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Dokumentenidentifikation DE102005027172A1 14.12.2006
Titel Verwendung von Ionischen Flüssigkeiten zur Proteinextraktion
Anmelder Merck Patent GmbH, 64293 Darmstadt, DE
Erfinder Hagen, Jörg von, Dr., 64347 Griesheim, DE;
Michelsen, Uwe, Dr., 69469 Weinheim, DE
DE-Anmeldedatum 13.06.2005
DE-Aktenzeichen 102005027172
Offenlegungstag 14.12.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 14.12.2006
IPC-Hauptklasse C07K 1/14(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, DE
IPC-Nebenklasse G01N 33/68(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   
Zusammenfassung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Proteinen, Proteinfragmenten und/oder Peptiden aus biologischen Proben, wobei als Extraktionsmittel ionische Flüssigkeiten der allgemeinen Formel K+A- eingesetzt werden, ein Kit zur Extraktion von Proteinen, Proteinfragmenten und/oder Peptiden sowie dessen Verwendung.

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Proteinen, Proteinfragmenten und/oder Peptiden aus biologischen Proben, wobei als Extraktionsmittel Ionische Flüssigkeiten der allgemeinen Formel K+A eingesetzt werden, ein Kit zur Extraktion von Proteinen, Proteinfragmenten und/oder Peptiden sowie dessen Verwendung.

Der Nachweis beziehungsweise die Analyse von Proteinen gewinnt in der Medizin zunehmende Bedeutung. Dies betrifft insbesondere die Analyse von Gewebeproben, um Anzeichen einer Erkrankung oder den Nachweis einer krankhaften Veränderung festzustellen. Zu diesem Zwecke werden Analysen des Gesamtproteoms der Zelle untersucht. Hierzu ist es essentiell, alle Proteine einer gegebenen Probe quantitativ zu extrahieren, da nur die Analyse aller beteiligten Proteine in ihrer Gesamtheit Rückschlüsse auf Krankheiten und deren Entstehung zulässt.

Es bestand daher die Aufgabe, Verfahren bereit zu stellen, mit deren Hilfe Proteine aus biologischen Proben extrahiert werden können, um sie weiter analysieren zu können.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind demgemäss Verfahren zur Extraktion von Proteinen, Proteinfragmenten und/oder Peptiden aus biologischen Proben, wobei als Extraktionsmittel Ionische Flüssigkeiten der allgemeinen Formel K+A eingesetzt werden.

Ionische Flüssigkeiten oder flüssige Salze sind ionische Spezies, die aus einem organischen Kation und einem in der Regel anorganischen Anion bestehen. Sie enthalten keine neutralen Moleküle und weisen meistens Schmelzpunkte kleiner 373 K auf.

Das Gebiet der ionischen Flüssigkeiten wird zur Zeit intensiv erforscht, da die Anwendungsmöglichkeiten vielfältig sind. Übersichtsartikel zu ionischen Flüssigkeiten sind beispielsweise R. Sheldon „Catalytic reactions in ionic liquids", Chem. Commun., 2001, 2399–2407; M.J. Earle, K.R. Seddon "Ionic liquids. Green solvent for the future", Pure Appl. Chem., 72 (2000), 1391–1398; P. Wasserscheid, W. Keim „Ionische Flüssigkeiten – neue Lösungen für die Übergangsmetallkatalyse", Angew. Chem., 112 (2000), 3926–3945; T. Welton „Room temperature ionic liquids. Solvents for synthesis and catalysis", Chem. Rev., 92 (1999), 2071–2083 oder R. Hagiwara, Ya. Ito „Room temperature ionic liquids of alkylimidazolium cations and fluoroanions", J. Fluorine Chem., 105 (2000), 221–227).

Es hat sich überraschend herausgestellt, dass ionische Flüssigkeiten der allgemeinen Formel K+A geeignet sind, Proteine, Proteinfragmente und/oder Peptide aus biologischen Proben zu extrahieren. Dies gilt auch dann, wenn die biologischen Proben fixiert sind, wie es üblicherweise bei der Probenpräparation von biologischen Proben der Fall ist. Das erfindungsgemäße Extraktionsverfahren kann überraschenderweise auch auf fixierte Proben angewendet werden, was die Einsatzmöglichkeiten der Verfahren enorm erweitert. Auf diese Weise lassen sich mit den erfindungsgemäßen Verfahren biologische Proben universell behandeln, um daraus Proteine, Proteinfragmente und/oder Peptide zu extrahieren. Dabei hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, dass die zu extrahierenden Bestandteile nicht degradiert werden, das heißt ihre chemische Konstitution bleibt erhalten. Dies ist ein wesentlicher Vorteil gegenüber bekannten Verfahren, wie sie beispielsweise in WO2004/080579 beschrieben sind, bei denen die zu extrahierenden Proteine in einem proteolytischen Schritt zu Peptiden degradiert werden müssen, um sie nachfolgend analysieren zu können. Insgesamt wird damit mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine einfache Aufbereitung biologischer Proben zur Isolierung von Proteinen, Proteinfragmenten und/oder Peptiden möglich, die mit dem aus dem Stand der Technik beschriebenen Verfahren nicht zugänglich war.

Die Extraktion von Proteinen, Proteinfragmenten und/oder Peptiden in den erfindungsgemäßen Verfahren kann aus allen dem Fachmann bekannten biologischen Proben erfolgen. Vorzugsweise handelt es sich bei den biologischen Proben um Gewebe, wie z.B. Biopsien und histologische Präparate, Zellen, Zellkulturen und/oder Körperflüssigkeiten, wie z.B. Blut, Plasma, Serum, Urin, Liquor oder Speichel. Die Extraktion von Proteinen aus Geweben und Zellkulturen erlaubt insbesondere den Nachweis spezifischer Proteine, z.B. zum Nachweis von Proteinen, die auf das Vorhandensein von Krankheiten schließen lassen. Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere auch für pathologisch interessante Gewebeproben vorteilhaft.

Die biologischen Proben können unfixiert oder fixiert sein, vorzugsweise sind sie fixiert. Dabei kann die Fixierung nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgt sein, z.B. durch Einsatz von Formalin, Glutaraldehyd, Formalinsubstituten, Alkoholen, wie z.B. Ethanol, Methanol, Isopropanol, oder inerten Materialien, wie z.B. Paraffin, Harzen oder Polymeren. Vorzugsweise sind die biologischen Proben mit Formalin fixiert. Formalin ist das gängigste Fixierungsmittel bei der Präparation histologischer Proben und wird, wegen des geringen Preises und der guten Fixierungswirkung, vielerorts und nunmehr seit mehr als hundert Jahren eingesetzt. Die Fixierung mit Formalin hat aber den Nachteil, dass es zu einer Quervernetzung der Proteine mit der Probenmatrix kommt. Dadurch wurden die Proteine generell unlöslich und standen einer weiteren Analytik nicht zur Verfügung. Durch Einsatz von Ionischen Flüssigkeiten in den erfindungsgemäßen Verfahren können die Proteine jedoch unter Erhalt ihrer Struktur auch aus diesen Proben extrahiert werden, um sie weiter zu analysieren. Auf diese Weise wird die gängigste Fixierungsmethode mit Formalin in ihrer Praktikabilität erweitert, ohne die Möglichkeiten der nachfolgenden Analytik einzuschränken. Damit können nun unter Einsatz der erfindungsgemäßen Verfahren auch Proben mit der modernen Proteinanalytik untersucht werden, die bereits sehr lange mittels Einsatz von Formalin konserviert wurden, das heißt eine zeitliche Begrenzung der Analysierbarkeit von Proben entfällt.

Generell eignen sich in den erfindungsgemäßen Verfahren alle dem Fachmann bekannten Ionischen Flüssigkeiten der allgemeinen Formel K+A, beispielsweise mit Hexafluorophosphat-, Tetrafluroborat- oder Halogenid-Anionen. Beispiele für geeignete Ionische Flüssigkeiten sind Trihexyl(tetradecyl)-phosphoniumhexafluorophosphat, Trihexyl(tetradecyl)-phosphoniumchlorid oder Trihexyl(tetradecyl)-phosphoniumtetrafluoroborat.

Vorzugsweise ist das Anion A der Ionischen Flüssigkeit ausgewählt aus der Gruppe der Imide, insbesondere jene der allgemeinen Formel wobei Rf teilweise oder vollständig mit Fluor substituiertes Alkyl mit 1 bis 8 C-Atomen oder Rf2X bedeutet, wobei Rf2 teilweise oder vollständig mit Fluor substituiertes Alkyl mit 1 bis 8 C-Atomen und X SO2 oder CO bedeutet, aus der Gruppe der Fluoralkylphosphate, insbesondere jene der allgemeinen Formel mit 1 ≤ x < 6, 1 ≤ y ≤ 8 und 0 ≤ z ≤ 2y + 1 oder aus Mischungen hieraus.

Vorzugsweise ist Rf Trifluormethyl, Pentafluorethyl, Nonaflurobutyl oder Rf2SO2, insbesondere Trifluormethyl oder Rf2SO2, wobei besonders bevorzugt Rf2 Trifluormethyl ist. Im Falle der Fluoralkylphosphate ist bevorzugt x = 3, z = 0 und y = 2, 3 oder 4, wobei y = 2 ganz besonders bevorzugt ist. Ionische Flüssigkeiten enthaltend die besonders bevorzugten [(CF3SO2)2N]- oder [PF3(C2F5)3]-Anionen sind besonders zur Extraktion von Proteinen, Proteinfragmenten und/oder Peptiden in den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet.

In Bezug auf die Wahl des Kations K+ der Ionischen Flüssigkeit der ionischen Flüssigkeit gibt es per se keine Einschränkungen. Vorzugsweise handelt es sich aber um organische Kationen, wobei es sich insbesondere bevorzugt um Ammonium-, Phosphonium, Uronium-, Thiouronium-, Guanidiniumkationen oder um heterocyclische Kationen handelt.

Ammoniumkationen können beispielsweise durch die Formel (1) beschrieben werden, wobei

R jeweils unabhängig voneinander

H, wobei nicht alle Substituenten R gleichzeitig H sein dürfen,

OR', NR'2, mit der Maßgabe, dass maximal ein Substituent R in Formel (1) OR', NR'2 ist,

geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1–20 C-Atomen,

geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2–20 C-Atomen und einer oder mehreren Doppelbindungen,

geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2–20 C-Atomen und einer oder mehreren Dreifachbindungen,

gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Cycloalkyl mit 3–7 C-Atomen, das mit Alkylgruppen mit 1–6 C-Atomen substituiert sein kann, bedeutet, wobei ein oder mehrere R teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OH, -OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'2, -SO2NR'2, -C(O)X, -SO2OH, -SO2X, -NO2, substituiert sein können, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht &agr;-ständige Kohlenstoffatome des R, durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -SO2O-, -C(O)-, -C(O)O-, -N+R'2–, -P(O)R'O-, -C(O)NR'-, -SO2NR'-, -OP(O)R'O-, -P(O)(NR'2)NR'-, -PR'2=N- oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise oder perfluoriertes C1– bis C6-Alkyl, C3– bis C7-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X =Halogen sein kann.

Phosphoniumkationen können beispielsweise durch die Formel (2) beschrieben werden, wobei

R2 jeweils unabhängig voneinander

H, OR' oder NR'2

geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1–20 C-Atomen,

geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2–20 C-Atomen und einer oder mehreren Doppelbindungen,

geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2–20 C-Atomen und einer oder mehreren Dreifachbindungen,

gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Cycloalkyl mit 3–7 C-Atomen, das mit Alkylgruppen mit 1–6 C-Atomen substituiert sein kann, bedeutet, wobei ein oder mehrere R2 teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OH, -OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'2, -SO2NR'2, -C(O)X, -SO2OH, -SO2X, -NO2, substituiert sein können, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht &agr;-ständige Kohlenstoffatome des R2, durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -SO2O-, -C(O)-, -C(O)O-, -N+R'2-, -P(O)R'O-, -C(O)NR'-, -SO2NR'-, -OP(O)R'O-, -P(O)(NR'2)NR'-, -PR'2=N- oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise oder perfluoriertes C6- bis C6-Alkyl, C3- bis C7-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X = Halogen.

Ausgeschlossen sind jedoch Kationen der Formeln (1) und (2), in denen alle vier oder drei Substituenten R und R2 vollständig mit Halogenen substituiert sind, beispielsweise das Tris(trifluormethyl)methylammoniumkation, das Tetra(trifluormethyl)ammoniumkation oder das Tetra(nonafluorbutyl)ammoniumkation.

Uroniumkationen können beispielsweise durch die Formel (3) und Thiouroniumkationen durch die Formel (4), beschrieben werden, wobei

R3 bis R7 jeweils unabhängig voneinander

Wasserstoff, wobei Wasserstoff für R5 ausgeschlossen wird,

geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 20 C-Atomen,

geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2–20 C-Atomen und einer oder mehreren Doppelbindungen,

geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2–20 C-Atomen und einer oder mehreren Dreifachbindungen,

gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Cycloalkyl mit 3–7 C-Atomen, das mit Alkylgruppen mit 1–6 C-Atomen substituiert sein kann, bedeutet, wobei ein oder mehrere der Substituenten R3 bis R7 teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OH, -OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'2, -SO2NR'2, -C(O)X, -SO2OH, -SO2X, -NO2, substituiert sein können, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht &agr;-ständige Kohlenstoffatome von R3 bis R7 durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -SO2O-, -C(O)-, -C(O)O-, -N+R'2-, -P(O)R'O-, -C(O)NR'-, -SO2NR'-, -OP(O)R'O-, -P(O)(NR'2)NR'-, -PR'2=N- oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise oder perfluoriertes C1- bis C6-Alkyl, C3- bis C7-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X = Halogen.

Guanidiniumkationen können durch die Formel (5) , beschrieben werden, wobei

R8 bis R13 jeweils unabhängig voneinander

Wasserstoff, -CN, NR'2, -OR'

geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 20 C-Atomen,

geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2–20 C-Atomen und einer oder mehreren Doppelbindungen,

geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2–20 C-Atomen und einer oder mehreren Dreifachbindungen,

gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Cycloalkyl mit 3–7 C-Atomen, das mit Alkylgruppen mit 1–6 C-Atomen substituiert sein kann, bedeutet, wobei ein oder mehrere der Substituenten R8 bis R13 teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OH, -OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'2, -SO2NR'2, -C(O)X, -SO2OH, -SO2X, -NO2, substituiert sein können, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht &agr;-ständige Kohlenstoffatome von R8 bis R13 durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -SO2O-, -C(O)-, -C(O)O-, -N+R'2-, -P(O)R'O-, -C(O)NR'-, -SO2NR'-, -OP(O)R'O-, -P(O)(NR'2)NR'-, -PR'2=N- oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise oder perfluoriertes C1- bis C6-Alkyl, C3- bis C7-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X = Halogen.

Darüber hinaus können Kationen der allgemeinen Formel (6) eingesetzt werden, wobei

HetN+ ein heterocyclisches Kation, ausgewählt aus der Gruppe bedeutet, wobei die Substituenten

R1' bis R4' jeweils unabhängig voneinander

Wasserstoff, -CN, -OR', -NR'2, -P(O)R'2, -P(O)(OR')2, -P(O)(NR'2)2, -C(O)R', -C(O)OR',

geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1–20 C-Atomen,

geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2–20 C-Atomen und einer oder mehreren Doppelbindungen,

geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2–20 C-Atomen und einer oder mehreren Dreifachbindungen,

gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Cycloalkyl mit 3–7 C-Atomen, das mit Alkylgruppen mit 1–6 C-Atomen substituiert sein kann,

gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Heteroaryl, Heteroaryl-C1-C6-alkyl oder Aryl-C1-C6-alkyl bedeutet,

wobei die Substituenten R1', R2', R3' und/oder R4' zusammen auch ein Ringsystem bilden können,

wobei ein oder mehrere Substituenten R1' bis R4' teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder -OH, -OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'2, -SO2NR'2, -C(O)X, -SO2OH, -SO2X, -NO2, substituiert sein können, wobei jedoch nicht gleichzeitig R1' und R4' vollständig mit Halogenen substituiert sein dürfen, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht am Heteroatom gebundene Kohlenstoffatome der Substituenten R1' bis R4', durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -SO2O-, -C(O)-, -C(O)O-, -N+R'2-, -P(O)R'O-, -C(O)NR'-, -SO2NR'-, -OP(O)R'O-, -P(O)(NR'2)NR'-, -PR'2=N- oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise oder perfluoriertes C1- bis C6-Alkyl, C3- bis C7-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X = Halogen.

Unter vollständig ungesättigten Substituenten werden im Sinne der vorliegenden Erfindung auch aromatische Substituenten verstanden.

Als Substituenten R und R2 bis R13 der Verbindungen der Formeln (1) bis (5) kommen erfindungsgemäß dabei neben Wasserstoff bevorzugt in Frage: C1- bis C20-, insbesondere C1- bis C14-Alkylgruppen, und gesättigte oder ungesättigte, d.h. auch aromatische, C3- bis C7-Cycloalkylgruppen, die mit C1- bis C6-Alkylgruppen substituiert sein können, insbesondere Phenyl.

Die Substituenten R und R2 in den Verbindungen der Formel (1) oder (2) können dabei gleich oder verschieden sein. Bevorzugt sind die Substituenten R und R2 verschieden.

Die Substituenten R und R2 sind insbesondere bevorzugt Methyl, Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl, sek.-Butyl, tert.-Butyl, Pentyl, Hexyl, Octyl, Decyl oder Tetradecyl.

Bis zu vier Substituenten des Guanidinium-Kations [C(NR8R9)(NR10R11)(NR1 2R13)]+ können auch paarweise derart verbunden sein, dass mono-, bi- oder polycyclische Kationen entstehen.

Ohne Einschränkung der Allgemeinheit sind Beispiele für solche Guanidinium-Kationen: wobei die Substituenten R8 bis R10 und R13 eine zuvor angegebene oder besonders bevorzugte Bedeutung haben können.

Gegebenenfalls können die Carbocyclen oder Heterocyclen der zuvor angegebenen Guanidinium-Kationen noch durch C1- bis C6-Alkyl, C1- bis C6-Alkenyl, NO2, F, Cl, Br, I, OH, C1-C6-Alkoxy, SCF3, SO2CF3, COOH, SO2NR'2, SO2X' oder SO3H substituiert sein, wobei X und R' eine zuvor angegebene Bedeutung haben, substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl oder unsubstituierter oder substituierter Heterocyclus substituiert sein.

Bis zu vier Substituenten des Uroniumkations [(R3R4N)-C(=OR5)(NR6R7)]+ oder des Thiouroniumkations [(R3R4N)-C(=SR5)(NR6R7)]+ können auch paarweise derart verbunden sein, dass mono-, bi- oder polycyclische Kationen entstehen.

Ohne Einschränkung der Allgemeinheit sind Beispiele für solche Kationen im folgenden angegeben, wobei Y = O oder S bedeutet: wobei die Substituenten R3, R5 und R6 eine zuvor angegebene oder besonders bevorzugte Bedeutung haben können.

Gegebenenfalls können die Carbocyclen oder Heterocyclen der zuvor angegebenen Kationen noch durch C1- bis C6-Alkyl, C1- bis C6-Alkenyl, NO2, F, Cl, Br, I, OH, C1-C6-Alkoxy, SCF3, SO2CF3, COOH, SO2NR'2, SO2X oder SO3H oder substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl oder unsubstituierter oder substituierter Heterocyclus substituiert sein, wobei X und R' eine zuvor angegebene Bedeutung haben.

Die Substituenten R3 bis R13 sind jeweils unabhängig voneinander bevorzugt eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 10 C-Atomen. Die Substituenten R3 und R4, R6 und R7, R8 und R9, R10 und R11 und R12 und R13 in Verbindungen der Formeln (3) bis (5) können dabei gleich oder verschieden sein. Besonders bevorzugt sind R3 bis R13 jeweils unabhängig voneinander Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, tert.-Butyl, sek.-Butyl, Phenyl oder Cyclohexyl, ganz besonders bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl oder n-Butyl.

Als Substituenten R1' bis R4' von Verbindungen der Formel (6) kommen erfindungsgemäß dabei neben Wasserstoff bevorzugt in Frage: C1- bis C20, insbesondere C1- bis C12-Alkylgruppen, und gesättigte oder ungesättigte, d.h. auch aromatische, C3- bis C7-Cycloalkylgruppen, die mit C1- bis C6-Alkylgruppen substituiert sein können, insbesondere Phenyl.

Die Substituenten R1' und R4' sind jeweils unabhängig voneinander insbesondere bevorzugt Methyl, Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl, sek.-Butyl, tert.-Butyl, Pentyl, Hexyl, Octyl, Decyl, Cyclohexyl, Phenyl oder Benzyl. Sie sind ganz besonders bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Butyl oder Hexyl. In Pyrrolidinium-, Piperidinium- oder Indolinium-Verbindungen sind die beiden Substituenten R1' und R4' bevorzugt unterschiedlich.

Der Substituent R2' oder R3' ist jeweils unabhänigig voneinander insbesondere Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl, sek.-Butyl, tert.-Butyl, Cyclohexyl, Phenyl oder Benzyl. Besonders bevorzugt ist R2' Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl oder sek.-Butyl. Ganz besonders bevorzugt sind R2' und R3' Wasserstoff.

Die C1-C12-Alkylgruppe ist beispielsweise Methyl, Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl, sek.-Butyl oder tert.-Butyl, ferner auch Pentyl, 1-, 2- oder 3-Methylbutyl, 1,1-, 1,2- oder 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl oder Dodecyl. Gegebenenfalls Difluormethyl, Trifluormethyl, Pentafluorethyl, Heptafluorpropyl oder Nonafluorbutyl.

Ein geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2 bis 20 C-Atomen, wobei auch mehrere Doppelbindungen vorhanden sein können, ist beispielsweise Allyl, 2- oder 3-Butenyl, Isobutenyl, sek.-Butenyl, ferner 4-Pentenyl, iso-Pentenyl, Hexenyl, Heptenyl, Octenyl, -C9H17, -C10H19 bis -C20H39; vorzugsweise Allyl, 2- oder 3-Butenyl, Isobutenyl, sek.-Butenyl, ferner bevorzugt ist 4-Pentenyl, iso-Pentenyl oder Hexenyl.

Ein geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2 bis 20 C-Atomen, wobei auch mehrere Dreifachbindungen vorhanden sein können, ist beispielsweise Ethinyl, 1- oder 2-Propinyl, 2- oder 3-Butinyl, ferner 4-Pentinyl, 3-Pentinyl, Hexinyl, Heptinyl, Octinyl, -C9H15, -C10H17 bis -C20H37, vorzugsweise Ethinyl, 1- oder 2-Propinyl, 2- oder 3-Butinyl, 4-Pentinyl, 3-Pentinyl oder Hexinyl.

Aryl-C1-C6-alkyl bedeutet beispielsweise Benzyl, Phenylethyl, Phenylpropyl, Phenylbutyl, Phenylpentyl oder Phenylhexyl, wobei sowohl der Phenylring als auch die Alkylenkette, wie zuvor beschrieben teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OH, -OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'2, -SO2NR'2, -C(O)X, -SO2OH, -SO2X, -NO2 substituiert sein können.

Unsubstituierte gesättigte oder teilweise oder vollständig ungesättigte Cycloalkylgruppen mit 3–7 C-Atomen sind daher Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclopentenyl, Cyclopenta-1,3-dienyl, Cyclohexenyl, Cyclohexa-1,3-dienyl, Cyclohexa-1,4-dienyl, Phenyl, Cycloheptenyl, Cyclohepta-1,3-dienyl, Cyclohepta-1,4-dienyl oder Cyclohepta-1,5-dienyl, welche mit C1- bis C6-Alkylgruppen substituiert sein können, wobei wiederum die Cycloalkylgruppe oder die mit C1- bis C6-Alkylgruppen substituierte Cycloalkylgruppe auch mit Halogenatomen wie F, Cl, Br oder I, insbesondere F oder Cl oder mit -OH, -OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'2, -SO2NR'2, -C(O)X, -SO2OH, -SO2X, -NO2 substituiert sein kann.

In den Substituenten R, R2 bis R13 oder R1' bis R4' können auch ein oder zwei nicht benachbarte und nicht &agr;-ständig zum Heteroatom gebundene Kohlenstoffatome, durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -SO2O-, -C(O)-, -C(O)O-, -N+R'2-, -P(O)R'O-, -C(O)NR'-, -SO2NR'-, -OP(O)R'O-, -P(O)(NR'2)NR'-, -PR'2=N- oder -P(O)R'- ersetzt werden, mit R' = nicht, teilweise oder perfluoriertes C1- bis C6-Alkyl, C3- bis C7-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl.

Ohne Einschränkung der Allgemeinheit sind Beispiele für derart modifizierte Substituenten R, R2 bis R13 und R13 bis R4':

-OCH3, -OCH(CH3)2, -CH2OCH3, -CH2-CH2-O-CH3, -C2H4OCH(CH3)2, -C2H4SC2H5, -C2H4SCH(CH3)2, -S(O)CH3, -SO2CH3, -SO2C6H5, -SO2C3H7, -SO2CH(CH3)2, -SO2CH2CF3, -CH2SO2CH3, -O-C4H8-O-C4H9, -CF3, -C2F5, -C3F7, -C4F9, -C(CF3)3, -CF2SO2CF3, -C2F4N(C2F5)C2F5, -CHF2, -CH2CF3, -C2F2H3, -C3FH6, -CH2C3F7, -C(CFH2)3, -CH2C(O)OH, -CH2C6H5, -C(O)C6H5 oder P(O)(C2H5)2.

In R' ist C3- bis C7-Cycloalkyl beispielweise Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Cycloheptyl.

In R' bedeutet substituiertes Phenyl, durch C1- bis C6-Alkyl, C1- bis C6-Alkenyl, NO2, F, Cl, Br, I, OH, C1-C6-Alkoxy, SCF3, SO2CF3, COOH, SO2X', SO2NR''2 oder SO3H substituiertes Phenyl, wobei X' F, Cl oder Br und R'' ein nicht, teilweise oder perfluoriertes C1- bis C6-Alkyl oder C3- bis C7-Cycloalkyl wie für R' definiert bedeutet, beispielsweise, o-, m- oder p-Methylphenyl, o-, m- oder p-Ethylphenyl, o-, m- oder p-Propylphenyl, o-, m- oder p-Isopropylphenyl, o-, m- oder p-tert.-Butylphenyl, o-, m- oder p-Nitrophenyl, o-, m- oder p-Hydroxyphenyl, o-, m- oder p-Methoxyphenyl, o-, m- oder p-Ethoxyphenyl, o-, m-, p-(Trifluormethyl)phenyl, o-, m-, p- (Trifluormethoxy)phenyl, o-, m-, p-(Trifluormethylsulfonyl)phenyl, o-, m- oder p-Fluorphenyl, o-, m- oder p-Chlorphenyl, o-, m- oder p-Bromphenyl, o-, m- oder p-Iodphenyl, weiter bevorzugt 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-Dimethylphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-Dihydroxyphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-Difluorphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-Dichlorphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-Dibromphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-Dimethoxyphenyl, 5-Fluor-2-methylphenyl, 3,4,5-Trimethoxyphenyl oder 2,4,5-Trimethylphenyl.

In R1' bis R4' wird als Heteroaryl ein gesättigter oder ungesättigter mono- oder bicyclischer heterocyclischer Rest mit 5 bis 13 Ringgliedern verstanden, wobei 1, 2 oder 3 N- und/oder 1 oder 2 S- oder O-Atome vorliegen können und der heterocyclische Rest ein- oder mehrfach durch C1- bis C6-Alkyl, C1- bis C6-Alkenyl, NO2, F, Cl, Br, I, OH, C1-C6-Alkoxy, SCF3, SO2CF3, COOH, SO2X', SO2NR''2 oder SO3H substituiert sein kann, wobei X' und R'' eine zuvor angegebene Bedeutung haben.

Der heterocyclische Rest ist vorzugsweise substituiertes oder unsubstituiertes 2- oder 3-Furyl, 2- oder 3-Thienyl, 1-, 2- oder 3-Pyrrolyl, 1-, 2-, 4- oder 5-Imidazolyl, 3-, 4- oder 5-Pyrazolyl, 2-, 4- oder 5-Oxazolyl, 3-, 4- oder 5-Isoxazolyl, 2-, 4- oder 5-Thiazolyl, 3-, 4- oder 5-Isothiazolyl, 2-, 3- oder 4-Pyridyl, 2-, 4-, 5- oder 6-Pyrimidinyl, weiterhin bevorzugt 1,2,3-Triazol-1-, -4- oder -5-yl, 1,2,4-Triazol-1-, -4- oder -5-yl, 1- oder 5-Tetrazolyl, 1,2,3-Oxadiazol-4- oder -5-yl 1,2,4-Oxadiazol-3- oder -5-yl, 1,3,4-Thiadiazol-2- oder -5-yl, 1,2,4-Thiadiazol-3- oder -5-yl, 1,2,3-Thiadiazol-4- oder -5-yl, 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-2N-Thiopyranyl, 2-, 3- oder 4-4H-Thiopyranyl, 3- oder 4-Pyridazinyl, Pyrazinyl, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzofuryl, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzothienyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7-1H-Indolyl, 1-, 2-, 4- oder 5-Benzimidazolyl, 1-, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzopyrazolyl, 2-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzoxazolyl, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzisoxazolyl, 2-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzthiazolyl, 2-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzisothiazolyl, 4-, 5-, 6- oder 7-Benz-2,1,3-oxadiazolyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- oder 8-Chinolinyl, 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- oder 8-Isochinolinyl, 1-, 2-, 3-, 4- oder 9-Carbazolyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- oder 9-Acridinyl, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- oder 8-Cinnolinyl, 2-, 4-, 5-, 6-, 7- oder 8-Chinazolinyl oder 1-, 2- oder 3-Pyrrolidinyl.

Unter Heteroaryl-C1-C6-alkyl wird nun in Analogie zu Aryl-C1-C6-alkyl beispielsweise Pyridinyl-methyl, Pyridinyl-ethyl, Pyridinyl-propyl, Pyridinyl-butyl, Pyridinyl-pentyl, Pyridinyl-hexyl verstanden, wobei weiterhin die zuvor beschriebenen Heterocyclen in dieser Weise mit der Alkylenkette verknüpft werden können.

HetN+ ist bevorzugt wobei die Substituenten R1' bis R4' jeweils unabhängig voneinander eine zuvor beschriebene Bedeutung haben.

Vorzugsweise handelt es sich bei den Kationen der erfindungsgemäßen ionischen Flüssigkeit um Ammonium-, Phosphonium-, Imidazolium-, Pyridinium- oder Pyrrolidinium-Kationen.

Ganz besonders bevorzugt werden Ammonium-, Phosphonium-, Imidazolium-, Pyridinium- oder Pyrrolidiniumtrifluormethylsulfonylimide, oder Ammonium- oder Phosphoniumtris(pentafluorethyl)trifluorophosphate zur Extraktion in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt, wobei Trihexyl(tetradecyl)-phosphonium-hexafluorophosphat, Trihexyl(tetradecyl)-phosphonium-chlorid, Trihexyl(tetradecyl)-phosphonium-tetrafluorborat, N-(3-Hydroxypropyl)-N-methylpyrrolidinium-bis-(trifluormethylsulfonyl)imid, N-(Ethoxymethyl)-N-methylpyrrolidinium-bis-(trifluormethylsulfonyl)imid, N-(2-Methoxyethyl)-N-methylpyrrolidinium-bis-(trifluormethylsulfonyl)imid, N-(2-Methoxyethy)pyridinium-bis-(trifluormethylsulfonyl)imid, N-Ethyl-4-(N,N-dimethylammonium)pyridinium-bis-(trifluormethylsulfonyl)imid, N-Butyl-4-(N,N-dimethylammonium)pyridinium-bis-(trifluormethylsulfonyl)imid, N-Hexyl-4-(N,N-dimethylammonium)pyridinium-bis-(trifluormethylsulfonyl)imid, 1-(3-Hydroxypropyl)-3-methyl-imidazolium-bis-(trifluormethylsulfonyl)imid, 1-(Ethoxymethyl)-3-methyl-imidazolium-bis-(trifluormethylsulfonyl)imid, 1-(2-Methoxyethyl)-3-methyl-imidazolium-bis-(trifluormethylsulfonyl)imid, 1-(2-Ethoxyethyl)-3-methyl-imidazolium-bis-(trifluormethylsulfonyl)imid, Tetrabutyl-ammonium-bis-(trifluormethylsulfonyl)imid, Tetra-ethyl-ammonium-bis-(trifluormethylsulfonyl)imid, Trihexyl(tetradecyl)ammonium-trifluormethylsulfonylimid, Methyl-trioctyl-ammonium-bis-(trifluormethylsulfonyl)imid, (Ethoxymethyl)ethyldimethylammonium-bis-(trifluormethylsuifonyl)imid, (2-Ethoxymethyl)ethyldimethylammonium-bis-(trifluormethylsulfonyl)imid, (2-Ethoxyethyl)ethyldiethylammonium-bis-(trifluormethylsulfonyl)imid, Ehyldimethylpropylammonium-bis-(trifluormethylsulfonyl)imid, Trihexyl(tetradecyl)-phosphonium-bis(trifluormethylsulfonyl)imid, Trihexyl(tetradecyl)-phosphonium-tris(pentafluorethyl)trifluorphosphat, Tetrabutyl-phosphonium-tris(pentafluorethyl)trifluorphosphat, Tetra-methyl-ammonium-tris(pentafluorethyl)trifluorphosphat, Tetra-ethyl-ammonium-tris(pentafluorethyl)trifluorphosphat oder Tetra-butyl-ammonium-tris(pentafluorethyl)trifluorphosphat, und besonders bevorzugt N-(3-Hydroxypropyl)-N-methylpyrrolidinium-bis-(trifluormethylsulfonyl)imid, N-(Ethoxymethyl)-N-methylpyrrolidinium-bis-(trifluormethylsulfonyl)imid, Trihexyl(tetradecyl)ammoniumtrifluormethylsulfonylimid, Trihexyl(tetradecyl)phosphoniumtrifluormethylsulfonylimid oder Tetra-butyl-ammonium-tris(pentafluorethyl)trifluorphosphat, besonders gute Ergebnisse bei den erfindungsgemäßen Verfahren liefern.

Die erfindungsgemäßen Verfahren können bei Temperaturen von 0 bis 95°C erfolgen, vorzugsweise bei 55 bis 65°C und ganz besonders bevorzugt bei 60°C. Bei den bevorzugten Temperaturen wird eine verbesserte Extraktion in relativ kurzer Zeit beobachtet. Zur schonenden Extraktion, insbesondere von empfindlicheren Proteinen, Proteinfragmenten und/oder Peptiden empfiehlt sich die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei tieferen Temperaturen innerhalb des angegebenen Temperaturintervalls, unter Berücksichtigung einer dafür erforderlichen längeren Extraktionszeit.

Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich zur Extraktion von Proteinen, Proteinfragmenten und/oder Peptiden aus biologischen Proben unter Erhalt der zellularen Grundstruktur der Proben. Darüber hinaus ist aber auch die Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren auf entsprechend vorbehandelte Proben denkbar, bei denen z.B. die zellulare Grundstruktur vor Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren zerstört wurde. Diese Vorbehandlung kann auf alle dem Fachmann bekannten Arten erfolgen, z.B. durch manuelle Homogenisierung oder durch Vortexing.

Die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Extrakte enthalten Proteine, Proteinfragmente und/oder Peptide. Diese eignen sich für alle dem Fachmann bekannten Arten von Proteinanalytik, z.B. Elektrophorese (z.B. 2-dimensionale Gelelektrophorese), immunchemische Nachweismethoden (z.B. Western Blot Analyse, ELISA, RIA), Protein-Arrays (z.B planare und beadbasierende Systeme), Massenspektrometrie (z.B. Maldi, Esi und Seldi) sowie alle biochromatographischen Trennverfahren (IEX, SEC, HIC und Affinitätschromatographie).

Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur Extraktion von Proteinen, Proteinfragmenten und/oder Peptiden mit einem der vorab beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren, umfassend mindestens eine Ionische Flüssigkeit. Der erfindungsgemäße Kit kann eine oder mehrere Ionische Flüssigkeiten umfassen. Enthält der Kit mehrere Ionische Flüssigkeiten, so können diese getrennt oder zusammen als Mischung vorliegen. Vorzugsweise sind die oben genannten und besonders bevorzugten Ionischen Flüssigkeiten im Kit enthalten.

Darüber hinaus kann der Kit in einer weiteren Ausführungsform zusätzlich mindestens eines zur Fällung von Proteinen, Proteinfragmenten und/oder Peptiden geeigneten Reagenzes enthalten, wobei das Reagenz aus allen dem Fachmann bekannten Fällungsreagenzien ausgewählt sein kann, z.B. Trichloressigsäure.

Mit dem erfindungsgemäßen Kit wird es dem Anwender ermöglicht, Proteine aus biologischen Proben auf einfache Weise zu extrahieren und gegebenenfalls auch für die Anwendung in der weiteren Analytik auszufällen.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Kits zur Extraktion von Proteinen, Proteinfragmenten und/oder Peptiden aus biologischen Proben ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, dass ein Fachmann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeiner Weise limitierende Offenbarung aufzufassen.

Beispiel 1

1 g einer mit Formalin fixierten Gewebeprobe (z.B. Lunge, Herz, Niere, Leber, Milz) wird mehrmals mit 10 ml isotonischer Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und mit einem Skalpell zerkleinert. 0.1 g der zerkleinerten Probe werden mit 60 &mgr;l Trihexyl(tetradecyl)phosphoniumtrifluormethylsulfonylimid vermischt und über einen Zeitraum von zwei Stunden in einem Rotationsmischer bei 60°C inkubiert. Die überstehende Lösung wird abgetrennt und kann zur weiteren Analytik der darin enthaltenen Proteine eingesetzt werden.

Proteinanalytik

Mit dem in Beispiel 1 erhaltenen Extrakt wird eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wie folgt durchgeführt: 3 &mgr;l des Proteinextraktes werden mit 16 &mgr;l SDS Probenauftragspuffer (3M Tris pH 8.5, Glyzerin 24 % (v/v), Natriumdodecylsulfat 8% (w/v), 2-Mercaptoethanol 2%, Bromphenolblau 0.1 % (w/v)) vermischt und 5 Minuten bei 95°C inkubiert. Nach Zentrifugation bei 10000xg wird die Probe auf ein 10% SDS Page aufgetragen und 90 Minuten bei 120 Volt aufgetrennt.

Zur Identifizierung der extrahierten Proteine wird ein Westernblot des Gels unter Verwendung von Antikörpern, beispielsweise gegen das Membranprotein Calnexin (90 kDa, Anti-Calnexin, C-terminal, 1:2000, Calbiochem Cat.No: 208880) durchgeführt. In der Westernblot-Analyse wird Calnexin in seiner nativen molekularen Größe identifiziert.

Insgesamt zeigt sich, dass sich die erfindungsgemäßen Verfahren in vorteilhafter Weise zur Extraktion von Proteinen aus biologischen Proben eignen.


Anspruch[de]
Verfahren zur Extraktion von Proteinen, Proteinfragmenten und/oder Peptiden aus biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass als Extraktionsmittel Ionische Flüssigkeiten der allgemeinen Formel K+A eingesetzt werden. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den biologischen Proben um Gewebe, Zellen, Zellkulturen und/oder Körperflüssigkeiten handelt. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Proben fixiert sind. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Proben mit Formalin fixiert sind. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Anionen A der Ionischen Flüssigkeit ausgewählt sind aus der Gruppe der Imide der allgemeinen Formel [N(Rf)2] wobei Rf teilweise oder vollständig mit Fluor substituiertes Alkyl mit 1 bis 8 C-Atomen oder Rf2X bedeutet, wobei Rf2 teilweise oder vollständig mit Fluor substituiertes Alkyl mit 1 bis 8 C-Atomen und X SO2 oder CO bedeutet, aus der Gruppe der Fluoralkylphosphate der allgemeinen Formel [PFx(CyF2y+1–zHz)6–x] mit 1 ≤ x < 6, 1 ≤ y ≤ 8 und 0 ≤ z ≤ 2y + 1 oder aus Mischungen hieraus. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kationen K+ der Ionischen Flüssigkeit ausgewählt sind aus der Gruppe der Ammonium-, Phosphonium, Uronium-, Thiouronium-, Guanidiniumkationen oder heterocyclischen Kationen. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion bei Temperaturen von 0 bis 95°C erfolgt. Kit zur Extraktion von Proteinen, Proteinfragmenten und/oder Peptiden nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend mindestens eine Ionische Flüssigkeit. Kit gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich mindestens eines zur Fällung von Proteinen, Proteinfragmenten und/oder Peptiden geeigneten Reagenzes enthält. Kit gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine zur Fällung von Proteinen, Proteinfragmenten und/oder Peptiden geeignete Reagenz Trichloressigsäure ist. Verwendung eines Kits gemäß Anspruch 8 bis 10 zur Extraktion von Proteinen, Proteinfragmenten und/oder Peptiden aus biologischen Proben.






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