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Dokumentenidentifikation DE69833629T2 21.12.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000882788
Titel Verfahren zur Trennung von Blutbestandteilen oder aus Blutplättchen, Mikropartikel aus einem diese enthaltenden Muster
Anmelder Biocytex, Marseille, FR
Erfinder Besson-Faure, Isabelle, 13001 Marseille, FR;
Poncelet, Philippe, 13010 Marseille, FR
Vertreter Samson & Partner, Patentanwälte, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69833629
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, IE, IT, LI, NL, SE
Sprache des Dokument FR
EP-Anmeldetag 08.06.1998
EP-Aktenzeichen 984013615
EP-Offenlegungsdatum 09.12.1998
EP date of grant 01.03.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 21.12.2006
IPC-Hauptklasse C12N 5/06(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 5/08(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft die Abtrennung von Blutplättchen oder Mikropartikeln Blutplättchen-Ursprungs aus einer sie enthaltenden biologischen Probenahme.

Die Erfindung ist sowohl auf Blutplättchen als auch auf Mikropartikel Blutplättchen-Ursprungs anwendbar. Unter Mikropartikel Blutplättchen-Ursprungs versteht man eine Untereinheit oder Vesikulation der Zelle, die durch jedwede mechanische oder andere Behandlung erhalten wurde oder sich aus einem Zustand der Zellaktivierung oder einem besonderen pathophysiologischen Zustand, wie zum Beispiel der Apoptose oder der Zell- oder Blutplättchenlyse, ergibt.

In der nachfolgenden Beschreibung wird der Ausdruck "Zellen" verwendet, um unterschiedslos, außer bei gegenteiliger Angabe, die unterschiedlichen Produkte zu bezeichnen, die man abzutrennen wünscht, insbesondere Blutplättchen und Mikropartikel Blutplättchen-Ursprungs.

Die vorliegende Erfindung hat zum speziellen Ziel, von einer Probe die Moleküle, die an Zellen gebunden sind, von den gleichen ungebundenen Molekülen abzutrennen, die in der flüssigen Phase, insbesondere in löslicher Form, vorliegen. Diese Moleküle können zum Beispiel Zellmarker oder an der Oberfläche der Zellen gebundene Elemente, wie Antikörper, oder Liganden sein. In bestimmten Fällen kann es von Interesse sein, gleichzeitig das an Zellen gebundene Element und das ungebundene Element, das in der flüssigen Phase, insbesondere in löslicher Form, vorliegt, oder auch das Verhältnis zwischen beiden quantitativ zu bestimmen.

Führt man quantitative Bestimmungen von Zellmarkern in Blutproben durch, ist es erforderlich, die Zellen des Mediums, welche diese Marker tragen, von den gleichen Markern, die im löslichen Zustand vorliegen und somit die späteren quantitativen Bestimmungen verfälschen können, abzutrennen.

Das geläufigste Verfahren zur Abtrennung der Zellen besteht darin, die Probe nach einer eventuellen Vorbehandlung zu zentrifugieren.

Man erhält auf diese Weise ein Pellet, das die Zellen enthält und an dem die gebundenen Moleküle haften, während die ungebundenen Moleküle in einem Überstand bleiben (der durch jedwede Methode, insbesondere durch Absaugen/Dekantieren, entfernt werden kann).

Dennoch neigt das Zellpellet bei der Zentrifugation dazu, ungebundene Moleküle gefangen zu halten. Es ist somit zur Durchführung von Waschungen, um die Restkonzentration an ungebundenen Molekülen signifikant zu senken, erforderlich, das Pellet mehrfach wieder zu suspendieren. Es ist somit auf charakteristische Weise erforderlich, mindestens drei Waschungen mit einer 1:10-Verdünnung bei jedem Schritt durchzuführen (100 &mgr;l Rückstand auf 1 ml verdünnt), um die Restkonzentration an ungebundenen Molekülen um 3 log (1000-fach) zu senken.

Diese wiederholten Zentrifugationen haben natürlich zahlreiche Nachteile, darunter:

  • • einen Verlust an Zellen;
  • • eine Schwächung der Zellen;
  • • eine Bildung von Aggregaten zwischen den Zellen, die manchmal schwer rückgängig zu machen ist. Es handelt sich besonders um die Zellen, die besonders dazu neigen, aneinander zu haften, und insbesondere um die Blutplättchen;
  • • die Länge des Verfahrens und die Schwere der Bearbeitung. In der Tat erfordern drei Waschungen, selbst bei kurzer Zentrifugation (5 Min), insgesamt fast 30 Min Behandlung;
  • • die Bindungen sind instabil; Bindungen vom Typ Ligand/Rezeptor, Antikörper/Antigen, Enzym/Substrat sind reversibel und die Dissoziation der gebundenen Moleküle ist um so deutlicher, je länger die Waschzeit ist. Lange Waschzeiten stellen demnach einen um so deutlicheren Mangel des Verfahrens dar, je schwächer die Affinität des Verbindungspaares ist (schnelle Dissoziationsgeschwindigkeit). In diesem Fall ist es unerlässlich,

    – die Waschzeit zu verkürzen;

    – das Volumen der flüssigen Restphase, die in Kontakt mit den an die Zellen gebundenen Molekülen steht, zu verringern, was aber gleichermaßen die Wirksamkeit des Waschens verringert.
  • • schließlich bemerkt man im Fall von Bearbeitungen von infektiösen Materialien die Bildung von Aerosolen, die man natürlich, wenn möglich, zu vermeiden wünscht.

Im speziellen Fall der Blutplättchen führen die wiederholten Zentrifugationen neben den vorstehend genannten Problemen zu einer Aggregation und Aktivierung, die für die späteren quantitativen Bestimmungen immer sehr schädlich sind und auf jeden Fall die biologischen Eigenschaften der Blutplättchen nach den verschiedenen Zentrifugationsschritten verändern.

Deshalb hat man seit langem versucht, an dem bekannten Verfahren Veränderungen vorzunehmen, um einige der vorstehend genannten Nachteile zu beheben.

Es wurde insbesondere vorgeschlagen, Zentrifugationen auf Serumkissen durchzuführen, die für die Zellen weniger belastend, aber natürlich sehr viel teurer und vor allem schwieriger durchzuführen sind, weshalb diese Art von Verfahren nur wenig angewandt wurde.

Es wurden ebenfalls Zentrifugationen durch eine hydrophobe Ölphase in Betracht gezogen (siehe insbesondere P. Poncelet und P. Carayon, J. Immunol. Methods (1985), 85, 65–74 und Titus JA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 519). Diese Strategie, die vor allem für radioimmunologische Messungen verwendet wird, hat einige Vorteile. Sie ist äußerst wirksam, um die freien Moleküle, die in der wäßrigen Phase bleiben, und die gebundenen Moleküle, die mit den Zellen in die hydrophobe Phase gezogen werden, zu trennen; die Trennung ist schnell, in der Größenordnung von 2 Min, und die Restkonzentration an ungebundenen Molekülen beträgt weniger als 1 %. Darüber hinaus tritt nach der Trennung sehr wenig Dissoziation von gebundenen Molekülen auf.

Dennoch muss angemerkt werden, dass, wenn man wünscht, die auf diese Weise abgetrennten Zellen einer Durchflußzytometrie, Mikroskopie oder biologischen Aktivitätstests oder auch Wieder-in-Kultur-Bringungen zu unterziehen, diese Technik natürlich den Mangel hat, dass die Zellen, wenn sie einmal in das Öl gebracht wurden, nicht mehr verwendbar sind. Außerdem erzeugt der Kontakt mit einem Mineralöl im Fall von Blutplättchen eine Aktivierung/Aggregation, die sie natürlich für eine spätere Behandlung völlig ungeeignet macht.

Es wurden ebenfalls Waschungen auf Filterträgern, zum Beispiel durch Unterdruck, in Betracht gezogen. Der Vorteil liegt darin, dass man in diesem Fall weniger Bearbeitung hat. Man kann große Serien bearbeiten und dies ist leicht auf "Screenings" anpassbar, die Waschungen sind wirksam und schnell, was von Vorteil ist. Der Hauptmangel ist die Nichtverfügbarkeit der Zellen (Wiedergewinnung ausgeschlossen) für Analysen wie die vorstehend angegebenen.

Im Stand der Technik wurden ziemlich allgemeine Verfahren beschrieben, die das Waschen von Zellen durch Zentrifugation betreffen. Zum Beispiel beziehen sich die EP 0 176 080 und Gadol N. et al. (Diagnostic Immunology, 1985 3 (3) 145–154) auf Verfahren zum Waschen von mononukleären Zellpopulationen anhand eines Gels, das für die Zellen wenig belastend zu sein scheint. Andere Techniken auf der Grundlage eines hydrophoben Gels werden in der EP 176 080, Poncelet et al., Journal of Immunological Methods, 1985, Bd. 85, Nr. 1, Seiten 65–74 und Titus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, Bd. 78, Nr. 1, Seiten 519–523 beschrieben. Die US 3 997 442 bezieht sich auf eine Methode zur Trennung von zwei Phasen unterschiedlicher Dichte ausgehend von einer Flüssigkeit, ausgehend von von einem thixotropen Material, das am Boden des Zentrifugationsröhrchens abgeschieden ist.

Die Abfolge Zentrifugation auf Albuminkissen oder -gradienten + Molekularsieb-Gelchromatographie schließlich wurde bereits vorgeschlagen, um Plasmamoleküle zu entfernen, die nicht an Blutplättchen gebunden sind. Diese Labortechnik, die verwendet wird, um in bestimmten Fällen Plasmaproteine zu entfernen, die nicht an Blutplättchen gebunden sind und mit Funktionstests wechselwirken können, bleibt dennoch sehr langwierig und kompliziert in der Durchführung.

Deshalb schlägt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Abtrennung von Blutplättchen oder Mikropartikeln Blutplättchen-Ursprungs aus einer sie enthaltenden Probe vor, das dadurch gekennzeichnet ist, dass:

  • a) man die Probe in einem Gefäß zentrifugiert, das an seinem distalen Ende ein kompaktes Gel enthält, wobei das Gel für die flüssige Phase der Probe annähernd undurchlässig ist, aber unter den Zentrifugationsbedingungen von den abzutrennenden Blutplättchen oder den Mikropartikeln Blutplättchen-Ursprungs penetriert werden kann;
  • b) man unter Umständen den Zentrifugationsüberstand abtrennt und
  • c) man anschließend die Blutplättchen oder die Mikropartikel Blutplättchen-Ursprungs, die in dem Gel enthalten sind, gewinnt; wobei das Gel aus hydrophilen Teilchen besteht, die im gequollenen Zustand einen Durchmesser zwischen 30 und 500 &mgr;m einschließlich und vorzugsweise zwischen 90 und 350 &mgr;m einschließlich aufweisen.

Die Blutplättchen oder die Mikropartikel Blutplättchen-Ursprungs, die in dem Gel enthalten sind, werden dann durch Suspendieren des Gels in einem geeigneten Medium, wie zum Beispiel einem Puffermedium und/oder einem Medium mit einer speziellen Ionenstärke, gewonnen. Dann werden die Blutplättchen oder die Mikropartikel Blutplättchen-Ursprungs von dem Gel beispielsweise durch Filtration abgetrennt. Dies ermöglicht den Erhalt einer Blutplättchen-Suspension, die auf diese Weise bezüglich der Ausgangsprobe konzentriert werden kann; das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann also auch ein Konzentrationsverfahren sein.

Dieses Verfahren beruht auf der Tatsache, dass bei einer Zentrifugation das Penetrationsvermögen der in einer Lösung enthaltenen festen Elemente direkt proportional zu ihrer Masse ist, so dass die schwersten Teilchen dazu fähig sein werden, in das Gel einzudringen oder es gegebenenfalls sogar zu durchdringen, während die löslichen Teilchen ebenso wie das flüssige Medium in den meisten Fällen nicht in der Lage sein werden, das entsprechende Gel zu penetrieren.

Natürlich muss das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung für jede Abtrennung durch Einwirken auf die Natur und die physikalischen Eigenschaften des Gels sowie auf die Zentrifugationsgeschwindigkeiten an die Natur der Produkte, die man abzutrennen wünscht, insbesondere an die Blutplättchen, angepasst werden, um die gewünschte Trennung der Phasen zu gewährleisten.

Dieses Verfahren ist besonders an die Abtrennung von Molekülen, die an Zellen gebunden sind, von den gleichen, ungebundenen Molekülen, die in der flüssigen Phase, insbesondere in löslicher Form, vorliegen, ausgehend von einer sie enthaltenden Probe angepasst.

Das in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzte Gel ist bevorzugt ein hydrophiles Gel, das aus Teilchen besteht, die im gequollenen Zustand einen Durchmesser zwischen 30 und 500 &mgr;m einschließlich und vorzugsweise zwischen 90 und 350 &mgr;m einschließlich aufweisen.

Ebenso hat das gequollene Gel, wenn es sich an Ort und Stelle befindet, Merkmale wie jenes, dass die Konzentration als Teilchen-Trockengewicht zwischen 0,04 und 0,2 g/ml einschließlich liegt.

Natürlich kann das besagte Gel gebrauchsfertig sein, das heißt bereits unten in das Zentrifugationsgefäß eingebracht sein, oder aber frisch eingebracht werden, das heisst aus einem verdünnten Gel, das durch Zentrifugation sedimentiert wird.

Dieses Gel wird vorzugsweise aus der Sephadex®-Produktserie gewählt, insbesondere den Gelen, die unter den Bezeichnungen G25, G100, G200 oder einer entsprechenden Bezeichnung im Handel sind, welche für die Molekularsieb-Gelchromatographie geläufig verwendet werden.

Die Zentrifugationsgeschwindigkeit liegt bevorzugt so, dass die Zentrifugalkraft zwischen 200 g und 5000 g einschließlich liegt.

Somit umfasst das Verfahren schematisch:

  • 1) das Einbringen einer flüssigen Probe, die insbesondere die Blutplättchen oder die Mikropartikel Blutplättchen-Ursprungs enthält, in ein Zentrifugationsröhrchen über einem gelierten System;
  • 2) eine Zentrifugation bei geeigneter Geschwindigkeit;
  • 3) das Waschen durch Entfernen, insbesondere Absaugen oder Dekantieren, der flüssigen Phase;
  • 4) das Gewinnen der Blutplättchen oder der Mikropartikel Blutplättchen-Ursprungs im Gel oder, wie nachstehend zu sehen, gegebenenfalls unter dem Gel.

Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht somit den Erhalt zweier getrennter Phasen:

  • • eines Überstands über dem Gel, der die gesamten in Lösung gebliebenden Moleküle enthält, in bestimmten Fällen den Überschuss an Reagens, aber in anderen Fällen die löslichen Zellproteine, die nicht an den Zellen haften geblieben sind, und
  • • eines Gels, das insbesondere die Blutplättchen sowie die Moleküle enthält, die an diesen Blutplättchen haften.

Als Zentrifugationsgefäß wird bevorzugt ein Röhrchen verwendet, dessen distales Ende einen geringeren Durchmesser aufweist, wobei sich das Gel in diesem distalen Teil mit geringerem Durchmesser befindet. Als "distaler Teil" oder "distales Ende" wird selbstverständlich der Teil bezeichnet, der am weitesten von der Öffnung des Röhrchens entfernt ist. Das Zentrifugationsröhrchen, das somit eine Einengung in seinem unteren Teil aufweist, ermöglicht einerseits ein Konzentrieren der Zellen und sichert andererseits dem Gel, wenn es einige Zeit vor der Verwendung hergestellt wurde, eine bessere Konservierung zu. Deshalb liegt der Durchmesser des Gelzonenbereichs, das heißt der Durchmesser des unteren Teils des Röhrchens, im Allgemeinen bevorzugt zwischen 2 und 7 mm und bevorzugt unter 5 mm. Im Allgemeinen liegt das Verhältnis der Volumina von der oberen Kammer, das heißt der Probe oder dem Überstand, und der Sammelkammer vorzugsweise über 10, was unter diesen Bedingungen eine bessere Konzentrierung ermöglicht.

Es ist ebenfalls möglich, in einer bevorzugten Ausführungsform vorzusehen, dass der distale Teil des Röhrchens, in den das Gel eingebracht ist, an seinem Ende offen ist, wobei diese Öffnung durch einen Filter verschlossen ist, der das Gel zurückhalten kann. In diesem Fall mündet das offene Ende in ein Gefäß, das auf lösbare Weise mit dem Röhrchen verbunden sein muss, um die genannten Elemente der Probe, die das Gel durchquert haben, aufzunehmen.

Es sollte daran erinnert werden, dass die Zellen in Abhängigkeit von ihrer Masse wandern und dass sie im Prinzip im Gel eingeschlossen bleiben. In diesem Fall kann man die im Gel enthaltenen Zellen zurückgewinnen, indem man das Gel wieder suspendiert und die Suspension mit einem Filter filtriert, der die Gelteilchen zurückhält und den Durchtritt der genannten Elemente zulässt. Wenn man die Stärke der Zentrifugation oder die Dauer der Zentrifugation erhöht oder ein geeignetes Gel verwendet, ist es jedoch möglich, die Zellen dazu zu bringen, durch das Gel zu wandern. In diesem Fall können sie direkt in das untere Gefäß gelangen. Verwendet man eine derartige Vorrichtung, empfiehlt es sich selbstverständlich, das untere Gefäß vor der Zentrifugation mit einer Flüssigkeit zu füllen.

Das Gefäß des unteren Teils kann insbesondere ein Röhrchen sein, das an den unteren Teil des eigentlichen Zentrifugationsröhrchens geschraubt ist oder durch jedes beliebige geeignete Mittel mit diesem verbunden ist. In dieser Ausführungsform ist es somit möglich, in dem unteren Gefäß den Aufbau eines Gradienten vorzusehen, der zwei oder mehreren Dichten entspricht, was es zugleich erlaubt, bei der Zentrifugation die verschiedenen Zellsorten in Abhängigkeit von ihrer Dichte zu trennen. Die Methode, die den Aufbau der Dichtegradienten erlaubt, ist bekannt und wird hier nicht weiter im Detail beschrieben. Meistens genügt ein Gradient mit zwei Dichten, der es zum Beispiel erlaubt, die Blutplättchen von den anderen genannten Elementen des Blutes abzutrennen.

Unter den Proben, die nach dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, sind insbesondere zu nennen:

  • • ein plättchenreiches Plasma;
  • • das Vollblut, das vorzugsweise zuvor mit einer Lösung vom Typ Erythrozytenlyse behandelt wurde;
  • • eine Zellsuspension in einer dem Aufnahmepuffer entsprechenden oder anderen Lösung, wie zum Beispiel:

    – einer Fixierlösung (Paraformaldehyd, Formol, Glutaraldehyd, Ethanol);

    – einer Lösung zur differentiellen Lyse (Erythrozytenlyse);

    – einer Lösung zur enzymatischen (Phospholipase, Trypsin, Proteinase...), chemischen (Ameisensäure, Citronensäure, Essigsäure...) Behandlung, bevorzugte Lösungen, wenn die Zellen unbedingt nach dem Stoppen/Neutralisieren durch Verdünnung von der Lösung abgetrennt werden müssen;

    – einer Lösung, die ein Reagens, immunologisch (Antikörper, Antigen) oder nicht (Ligand), Enzymsubstrat, Element eines Bindungspaares (wie Biotin, X-biotin, Avidin...) enthält.

Wie vorstehend erwähnt, ist es besonders interessant, Suspensionen zu verwenden, in welchen die Zellen mit einem Reagens behandelt worden sind. In der Tat kann in diesem Fall der Überschuss an Reagens durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung abgetrennt werden, und es ist möglich, den Nachweis des Reagens oder übrigens sogar des Zellmarkers vorzusehen, wenn dies durch Einbringen eines Nachweiselementes in das Gel möglich ist.

So ist es möglich, das Einbringen eines mit Hilfe von Produkten wie DDAF (F(ab')2-Fragment von FITC-konjugierten Anti-Maus-IgG-Antikörpern, von der Firma Eurobio vermarktet) markierten, zum Beispiel fluoreszierenden Anti-Maus-IgG-Antikörpers in das Gel vorzusehen und dann in den oberen Teil des Röhrchens ein Medium einzubringen, das Zellen sowie einen monoklonalen Maus-Antikörper enthält, der mit diesen Zellen reagiert. Damit die Reaktion vollständig ist, liegt der monoklonale Antikörper selbstverständlich im Überschuss vor, und unter diesen Bedingungen wird ein Teil der Antikörper an die Zellen gebunden, die anderen bleiben in Lösung. Nach Behandlung mittels des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung dringen die durch die monoklonalen Antikörper markierten Zellen in das Gel ein und werden in diesem Gel von den fluoreszierenden Anti-Maus-IgG-Antikörpern erkannt und werden folglich einen Nachweis erbringen.

Einer der Vorteile dieses Verfahrens liegt darin, dass es möglich ist, vorbehandelte Röhrchen vorzusehen, die das Gel und den fluoreszierenden Anti-Maus-IgG-Antikörper enthalten, so dass der Betreiber dann nur noch den Schritt der Bindung der monoklonalen Antikörper und die Zentrifugation vornehmen muss, woraufhin der Nachweis indirekt im Gel auftritt.

Darüber hinaus erlaubt die Abtrennung der ungebundenen Moleküle die Verwendung eines Zweitschicht-Reagens in sehr geringer Menge, was natürlich die Hintergrundfärbung der Immunmarkierung beseitigt und folglich die Empfindlichkeit erhöht.

In demselben Ansatz kann man auch den Nachweis beispielsweise eines Zelloberflächenmarkers vorsehen, insbesondere wenn es sich um Enzyme handelt. Dieses Enzym muss sowohl im gebundenen Zustand als auch im ungebundenen Zustand vorliegen. Enthält das Gel nach der Zentrifugation das Substrat dieses Enzyms mit einem Chromogen oder einem Fluorogen, kann man die Anwesenheit von Zellen, die den Enzymmarker tragen, sofort im Gel sichtbar machen.

Unter den verwendbaren Enzymen sind insbesondere die zellulären und gleichzeitig löslichen Ektoenzyme zu nennen, wie die Enzyme der Gerinnungskette, die von Leukozyten, Blutplättchen oder Mikropartikeln Blutplättchen-Ursprungs getragen werden (zum Beispiel die Faktoren Xa, XIa, IXa und das Protein C). Es kann sich auch um rein zelluläre Enzyme handeln, von denen aber ein Hemmstoff oder ein Substrat, das den Test stört, in löslicher Form im Plasma vorliegt.

Schließlich kann es sich um Enzyme handeln, die an ein Reagens, zum Beispiel einen Antikörper, einen Liganden, Peroxidase-konjugiertes Avidin, &bgr;-Galactosidase, Acetylcholinesterase gekoppelt sind.

In allen diesen Verfahren erlaubt die Zentrifugation es, die nicht an Zellen gebundenen löslichen Arten zu beseitigen.

Zahlreiche Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus den nachstehenden Beispielen hervor.

BEISPIEL 1: Messung der an die Blutplättchen assoziierten Ig

Die Immunglobuline (Ig) liegen normalerweise im Plasma zu 10–20 mg/ml vor. Das Vorliegen dieser sehr hohen Menge macht ein ausgiebiges Waschen der in dem Plättchen-reichen Plasma (PRP) vorliegenden Blutplättchen vor der Immunmarkierung mit einem Anti-Ig-Antikörper zwingend erforderlich, d.h. 2 bis 4 Waschungen durch Zentrifugation.

Diese wiederholten Zentrifugationen führen zu:

  • • bedeutenden Einbußen, die große Ausgangsproben erforderlich machen (bis zu 5–10 ml Blut), was mit Tests in der Neonatal-Pädiatrie unvereinbar ist;
  • • die Blutplättchen können in Gegenwart von roten und weißen Blutkörperchen nicht durch Zentrifugation gewaschen werden, was dazu verpflichtet, mit einem PRP zu arbeiten (eine zusätzliche Anfangszentrifugation);
  • • einem hohen Risiko des Ablösens und Verlusts aller oder eines Teils (also Selektionsverfälschung) der Anti-Blutplättchen Ig-Antikörper, die für ihre geringe Affinität bekannt sind (Autoantikörper);
  • • einem Arbeitsaufwand und einer Belegzeit der Zentrifugen (jedes Waschen erfordert eine schnelle Zentrifuge für 15 min), die nicht vernachlässigbar sind.

Bei der Röhrchen-Gel-Technik gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Probe unterschiedslos Vollblut oder PRP sein.

Der Überstand wird durch einfaches Umdrehen dekantiert (Vorgang 3-mal wiederholt = 3 Waschungen). Das Gel, das die Zellen (Plättchen +/- rote Blutkörperchen und weiße Blutkörperchen) enthält, wird in einem geringen Volumen Immunmarkierungspuffer wieder suspendiert.

Das Gel wird auf den Maschen eines Filters zurückgehalten (Nylongitter, Öffnung 35 &mgr;m), wie zum Beispiel dem "Cell Strainer" von Falcon/Becton-Dickinson, und die Zellen werden nach kurzer Zentrifugation (3 Min, 800 U/Min) für die Immunmarkierung zurückgewonnen.

Man verfügt dann über eine Suspension von Plättchen (+/- rote und weiße Blutkörperchen), die frei von Plasma und insbesondere plasmatischen Ig sind und ihre morphologischen Eigenschaften, was die Analyse durch Durchflusszytometrie ermöglicht, ihren anfänglichen immunologischen Phänotyp beibehalten haben, die keine assoziierten Antikörper im Verlauf von Waschvorgängen verloren haben und die durch das Trennverfahren nicht aktiviert wurden.

Die Wirksamkeit des durch den Transfer in das Gel durchgeführten "Waschens" wurde unter Verwendung eines fluoreszierenden Marker-Ig getestet, das in der Ausgangsprobe und in der Endsuspension quantitativ bestimmt wird. Man hat einen Verdünnungsfaktor ≥ 1000 zwischen Ausgangs- und Endkonzentration des Markers gemessen. Dies entspricht bei einem Plasma, das 10 mg/ml Ig enthält, einer Ig-Restkonzentration ≤ 10 &mgr;g/ml in der Zellsuspension. Eine solche Restkonzentration würde unter den oben genannten Bedingungen mindestens 2 bis 3 Waschungen der Plättchen beanspruchen.

BEISPIEL 2: Fixierung von Blutplättchen für verzögerte Immunmarkierungen

Für die Messung der Plättchen-assoziierten 1g sowie für andere Antigene der Plättchenoberfläche stellt ein Protokoll zur Zellstabilisierung, das es ermöglicht, die Expression der interessierenden Antigene auf deren Ausgangsniveau zu halten, ein grosses und schwieriges Problem dar.

Die Lösung dieses Problems für Blutplättchen würde es ermöglichen, die Durchflusszytomettie-Analyse (Vorgang, der eine besondere Technik erfordert) hinsichtlich der Behandlung der Probe (kurzfristig vor Ort durchzuführender Vorgang) zu verschieben.

Eine sanfte aber zugleich wirksame und standardisierte Fixierung erfordert eine Behandlung der Zellprobe mit dem löslichen Fixierer von begrenzter Dauer mit einem Auswechseln des Fixierers gegen ein Konservierungsmedium, das keinen Fixierer enthält.

Das Röhrchen-Gel-System bietet diese Möglichkeit.

Die Probe (PRP, 500 &mgr;l) wird auf diese Weise im Fixierer (PFA, 0,2 %-ig, 500 &mgr;l) verdünnt, und die Inkubation wird 10 Min fortgesetzt.

Die quantitative Analyse des immunologischen Phänotyps der Plättchen, die auf diese Weise fixiert und nach 10 Min sofort vom Fixierer befreit wurden, hat die Zuverlässigkeit dieses Protokolls für eine einwöchige Konservierung der wesentlichen Plättchen-Antigene gezeigt, auf welche sich die Protokolle multizentrischer/multinationaler pharmakologischer Studien richten.

Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch in größerem Maßstab verwendet werden, um eine schnelle Präparation gewaschener Blutplättchen durchzuführen, was eine Alternative zu der Methode nach Mustard (Methods in Enzymology, 1989, Vol. 169, 3–21) darstellt. Andererseits wurden bestimmte chemische Behandlungen von Blutplättchen und Leukozyten beschrieben (zum Beispiel eine Behandlung mit Citronensäure, pH 4), um die HLA-Antigene zu entfernen und spezifisch die Antikörper nachzuweisen, die gegen die von HLA verschiedenen Antigene gerichtet sind. Derartige Behandlungen erfordern natürlich eine Neutralisation mit der Entfernung bestimmter chemischer Moleküle, die mit den Zellen in Kontakt stehen, und es ist sicher, dass das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, das besonders schnell und einfach ist, eine vereinfachte Durchführung dieser Art von Vorgang ermöglichen sollte.

Ebenso können die enzymatischen Behandlungen eine schnelle Abtrennung der zellulären Elemente erfordern (zum Beispiel Trypsin, PIPLC oder Proteinase K). Eine Standardzentrifugation lässt die Zellen über 5 Min in Kontakt mit dem das aktive Enzym enthaltenden Überstand, während man dank des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung in Betracht ziehen kann, die Dauer der Kontaktzeit zu begrenzen.

Es ist ebenfalls möglich, die Verwendung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung in der QIFI-Methode zur Quantifizierung zellulärer Moleküle durch Zytometrie vorzusehen, die auf indirekten Markierungen (in zwei Schichten monoklonaler Antikörper 1 + fluoreszierender Anti-Ig) beruht. Diese Methode wird in Poncelet et al., J. of Immunol. Methods, 85 (1985), 65–74 beschrieben, dessen Inhalt durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Beschreibung ist. Es handelt sich um ein schwer anwendbares Prinzip mit einer Gegenmarkierung (monoklonaler Antikörper 2 ist Träger eines anderen Fluorochroms). Das Trennverfahren, bei welchem der Reagenzüberschuss an monoklonalem Antiköper 1 und Anti-Ig entfernt wird, ermöglicht es, eine einfach durchzuführende Gegenmarkierung in Betracht zu ziehen.

Ebenso ist es möglich, bestimmte unerwünschte Reagenzien schnell zu beseitigen, wie zum Beispiel Aktivatoren, Zytokine, Boten, kurzfristig toxische Produkte (destilliertes Wasser für die Erythrozytenlyse oder Ameisensäure), Komplexbildner, wie EDTA oder Citrat, oder reaktionsauslösende Ionen, wie Calcium oder Magnesium.

BEISPIEL 3: Abtrennungsprotokoll

  • • Herstellung eines plättchenreichen Plasmas.

    Das Vollblut wird 15 Min bei 170 g zentrifugiert. Die obere Phase, die dem PRP (Plättchen-reiche Plasma) entspricht, wird abgehoben.
  • • Abtrennung der Plättchen

    – 200 &mgr;l PRP werden zu 2 ml geeignetem Puffer im Gelröhrchen gegeben,

    – Zentrifugation 5 Min – 1 200 g,

    – Entfernung der oberen flüssigen Phase durch Umdrehen,

    – 2 Waschungen des die Plättchen enthaltenden Gels in einem geeigneten Puffer (Zugabe von 2 ml Puffer in das Röhrchen über das Gel und Entfernung durch Umdrehen),

    – Suspendieren des Gels und der Plättchen mittels einer Pipette,

    – Übertragen der Suspension auf einen Filter in einem Röhrchenstopfen,

    – Zentrifugation des verschlossenen Röhrchens, die Gelteilchen werden vom Filter zurückgehalten, während die Plättchen nach unten in das Röhrchen "fallen",

    – Entfernung des Filterstopfens und Sammeln des Filtrats.

BEISPIEL 4: Eigenschaften des Gels

  • • Ausbeute: 51 % (siehe nachstehende Tabelle 1 und 1)

    – Zählung der Plättchen im Filtrat, Zählung auf einen Mikroliter beziehen,

    – Vergleich dieser Zählung mit der des Ausgangs-PRP,

    – Aufstellen eines Verhältnisses Zählung Filtrat/Zählung RPR, als Prozentsatz dargestellt.
  • • Erhaltung der Unversehrtheit der Plättchen

    Abwesenheit einer Aktivierung der Plättchen im Verlauf des Trennvorgangs (siehe Tabelle 1). Das Aktivierungsniveau der Plättchen wird durch die Messung der spezifischen Oberflächenmarker objektiviert.

    Die Plättchen werden als nicht aktiviert betrachtet, wenn GMP140 unter 500 Kopien pro Plättchen liegt.

    Erhaltung der Plättchenreaktivität (Tabelle 1). Die Erhaltung der Plättchenreaktivität wird durch die quantitativen Veränderungen bestimmter Oberflächenmarker infolge einer in-vitro-Aktivierung definiert. Es wurden gewählt:

    – GMP140, das nur auf den aktivierten Plättchen exprimiert wird,

    – GpIIb/IIIa, dessen Wert während der Aktivierung zunimmt,

    – GpIb, dessen Wert während der Aktivierung durch Einschluss fällt.

    Die Plättchenreaktivität bleibt für den Aktivator TRAP erhalten.

BEISPIEL 5: Verwendung des Gelröhrchens im Rahmen von Thrombopenien

Die Ausbeute ist für jede Plättchenzählung reproduzierbar. So bestätigt sich das Trennverfahren für eine normale Plättchenzählung (150 bis 400 × 109 Plättchen/Liter). Um eine größere Anzahl an Plättchen zu erhalten, ist bei den thrombopenischen Proben (10 × 109 bis 150 × 109 Plättchen pro Liter Blut) eine Erweiterung des Volumens der Probe bis auf &mgr;l 500 durchführbar, siehe nachstehende Tabelle 2.

BEISPIEL 6: spezielle Anwendung

Messung der mit den Blutplättchen assoziierten Immunglobuline (PAIg). Vergleich der Techniken Waschung/Abtrennung in einem Gelröhrchen und durch mehrfache Zentrifugation (siehe nachstehende Tabelle 3).

Das Verfahren des Abtrennens/Waschens der Blutplättchen durch Zentrifugation kann diese Zellen aktivieren, was zu einer Freisetzung der inneren Ig führt, die für Ergebnisse durch Überschuss verantwortlich sind. Die Messung der PAIg wurde an einer normalen Probe durchgeführt, deren Blutplättchen mittels Gelröhrchen oder mittels 3 Zentrifugationen gewaschen wurden. Es liegt in der Tat eine höhere gemessene Zahl an PAIg für den Vorgang des Abtrennens/Waschens durch Zentrifugation vor (Tabelle 3).


Anspruch[de]
Verfahren zur Abtrennung von Blutplättchen oder Mikropartikeln Blutplättchen-Ursprungs aus einer sie enthaltenden Probe, die aus einem an Blutplättchen reichen Plasma und einer Probe ausgewählt ist, welche Moleküle, die an Blutplättchen oder Mikropartikel Blutplättchen-Ursprungs gebunden sind, und gleiche, nicht-gebundene Moleküle enthält, die in der flüssigen Phase vorliegen, insbesondere in löslicher Form, umfassend die folgenden Schritte:

a) man zentrifugiert die Probe in einem Behälter, der an seinem distalen Ende ein kompaktes Gel enthält, wobei das Gel für die flüssige Phase der Probe deutlich undurchlässig ist, aber unter den Zentrifugationsbedingungen von den Blutplättchen oder den Mikropartikeln Blutplättchen-Ursprungs penetriert werden kann;

b) man trennt unter Umständen den Zentrifugationsüberstand ab und

c) man gewinnt anschließend die Blutplättchen oder die Mikropartikel Blutplättchen-Ursprungs, die in dem Gel enthalten sind;

dadurch gekennzeichnet, dass das Gel aus hydrophilen Teilchen besteht, die im gequollenen Zustand einen Durchmesser zwischen 30 und 500 &mgr;m einschließlich und vorzugsweise zwischen 90 und 350 &mgr;m einschließlich aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Moleküle Immunglobuline sind. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Gel in einer Konzentration als Teilchen-Trockengewicht von 0,04 g/ml bis 0,2 g/ml vorliegt, bezogen auf das Gel. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zentrifugationsgeschwindigkeit zwischen 200 und 5000 g einschließlich liegt. Verfahren nach einem Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Zentrifugationsbehälter ein Rohr ist, dessen distaler Teil einen geringeren Durchmesser aufweist, wobei das Gel in diesem distalen Teil mit geringerem Durchmesser angeordnet ist. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der geringere Durchmesser in der Größenordnung von 2 bis 7 mm liegt. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass der distale Teil des Rohrs, in dem das Gel angeordnet ist, an seinem unteren Ende offen ist, wobei diese Öffnung durch einen Filter verschlossen ist, der das Gel zurückhalten kann, wobei das offene Ende in einen Behälter einmündet, der auf lösbare Weise mit dem Rohr verbunden ist, um die Zellen der Probe, die das Gel durchquert haben, aufzunehmen. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter einen Dichtegradienten enthält. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man im Schritt c) das Gel gewinnt, indem man es wieder in Suspension gibt und die Suspension mit einem Filter filtriert, der die Gelteilchen zurückhält und den Durchtritt von Blutplättchen oder Mikropartikeln Blutplättchen-Ursprungs gestattet. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe aus einer Suspension besteht, in der die Blutplättchen oder die Mikropartikel Blutplättchen-Ursprungs mit einem Reagens behandelt worden sind. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Blutplättchen oder die Mikropartikel Blutplättchen-Ursprungs im Überschuss mit einem Antikörper, der ein Blutplättchen-Antigen erkennt, als Reagens behandelt worden sind. Verfahren nach einem Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Gel eine Verbindung enthält, welche den Nachweis des Reagens oder des Markers der Blutplättchen sicherstellt.






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