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Dokumentenidentifikation DE69636440T2 21.12.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001090985
Titel IL-2 unabhängige T-Zellen der Katze
Anmelder The Regents of the University of California, Oakland, Calif., US;
University of Florida Research Foundation, Inc., Gainesville, Fla., US
Erfinder Yamamoto, Janet K., Gainesville, Florida 32608, US
Vertreter Barz, P., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat., Pat.-Anw., 80803 München
DE-Aktenzeichen 69636440
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 23.08.1996
EP-Aktenzeichen 001110790
EP-Offenlegungsdatum 11.04.2001
EP date of grant 09.08.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 21.12.2006
IPC-Hauptklasse C12N 5/06(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 5/10(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   
IPC additional class A61K 39/21  (2006.01)  A,  L,  N,  20051017,  B,  H,  EP
G01N 33/68  (2006.01)  A,  L,  N,  20051017,  B,  H,  EP

Beschreibung[de]
Hintergrund der Erfindung

Bei Hauskatzen treten Infektionen durch mehrere Retroviren auf, einschließlich felines Leukämie-Virus (FeLV), felines Sarcoma-Virus (FeSV), endogenes Typ C-Oncoronavirus (RD-114) und felines Syncytia-bildendes Virus (FeSFV). Darunter stellt FeLV das wichtigste Pathogen dar, das verschiedene Symptome hervorruft, einschließlich lymphoretikuläre und myeloide Neoplasmen, Anämien, immunvermittelte Störungen und ein Immunschwächesyndrom, das Ähnlichkeiten mit dem humanen erworbenen Immunschwächesyndrom (AIDS) aufweist. Kürzlich wurde eine spezielle replikationsdefektive FeLV-Mutante mit der Bezeichnung FeLV-AIDS in spezieller Weise mit immunosuppressiven Eigenschaften in Verbindung gebracht.

Über die Entdeckung des felinen T-lymphotropen Lentivirus (jetzt als feliner Immunschwächevirus, FIV, bezeichnet) berichteten zunächst Pedersen et al. (1987). Über die Eigenschaften von FIV berichteten Yamamoto et al. (1988a); Yamamoto et al. (1988b); und Ackley et al. (1990). Seroepidemiologische Daten haben gezeigt, dass FIV-Infektionen bei Hauskatzen und Wildkatzen in der gesamten Welt angeboren sind. Eine große Vielzahl von Symptomen tritt bei Infektionen mit FIV auf, einschließlich Abort, Alopezie, Anämie, Konjunktivitis, chronische Rhinitis, Enteritis, Gingivitis, Hämatochezie, neurologische Abnormalitäten, Periodontitis und seborrhoische Dermatitis. Das immunologische Kennzeichen von Hauskatzen, die mit FIV infiziert sind, ist eine chronische und progressive Verarmung an felinen peripheren CD4+-Blutlymphozyten, eine Verringerung des CD4:CD8-Zellverhältnisses und in einigen Fällen eine Zunahme von CD8 aufweisenden Lymphozyten. Auf der Grundlage der molekularen, biochemischen und immunopathologischen Eigenschaften wird eine FIV-Infektion von Katzen nunmehr als ein AIDS-Katzenmodell angesehen, das besser ist als FeLV-FAIDS.

Über eine Klonierung und Sequenzanalyse von FIV berichten Olmsted et al. (1989a); Olmsted et al. (1989b); und Talbott et al. (1989). Hosie und Jarret (1990) beschreiben die serologische Reaktion von mit FIV infizierten Katzen. FIV-Virus-Subtypen lassen sich entsprechend dem Immunotyp auf der Grundlage der Konzentration an kreuzneutralisierenden Antikörpern, die durch jeden Stamm hervorgerufen werden, klassifizieren (Murphy und Kingsbury, 1990). Neuerdings werden Viren in Subtypen gemäß dem Genotyp auf der Grundlage der Nucleotidsequenzhomologie klassifiziert. Obgleich die HIV- und FIV-Subtypisierung auf dem Genotyp beruht (Sodora et al., 1994; Rigby et al., 1993; und Louwagie et al., 1993), ist wenig über den Zusammenhang zwischen dem Genotyp und dem Immunotyp von Subtypen bekannt. Virale FIV-Isolate werden derzeit in vier FIV-Subtypen eingeteilt: A, B, C und D (Kakinuma et al., 1995). Infektiöse Isolate und infektiöse molekulare Klone wurden für sämtliche FIV-Subtypen beschrieben, ausgenommen der Subtyp C (Sodora et al., 1994). Der Subtyp C-FIV wurde nur aus zellulärer DNA von Katzen aus Kanada identifiziert (Sodora et al.; Rigby et al., 1993; Kakinuma et al., 1995).

Zahlreiche FIV-Isolate wurden in der Literatur beschrieben und sind dem Fachmann geläufig. FIVPet ist in US-A-5 037 753 beschrieben. Weitere FIV-Isolate, die beschrieben wurden, lassen sich vom Fachmann unter Anwendung üblicher Techniken leicht aus infizierten Katzen isolieren. Verfahren zum Isolieren und Züchten von FIV werden in US-A-5 037 753 und US-A-5 118 602 beschrieben.

WO-93/01278 führt aus, dass FeT1M-Zellen (feline, gemischte frische PBLs) mit FIVPet infiziert werden und für ihr Wachstum Interleukin-2 benötigen. WO-93/01278 beschreibt ferner die Entwicklung und die Charakterisierung der IL-2-unabhängigen, FIV-erzeugenden Zelllinien FL-4 und FL-6. Diese Zelllinien weisen die charakteristischen Oberflächenantigene von T-Zellen auf und erzeugen FIVPet. Die FIV-infizierten FeT-1 und FL-4-Zellen sind dazu in der Lage, FIV-belastete Katzen zu schützen. US-A-5 275 813 und Yamamoto et al. (1991) beschreiben ebenfalls diese Zelllinien.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue feline Zelllinien, die gegenüber einer Infektion durch vielfältige FIV-Subtypen empfindlich sind. Die Zelllinien eignen sich zur Vermehrung und Erzeugung von vielfältigen FIV-Subtypen sowie zur Verwendung in FIV-Vaccinen. Ferner können die Zelllinien anstelle von felinen peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC) bei FIV-Virus-Neutralisationstests von felinen Antiseren verwendet werden.

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine nicht-infizierte, IL-2-unabhängige, von Katzen abgeleitete T-Zelllinie. Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung einer FIV-infizierten Katzen-T-Zelllinie, das die Infektion einer T-Zelle aus einer T-Zelllinie umfasst.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die hier beschriebene FeT-J-Zelllinie stellt ein Beispiel für die Erfindung dar. Die erfindungsgemäßen Zelllinien können zelluläre Produkte erzeugen, die unter Anwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren isoliert und nachgewiesen werden können. Antikörper gegen die Zelllinien können ebenfalls unter Anwendung bekannter Verfahren erzeugt werden.

Die nicht mit FIV infizierten Zelllinien mit den Bezeichnungen FeT-1C (ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11968) und FeT-J (ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11967) wurden beide bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 24. August 1995 hinterlegt. Mit FIVBang (ATCC-Hinterlegungsnummer 11975) und mit FIVShi (ATCC-Hinterlegungsnummer 11976) infizierte Zelllinien wurden bei der American Type Culture Collection am 25. August 1995 hinterlegt.

Die FeT-1C-Zelllinie ist von IL-2 abhängig, während die FeT-J-Zelllinie von IL-2 unabhängig ist. Die letztgenannte Zelllinie dient zur Erläuterung der Erfindung. Sie eignet sich zur Bereitstellung eines Trägers für die FIV-Immunisierung von Katzen sowie zur in vitro-Vermehrung und -Erzeugung von viralen FIV-Stämmen. Sowohl die IL-2-abhängige nicht-infizierte Zelllinie FeT-1C als auch die IL-2-unabhängige, nicht-infizierte FeT-J-Zelllinie wurden 20 Mal auf ihre reverse Transcriptase (RT)-Aktivität in Kulturflüssigkeiten und durch PCR auf die FIV-provirale Sequenz getestet. Dabei wurden sie als negativ in bezug auf FIV befunden. Die FeT-J-Zelllinie war hochgradig mit sämtlichen getesteten FIV-Stämmen infizierbar, einschließlich FIVShi, FIVDix, FIVUK8, FIVPet und FIVBang, war aber schwieriger direkt mit FIVShi zu infizieren.

Virus-neutralisierende (VN) Antikörper in einer Probe können analysiert werden, indem man die erfindungsgemäßen nicht-infizierten Zelllinien verwendet. Im Gegensatz zu PBMC, die nach einer begrenzten Anzahl von Passagen absterben und sich nicht so leicht wie FeT-J-Zellen vermehren, ist die FeT-J-Zelllinie etabliert und lässt sich zur zukünftigen Verwendung leicht durch Einfrieren konservieren.

Materialien und Methoden

Zellkulturen. Sämtliche Suspensionszelllinien wurden in RPMI 1640 mit einem Gehalt an 10 % wärmeinaktiviertem, fötalem Kälberserum (FCS) gezüchtet. 10 mM HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure), 2 mM L-Glutamin, 50 &mgr;g/ml Gentamicin und 5 × 10–5 M 2-Mercaptoethanol. IL-2-abhängige Zellen wurden mit 100 U/ml rekombinantem humanem IL-2 (Cetus Corporation, Emeryville, Kalifornien) ergänzt. Die Suspensionszellen wurden einer Passage in einer Zellkonzentration von 0,5–4 × 106 Zellen/ml unterzogen und erneut 2-mal wöchentlich in frischem Kulturmedium gezüchtet. Sämtliche Monolayer-Zellen wurden 2-mal wöchentlich einer Passage bei einer anfänglichen Zellkonzentration von 2 × 106 Zellen/ml unterzogen. Die Gewebekulturflüssigkeiten (TCF) von FIV-infizierten Zellen wurden 2-mal wöchentlich geerntet, zur Entfernung von restlichen Zellen 1 Stunde mit 3 000 U/min zentrifugiert und bei –20 °C oder bei –70 °C für die TCF, die für eine sofortige Verwendung beim Test vorgesehen waren, aufbewahrt. FIV-empfindliche Zellen (1 × 106 Zellen/ml) wurden mit FIV mit einer Aktivität an reverser Transkriptase (RT) von etwa 30 000 cpm/ml infiziert.

FIV-Reinigung. Gewebekulturflüssigkeiten von FIV-infizierten Zelllinien wurden zur Entfernung von Zellen individuell 1 Stunde mit 2 000 bis 3 000 U/min zentrifugiert. Virus in TCF wurde durch 2-stündige Ultrazentrifugation mit 16 000 U/min pelletisiert und durch Ultrazentrifugation zunächst mit einem 10/50 % (Gew./Vol.) diskontinuierlichen Saccharosegradienten und anschließend mit einem 10/50 % kontinuierlichen Saccharosegradienten gereinigt (Pederson et al., 1987; Yamamoto et al., 1988). Die einzelnen viralen Isolate wurden 18 Stunden mit 1,25 sterilem Paraformaldehyd (0,22 &mgr;m steril filtriert) inaktiviert und anschließend gründlich gegen sterile PBS dialysiert. Die inaktivierten Viren wurden mit steriler PBS auf eine Konzentration von 500 &mgr;g/ml verdünnt. 250 &mgr;g/0,5 ml der einzelnen Stämme wurden in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und bei –70 °C aufbewahrt. Die inaktivierten FIV-Stämme wurden auf Raumtemperatur aufgetaut. 250 &mgr;g inaktiviertes Virus in 0,5 ml steriler PBS wurde unmittelbar vor der Immunisierung mit 0,5 ml Adjuvans vereinigt. FIV-infizierte Zelllinien wurden getrennt 18 Stunden mit 1,25 % sterilem Paraformaldehyd inaktiviert, 3-mal mit steriler PBS gewaschen, in frischer steriler PBS in einer Konzentration von etwa 5,0 × 107 Zellen/ml in sterilen Röhrchen resuspendiert und bei 4 °C aufbewahrt. Typischerweise wurden etwa 2,5 × 107 inaktivierte, infizierte Zellen in 0,5 ml steriler PBS mit 0,5 ml Adjuvans unmittelbar vor der Immunisierung vereinigt. 250 &mgr;g/0,5 ml Threonylmuramyl-dipeptid (MDP MF75.2 Adjuvans; Chiron Corporation, Emeryville, CA) wurde als Adjuvans verwendet.

Test auf reverse Transcriptase (RT)

Die Anwesenheit von RNA-abhängiger DNA-Polymerase (RT) wurde in Zellkulturüberständen im wesentlichen gemäß den Angaben von Rey et al. getestet. Beim RT-Test zum Nachweis von FIV wurden Poly(RA)-oligo(dT12-18) als exogener Matrizenprimer, vier verschiedene Desoxyribonucleotid-triphosphate, 20 mM KCI mit Mg++ als zweiwertigem Kation und 5 &mgr;Ci [3H]-markiertes Thymidintriphosphat (TTP) pro Probe verwendet. 5 &mgr;Ci [3H]-TTP ergaben ein mittleres Gesamtzählergebnis von 1 200 000 cpm unter Verwendung eines Szintillationsflüssigkeitsgemisches (1 Teil Xylol auf 9 Teile biologisch abbaubare Flüssigkeit für die Szintillationszählung der Research Products International) an einem Beckman LS250-Szintillationszähler (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA). Als Ergebnis wurden RT-Werte unter 1 200 000 cpm/ml festgestellt.

Die RT-Werte für FIVBang und FIVShi nach ihrer Verwendung zur Infektion von FeT-IC und FeT-J-Zelllinien sind in 1 dargestellt. Das folgende Beispiel dient zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1 – FIV-infizierte Zelllinien

Eine neue, von Interleukin-2 (IL-2) abhängige, feline T-Zelllinie mit der Bezeichnung FeT-1 C, bei der es sich um eine Mutterlinie eines IL 2-abhängigen FeT-1M Klons handelt, wurde zur Bereitstellung von individuellen Zelllinien, die chronisch mit FIVPet, FIVDix, FIVUK8, FIVBang, FIVAom2 oder FIVShi infiziert waren, verwendet. Der FeT1M-Klon (auch als FIV-FeT1M bezeichnet) ist im US-Patent 5 275 813 (durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) beschrieben. Er wurde zur Herstellung einer IL-2-unabhängigen Zelllinie, nämlich FL-4 (ebenfalls im US-Patent 5 275 813 beschrieben), verwendet, die chronisch FIVPet bildet. Die FeT-1C-Zelllinie ist hochgradig mit verschiedenen Isolaten von FIV-Subtypen A, B und D infizierbar. Eine Langzeitpassage der FeT-1C-Zelllinie verringert deren Infizierbarkeit, insbesondere beim FIV-Subtyp D. Daher soll zur Erzielung optimaler FIV-Infektionsraten oder für die Verwendung bei VN-Tests die Anzahl der Passagen weniger als etwa 35 betragen. Eine halbquantitative PCR und Viruskern-Antigenanalysen zeigten, dass sämtliche mit FIV belasteten Zelllinien signifikant mit individuellen FIV-Stämmen infiziert waren.

Eine IL-2-unabhängige feline Zelllinie, die gegenüber einer FIV-Infektion empfindlich ist, wurde ebenfalls aus FeT-1C-Zellen entwickelt. Diese Zelllinie mit der Bezeichnung FeT-J kann mit FIV durch gemeinsame Züchtung unter Verwendung von FIV-infizierten Medien oder Zellen infiziert werden. Beispielsweise wurde eine FIVBang-infizierte Fet-1C-Zelllinie in Abwesenheit von IL-2 gemeinsam mit nicht-infizierten FeT-J-Zellen gezüchtet, um eine IL-2-unabhängige FIVBang-infizierte FeT-J-Zelllinie (mit der Bezeichnung Bang/FeT-J) bereitzustellen. Beim Infektionsverfahren unter gemeinsamer Züchtung wurden Bang/FeT-1C-Zellen mit nicht-infizierten FeT-J-Zellen in einem Verhältnis von etwa 2:1 bis etwa 10:1 (infiziert:nicht-infiziert) vereinigt. Das Zellgemisch wurde im Medium in Abwesenheit von IL-2 mehrere Tage gezüchtet. Man ließ die Fet-1C-Zellen absterben. Die verbleibenden Zellen bestanden aus FIVBang-infizierten FeT-J-Zellen. Somit können FIV-infizierte FeT-1C-Zellen zur Infektion von FeT-J-Zellen und zur Bereitstellung von IL-2-unabhängigen FeT-J-Zelllinien, die mit verschiedenen FIV-Subtypen infiziert sind, verwendet werden. Das Verfahren zur gemeinsamen Züchtung mit FIV-infizierten FeT-1C-Zellen führte zu IL-2-unabhängigen FeT-J-Zelllinien, die mäßige bis hohe Konzentrationen an verschiedenen FIV-Subtypen erzeugen.

Die FeT-1C-Zelllinie wurde auch mit FIVShi infiziert und einer ausgedehnten Passagierung zur Erzeugung einer IL-2-abhängigen Zelllinie mit der Bezeichnung Shi/FeT-1C unterzogen. Die Shi/FeT-1C-Zelllinie wurde später gemeinsam mit FeT-J in Abwesenheit von IL-2 gezüchtet. Die erhaltene IL-2-unabhängige FIVShi-infizierte Zelllinie erhielt die Bezeichnung Shi/FeT-J. Die IL-2-unabhängige Shi/FeT-J-Zelllinie erzeugt höhere Konzentrationen an FIVShi als die IL-2-abhängige Shi/FeT-1C-Zelllinie (1).

Die Entwicklung einer FeT-J-Zelllinie, die mit FIVBang infiziert ist, wurde auch ohne die Verwendung der FeT-1C-Zelllinie durchgeführt. Die FeT-J-Zelllinie wurde direkt mit zellfreiem FIVBang-Inokulum infiziert und eingehend mit IL-2 passagiert. Die erhaltene IL-2-unabhängige FIVBang-Erzeuger-Zelllinie erhielt die Bezeichnung Bang/FeT-J. Die Bang/FeT-J-Zelllinie erzeugte höhere Konzentrationen an FIVBangals die IL-2-abhängige Bang/FeT-1C-Zelllinie, die durch Infektion der FeT-1C-Zelllinie mit FIVBang entwickelt wurde (1).

Literaturverzeichnis

  • Pedersen et al (1987) Science 235:790–793.
  • Yamamoto et al (1988a) Leukemia, December Supplement 2:2045–215S
  • Yamamoto et al (1988b) Am. J. Vet. Res. 49:1246–1258.
  • Ackley et al (1990) J. Virol. 64:5652–5655.
  • Olmsted et al (1989a) Proc. Nat. Acad. Sci. 86:2448–2452.
  • Olmsted et al (1989b) Proc. Nat. Acad. Sci. 86:8088–8092.
  • Talbott et al (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:5743–5747.
  • Hosie and Jarrett (1990) AIDS 4:215–220.
  • Sodora et al (1994) J. Virol. 68:2230–2238.
  • Rigby et al (1993) J. Gen. Virol. 74:425–436.
  • Kakinuma et al (1995) J. Virology 69(6):3639–3646.
  • Murphy and Kingsbury (1990) "Virus Taxonomy", In Fields Virology, 2nd Ed., B.N. Fields, D.M. Knipe et al eds, Raven Press, New York, Chapter 2, pp. 9–36.
  • Louwagie et al (1993) AIDS 7:769–780.
  • Rey et al (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 21:1247–1253.


Anspruch[de]
Nicht-infizierte, IL-2-unabhängige, von Katzen abgeleitete T-Zelllinie. Zelllinie nach Anspruch 1 mit den identifizierenden Eigenschaften der Zelllinie mit der Bezeichnung FeT-J, die unter der ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11967 hinterlegt worden ist. Zelllinie nach Anspruch 1 mit der Bezeichnung FeT-J, die unter der ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11967 hinterlegt worden ist. Verfahren zur Herstellung einer FIV-infizierten Katzen-T-Zelllinie, das die Infektion einer T-Zelle aus einer T-Zelllinie gemäß einem der vorstehenden Ansprüche mit einem FIV umfasst. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das FIV den Untertyp A, B, C oder D aufweist. Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich beim FIV um einen Stamm handelt, der aus FIVDix, FIVUK8, FIVBang, FIVAom1, FIVAom2, FIVPet und FIVShi ausgewählt ist. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Zelle mit zwei oder mehr verschiedenen Stämmen von FIV infiziert wird. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die FIV-Stämme aus FIVDix, FIVUK8, FIVBang, FIVAom1, FIVAom2, FIVPet und FIVShi ausgewählt ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, wobei die FIV-infizierte Zelle ein FIV-Protein exprimiert. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das FIV-Protein ein FIV-Hüllglycoprotein oder ein Fragment davon umfasst. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das FIV-Hüllglycoprotein die in SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 2 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das FIV-Protein durch FIVenv, FIVgag/pro oder FIVenv-gag/pro kodiert wird. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Zelle mit dem FIV-Virusstamm FIVBang infiziert wird. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die FIV-infizierte Zelllinie die identifizierenden Eigenschaften der Zelllinie mit der Bezeichnung Bang/FeT-J aufweist und unter der ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11975 hinterlegt worden ist. Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei der FIV-infizierten Zelllinie um die Zelllinie mit der Bezeichnung Bang/FeT-J handelt, die unter der ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11975 hinterlegt worden ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 15, das zusätzlich die Inaktivierung des FIV, das die FIV-infizierte Zelle infiziert, umfasst. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 15, das zusätzlich die Abschwächung des FIV, das die FIV-infizierte Zelle infiziert, umfasst. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei die Inaktivierung oder Abschwächung die Einwirkung von Paraformaldehyd, Formalin, Phenol, UV-Licht oder erhöhten Temperaturen auf die FIV-infizierte Zelle umfasst.






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