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Dokumentenidentifikation DE102005033425A1 25.01.2007
Titel Verfahren zur Entfärbung von Proteinen
Anmelder OMX GmbH, 80638 München, DE
Erfinder Eichacker, Lutz, 82234 Weßling, DE;
Gruber, Patrick, 81547 München, DE
Vertreter Fleuchaus & Gallo, 81479 München
DE-Anmeldedatum 18.07.2005
DE-Aktenzeichen 102005033425
Offenlegungstag 25.01.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 25.01.2007
IPC-Hauptklasse C07K 1/14(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, DE
IPC-Nebenklasse C07K 1/26(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   G01N 33/483(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   
Zusammenfassung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Entfernen von Farbstoffmolekülen aus biologischen Materialien sowie die Verwendung von Polyamid zum Entfernen von Farbstoffmolekülen aus biologischen Materialien. Die Erfindung betrifft im Weiteren Vorrichtungen, um das Entfernen von Farbstoffen aus biologischen Materialien zu verbessern.

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Entfernen von Farbstoffmolekülen aus biologischen Materialien sowie die Verwendung von Polyamid zum Entfernen von Farbstoffmolekülen aus biologischen Materialien. Die Erfindung betrifft im Weiteren Vorrichtungen, um das Entfernen von Farbstoffen aus biologischen Materialien zu verbessern.

In der molekularbiologischen, biochemischen oder medizinischen Forschung entwickelten sich über die Jahre Techniken, die sich die Ladung von biologischen Materialien zur Auftrennung von Gemischen im elektrischen Feld zu Nutze machen. Bekannte Standardverfahren zur Untersuchung, Bestimmung, Auftrennung und Charakterisierung von biologischen Materialien und insbesondere von Proteinen oder Peptiden sind z. B. die Gelelektrophoese oder die isoelektrische Fokussierung. Die Trennung der biologischen Materialien, die zumeist als Gemische vorliegen, erfolgt dabei in einer immobilisierenden Matrix, wie z. B. einem Polyacrylamidgel oder einem Agarosegel. Da nur wenige biologische Materialien Absorptions- bzw. Emissionslinien im sichtbaren Spektrum besitzen (z.B. Myoglobin, Hämoglobin) folgt üblicherweise im Anschluss an eine Auftrennung der biologischen Materialien eine unspezifische Färbung, um die aufgetrennten Bestandteile visuell sichtbar zu machen.

Bekannte unspezifische Farbstoffe zur Anfärbung biologischer Materialien sind zum einen organische Farbstoffe, die im sichtbaren Licht absorbieren, zum anderen Fluoreszenzfarbstoffe. Unter den bekannten organischen Farbstoffen finden u. a. Triphenylmethanfarbstoffe und Azofarbstoffe, unter den Fluoreszenzfarbstoffen u. a. Cyaninfarbstoffe und Komplex-Farbstoffe mit Übergangsmetallen breite Anwendung. Sofern im Rahmen der folgenden Beschreibung von Farbstoffen die Rede ist, sind damit alle bekannten Farbstoffe, die zum Färben von biologischen Materialien geeignet sind, zu verstehen. Sofern im Rahmen der folgenden Beschreibung von Triphenylmethanfarbstoffen die Rede ist, sind damit alle bekannten Triphenylmethanfarbstoffe, die zum Färben von biologischen Materialien geeignet sind (z.B. Malachitgrün, Kristallviolett, Phenolphthalein, Patentblau V) zu verstehen. Insbesondere umfasst der Begriff Triphenylmethanfarbstoffe, Coomassie-Blau Farbstoffe die unter den Handelsnamen Coomassie Brilliant Blue G-250, R-250 und W-250 vertrieben werden und die für die Visualisierung von Proteinen und Peptiden nach einer Auftrennung in einem Gel häufig verwendet werden (1A). Beispiele für Azofarbstoffe, die zur Färbung von Proteinen verwendet werden können, sind Ponceau S (1B) und Amido black (1C).

Viele dieser Farbstoffe und insbesondere Coomassie-Blau Farbstoffe binden über ihre sauren Sulfonsäuregruppen an basische Gruppen von Aminosäuren. Sie weisen daher eine hohe Affinität zu biologischen Materialien und insbesondere Proteinen auf. Coomassie-Blau Farbstoffe werden deshalb häufig für unspezifische Proteinfärbungen in der biologischen, biochemischen oder medizinischen Forschung eingesetzt.

Für derartige Forschungs- und Analysezwecke werden biologische Materialien und insbesondere Proteingemische in wässriger Lösung und gemäß bekannter Elektrophoresemethoden zunächst in einer immobilisierenden Matrix aufgetrennt. Um anschließend derart aufgetrennte Proteine in der Gelmatrix sichtbar zu machen, wird das Gel nach der Elektrophorese in ein Färbebad gelegt. Für eine Coomassie-Blau Färbung werden die Gele z. B. in eine ethanolische, essigsaure Coomassie-Blau-Lösung gelegt, denn eine Coomassie-Blau Färbung erfordert ein saures Medium für die Bildung von elektrostatischen Ionenbindungen zwischen den protonierten, basischen Gruppen von Aminosäuren und den Sulfonatgruppen des Farbstoffes.

Um dann die eingefärbten Proteine als blaue Banden oder Proteinspots im Gel sichtbar zu machen, wird überschüssiger Farbstoff durch einen Waschschritt aus dem Gel entfernt. Üblicherweise erfolgt eine Entfärbung in Schalen, die mit verdünnten Lösungsmitteln befüllt sind und geschwenkt werden, um ständig frisches Lösungsmittel mit dem Gel in Kontakt zu bringen. Um eine faktische Entfärbung zu erreichen, muss das Lösungsmittelgemisch, in dem sich die Farbstoffmoleküle anreichern, regelmäßig erneuert werden. Nach einem solchen Entfärbeprozess treten die gefärbten Proteine in Form von Banden oder Spots gegenüber dem umgebenden, farblosen Gel hervor.

Üblicherweise sind mindestens 2 Waschschritte erforderlich, so dass die lange Dauer der einzelnen Schritte und der hohe Verbrauch von Lösungsmitteln einen erheblichen Nachteil dieser Technik darstellen.

Eine alternative Technik zum Färben besteht darin, die Proteine noch bevor sie elektrophoretisch aufgetrennt werden, einzufärben. Hierzu wird Coomassie-Blau-Farbstoff in einem Puffer zu der Proteinlösung gegeben und anschließend die gefärbte Lösung im Polyacrylamidgel aufgetrennt. Zur elektrophoretischen Auftrennung wird die Coomassie haltige Pufferlösung bei etwa pH 7 zusätzlich in den kathodischen Puffertank gefüllt und nach etwa der Hälfte der Auftrennungszeit der gefärbten Proteine durch eine Coomassie freie Pufferlösung ersetzt. Nach abgeschlossener Auftrennung sind die Bereiche, in denen sich Proteine angereichert haben, als blaue Banden vor dem jetzt Coomassie freien Gel-Hintergrund erkennbar.

In vielen Anwendungen werden gefärbte Proteingele nur für den Nachweis über das Vorliegen von bestimmten Proteinen bzw. Proteinbanden im Gel angefertigt. Die gefärbten Gele werden hierfür nach dem Färben ausgewertet und eventuell getrocknet, um sie besser aufbewahren zu können. In diesem Fall kommt es zu keiner Weiterverarbeitung oder Charakterisierung der im Gel aufgetrennten Proteine.

Sofern aber nach der Auftrennung und Anfärbung eine weitere Verarbeitung und Charakterisierung einzelner oder auch aller aufgetrennten Proteine beabsichtigt wird (z. B. durch eine weitere Elektrophorese, durch Massenspektrometrie (MS), durch Proteinsequenzierung oder durch Peptidsequenzierung nach Spaltung der Proteine in kleinere Bruchstücke), ist es regelmäßig erforderlich, die Farbstoffmoleküle wieder von den Proteinen abzutrennen. Denn die Farbstoffmoleküle stören bei einer weiteren Verarbeitung oder analytischen Untersuchungen, insbesondere bei spektroskopischen Techniken wie Massenspektrometrie (MS) oder chemischen Prozessen.

Grundsätzlich sind die Bindungen zwischen den Farbstoffmolekülen und den Proteinen in entsprechenden Lösungsmitteln reversibel, so dass Farbstoffe und insbesondere Coomassie-Blau Farbstoffe – wie bereits erwähnt – in langwierigen Waschschritten in geeigneten und verdünnten Lösungsmitteln weitgehend wieder aus den gefärbten Gelen und von den gefärbten Proteine entfernt werden können. Bekannte Entfärbeprozesse sind z. B. das Waschen ausgeschnittener Gelbanden in Gemischen aus organischen Lösungsmitteln wie Acetonitril. Das Prinzip der Entfärbung basiert einerseits auf einer Änderung des pH-Wertes. Dadurch werden die basischen Seitenketten der Aminosäuren teilweise deprotoniert und so die Ionenbindungen zwischen den basischen Gruppen des Proteins und den Sulfonatgruppen des Farbstoffes aufgehoben. Zum anderen sind die Farbstoffe in organischen, polar-protischen Lösungsmitteln besser löslich als in Wasser. So bildet sich ein Diffusionsgleichgewicht, welches das Herauslösen der Farbstoffe aus den Komplexen mit den Proteinen begünstigt. Üblicherweise erfolgt eine Entfärbung durch Schütteln der gefärbten Gele oder ausgeschnittener Gelbanden in Lösungsmittelgemischen, wobei das Lösungsmittelgemisch, in dem sich die Farbstoffmoleküle anreichern, regelmäßig erneuert werden muss.

Es ist folglich ein erheblicher Nachteil dieser Entfärbeprozesse, dass die Waschschritte langwierig sind und erhebliche Mengen an Lösungsmitteln, die zudem zumindest teilweise giftig sind, benötigt werden.

Auch wenn man weder den Lösungsmittelverbrauch noch den Zeitaufwand für eine solche Entfärbung vorrangig berücksichtig, so muss zusätzlich festgestellt werden, dass bei einer solchen herkömmliche Entfärbung immer geringe Mengen an Farbstoffmoleküle an den Proteinen gebunden bleiben, die eine weitere Verarbeitung der Proteine und deren Aufreinigung oder Charakterisierung behindern.

Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Vorrichtungen bereit zu stellen, um den Entfärbungsprozess von mit Farbstoffen gefärbten Proteinen zu verbessern und zu beschleunigen, wobei die Waschschritte, die nach einem Färbebad von Gelen nötig sind, um überschüssigen Farbstoff aus dem Gel herauszulösen und dadurch die gefärbten Proteine im farblosen Gel sichtbar werden lassen, verbessert und beschleunigt werden sollen. Weiterhin ist es eine Aufgabe der Erfindung das Entfärben von gefärbten Proteinbanden aus einem Gel zum Zwecke einer Verbesserung nachgelagerter Verarbeitungsschritte zu verbessern und zu beschleunigen und schließlich ist es eine weitere Aufgabe der Erfindung das Entfärben von gefärbten Proteinbanden aus einem Gel in einem Verarbeitungsschritt, der parallel zu anderen Reaktionen abläuft, zu verbessern und zu beschleunigen.

Zur Lösung dieser Aufgabe präsentieren die Erfinder ein Verfahren, in dem Polyamid zum Entfärbeprozess zugegeben wird. Die Polyamide werden mit der Absicht, die mit Farbstoff gefärbten Proteinen zu entfärben, zu dem Lösungsmittel zu gegeben. Aufgrund der hohen Bindungsspezifität der Polyamide für die Farbstoffmoleküle werden die Farbstoffmoleküle überraschend schnell aus dem Lösungsmittel und aus den gefärbten Proteinen entfernt und an das Polyamid gebunden. Die an das Polyamid gebundenen Farbstoffmoleküle werden hierbei in eine unlösliche Form überführt. So können gefärbte Proteingele deutlich schneller und effizienter entfärbt werden als dies mit den herkömmlichen Methoden möglich ist. Die an das Polyamid gebundenen Farbstoffmoleküle können anschließend leicht vom Gel bzw. aus dem entfärbten Lösungsmittel abgetrennt werden. Durch die Farbstoffbindung an das Polyamid als Schüttgut kann der Entfärbeprozess auch optisch gut verfolgt werden.

Da der Bindung von sauren Farbstoffen an Polyamid ähnliche Prozesse zugrunde liegen, wie sie bei der Färbung von Proteinen mit diesen Farbstoffen erfolgen, ist es zu erwarten, dass die Bindung der Farbstoffe an Polyamid vornehmlich bei niedrigem pH-Wert (∼ pH 2,0) abläuft. Die Erfinder fanden nun, dass die Bindung von Farbstoffen an Polyamid nicht nur in stark saurer Lösung erfolgt, sondern auch bei schwach saurem, neutralem und sogar bei schwach alkalischem (∼ pH 8,5) pH-Wert abläuft. Dementsprechend kann eine erfindungsgemäße Entfärbung von gefärbten Gelen bzw. von in Gelen fixierten Proteinen unter Zusatz von Polyamiden auch in Wasser bzw. wässrigen Puffern bei neutralem oder schwach alkalischem pH-Wert stattfinden. Im Gegensatz zu klassischen Entfärbeprotokollen kann auch auf den Zusatz von organischen Lösungsmitteln verzichtet werden. Versuche zeigten, dass bei Zusatz von Polyamid mit Coomassie gefärbte Gele bzw. Proteinbanden schneller und besser entfärbt werden, als mit den herkömmlichen Methoden. Ein weiterer Vorteil dieser Verfahrensweise ist die breite Variabilität des pH-Wertes sowie die Möglichkeit, auf giftige organische Lösungsmittel zu verzichten. Gleichzeitig wurde gefunden, dass sich eine Erhöhung der Temperatur beschleunigend auf den Entfärbeprozess und die Anbindung der Farbstoffe an den Kunststoff auswirkt. Offenbar werden die Coomassie Farbstoffe vom Polyamid derart fest gebunden und in eine unlösliche Form überführt, dass keine Rückreaktion erfolgt, d. h. das Ablösen des Farbstoffes vom Polyamid und die Wiederanbindung an das Gel bzw. Protein verhindert wird. Vermutlich erfolgt die Anbindung des Farbstoffs über die freien Aminogruppen, welche sich an den Enden der Polyamidmolekülketten befinden.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Aufreinigung von biologischen Proben, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Auftrennung der biologischen Proben in einer inerten Matrix; b) Anfärben der aufgetrennten biologischen Proben in der Matrix mit einem Farbstoff; c) optionale Isolation einer oder mehrerer Isolate, z.B. Proteinbanden oder -spots; d) Entfärben der biologischen Probe oder ein oder mehrerer Isolate im geeigneten Lösungsmittel, wobei durch die Zugabe von Polyamid zu dem Lösungsmittel die Farbstoffmoleküle an das Polyamid gebunden werden; und e) Isolation, Weiterverarbeitung und/oder analytische Charakterisierung der entfärbten biologischen Probe.

Eine biologische Probe im Sinne der Erfindung ist jedes Gemisch, Extrakt oder Isolat, das von biologischen Materialen abgeleitet wird. Eine solche biologische Probe kann insbesondere tierischen, pflanzlichen, humanen, bakteriologischen oder pilzlichem (fungalem) Ursprungs sein. Sie enthält z.B. Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Lipide, Polysaccharide oder Komplexe und Mischungen aus diesen Bestandteilen.

Im Sinne der Erfindung umfasst die Auftrennung der biologischen Probe jede Separationstechnik, die Gemische, Extrakte oder Isolate aus biologischen Bestandteilen auftrennt. Als Beispiel für eine Separationstechnik wird die klassische Technik der ein- zwei- und mehrdimensionalen Elektrophorese und der isoelektrischen Fokussierung genannt, die dem Fachmann bekannt sind und z.B. bei Laemmli, Nature, 227, 680-685, 1970; Lottspeich und Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg-Berlin, 1998 beschrieben sind. Insbesondere umfasst die Auftrennung im Rahmen der Erfindung die denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, bei der die Proteine anhand ihres Molekulargewichtes aufgetrennt werden. Ferner umfasst die Auftrennung im Rahmen der Erfindung die Blau-Native- und Native-Gelelektrophorese, bei der Proteine oder Proteinkomplexe anhand ihrer nativen Molekularmasse aufgetrennt werden. Beide Verfahren sind wohlbekannt und z.B. bei Schrägger und von Jagow, Anal. Biochem., 199, 223-231, 1991; Schrägger et al, Anal. Biochem., 217, 220-230, 1994 detailliert beschrieben.

Die elektrophoretische Auftrennung erfolgt in einer Martix, die je nachdem mit welcher Pufferlösung sie getränkt ist bzw. je nachdem wie hoch ihr Polymerisationsgrad ist, das Wanderverhalten der biologischen Bestandteile beeinflusst. Typischerweise wird zum Herstellen der Matrix lineares oder quervernetztes Polyacrylamid oder Agarose verwendet, wie es auch bei Lottspeich und Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg-Berlin, 1998 beschrieben ist.

Im Anschluss an eine elektrophoretische Auftrennung werden die biologischen Materialien wie oben beschrieben eingefärbt. Für das Anfärben von Proteinen haben sich saure Azo- und Triphenylmethanfarbstoffe als besonders geeignet erwiesen und insbesondere Coomassie-Blau-Farbstoffe werden regelmäßig zum Anfärben von Proteinen in Polyacrylamidgelen verwendet. Hierzu wird, entsprechend wohlbekannter Verfahren, entweder das gesamte Gel, oder ein Ausschnitt aus einem Gel kurzzeitig in ein Färbebad eingelegt. In diesem Färbebad färbt sich zunächst die Gel-Matrix gemeinsam mit den Proteinen. Da jedoch vermutlich die Bindung zwischen den Proteinen und den Farbstoffmolekülen stabiler als die Bindung der Lösungsmoleküle an den Farbstoff und als die Bindung der Matrix an den Farbstoffsist, kann durch Waschen des Gels mit geeigneten Lösungen die nicht an Protein gebundene Farbe mit der Lösung aus der Gel-Matrix ausgewaschen werden und es bleiben nur die Bereiche, in denen sich Proteinen angereichert haben, eingefärbt.

Je nach experimentellem Ansatz können in einem weiteren optionalen Verfahrensschritt ein oder mehrere Banden oder Spots, die durch das Anfärben sichtbar geworden sind, isoliert werden und als Isolate weiterverarbeitet, z.B. entfärbt und analysiert werden.

Sofern die aufgetrennten Proteine oder ein oder mehrere Isolate davon weiterverarbeitet werden sollen, ist es erforderlich, die Farbstoffmoleküle wieder zu entfernen. Erfindungsgemäß wird zum Entfärben der mit Farbstoffen und insbesondere mit Coomassie-Blau-Farbstoffen gefärbten Proteine Polyamid eingesetzt. Hierfür werden die gefärbten Proteinlösungen, die Gele oder Teile davon, in denen die Proteine aufgetrennt und angefärbt wurden, mit Polyamid in Kontakt gebracht.

Unter "in Kontakt bringen" ist im Rahmen der Erfindung jegliches Verfahren oder jegliche Vorrichtung zu verstehen, bei der Proteinfarbstoffkomplexe, gefärbte Gele mit überschüssigem Farbstoff, und Gele mit gefärbten Proteinen oder Teile davon mit Polyamid in einer umgebenden Phase gemeinsam zugegen sind. Im einfachsten Fall wird das Gel als Ganzes oder als Teilstücke in einer Schale mit Wasser, Puffer, verdünnten Säuren, organischen Lösungsmittel oder beliebigen Mischungen hiervon zusammen mit dem Polyamid inkubiert und gegebenenfalls dabei geschwenkt.

Das Polyamid, das zum Entfärben der Lösungsmittel in die Schale zugegeben wird, liegt vorzugsweise als Feststoff vor. Entsprechend einer Ausführungsform wird das Polyamid zum Entfärben der Lösungsmittel und damit indirekt zum Entfärben der Proteine als Pulver zu dem Gel in die Schale zugegeben. Die Geschwindigkeit der Proteinentfärbung ist abhängig von der Oberfläche des zugesetzten Polyamids., Vermutlich erhöht eine große Oberfläche proportional den Anteil an zugänglichen Bindungsstellen des Polyamids, mit welchem die Farbstoffmoleküle aus dem Lösungsmittel entfernt werden. Damit steht das durch Polyamid gereinigte Lösungsmittel für die Aufnahme weiterer Farbstoffmoleküle aus dem Gel und dem Protein erneut zur Verfügung.

In weiteren Ausführungsformen wird das Polyamid in Form von Pellets, Chips, einer Folie, eines versponnenen Fadens, als Membran, als Schwamm, als Hohlkugel oder in jeder anderen denkbaren Form, die eine möglichst große Oberfläche und damit Wechselwirkungsfläche bietet, zugegeben. Für die Interaktion des Polyamid mit den Farbstoffmolekülen ist es hierbei von entscheidender Bedeutung, dass der Farbstoff ungehinderten Zugang zu den Bindestellen des Polyamids aufweist und auch nach Bindung des Farbstoffes im äußeren Bereich des dreidimensionalen Netzwerkes die weiter im Inneren liegenden Bindungsstellen für die Farbstoffmoleküle erreichbar bleiben.

Es ist somit ein wesentlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Vorgehensweise zum Entfärben der Proteine, dass es nicht nötig ist die Waschlösung auszutauschen, sondern dass es für eine Entfärbung der Proteine genügt, Polyamid zu der Waschlösung zuzugeben. Trotz dieser Vereinfachung des Waschverfahrens sind die entfärbten Proteine so vollständig entfärbt, dass es zu keinen Störungen oder Artefakten bei der anschließenden Analyse mittels z. B. mittels MS kommt.

Entsprechend einer weiteren Ausführungsform werden als Polyamide Homopolymere des Aminocarbonsäuretypes, vorzugsweise unverzweigter Homopolymere, weiter vorzugsweise protease-beständigen Homopolymere, weiter vorzugsweise z. B. Polyamid 6 (PA 6), Polyamid 11 (PA 11), Polyamid 12 (PA 12) oder Mischungen aus zwei oder mehreren dieser Polyamide eingesetzt.

Polyamide sind hochmolekulare Verbindungen, die aus über Säureamidbindungen verknüpften Bausteinen bestehen. Genauer betrachtet sind Polyamide kettenförmige Polymere mit wiederkehrenden Säureamid-Gruppierungen in der Hauptkette. Benannt werden solche Polyamide – im Falle aliphatischer Bausteine – nach der Anzahl der C-Atome der unverzweigten aliphatischen Bausteine. Die Zahl "X" in der Bezeichnung "Polyamid X" besagt, dass das Monomer eine Aminocarbonsäure mit "X" C-Atomen ist. So ist z. B. Polyamid 6 aus der 6-Aminohexansäure aufgebaut und Polyamid 12 besteht aus polymerisierter 12-Aminododecansäure (siehe auch 2A/B)

Neben den aus Aminocarbonsäuremonomeren aufgebauten Polyamiden gibt es weiterhin Polyamide, die aus Kondensationsreaktionen von Diaminen und Dicarbonsäuren entstehen (siehe auch 2C). Für die Nomenklatur dieser Polyamide werden – im Falle aliphatischer Bausteine – die Anzahl der C-Atome des Diamins und der Dicarbonsäure hintereinander geschrieben. So setzt sich z. B. das Polyamid 66 aus 1,6-Diaminohexan und 1,6-Hexandisäure, die im Wechsel gegeneinander kondensiert sind, zusammen (2C).

Neben den beschriebenen Polyamiden, die auch in der Klasse der Homopolyamide zusammenfassbar sind, gibt es auch zahlreiche Copolyamide, die sowohl aus Aminocarbonsäurepolyamiden wie aus Diamino-Dicarbonsäurepolyamiden in verschiedenen Verhältnissen aufgebaut sind.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren präsentieren die Erfinder eine neue Verwendung von Polyamiden, vorzugsweise Homopolymeren des Aminocarbonsäuretypes, weiter vorzugsweise unverzweigten Homopolymeren, weiter vorzugsweise protease-beständigen Homopolymeren, weiter vorzugsweise z. B. Polyamid 6 (PA 6), Polyamid 11 (PA 11) oder Polyamid 12 (PA 12) sowie Mischungen dieser Polyamide zur Entfärbung von Proteinen vor einer weiteren Verarbeitung bzw. einer analytischen Untersuchung.

Hierbei stellt sich bei in Kontakt bringen der gefärbten Proteine mit dem Polyamid und aufgrund der hohen Affinität der Farbstoffe zu Polyamid ein Diffusionsgleichgewicht zwischen dem gefärbten Protein, dem Lösungsmittel und dem Polyamid ein, durch welches sich die Farbstoffmoleküle aus den Proteinen lösen und an das Polyamid binden. Das Polyamid, an welches nun die Farbstoffmoleküle gebunden sind, kann dann aus dem Lösungsbad entnommen werden. Alternativ kann das Polyamid auch durch Filtration oder Zentrifugation abgetrennt werden.

Die entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren und unter Verwendung von Polyamid entfärbten Proteine sind insbesondere für analytische Verfahren wie Massenspektrometrie, andere optische Spektroskopieverfahren, sowie Flüssigkeitschromatographien z.B. HPLC, mehrdimensionale Elektrophorese, Proteinsequenzierung oder Peptidkartierung geeignet.

Es ist somit ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, dass Proteine, die mit Farbstoffen gefärbt wurden, so vollständig von Farbstoffmolekülen zu befreien sind, dass es bei einer weiteren Verarbeitung dieser Proteine und insbesondere bei einer analytischen Untersuchung dieser Proteine zu keinen verunreinigungsbedingten Störungen kommt (8).

Die Erfinder zeigten weiterhin, dass die Entfärbung von mit Farbstoffen gefärbten Proteinen in Abhängigkeit von der Menge und der zur Verfügung sehenden Reaktionsoberfläche des Polyamides beschleunigt werden kann.

Es ist somit ein weiterer Vorteil, dass das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gefärbte Proteine wesentlich schneller entfärbt werden können als mit herkömmlichen Waschschritten in organischen Lösungsmitteln, wie verdünntem Methanol, Acetonitril oder Eisessig (3).

Vorzugsweise wird daher das Polyamid als Festkörper mit vergrößerter Oberflächenstruktur eingesetzt. Zum Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren oder der erfindungsgemäßen Verwendung eignen sich daher insbesondere Festkörper wie Pulver, Körner oder Kügelchen, Pellets, Chips, Membranen, Folien, Schwämme, Fadengespinste, Hohlkugeln oder anderen Konfiguration mit großen Wechselwirkungsflächen.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung ferner die Verwendung von Polyamid zur Entfärbung von mit Farbstoff angereicherten Lösungsmitteln. wobei davon auszugehen ist, dass das eingesetzte Polyamid das Diffusionsgleichgewicht verschiebt, so dass die Konzentration der Farbstoffmoleküle im Lösungsmittel erniedrigt wird. Vorliegende Verwendung eignet sich insbesondere zur Regeneration von Lösungsmitteln, die zur Entfärbung von Proteinen eingesetzt werden.

In der bio-medizinischen Forschung wird regelmäßig auch eine oder mehrere Banden eines Auftrennungsgels isoliert, um diese dann gesondert weiter untersuchen oder einsetzen zu können. Die Proteine, die noch in einer Gelmatrix gebunden sind, können vor dem Entfärben z.B. durch Diffusion, durch Elektroelution, oder durch chemisches Auflösen der Gelmatrix oder durch mechanisches Zerstören der Gelmatrix insbesondere in einem Zentrifugationsschritt für die Entfärbung vorbereitet werden. Eine Entfärbung findet dann z. B. durch ein in Kontakt bringen der Protein haltigen Lösung mit dem Polyamid z. B. durch einfaches Schwenken, Schütteln oder Mischen in einem Reaktionsgefäß statt.

In einer entsprechenden Ausführungsform wird die gefärbte Proteinlösung oder ein Gelstück, in welchem ein gefärbtes Proteinisolat gebunden ist, in ein Reaktionsgefäß, in dem sich Polyamid befindet, gegeben. Das Polyamid kann sich in dem Reaktionsgefäß als beliebiger Feststoff, z.B. als Pulver, als Pellets, als Chip, als Gespinst, als Schwamm oder als Hohlkugeln befinden. Idealerweise lässt sich das Polyamid nach der Entfärbereaktion abzentrifugieren oder es bleibt im Gefäß gebunden. Das entfärbte Protein kann dann mit dem Überstand oder als Eluat aus dem Reaktionsgefäß entnommen werden oder direkt einer weiteren Verarbeitung oder Analyse zugeführt werden.

Alternative, entsprechend weiterer Ausführungsformen kann das Reaktionsgefäß im Ganzen oder in Teilbereichen aus Polyamid gefertigt sein bzw. im Ganzen oder in Teilbereichen mit Polyamid beschichtet sein. Sofern die Proteine noch in einer Gelmatrix gebunden sind, werden sie im Reaktionsgefäß z.B. durch chemisches Auflösen der Gelmatrix oder durch mechanisches Zerstören der Gelmatrix in einem Zentrifugationsschritt für den Entfärbeschritt vorbereitet. Durch einfaches Schütteln, Mischen oder auch Zentrifugieren wird dann das gefärbte Protein mit dem Polyamid, welches an der Innenseite des Reaktionsgefäßes aufgebracht ist oder aus welchem das Reaktionsgefäß besteht in Kontakt gebracht und dabei entfärbt. Nach kurzer Inkubationszeit kann bei Reaktionsgefäßen aus Polyamid oder beschichtet mit Polyamid die saubere Proteinlösung entnommen werden. Sofern das Polyamid als lose Schüttung in dem Reaktionsgefäß vorliegt, wird die saubere Proteinlösung nach Abtrennung des Polyamids insbesondere durch Gravitation als Überstand oder Eluat weiter verwendet. Um das Abzentrifugieren des Polyamids zu erleichtern, werden vorzugsweise größere Partikel oder Hohlkugeln aus Polyamid verwendet.

„Reaktionsgefäße" im Sinne der Erfindung sind Schalen, Dosen, Röhrchen oder Röhren in denen Gele oder Gelstücke Platz finden. Des Weiteren sind unter dem Begriff Reaktionsgefäß alle Einmalgefäße, die für chemische Reaktionen z. B. Verdaureaktionen eingesetzt werden oder die in einer Zentrifuge verwendet werden, zu verstehen.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können auch Gelbanden, die gefärbte Proteine enthalten, parallel zu einem weiteren Verarbeitungsschritt der Gelbande im Reaktionsgefäß mit Polyamid in Kontakt gebracht werden, um den Farbstoff gleichzeitig mit bzw. während des weiteren Verarbeitungsschrittes in eine unlösliche Form zu überführen und ihn vom Gel, dem darin eingelagerten Protein und dessen Reaktionsprodukten abzutrennen.

„Weitere Verarbeitungsschritte" im Sinne der Erfindung können chemische, physikalische und/oder enzymatische Prozesse, vorzugsweise Spaltungen der Proteine, vorzugsweise enzymatische Spaltungen der Proteine, vorzugsweise Spaltungen der Proteine mit Trypsin sein.

Gemäß dieser Ausführungsform wird z.B. ein Gelstück, in welchem ein gefärbtes Protein gebunden ist, oder eine gefärbte Proteinlösung, die aus diesem Gelstück erhalten wurde, in ein Reaktionsgefäß gegeben, in dem sich neben den für den Verarbeitungsschritt nötigen Reaktanden zusätzlich Polyamid befindet. Im Sinne obiger Ausführungen kann sich das Polyamid in dem Reaktionsgefäß als Pulver, als abzentrifugierbarer Feststoff, z.B. Gespinst, Schwamm, Pellet oder dergleichen befinden, oder das Reaktionsgefäß selbst ganz oder teilweise aus Polyamid bestehen oder damit ganz oder teilweise beschichtet sein. Während dieses Verarbeitungsschrittes wird der Farbstoff durch das Polyamid gebunden und so dem Protein und der Reaktionsmischung entzogen. Auf diese Weise wird der Farbstoff aus den zuvor gefärbten Gelstücken bzw. der Reaktionsmischung so vollständig entfernt, dass es zu keinen Störungen oder Artefakten bei dem parallel durchgeführten Verarbeitungsschritt und der anschließenden Analyse z. B. mittels MS kommt. Die erfindungsgemäß verarbeiteten und entfärbten Proteine sind insbesondere für analytische Techniken wie mehrdimensionale Elektrophorese, Chromatographie, wie z. B. HPLC (High performance liquid chromatography), Massenspektrometrie (MS), Proteinsequenzierung, Peptidkartierung oder für weitere chemische und/oder enzymatische Reaktionen einsetzbar.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist das eingesetzte Polyamid gegen Proteasen, vorzugsweise gegen Trypsin beständig. In Verarbeitungsschritten, bei denen das gefärbten Protein mittels Proteasen, vorzugsweise Trypsin in kleinere Peptide zerlegt werden soll, ist es entscheidend, dass ein Polyamid eingesetzt wird, das von Proteasen, insbesondere Trypsin nicht angegriffen und zersetzt werden kann.

Sofern im Rahmen dieser Erfindung von einem protease-beständigen Polyamid und dessen Einsatz im erfindungsgemäßen Verfahren die Rede ist, ist insbesondere ein Polyamid zu verstehen, welches gegenüber Proteasen (z.B. Trypsin), die in weiteren, parallel laufenden Reaktionsschritten zugegeben werden, beständig ist oder von solchen nur langsam angegriffen und zersetzt werden kann, so dass genügend Polyamid für die Entfärbereaktion während des parallelen Verarbeitungsschrittes bereitsteht.

Gemäß einer Ausführungsform ist das eingesetzte Polyamid beständig gegenüber anderen chemischen Reaktionen, die üblicherweise mit Proteinen durchgeführt werden. Darunter fallen z. B. die Markierung von Proteinen mit radioaktiven oder isotopen-markierten Verbindungen oder die chemische oder enzymatische Modifizierung bestimmter Atomgruppen des Proteins. In Verfahren, bei denen das gefärbte Protein derart modifiziert werden soll, ist es entscheidend, dass ein Polyamid eingesetzt wird, das von diesen Chemikalien nicht angegriffen und zersetzt werden kann, bzw., dass die sich bildenden Reaktionsprodukte unlöslich sind und von den löslichen Reaktionsprodukten des Proteins abgetrennt werden können.

Entsprechend der vorangegangenen Beschreibung wird für die Herstellung von Reaktionsgefäßen, welche im Ganzen oder in Teilbereichen aus Polyamid gefertigt sind bzw. im Ganzen oder in Teilbereichen mit Polyamid beschichtet sind, ein Homopolyamid des Aminocarbonsäuretypes, vorzugsweise ein unverzweigtes Homopolyamid des Aminocarbonsäuretypes eingesetzt. Weiter vorzugsweise ist das eingesetzte Polyamid ein protease-beständigen Homopolymer, z. B. Polyamid 6 (PA 6), Polyamid 11 (PA 11), Polyamid 12 (PA 12) oder eine Mischung aus zwei oder mehreren dieser Polyamide.

Sofern die Erfindung eingesetzt werden soll, um ganze Gele oder größere Gelausschnitte zu entfärben, wird gemäß einer weiteren Ausführungsform eine Vorrichtung bereitgestellt, die das Polyamid in einen flüssigkeitsdurchlässigen aber das Polyamid zurückhaltenden Beutel verpackt, der eine durchbrochene Aussenhaut hat und der gemeinsam mit dem zu entfärbenden Gel in die Entfärbelösung gelegt werden kann. Typischerweise besteht der flüssigkeitsdurchlässige Beutel aus Filterpapier, einer Kunststoffmembran oder einem anderen natürlichen Werkstoff, z. B. Cellulose. Der Beutel muss ferner Öffnungen haben, so dass die Entfärbelösung mit den Farbstoffmolekülen zum Polyamid diffundieren kann.

Idealerweise hat der Beutel Öffnungen mit einer Größe von zwischen etwa 5 &mgr;m und etwa 100 &mgr;m. Sobald der Entfärbevorgang abgeschlossen ist und die Farbstoffmoleküle an das Polyamid gebunden sind, kann das Polyamid und damit die gebundenen Farbstoffmoleküle aus dem Bad entfernt werden. Zur leichteren Handhabung kann an dem Beutel ein Faden befestigt sein, der das Herausholen des Beutels aus dem Entfärbebad erleichtert. Weiterhin ist die durchbrochene Aussenhaut vorzugsweise protease stabil.

In einer weiteren Ausführungsform sind die Öffnungen der Aussenhaut des Beutels zunächst mit einem Material verschlossen, welches enzymatisch oder temperaturabhängig zersetzt werden kann, so dass die Entfärbung durch das im Beutel befindliche Polyamid erst beginnt, wenn eine Temeraturerhöhung stattfinded oder wenn eine andere paralelle Reaktion, z.B. ein enzymatischer Verdau mit Trypsin, gestarted wird.

In einer weiteren Ausführungsform besteht der Beutel selbst aus Polyamid. Die Verfärbung des Beutels von weiß nach gefärbt kann dann als Indikator für die Sättigung der Bindekapazität der Polyamidschüttung des Beutelinhaltes verwendet werden.

In einer weiteren Ausführungsform ist der Beutel aus einem Material gefertigt und/oder mit einem Farbstoff beschichtet der nach Benetzung des Beutels mit Lösungsmittel zur Bindung von Farbstoff und zur Abgabe des Farbstoffes an Polyamid geeignet ist, so dass im Gesamtverlauf der Entfärbung, die Kinetik des Farbverlustes der Beutelwandung selbst den Abschluss des Entfärbevorganges anzeigt.

Es ist ein wesentlicher Vorteil der Erfindung, dass zum Entfärben der Gele nicht nötig ist, die Waschlösung auszutauschen, sondern dass es für eine Entfärbung der Gele genügt, Polyamid zu der Waschlösung zu zugeben und gegebenenfalls nach der erfolgten Entfärbung wieder aus der Waschlösung zu entfernen.

Sofern die aufgetrennten und gefärbten Proteine auf Blotmembranen übertragen werden sollen, müssen gemäß einer weiteren Ausführungsform die gefärbten Proteine im Polyacrylamidgel nicht in der Schale entfärbt werden, sondern die Entfärbung kann direkt während dem Blotten ablaufen. Hierzu wird ein Blot aufgebaut, in dem eine Polyamidmembran bzw. ein engmaschiges Polyamidnetz in derselben, einer grösseren oder einer kleineren Größe wie das zu entfärbende Gel in den Blotaufbau auf einer, auf beiden oder auf allen Seiten des Geles eingebracht wird und die Proteine während des Transfers aus dem Gel auf eine Blotmembran entfärbt werden. Beim Blotten der Proteine aus dem Gel auf eine weiterverarbeitende Blotmembran, z. B. eine Nitrocellulose- oder Polyvenyldiflourid (PVDF)-Membran, wird dann der Farbstoff bei der Passage durch die Polyamidmembran oder während er an der Polyamidmembran vorbei transportiert wird, gebunden und verbleibt in dieser, während die sauberen Proteine auf die weiterverarbeitende Membran geblottet werden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform, stellt die vorliegende Erfindung auch Polyamidmembranen oder Polyamidgitter für den direkten Einsatz in einer zweidimensionalen Elektrophorese bereit. Hierzu wird die Polyamidmembranen oder das Polyamidgitter vor, während oder nachdem Lauf der zweiten Dimension auf oder an das Trenngel gebracht, so dass die eingefärbten Proteine beim Durchtritt durch oder durch die Gegenwart der Polyamidmembran oder des Polyamidgitters direkt entfärbt werden.

Die bereitgestellten Polyamidmembranen oder Polyamidgitter haben vorzugsweise eine Dimension, die der Grösse der zu entfärbenden Proteinbanden oder Proteinspots oder der Trennmatrix einzelner Proben oder der Gesamttrennmatrix entspricht. Das Längen-zu-Breiten-Verhältnis kann von 0,002 inklusive bis 0,2 inklusive, 0,005 inklusive bis 0,1 inklusive, 0,01 inklusive bis 0,05 inklusive und besonders bevorzugt etwa 0,025 betragen, wobei die Länge der Membran vorzugsweise zwischen 1 und 50,0 cm, zwischen 5 und 40 cm, zwischen 10 und 30 cm, zwischen 15 und 25 cm und weiter vorzugsweise zwischen 18 und 22 cm, einschließlich aller Randwerte, beträgt und die Breite der Membran vorzugsweise zwischen 0,1 und 2,0 cm, zwischen 0,2 und 1,5 cm, zwischen 0,3 und 1 cm zwischen, zwischen 0,4 und 0,8 cm und weiter vorzugsweise zwischen 0,5 und 0,6 cm, einschließlich aller Randwerte, liegt. Weiter bevorzugte Längen- und Breitenangaben sind durch die Verwendung von kommerziell erhältlichen Gelkammern, die dem Fachmann bekannt sind, vorgegeben.

Die erfindungsgemäßen Polyamidmembranen oder Polyamidgitter sind geeignet, vor dem Starten des Gellaufes für die zweite Dimension direkt auf oder am Gel angebracht zu werden. Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Polyamidmembranen oder Polyamidgitter auf oder am Trenngel, weiter vorzugsweise im Bereich von oder zwischen Sammel- und Trenngel aufgebracht, so dass die eingefärbten Proteine beim Durchtritt durch die Polyamidmembran oder das Polyamidgitter oder während des Trennvorganges direkt entfärbt werden.

Insbesondere bei der Blau-Nativen-Gelelektrophorese bei der die Proteine zunächst mit Coomassie-Blau-Farbstoffen angefärbt und dadurch negativ geladen werden, bietet die erfindungsgemäße Polyamidmembran oder das Polyamidgitter große Vorteile, denn es entfällt ein Entfärbeschritt. Gleichzeitig ist gewährleistet, dass die Auftrennung der mit Coomassie beladenen Proteine in einer zweiten Dimension nicht mehr aufgrund der negativen Coomassie-Ladung erfolgt, sondern die Ladung der entfärbten Proteine vom pH-Wert der Pufferlösung bestimmt wird.

Weitere Vorteile und Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen zum Teil mit Bezug auf die Figuren dargestellt. Die Ausführungsbeispiele sind nicht als Einschränkung der Erfindung zu verstehen. Vielmehr sind im Rahmen der Beschreibung der Ausführungsbeispiele auch solche Varianten, Elemente und Kombinationen als offenbart anzusehen, die sich durch eine Kombination oder Abwandlung von einzelnen, in der allgemeinen Beschreibung, den Ausführungsbeispielen, den Ansprüchen oder den Zeichnungen enthaltenen Merkmalen ergeben, und diese Merkmalskombinationen oder Abwandlungen nicht ausdrücklich in einem Ausführungsbeispiel gezeigt bzw. beschrieben sind und gegebenenfalls zu einem geänderten Gegenstand oder zu neuen Verfahrensschritten bzw. einer neuen Abfolge von Verfahrensschritten führen.

Kurze Figurenbeschreibung

1: Strukturformeln von Farbstoffen, die zur Proteinfärbung eingesetzt werden können. A ist Coomassie Brillant Blue; B ist Ponceau S; C ist Amido black.

2: Strukturformeln von Polyamid 6 (A), Polyamid 12 (B) und Polyamid 66 (C).

3: Entfärben von SDS-Gelen nach dem Stand der Technik (A) und erfindungsgemäß mit Polyamid (B).

4: Beispiele für Versuchabläufe für das erfindungsgemäße Entfärben von Gelen mit Polyamid.

5: Entfärben von proteinhaltigen Gelbanden nach dem Stand der Technik (A) und erfindungsgemäß mit Polyamid (B).

6: Versuchsaufbau für das erfindungsgemäße Entfärben von proteinhaltigen Gelen mittels Blotten durch ein Polyamidnetz.

7: Tryptischer Verdau von gefärbten, proteinhaltigen Gelbanden nach dem Stand der Technik (A) und erfindungsgemäß mit Polyamid (B).

8: ESI-MS-Spektren von tryptischen Peptiden nach Verdau von 20 pmol GAPDH in Ab(A) und erfindungsgemäßer Anwesenheit von Polyamid 6 (B).

9: ESI-MS-Spektrum eines wässrigen Extraktes von käuflichem Polyamid 6 (A) und Strukturformeln der gefundenen Polyamid-Oligomere (B) (C).

Anwendungsbeispiele 1. Gelelektrophoretische Trennung, Färbung und Entfärbung

Zwei Proteinproben wurden jeweils mittels SDS-PAGE getrennt und die so erhaltenen farblosen Polyacrylamidgele über Nacht in ein Färbebad bestehend aus 0,2 % Coomassie Brillant Blue R250, 10 % Essigsäure, 40 % Ethanol und 49,8 % Wasser gelegt. Die Gele werden entnommen. Ein Gel wird danach in ein Entfärbebad bestehend aus 10 %iger Essigsäure gelegt (Weg A in 3), das andere Gel wird in ein Entfärbebad bestehend aus 10 %iger Essigsäure sowie 5 g Polyamid 6 in Form von Pellets gelegt (Weg B in 3) und beide Entfärbebäder sanft geschwenkt.

Es konnte nun gezeigt werden, dass das Gel durch die im Weg B gezeigte Methode schneller entfärbt wird als durch die konventionelle Methode gemäß Weg A. Das auf diese Weise mit Coomassie Brillant Blue R250 belegte Polyamid kann aus dem Färbebad entnommen.

Das „in Kontakt bringen" eines gefärbten Geles zum Zwecke einer beschleunigten Entfärbung mit Polyamid kann nicht nur durch Zugabe von Polyamidpellets zu einem Entfärbebad erfolgen (Weg B in 3 bzw. 4A). Es wurde gefunden, dass die Anbindung der Farbstoffe an Polyamid und somit die Regeneration des entfärbenden Lösungsmittelgemisches umso schneller erfolgt, je größer die Oberfläche des Polyamides ist. Daher ist es besonders zweckmäßig, das Polyamid in Form von oberflächenvergrößerten Netzen, Geweben oder Gespinsten (4B) oder als feines Pulver, welches sich zweckmäßigerweise in einem durchlöcherten Beutel befindet (4C), dem Entfärbebad zuzusetzen.

Nach dem Stand der Technik werden Gelstückchen, die ein gefärbtes Protein enthalten und zur Weiterverarbeitung vorgesehenen sind, durch Schütteln in einem Gemisch bestehend aus einem organischen Lösungsmittel wie Acetonitril und einer neutralen bis alkalischen, wässrigen Komponente entfärbt. Weit verbreitet ist die Anwendung einer Mischung aus 50 % Acetonitril und 50 % Wasser bzw. 50 % eines schwach basischen Puffers wie eines Ammoniumhydrogencarbonatpuffers (pH 7-9). Dabei wird der Farbstoff vom Protein abgelöst und diffundiert in die Entfärbelösung (Weg A in 5). Es wurde nun gefunden, dass die Entfärbung schneller vonstatten geht, wenn der Entfärbelösung Polyamid zugesetzt wird, da das Polymer den Farbstoff bindet und so dem Entfärber entzieht (Weg B in 5). Als Entfärbelösung eignen sich verschiedenste Gemische der zuvor beschriebenen Komponenten ebenso wie die Einzelkomponenten selbst. Es konnte beispielsweise gezeigt werden, dass die Reaktion in einem wässrigen Ammoniumhydrogencarbonatpuffer bzw. Tris-Puffer (pH 8,5) bei erhöhter Temperatur ohne Zusatz eines organischen Lösungsmittels erfolgt.

2. Blotten von Gelen und gleichzeitige Entfärbung

Zu Versuchszwecken wurden Polyacrylamidgele mit gefärbten Proteinbanden beim Blotten während des Transfers aus dem Gel auf eine Blotmembran entfärbt. Dies wurde erreicht, indem eine Polyamidmembran bzw. ein engmaschiges Polyamidnetz in derselben Größe wie das zu entfärbende Gel zwischen das Gel und die Blottmembran eingelegt wurden (6). Beim Blotten der Proteine im elektrischen Feld wird dann der Farbstoff bei der Passage durch die Polyamidmembran gebunden und verbleibt in dieser, während die sauberen Proteine auf die Membran geblottet werden.

3. Weiterverarbeitung von Proteinen und Peptiden

Nach dem Stand der Technik werden Gelstücke, die ein gefärbtes Protein enthalten und bei welchen dieses Protein zur Hydrolyse durch eine Protease, vorzugsweise Trypsin vorgesehenen ist, zunächst wie zuvor beschrieben durch Schütteln in einem Gemisch bestehend aus einem organischen Lösungsmittel wie Acetonitril und einer neutralen bis alkalischen, wässrigen Komponente entfärbt. Danach wird das Gelstück durch Filtration vom Entfärber befreit, in einem für den proteolytischen Verdau angemessenem Puffer aufgenommen und mit einer Protease wie z. B. Trypsin inkubiert. Dabei entstehen kurzkettige Peptide, die aus dem Gel in das umgebende Medium wandern. Durch Filtration kann die Peptidlösung vom Gel abgetrennt und anschließend analysiert werden, z. B. mittels Massenspektrometrie (Weg A in 7).

Es wurde nun gefunden, dass sich dieses mehrstufige und aufwändige Verfahren erheblich vereinfachen und verkürzen lässt, wenn der Entfärbeschritt parallel zum enzymatischen Verdau durchgeführt wird. Hierzu wird das gefärbte Gelstück in einem für den proteolytischen Verdau angemessenem Puffer aufgenommen und mit einer Protease wie z. B. Trypsin in Anwesenheit von Polyamid inkubiert. Bei dieser Vorgehensweise wird der Farbstoff zum einen durch die hohe Affinität zum Polyamid aus dem Gel herausgelöst und in eine unlösliche Form überführt. Zum anderen wird das Protein durch die Protease in Peptide zerlegt und setzt so einen Teil des Farbstoffes frei, da kurzkettige Peptide eine geringere Affinität zu Farbstoffen besitzen als langkettige Proteine. Der Farbstoff wandert aus dem Gel in das umgebende Medium und wird nun vom Polyamid fixiert. Letztendlich entsteht eine Peptidlösung, in der kein freier Farbstoff mehr vorliegt und die somit besonders für eine analytische Weiterverarbeitung geeignet ist. Durch eine einfache Filtration kann nun die Peptidlösung vom Gel, vom Polyamid und den daran gebundenen Farbstoffen befreit werden und einer Analyse zugeführt werden (Weg B in 7).

Die Erfinder konnten in experimentellen Versuchen zeigen, dass der proteolytische Verdau von Proteinen, die sich in einem gefärbten Gelstück befinden, auf diese Weise deutlich beschleunigt und vereinfacht werden kann.

In einem experimentellen Versuch unterwarfen die Erfinder zwei mit Coomassie Brillant Blau R-250 gefärbten Gelstücke, welche jeweils 20 pmol des Proteins Glycerinaldehyphosphat-Dehydrogenase (GAPDH) enthielten, einem enzymatischen Verdau mit der Protease Trypsin. Ein Gelstück wurde ohne vorhergehendes Entfärben der enzymatischen Reaktion einem Puffer (Tris 50 mM, pH 8,5) unterzogen. Nach erfolgter Reaktion war eine blau gefärbte Lösung entstanden, die neben den gewünschten Peptiden auch den Farbstoff als unerwünschte Komponente enthielt. Diese Lösung wurde vom Gelstück abgetrennt, über Chromatographie an C18-Silicagel (reversed phase chromatography) von Puffersalzen befreit und mittels Massenspektrometrie (ESI-MS) analysiert. Im zugehörigen Massenspektrum (8A) dominierten Signale von Ionen, die vom Coomassie Farbstoff herrühren. Die gewünschten Signale der Peptide waren demgegenüber unterdrückt und teilweise von den Farbstoffsignalen überlagert.

Das andere Gelstück wurde wie zuvor beschrieben dem enzymatischen Verdau unterworfen mit dem Unterschied, dass bei diesem Ansatz 50 &mgr;g Polyamid 6 Pulver zugegen war. Nach erfolgter Reaktion war eine farblose Peptidlösung entstanden, da der Farbstoff vom Polyamid fixiert worden war. Die farblose Lösung wurde vom Gelstück und vom Polyamidpulver abgetrennt, über Chromatographie an C18-Silicagel (reversed phase chromatography) von Puffersalzen befreit und mittels Massenspektrometrie (ESI-MS) analysiert. Im zugehörigen Massenspektrum ( 8B) waren keine Signale von Ionen zu beobachten, die vom Coomassie Blau Farbstoff herrühren. Stattdessen waren die gewünschten Signale der Peptide mit im Vergleich zu 8A erhöhter Intensität zu detektieren.

4. Aufbereitung des Polyamides

Kommerziell erhältliches Polyamid 6 Pulver (100 &mgr;g) wurde in Trispuffer (40 &mgr;l) auf 60 °C erhitzt, der so erhaltene Extrakt vom Polyamid abgetrennt und über RP-Chromatographie an C18-Material aufbereitet. Eine Analyse des so erhaltenen Polyamid-Extrakts mittels ESI-Massenspektrometrie lieferte eine Fülle von Signalen. Einigen Signalen konnten verschiedenen linearen wie cyclischen Oligomere des &egr;-Caprolactams (Ln und Cn in 9) zugeordnet werden, die sich als Nebenprodukte bei der Herstellung von Polyamid 6 bilden und im Kunststoff eingeschlossen sind. Andere Signale dürften auf Zusatzstoffe des Kunststoffes zurückzuführen sein. Die Ergebnisse zeigen, dass somit handelsübliches Polyamid nicht uneingeschränkt zum Entfärben von Proteingelen eingesetzt werden kann, da sich eine Kontamination der Probe mit löslichen Oligomeren und Rückständen aus Polyamid störend bemerkbar machen kann. Dies gilt vor allem, wenn die entfärbten Proteinproben spektrometrischen Analysen unterzogen werden. Daher ist es gegebenenfalls notwendig, das Polyamid vor dem Einsatz als Entfärber aufzubereiten und von diesen Kontaminanten zu befreien. Dies kann beispielsweise durch verschiedene Extraktionsverfahren mit Lösungsmitteln geschehen. Bei der ESI-MS-Analyse des tryptischen Verdaus in 8B wurde ein derart vorbereitetes Polyamid eingesetzt. Daher sind hier keine Signale von Polyamid-Oligomeren bzw. Zusatzstoffen zu erkennen (9).


Anspruch[de]
Verfahren zur Aufreinigung von biologischen Proben, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Auftrennung der biologischen Proben in einer Trennmatrix;

b) Anfärben der aufgetrennten biologischen Proben mit einem Farbstoff;

c) optionale, Isolation eines oder mehrerer Isolate aus der Trennmatrix;

d) Entfärben von der biologischen Proben und/oder der Trennmatrix oder eines oder mehrerer Isolate durch ein in Kontakt bringen der gefärbten biologischen Probe, der gefärbten Trennmatrix und/oder des oder der gefärbten Isolate mit Polyamid; und

e) Isolation, Weiterverarbeitung und/oder analytische Charakterisierung der entfärbten biologischen Probe bzw. eines oder mehrerer entfärbter Isolate, wobei der Entfärbeschritt vor, während oder nach der Auftrennung angeordnet sein kann.
Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass das Polyamid ein Homopolyamid des Amino-Carbonsäuretypes ist. Verfahren nach Anspruch 1 oder dadurch gekennzeichnet, dass das Polyamid unverzweigt ist. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, dass das Polyamid proteasebeständig ist. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, dass das Polyamid aus der Gruppe von Polyamiden bestehend aus Polyamid 6, Polyamid 11, Polyamid 12 und/oder einer Mischung aus zwei oder mehreren dieser Polyamide ausgewählt ist. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, dass der zur Färbung der Proteine eingesetzte Farbstoffe aus der Klasse der Triphenylmethanfarbstoffe ausgewählt wird. Verfahren nach Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, dass der zur Färbung verwendete Farbstoff ein Coomassie-Blau Farbstoff ist. Verwendung von Polyamid in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7. Verwendung von Polyamid zur Entfärbung von mit Farbstoff angereicherten Lösungsmitteln, Matrizen oder Proteingemischen, wobei das eingesetzte Polyamid das Diffusionsgleichgewicht so verschiebt, dass gelöste Farbstoffmoleküle dem Lösungsmittel, der Matrix oder dem Proteingemisch entzogen werden. Verwendung von Polyamid gemäß Anspruch 9 dadurch gekennzeichnet, dass der Farbstoff ein Triphenylmethanfarbstoff, vorzugsweise Coomassie-Blau Farbstoff ist. Vorrichtung zur Entfärbung von Lösungsmitteln und/oder Proteinen, die mit Farbstoff angereichert sind dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung als Ganzes oder in Teilbereichen aus Polyamid gefertigt ist, mit Polyamid beschichtet ist oder Polyamid enthält. Vorrichtung gemäß Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ein Einmalreaktionsgefäß ist, welches auf der Innenseite in Teilbereichen oder im Ganzen mit Polyamid beschichtet ist oder in welchem Polyamid vorgelegt ist. Vorrichtung gemäß Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine durchbrochene Aussenhaut hat, durch welche Lösungsmittel und Farbstoffmoleküle diffundieren oder wandern können. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13 dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine Aussenhaut aus trypsinbeständigen Materialien hat. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14 dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung Farbstoffbeschichtet ist, um die Kinetik der Proteinentfärbung mittels Polyamid optisch zu verfolgen. Polyamidmembran als Zwischenschicht für eine mehrdimensionale Gelelektrophorese dadurch gekennzeichnet, dass die Polyamidmembran ein Längen-zu-Breiten-Verhältnis von 0,002 inklusive bis 0,2 inklusive, 0,005 inklusive bis 0,1 inklusive, 0,01 inklusive bis 0,05 inklusive oder etwa 0,025 aufweist. Polyamidmembran als Auflage für großflächige zweidimensionale Gelelektrophoresen dadurch gekennzeichnet, dass die Polyamidmembran ein Längen-zu-Breiten-Verhältnis von 0,1 inklusive bis 10 inklusive, 0,25 inklusive bis 7,5 inklusive, 0,5 inklusive bis 5 inklusive, 0,75 inklusive bis 2,5 inklusive oder etwa 1 aufweist.






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