensein des Virus in den infizierten permissiven Zellen und in der aufschwimmenden Schicht der Kultur wird durch RT-PCR und/oder durch eine immunologische Technik aufgezeigt, wie beispielsweise durch indirekte Immunfluoreszenz mit Hilfe von spezifischen Antikörpern des Virus und/oder durch Flusszytometrie.

Das erfindungsgemäße Verfahren, das es ermöglicht, eine Ausbreitung des Virus HCV zu erzielen, ist insbesondere nützlich, um seinen Replikationsmechanismus zu studieren, um neutralisierende Antikörper und Antiviren zu testen, um biologische Stoffe für die Diagnose und die Therapie zu entwickeln. Überdies ermöglicht es das erfindungsgemäße Verfahren, eine infizierte Zelllinie zu erhalten, die nützlich ist, um mindestens ein antivirales Molekül durch Kontaktnahme der infizierten Zelllinie und des antiviralen Moleküls auszusortieren und/oder auszuwählen.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung für die Erfassung von gegen HCV gerichteten Antikörpern in einer Probe, das mindestens eine teilweise oder völlige Reinigung der viralen Partikel des Virus oder der Polypeptide, die aus dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurden, umfasst. Unter teilweiser oder völliger Reinigung ist beispielsweise eine Reinigung durch Ultrazentrifugation auf einem Sucrosegradienten durch Differentialausfällung in Ammoniumsulfat, eine Chromatographie auf Gel oder jedes andere dem Fachmann gut bekannte Verfahren zu verstehen. Insbesondere sind die viralen Partikel oder die Polypeptide auf einem festen Träger befestigt.

Überdies betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Erhalt von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die gegen das HCV-Virus gerichtet sind, nach dem ein Tier mit dem Komplex, der von LVPs in Kombination mit Human-Immunglobulinen mit einer Dichte unter 1,063 g/ml, vorzugsweise zwischen 1,0063 und 1,063 g/ml, gebildet ist, oder mit Fraktionen des Komplexes immunisiert wird; wobei der Komplex eventuell nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt ist. Der Komplex kann so einem vorherigen Schritt der Immunisierungsbehandlung unterzogen werden, beispielsweise durch Behandlung mit Detergenzien oder chaotropen Wirkstoffen, um Fraktionen zu erhalten, die von viralen Proteinen, Lipiden und Phospholipiden gebildet sind. Die Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern oder Antikörperfragmenten ist Teil der allgemeinen Kenntnisse des Fachmanns. Als Beispiel sind zu nennen Köhler G. und Milstein C. (1975) Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 256: 495–497 und Galfre G. et al. (1977) Nature, 266: 522–550 für die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern und Roda A., Bolelli G.F. Production of high titer antibody to bile acids, Journal of Steroid Biochemistry, Band 13, Seiten 449–454 (1980) für die Erzeugung von polyklonalen Antikörpern. Die Antikörper werden durch Immunisierung von Mäusen oder Kaninchen mit dem Komplex LVP/Ig+ oder mit Fraktionen des Komplexes, umfassend virale Proteine, Lipide und Phospholipide, erzeugt. Die Tiere werden einer Immungeninjektion bei Verwendung des kompletten Freund-Adjuvans unterzogen. Die Seren und die aufschwimmenden Hybridomkulturschichten, die von den immunisierten Tieren stammen, werden auf ihre Spezifizität und ihre Selektivität untersucht, wobei herkömmliche Techniken zum Einsatz kommen, wie beispielsweise ELISA-Tests oder Western Blot-Tests. Die Hybridome, die die spezifischsten und sensibelsten Antikörper erzeugen, werden ausgewählt. Monoklonale Antikörper können auch in vitro durch eine Zellkultur der erzeugten Hybridome oder durch Wiedergewinnung von Aszitesflüssigkeit nach intraperitonealer Injektion der Hybridome bei der Maus erzeugt werden. Unabhängig von der Erzeugungsart in der aufschwimmenden Schicht oder im Aszites werden die Antikörper dann gereinigt. Die verwendeten Reinigungsmethoden sind im Wesentlichen die Filterung auf Ionenaustauschgel und die Exklusionschromatographie oder die Immunpräzipitation. Eine ausreichende Anzahl von Antikörpern wird bei den Funktionstests aussortiert, um die stärksten Antikörper zu identifizieren. Die Erzeugung von Antikörpern in vitro, von Antikörperfragmenten oder Antikörperderivaten, wie beispielsweise chimären Antikörpern, die durch Gentechnik erzeugt werden, ist dem Fachmann gut bekannt.

Insbesondere sind unter Antikörperfragment die Fragmente F(ab)2, Fab, Fab', sFv (Blazar et al., 1997 Journal of Immunology 159: 5821–5833 und Bird et al., 1988, Science 242: 423–426) eines nativen Antikörpers zu verstehen, und unter Derivat ist unter anderem ein chimäres Derivat eines nativen Antikörpers zu verstehen (siehe beispielsweise Arakawa et al., 1996, J. Biochem. 120: 657–662 und Chaudray et al., 1989, Nature 339: 394–397).

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Kultur des HCV-Virus in vitro, nach dem ein Komplex vorhanden ist, der von LVPs gebildet ist, die mit Human-Immunglobulinen (LVP/Ig), wie vorher definiert, verbunden sind, und der Komplex mit dem Protein A für den Erhalt eines Komplexes LVP/Ig/Protein A in Kontakt gebracht wird, der Komplex LVP/Ig/Protein A mit mindestens einem spezifischen Antikörper von mindestens einem Zellrezeptor für den Erhalt eines Komplexes LVP/Ig/Protein A/Antikörper in Kontakt gebracht wird und in einem Kulturmedium und unter geeigneten Bedingungen der Komplex LVP/Ig/Protein A/Antikörper und permissive Zellen in Kontakt gebracht werden, die an ihrer Oberfläche mindestens einen Zellrezeptor umfassen oder ausdrücken, der die Fähigkeit besitzt, den Antikörper zu binden; wobei die permissiven Zellen in der Lage sind, die Ausbreitung und die Replikation des HCV-Virus in vitro zu gewährleisten. Nach diesem Verfahren und vorzugsweise:

  • – ist das Protein A mit einem Träger, wie beispielsweise Kugeln oder Sepharose, gekoppelt,
  • – ist der Antikörper ein spezifischer Antikörper mindestens eines der Rezeptoren der LDLs, und umfassen oder drücken die permissiven Zellen an ihrer Oberfläche mindestens einen Rezeptor von LDLs aus,
  • – werden die permissiven Zellen unter den primären menschlichen oder tierischen Hepatozyten und der Gruppe der Zelllinien des menschlichen oder tierischen Hepatokarzinoms ausgewählt, wie beispielsweise den Zellen der Linie des menschlichen Hepatokarzinoms HepG2,
  • – ist das Kulturmedium das Medium DMEM, das mit SVF 10 % ergänzt ist,
  • – wird das Vorhandensein des HCV-Virus in den permissiven Zellen durch RT-PCR und/oder durch Immuntechnik aufgezeigt, wie beispielsweise durch indirekte Immunfluoreszenz, insbesondere mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers des Virus und/oder durch Flusszytometrie.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Protein A im Überfluss hinzugefügt, was bedeutet, dass Protein A, das sich nicht an die Human-Immunglobuline der LVP/Ig gebunden hat, noch verfügbar ist, adsorbiert an der Oberfläche der LVP, um sich an den spezifischen Antikörper eines bestimmten Zellrezeptors zu binden. Natürlich kann der Antikörper ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper sein, ist allerdings vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, um eine bessere Spezifizität zu gewährleisten.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung für den Nachweis von gegen das HCV-Virus gerichteten Antikörpern in einer Probe, das mindestens eine teilweise oder völlige Reinigung der viralen HCV-Partikel oder der Polypeptide umfasst, die aus einem Kulturverfahren, wie oben definiert, gewonnen werden. Vorzugsweise sind die viralen Partikel oder Polypeptide für die Herstellung der Zusammensetzung auf einem festen Träger befestigt.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren für die Beaufschlagung von Antigene aufweisenden Zellen (APCs) in vitro, bei dem ein Komplex vorhanden ist, der von LPVs in Kombination mit Human-Immunglobulinen (LVP/Ig), wie in einem der Ansprüche 1 und 2 definiert, gebildet ist, der Komplex mit Protein A für den Erhalt eines Komplexes LVP/Ig/Protein A in Kontakt gebracht wird, der Komplex LVP/Ig/Protein A mit mindestens einem spezifischen Antikörper von mindestens einem Zellrezeptor der Antigene aufweisenden Zellen (APCs), die bei einem Menschen oder Tier entnommen wurden, für den Erhalt eines Komplexes LVP/Ig/Protein A/Antikörper in Kontakt gebracht wird und der spezifische Komplex LVP/Ig/Protein A/Antikörper mit den Antigene aufweisenden Zellen in Kontakt gebracht wird. Die APCs werden beim Verfahren zur Appretur der exogenen Antikörper eingesetzt, um immunogene Peptide zu erzeugen, die sich an die Moleküle des Hauptkomplexes der Histokompatibilität der Klasse I oder II binden, der die Stimulation der Lymphozyten ermöglicht. Der Begriff APCs deckt ganz allgemein die Makrophagen, die B-Zellen und die Dendritenzellen ab. Bei der vorliegenden Erfindung liegt das Hauptaugenmerk auf den Dendritenzellen, aber dies ist keineswegs einschränkend, und das Verfahren umfasst alle Antikörper, die in der Lage sind, sich an mindestens einen Rezeptor der APCs zu binden. Wenn die Antigene aufweisenden Zellen Dendritenzellen sind, ist der Antikörper ein spezifischer Antikörper mindestens eines Zellrezeptors der Dendritenzellen, der unter dem „Scavenger" Rezeptor A und B, dem Mannoserezeptor und den „Toll Like receptors" (TLRs) ausgewählt wird. Bei dem erfindungsgemäßen Beaufschlagungsverfahren sind die RPCs autolog, was bedeutet, dass sie bei einem Menschen oder Tier entnommen werden und dass sie nach der Beaufschlagung in vitro nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wieder demselben Menschen oder Tier eingeführt werden, um eine Humor- oder Zellantwort zu induzieren. Im Allgemeinen wird von Zelltherapie gesprochen.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die gegen das HCV-Virus gerichtet sind, bei dem ein Tier mit einem Komplex LVP/Ig/Protein A/Antikörper immunisiert wird, der durch ein Verfahren hergestellt werden kann, bei dem ein Komplex vorhanden ist, der von LVPs gebildet ist, die mit Human-Immunglobulinen (LVP/Ig), wie vorher definiert, verbunden ist, der Komplex mit Protein A für den Erhalt eines Komplexes LVP/Ig/Protein A in Kontakt gebracht wird, der Komplex LVP/Ig/Protein A mit mindestens einem spezifischen Antikörper mindestens eines Zellrezeptors von Antigene aufweisenden Zellen (APCs) für den Erhalt eines Komplexes LVP/Ig/Protein A/Antikörper in Kontakt gebracht wird. Vorzugsweise sind die Antigene aufweisenden Zellen die Dendritenzellen und der Antikörper ist ein spezifischer Antikörper mindestens eines Zellrezeptors der Dendritenzellen, der unter dem „Scavenger" Rezeptor A und B, dem Mannoserezeptor und den „Toll Like receptors" (TLRs) ausgewählt wird.

1 stellt die internalisierte Menge an LVP/Ig+ dar, die durch Quantifizierung der viralen RNA bestimmt wird. In der Abszisse sind die Mengen von LDL-Rezeptor-Antikörpern in &mgr;g/ml und in der Ordinate ist die Anzahl von RNA-Kopien pro &mgr;g Protein A dargestellt.

2 stellt die Anzahl von Kopien der viralen RNA dar, die pro Schacht im Beisein von Human-Immunglobulinen, von Human-Immunglobulinen und LDL-Rezeptor-Antikörpern, von LDL-Rezeptor-Antikörpern und der Kontrollgruppe erhalten wurde.

Beispiel 1: Herstellung des biologischen Stoffes.

Die Abtrennung der Lipoproteine erfolgt aus dem Plasma oder dem Serum eines Patienten, der seit 12 Stunden nüchtern ist und für das Hepatitis-C-Virus positiv ist.

Dem entnommenen Blut des Patienten wird 1 % einer EDTA-Lösung (0,15 M NaCl – 0,1 M EDTA) hinzugefügt. Die Mischung wird 10 Minuten lang bei 3500 U/min bei einer Temperatur von 4°C zentrifugiert. Das Plasma wird dann gesammelt und bei 4°C bis zur Verwendung gelagert.

Das Blut des Patienten wird auf einem Trockenröhrchen gesammelt und nach der Koagulation 10 Minuten lang bei 3000 U/min bei einer Temperatur von 4°C zentrifugiert. Das Serum wird entnommen und bei 4°C bis zur Verwendung gelagert.

  • (i) Gewinnung einer Fraktion, umfassend LVPs mit einer Dichte unter 1,0063 g/ml, einer Fraktion, umfassend LVPs mit einer Dichte zwischen 1,0063 g/ml und 1,063 g/ml und einer Fraktion, umfassend LVPs mit einer Dichte über 1,063 g/ml.

Das Plasma und das Serum werden jeweils 4 Stunden lang bei 100 000 U/min bei 4°C in einem Gerät TL100 ultrazentrifugiert, das von der Firma Beckman vertrieben wird und einen Rotor TL100.4 umfasst. Die obere Fraktion, die LVPs mit einer Dichte unter 1,0063 g/ml enthält, wird wiedergewonnen und bei 4°C aufbewahrt. Die untere Fraktion wird auf eine Dichte von 1,063 g/ml durch Beigabe von 7,21 g NaBr auf 100 ml der Fraktion eingerichtet. Die untere Fraktion wird dann 4 Stunden lang bei 100 000 U/min bei 4°C in einem Gerät TL100, umfassend einen Rotor TL100.4, ultrazentrifugiert. Die entstandene obere Fraktion, die die Fraktion mit einer Dichte zwischen 1,0063 g/ml und 1,063 g/ml enthält, wird wiedergewonnen und bei 4°C aufbewahrt.

  • (ii) Gewinnung einer Fraktion, umfassend LVPs mit einer Dichte unter 1,025 g/ml, einer Fraktion, umfassend LVPs mit einer Dichte zwischen 1,025 g/ml und 1,063 g/ml und einer Fraktion, umfassend LVPs mit einer Dichte über 1,063 g/ml.

Das Plasma und das Serum werden jeweils auf eine Enddichte von 1,025 g/ml durch Beigabe von 2,518 g NaBr auf 100 ml eingerichtet. Es erfolgt ein Zentrifugieren während 4 Stunden bei 100 000 U/min bei 4°C auf dem Gerät TL100, umfassend einen Rotor TL100.4.

Die obere Fraktion, die die Fraktion mit einer Dichte unter 1,025 g/ml enthält, wird wiedergewonnen und bei 4°C aufbewahrt. Die untere Fraktion wird auf eine Dichte von 1,063 g/ml durch Beigabe von 4,84 g NaBr auf 100 ml eingerichtet. Die untere Fraktion wird dann 4 Stunden lang bei 100 000 U/min bei 4°C in einem Gerät TL100, umfassend einen Rotor TL100.4, ultrazentrifugiert. Die entstandene obere Fraktion, die die LDLs enthält, wird wiedergewonnen und bei 4°C aufbewahrt.

Die verschiedenen gesammelten Fraktionen werden dann 18 Stunden lang bei 4°C gegen den Puffer 0, 15 M NaCl/0,24 mM EDTA dialysiert. Die Fraktionen werden dann wiedergewonnen und auf einer Membran von 0,45 &mgr; gefiltert. Es erfolgt eine Dosierung von Proteinen durch die Lowry-Methode (Sigma).

Beispiel 2: Nachweis der Verbindung der LVPs mit Human-Immunglobulinen.

Verschiedene Fraktionen, die LVPs enthalten, die aus dem Plasma von drei mit HCV infizierten Patienten gesammelt und nach dem Protokoll des Beispiels 1 präpariert wurden, wurden durch Elektrophorese auf Polyacrylamidgel (PAGE) im Beisein von SDS (Dodecylnatriumsulfat) (SDS-PAGE) analysiert (Laemmli, Nature (1970), 227: 680–685). Der Nachweis des Vorhandenseins von Immunglobulinen (Ig) in diesen Fraktionen erfolgte durch die Technik Western blot (Towbin et al., PNAS, (1979) 76: 4350–4354) mit Hilfe eines Serums von Ziege, Human-Antiimmunglobulinen, gekoppelt mit der Peroxidase (Jackson ImmunoResearch laboratories, Frankreich). Die Ergebnisse zeigen, dass die Human-Immunglobuline immer in den Fraktionen nachgewiesen werden, die LVPs in unterschiedlicher Menge je nach Patient enthalten.

Die Menge des HCV-Genoms in diesen Fraktionen, die LVPs enthalten, wurde durch Quantifizierung der RNA von HCV durch RT-PCR (RT = inverse Transkriptase; PCR = polymerase chain reaction) und Fluoreszenznachweis in Echtzeit (LIGHTCYCLERTM, ROCHE) (Wittwer et al., Biotechniques (1997), 22: 176–181) gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass die RNA von HCV immer mit Fraktionen verbunden ist, die LVPs in unterschiedlicher Menge je nach Patient enthalten.

Die mit den Ig verbundenen LVPs (LVP/Ig+) wurden ferner mit Hilfe von Protein A, gekoppelt mit Kugelns des Typs MAGmol Protein A MicroBeads (Miltenyi Biotec, Frankreich) nach einem Durchlaufen der Säulen MS+ Separation Columns (Miltenyi Biotec, Frankreich) oder auch mit Hilfe von Protein A – Sepharose CL-4B (Pharmacia Biotech, Frankreich) gereinigt. In diesem Fall wird die Gesamtheit oder die Mehrzahl der RNA-HCV mit den Ig gemeinsam gereinigt, wie in den nachfolgenden Tabellen dargestellt. Folglich können die für die Infektionen verwendeten Proben aus einer Fraktion reich an LVPs mit Hilfe ihrer Ig gereinigt werden, so dass vorzugsweise die LVP/Ig+/RNA+ verwendet werden.

  • d* bedeutet die Dichte der LVPs in g/ml.

  • d* bedeutet die Dichte der LVPs in g/ml.

  • d* bedeutet die Dichte der LVPs in g/ml.

Diese Ergebnisse zeigen, dass, wenn Immunglobuline in den Fraktionen, die LVPs enthalten, vorhanden sind, die viralen RNA mehrheitlich in den Fraktionen von LVPs zu finden sind, die mit Human-Immunglobulinen verbunden sind.

Beispiel 3: Internalisierung der LVPs durch Zellortung.

Beim ursprünglichen Schritt der viralen Infektion in vitro durch das nach Beispiel 2 gereinigte VHC-Virus ermöglicht es die Verwendung eines gegen einen Zellrezeptor gerichteten Antikörpers, die Wirksamkeit der Ortung und der Internalisierung der LVPs in einer gegebenen Zelllinie zu erhöhen.

Die mit den Ig verbundenen LVPs (LVP/Ig+) wurden aus einer Fraktion mit einer Dichte zwischen 1,025 und 1,055 g/ml mit Hilfe des Proteins A, gekoppelt mit den Kugeln des Typs MAGmol Protein A MicroBeads (Miltenyi Biotec, Frankreich), wie in Beispiel 2 beschrieben, gereinigt.

Die Linie des Human-Hepatokarzinoms HepG2, die im Medium DMEM-10% SFV kultiviert wurde, wurde für die Studie der Internalisierung der gereinigten LVP/Ig+ im Beisein eines LDL-Rezeptor-Antikörpers verwendet. Die Ergebnisse wurden nach folgendem Protokoll erhalten:

Die Zellen HepG wurden zu 45000 Zellen/Schacht auf eine Platte mit 96 Schächten ausgestreut, um nach 24 Stunden Inkubation bei 37°C – 5 % CO2 eine Konfluenz von ungefähr 70 % zu erhalten.

Drei Waschungen mit Puffer PBS 1X wurden durchgeführt, dann wurde die Fraktion LVP/Ig+ (d.h. 0,25 × 106 Kopien von VHC-RNA) jedem Schacht im Beisein einer steigenden Menge von LDL-Rezeptor-Antikörpern hinzugefügt: d.h. 0, 1, 5, 10 und 20 &mgr;g/ml. Es wurden vier Schächte pro Versuch hergestellt. Die Inkubation erfolgte bei +37°C 3 Stunden lang.

Die Zellen wurden dreimal mit Hilfe von PBS 1X/0,2 kaltem BSA gewaschen, dann mit Suramin 10 mM 1 Stunde lang auf einem Eisbett behandelt. Nach drei neuerlichen Waschungen in PBS1X wurden die Zellen mit 350 &mgr;l Lysepuffer des Rneasy-Kastens (Qiagen) lysiert. Die RNR wurde dann mit Hilfe eben dieses Kastens gereinigt und durch quantitative RT-PCR (LightCyclerTM) analysiert.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in 1 angegeben. Die Ergebnisse zeigen, dass die internalisierte Menge an LVP/Ig+ (bestimmt durch Quantifizieren der viralen RNA) umso größer ist, als die Menge an LDL-Rezeptor-Antikörpern hoch ist. Dies erklärt sich durch die Bildung eines Komplexes LVP/Ig+ – Protein A/Magnetkugel – LDL-Rezeptor-Antikörper, der dank des Vorhandenseins von freien und nicht an die LVPs gekoppelten Proteinen A auf den Magnetkugeln entsteht. Diese Hypothese wird in dem unten beschriebenen Experiment überprüft.

Die mit den Ig verbundenen LVPs (LVP/Ig+) wurden aus einer Fraktion mit einer Dichte unter 1,006 g/ml mit Hilfe des Proteins A, gekoppelt an die Kugeln des Typs MAGmol Protein A MicroBeads (Miltenyi Biotec, Frankreich), wie in Beispiel 2 beschrieben, gereinigt.

Die HepG2-Zellen wurden zu 50000 Zellen/Schacht (Platte mit 96 Schächten) ausgestreut, um nach 24 Stunden Inkubation bei 37°C – 5 % CO2 eine Konfluenz von ungefähr 80 % zu erhalten. Die Ergebnisse wurden mit dem vorher beschriebenen Protokoll erhalten, mit der Ausnahme, dass die Fraktion LVP/Ig+ (d.h. 0,4 × 106Kopien von VHC-RNA) für jeden Test unter verschiedenen Bedingungen hinzugefügt wurde:

  • – im Beisein von 50 &mgr;g Human-Immunglobulinen,
  • – im Beisein von 50 &mgr;g Human-Immunglobulinen und 10 &mgr;g/ml LDL-Rezeptor-Antikörpern,
  • – im Beisein von 10 &mgr;g/ml LDL-Rezeptor-Antikörpern.
wobei eine Vorinkubation der LVP/Ig+ mit den Human-Immunglobulinen durchgeführt wurde, die 1 Stunde lang bei Raumtemperatur erfolgte.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in 2 angeführt. Diese Ergebnisse bestätigen die Spezifizität der Zellortung insofern, als die Inkubation der LVPs mit nicht spezifischen Immunglobulinen des Rezeptors die Erleichterung der Internalisierung durch die LDL-Rezeptor-Antikörper blockieren.


Anspruch[de]
Komplex bestehend aus Lipo-Virus-Partikeln (LVPs) in Kombination mit Human-Immunglobulinen, der eine Dichte unterhalb 1,063 g/ml aufweist und durch ein Verfahren gewonnen werden kann, bei dem man:

über eine Probe eines Plasma- oder Serummaterials eines mit Hepatitis-C-Virus (HCV) infizierten Patienten verfügt,

die LVPs von dieser Probe mittels Zentrifugation aufgrund ihrer Dichte abtrennt, und

die mit Human-Immunglobulinen assoziierten LVPs mit Hilfe von Protein A, Humman-anti-Immunglobulinen oder beliebigen anderen Molekülen, die fähig sind, an die Human-Immunglobuline zu binden, abtrennt.
Komplex nach Anspruch 1 mit einer Dichte zwischen 1,0063 und 1,063 g/ml. Verfahren zur Herstellung eines Komplexes bestehend aus LVPs in Kombination mit Human-Immunglobulinen und mit einer Dichte unterhalb 1,063 g/ml, vorzugsweise zwischen 1,0063 und 1,063 g/ml, bei dem man:

über eine Probe eines Plasma- oder Serummaterials eines mit Hepatitis-C-Virus (HCV) infizierten Patienten verfügt,

die LVPs von dieser Probe mittels Zentrifugation aufgrund ihrer Dichte abtrennt, und

die mit Human-Immunglobulinen assoziierten LVPs mit Hilfe von Protein A, Humman-anti-Immunglobulinen oder beliebigen anderen Molekülen, die fähig sind, an die Human-Immunglobuline zu binden, abtrennt.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das Protein A, die Antikörper gegen Human-Immunglobuline oder andere Moleküle, die fähig sind, an Human-Immunglobuline zu binden, an einen Träger wie Perlon oder Sepharose gekoppelt sind. Verfahren zur in vitro-Kultivierung von HCV-Virus, bei dem man einen Komplex bestehend aus LVPs in Kombination mit Human-Immunglobulinen nach Anspruch 1 und 2, der gegebenenfalls nach Anspruch 3 und 4 hergestellt worden ist, und permissive Zellen, die an ihrer Oberfläche mindestens eine Art von Rezeptor für das Fragment Fc der Immunglobuline aufweisen, in einem Kulturmedium unter geeigneten Bedingungen in Kontakt bringt, wobei die permissiven Zellen fähig sind, die Vermehrung und Replikation des HCV-Virus in vitro zu gewährleisten. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die permissiven Zellen aus der Gruppe mononukleäre Zellen wie Knochenmarkstammzellen, Monoplasten, Promonocyten Monocyten und Makrophagen, Makrophagen-Vorläuferzellen, B-Lymphocyten, NK-Zellen, primäre humane oder tierische Hepatocyten, Zellen der Gruppe der tierischen oder menschlichen Leberkarzinomzellinien, Kuppfer-Zellen, Dendritenzellen, Epitelzellen, Gefäßendothelzellen, Mastocyten, Langerhanssche Zellen, Syncytiotrophoblasten, eosinophile, basophile und neutralophile polynukleäre Zellen sowie Blutplättchen stammen. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Makrophagen vorzugsweise aus der Gruppe Histiocyten, alveoläre Makrophagen, Ratten-Makrophagen, Lymphoidgewebe-Makrophagen, Kuppfer-Zellen, Osteoklasten, Typ-A-Synovialzellen, Gewebemakrophagen und Vorläuferzellen, von denen sich diese Zellen ableiten, stammen. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem es sich bei den permissiven Zellen um primäre oder tierische Hepatocyten, Zellen der Gruppe der menschlichen oder tierischen Leberkarzinomzellinien oder Kuppfer-Zellen, die mindestens eine Art von Rezeptor für das Fc-Fragment der Immunglobuline und/oder mindestens einen Rezeptor für Lipoproteine wie den LDL-Rezeptor und den Lipolysis Stimulated Receptor aufweisen, handelt. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei es sich bei dem Kulturmedium um das RPMI-1640-Medium mit Zusatz von 1% Penicillin, Streptomycin, 2 mM Glutamin, 10% SVF, das weiterhin gegebenenfalls 50 &mgr;M beta-Mercaptoethanol enthält, handelt. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, bei dem man das Vorhandensein des HCV-Virus in den permissiven Zellen mittels RT-PCR und/oder immunologisch, wie mittels indirekter Immunfluoreszenz insbesondere mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers dieses Virus, und/oder mittels Durchflußcytometrie nachweist. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung für den Nachweis von gegen das HCV-Virus gerichteten Antikörpern in einer Probe, bei dem man:

einen Komplex bestehend aus LVPs in Kombination mit Human-Immunglobulinen nach Anspruch 1 und 2, der gegebenenfalls nach Anspruch 3 und 4 hergestellt worden ist, und permissive Zellen, die an ihrer Oberfläche mindestens eine Art von Rezeptor für das Fc-Fragment der Immunglobuline aufweisen, in einem Kulturmedium unter geeigneten Bedingungen in Kontakt bringt, wobei die permissiven Zellen fähig sind, die Vermehrung und Replikation des HCV-Virus in vitro zu gewährleisten, wodurch man HCV-Virus-Partikel oder Polypeptide erhält, und

diese HCV-Viruspartikel oder diese Polypeptide teilweise oder vollständig aufreinigt.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Viruspartikel oder Polypeptide auf einem festen Träger fixiert sind. Verfahren für die Gewinnung von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die gegen das HCV-Virus gerichtet sind, bei dem man ein nichtmenschliches Tier mit einem Komplex nach Anspruch 1 oder 2, der gegebenenfalls nach einem Verfahren nach Anspruch 3 oder 4 hergestellt worden ist, immunisiert. Verfahren für die in-vitro-Kultivierung des HCV-Virus, bei dem man über einen Komplex bestehend aus LVPs in Kombination mit Human-Immunglobulinen (LVP/Ig) wie in einem der Ansprüche 1 und 2 definiert verfügt, diesen Komplex mit Protein A in Kontakt bringt, wodurch man einen LVP/Ig/Protein-A-Komplex erhält, diesen LVP/Ig/Protein-A-Komplex mit mindestens einem Antikörper der für mindestens einen Zellrezeptor spezifisch ist, in Kontakt bringt, wodurch man einen LVP/Ig/Protein-A/Antikörper-Komplex erhält, und man diesen LVP/Ig/Protein-A/Antikörper-Komplex und permissive Zellen, die an ihrer Oberfläche mindestens einen Zellrezeptor mit der Fähigkeit, den Antikörper zu binden, aufweisen oder exprimieren, in einem Kulturmedium unter geeigneten Bedingungen in Kontakt bringt; wobei die permissiven Zellen fähig sind, die Vermehrung und Replikation des HCV-Virus in vitro zu gewährleisten. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem das Protein A an einen Träger wie Perlon oder Sepharose gekoppelt ist. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei der Antikörper für mindestens einen der LDL-Rezeptoren spezifisch ist und die permissiven Zellen an ihrer Oberfläche mindestens einen LDL-Rezeptor aufweisen oder exprimieren. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die permissiven Zellen aus der Gruppe der menschlichen oder tierischen primären Hepatocyten und den Zellen aus der Gruppe der menschlichen oder tierischen Leberkarzinomzellinien, wie Zellen der menschlichen Leberkarzinomlinien HepG2, stammen. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei es sich bei dem Kulturmedium um das DMEM-Medium mit einem Zusatz von 10% SVF handelt. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, bei dem man das Vorhandensein des HCV-Virus in den permissiven Zellinien mittels RT-PCR und/oder immunologisch wie mittels indirekter Immunfluoreszenz, insbesondere mit Hilfe eines für dieses Virus spezifischen Antikörpers, und/oder Durchflußcytometrie nachweist. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung für den Nachweis von gegen das HCV-Virus gerichteten Antikörpern in einer Probe, bei dem man:

über einen Komplex bestehend aus LVPs in Kombination mit Human-Immunglobulinen (LVP/Ig) wie in einem der Ansprüche 1 und 2 definiert verfügt, diesen Komplex mit Protein A in Kontakt bringt, wodurch man einen LVP/Ig/Protein-A-Komplex erhält, diesen LVP/Ig/Protein-A-Komplex mit mindestens einem Antikörper der für mindestens einen Zellrezeptor spezifisch ist, in Kontakt bringt, wodurch man einen LVP/Ig/Protein-A/Antikörper-Komplex erhält, und man diesen LVP/Ig/Protein-A/Antikörper-Komplex und permissive Zellen, die an ihrer Oberfläche mindestens einen Zellrezeptor mit der Fähigkeit, den Antikörper zu binden, aufweisen oder exprimieren, in einem Kulturmedium unter geeigneten Bedingungen in Kontakt bringt, wobei die permissiven Zellen, fähig sind, die Vermehrung und Replikation des HCV-Virus in vitro zu gewährleisten, wodurch man zu HCV-Viruspartikeln oder Polypeptiden gelangt, und

man die HCV-Virsupartikel oder die Polypeptide teilweise oder vollständig auf reinigt.
Verfahren nach Anspruch 20, bei dem die Viruspartikel oder Polypeptide auf einem festen Träger fixiert sind. Verfahren zur in-vitro-Beladung von antigenpräsentierenden Zellen (APCs), bei dem man über einen Komplex bestehend aus LVPs in Kombination mit Human-Immunglobulinen (LVP/Ig) wie in einem der Ansprüche 1 und 2 definiert verfügt, diesen Komplex mit Protein A in Kontakt bringt, wodurch man einen LVP/Ig/Protein-A-Komplex erhält, diesen LVP/Ig/Protein-A-Komplex mit mindestens einem Antikörper, der für mindestens einen Zellrezeptor von antigenpräsentierenden Zellen (APCs), die von einem Menschen oder Tier entnommen wurden, spezifisch ist, in Kontakt bringt, wodurch man zu einem LVP/Ig/Protein-A/Antikörper-Komplex gelangt, und man diesen LVP/Ig/Protein-A/Antikörper-Komplex mit den antigenpräsentierenden Zellen in Kontakt bringt. Verfahren nach Anspruch 22, wobei es sich bei den antigenpräsentierenden Zellen um Dendritenzellen handelt und bei dem Antikörper um einen Antikörper, der für mindestens einen Zellrezeptor von Dendritenzellen spezifisch ist, aus der Gruppe „scavenger"-Rezeptor A und B, Manoserezeptor und „Toll-Like-Receptors" (TLRs) handelt. Verfahren zur Gewinnung von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die gegen das HCV-Virus gerichtet sind, bei dem man ein nichtmenschliches Tier mit einem LVP/Ig/Protein-A/Antikörper-Komplex immunisiert, der durch ein Verfahren gewonnen werden kann, bei dem man über einen Komplex bestehend aus LVPs in Kombination mit Human-Immunglobulinen (LVP/Ig) wie in einem der Ansprüche 1 und 2 definiert verfügt, diesen Komplex mit Protein A in Kontakt bringt, wodurch man einen LVP/Ig/Protein-A-Komplex erhält, diesen LVP/Ig/Protein-A-Komplex mit mindestens einem Antikörper der für mindestens einen Zellrezeptor von antigenpräsentierenden Zellen (APCs), spezifisch ist, in Kontakt bringt, wodurch man zu einem LVP/Ig/Protein-A/Antikörper-Komplex gelangt. Verfahren nach Anspruch 24, wobei es sich bei den antigenpräsentierenden Zellen um Dendritenzellen handelt und bei dem Antikörper um einen Antikörper, der für mindestens einen Zellrezeptor von Dendritenzellen spezifisch ist, aus der Gruppe „scavenger"-Rezeptor A und B, Manoserezeptor und „Toll-Like-Receptors" (TLRs) handelt.






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