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Dokumentenidentifikation DE60213002T2 08.02.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001459075
Titel NORMALISIERUNG VON MICROANORDNUNG-DATEN AUF DER BASIS VON HYBRIDISIERUNG MIT INTERNEM STANDARD
Anmelder PamGene B.V., Den Bosch, NL
Erfinder VAN BEUNINGEN, Gerardus, Marinus, NL-5345 RR Oss, NL
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 60213002
Vertragsstaaten AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, SI, SK, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 17.12.2002
EP-Aktenzeichen 027966639
WO-Anmeldetag 17.12.2002
PCT-Aktenzeichen PCT/EP02/14426
WO-Veröffentlichungsnummer 2003054551
WO-Veröffentlichungsdatum 03.07.2003
EP-Offenlegungsdatum 22.09.2004
EP date of grant 05.07.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 08.02.2007
IPC-Hauptklasse G01N 33/96(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12Q 1/68(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Beschreibung Fachgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verfahren und entsprechende Anordnungen („arrays"), die besonders dafür geeignet sind, Signalfehler zu korrigieren, die aufgrund von Variationen bei der Probenherstellung entstanden sind. Verfahren und Zusammensetzungen für die Durchführung quantitativer, auf einer Anordnung basierender Analysen werden zur Verfügung gestellt. In den vorliegenden Verfahren wird sowohl ein Reporter als auch ein Analyt verwendet, wobei der Reporter durch die selektive Bindung an einen internen Standard gekennzeichnet ist, der auf der Anordnung vorhanden ist, das heißt, dass mindestens eine Untergruppe der Spots, wenn nicht sogar alle Spots, die auf der Anordnung vorhanden sind, die in dem Verfahren verwendet wird, einen internen Standard enthalten, der durch den Rezeptor gebunden werden kann.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Mikro-Anordnungen von bindenden Stoffen wie z.B. Oligonucleotiden und Peptiden wurden in der Biotechnologie und in verwandten Fachgebieten ein immer wichtigeres Werkzeug. Diese bindenden Stoff-Anordnungen, bei denen eine Mehrheit von bindenden Stoffen in der Form einer Anordnung oder eines Musters auf ein Substrat aufgebracht werden, häufig ein festes Substrat, finden bei einer Vielzahl von Anwendungen Verwendung, einschließlich des Absuchens von Arzneistoffen, der Sequenzierung von Nucleinsäuren, der Mutationsanalyse, eines Verfahrens zur Bestimmung des Genotyps, der Analyse zur Expressionsdarstellung („expression profiling"), der Durchmusterung auf Gen-Abnormalität durch MAPH und dergleichen. Eine wichtige Verwendung der Mikro-Anordnungen ist bei der Analyse der differentiellen Genexpression, wobei die Expression von Genen in verschiedenen Zellen, normalerweise einer Zelle des Interesses und einer Kontrolle, verglichen wird und alle Abweichungen in der Expression identifiziert werden. In solchen Analysen zeigt das Vorhandensein von Abweichungen einen Unterschied in den Genklassen, die in den Zellen exprimiert werden, die miteinander verglichen werden.

In den Verfahren der differentiellen Genexpression finden die Anordnungen eine Verwendung, indem sie als ein Substrat dienen, an denen "Sonden"-Fragmente oder "Rezeptoren" wie z.B. Polynucleotide gebunden werden. Man erhält anschließend "Ziele" oder "Analyten" von analogen Zellen, Geweben oder Organen z.B. von einem gesundem und einem erkrankten Organismus. Die Ziele werden anschließend an die immobilisierte Gruppe von Polynucleotid-"Sonden"-Fragmenten hybridisiert. Unterschiede zwischen den so erhaltenen Hybridisierungsmustern werden anschließend nachgewiesen und mit den Unterschieden bei der Genexpression in den zwei Quellen in eine Beziehung gesetzt.

Aufgrund der verschiedenartigen und wichtigen Informationen, die Mikro-Anordnungen zur Verfügung stellen können, sowie der vielen potentiellen Anwendungen solcher Vorrichtungen ist die Verwendung dieser Mikro-Anordnungen in der Forschung, der Diagnose und verwandten Anwendungen deutlich gestiegen und eine weitere Steigerung wird erwartet. Eine Vielfalt von verschiedenen Anordnungs-Technologien wurde entwickelt, um den steigenden Bedarf der biotechnologischen Industrie zu decken, wie durch die große Anzahl der Patente und der anderen veröffentlichten Literatur gezeigt wird.

Es bestehen jedoch Nachteile bei den aktuellen Protokollen. Die Effizienz der Hybridisierung der Ziel-Nucleinsäuren an die Anordnung kann zum Beispiel durch experimentelle Einschränkungen wie z.B. Unterscheide bei der Probenherstellung eingeschränkt sein oder verschiedenen Ziel-Nucleinsäuren können unterschiedliche Hybridisierungseffizienzen für die Sonden-Nucleinsäuren auf der Anordnung besitzen. Unterschiede bei der Hybridisierungseffizienz führen zu Unterschieden bei der Intensität der Hybridisierung an die verschiedenen Sonden-Nucleinsäuren auf der Anordnung, auch wenn die Ziele in äquivalenten Konzentrationen vorhanden sind. Wenn zwei oder mehr Anordnungen in einer bestimmten Anwendung verwendet werden, z.B. bei der Genexpressionsanalyse, kann eine Variation in der Qualität der Anordnung (Reproduzierbarkeit der Herstellung der Anordnung) und in den Analysebedingungen zwischen den unterschiedlichen Anordnungen einen direkten Vergleich der von den Anordnungen erhaltenen Daten verhindern, weil die Bedingungen wie z.B. die Hybridisierungszeit, Sondenmarkierung und Nachweisverfahren unterschiedlich sein können und Variationen zwischen den Anordnungen vorliegen können. Jeder dieser Fehler führt zu einer Spot-zu-Spot-Variation. Des weiteren ist es schwierig, Daten zu vergleichen, die durch die Verwendung von unterschiedlichen Arten von auf Oligonucleotiden oder Polynucleotiden basierenden Anordnungen gewonnen wurden. Die Konzentration der Ziel-Nucleinsäuren in einer Probe kann nicht auf der Basis der Signalintensität zwischen Anordnungen verglichen werden, die durch unterschiedliche Verfahren und/oder von verschiedenen Herstellern hergestellt wurden, weil die Gruppe von Sondensequenzen zwischen den Anordnungen häufig variiert. Der Signalfehler, der in den Anordnungen erhalten wird, ist daher die Summe von allen individuellen Fehlern wie z.B. die inhomogene Substrataktivierung, eine Variation des flüssigen verabreichten Volumens, Unterschiede bei der Sondenbindung, Temperaturvariation, Flussvariation, Abbildungsfehler usw. Daher wird die aktuelle Anordnungs-Technologie hauptsächlich für die Entdeckung von differentiell exprimierten Genen und nicht für eine spezifische quantitative Analyse verwendet. In dieser Beziehung werden im Allgemeinen zwei Formate verwendet: (a) der Vergleich von zwei Hybridisierungsmustern zueinander und (b) die gleichzeitige Hybridisierung von zwei unterschiedlichen Zielen, die von zwei unterschiedlichen biologischen Quellen stammen und durch verschiedene Markierungen markiert sind, an die gleiche Anordnung. Im zweiten Ansatz, der häufiger verwendet wird, werden häufig x-fache Unterschiede in der Genexpression zwischen den beiden Proben gemessen.

In diesen und anderen Anwendungsgebieten ist es wichtig, dass eine deutliche Unterscheidung zwischen den verschiedenen mRNA-Expressionsspiegeln und den Unterschieden in der Anzahl der genetischen Kopien, die so klein wie 1,5-fach sind, getroffen werden kann. Dies benötigt, dass alle Aspekte des Systems einen Signalunterschied von nur 1,5-fach unterscheiden können sollten.

Daher besteht ein kontinuierlicher Bedarf für die Entwicklung von zusätzlichen Anordnungen und auf Anordnungen basierenden Protokollen.

Es wäre von Interesse, ein auf einer Anordnung basierendes Verfahren zu entwickeln, das einen internen Kalibrierungsstandard einschließt, wobei ein solches Verfahren Variationen eliminieren würde, die von der Qualität der Anordnung, der Art der Anordnung, der Qualität der Analysebedingungen und dergleichen stammen. Zusätzlich besteht ein Bedarf für ein auf einer Anordnung basierendes Protokoll, das quantitative Daten über die Probenherstellung, die Zielkonzentration und ein entsprechendes Verfahren der Quantifizierung, das einen genaueren Vergleich der Daten zwischen Anordnungen ermöglicht, zur Verfügung stellt.

WO 00/34523 von Hyseq Inc. beschreibt die Zugabe einer nachweisbaren Markierung, die proportional zu der Menge ist, die an einem bestimmten Spot immobilisiert ist, um die Unterschiede der Sondenbindung während der Herstellung der Analysen zu korrigieren. WO 00/65095 von Clontech Laboratories Inc. betrifft gleichermaßen die Normalisierung von Unterschieden bei der Immobilisierungseffizienz der Sonden an verschiedenen Adressen in der Anordnung.

Offensichtlich betrifft der Stand der Technik nur die Herstellung von Anordnungen und die Spot-zu-Spot-Variation, aber nicht die Signalfehler, die aufgrund der Analytverarbeitung entstehen. Mittlerweile werden die heutigen Mikro-Anordnungen durch etablierte Techniken hergestellt, was im Allgemeinen zu qualitativ sehr verlässlichen Produkten führt. Das vorherrschende Qualitätsproblem liegt bei der Probenherstellung.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Um die individuellen Unterschiede zu messen und anschließend diese Unterschiede zu korrigieren, stellt die vorliegende Erfindung Mikro-Anordnungen zur Verfügung, die ein Substrat mit definierten Regionen umfassen, wobei jede bindende Substanz, die an einer vordefinierten Region an dem Substrat immobilisiert ist, einen Rezeptor und eine vorweg bestimmte Menge eines internen Standards umfasst, wobei das durch den internen Standard erzeugte Signal mittels eines Reporter-Moleküls bestimmt wird und wobei das Reporter-Molekül selektiv an den internen Standard bindet. Des weiteren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Analyten in einer Probe wie zum Beispiel einer biologischen Probe zur Verfügung, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

  • (a) eine Mikro-Anordnung zur Verfügung zu stellen, die ein Substrat umfasst, wobei jede bindende Substanz, die an dem Substrat immobilisiert ist, eine vorweg bestimmte Menge von Rezeptor und eine vorweg bestimmte Menge eines internen Standards umfasst,
  • (b) ein Reporter-Molekül zur Verfügung zu stellen, das selektiv an den internen Standard bindet,
  • (c) das Reporter-Molekül der Probe zuzusetzen,
  • (d) die Probe, die das Reporter-Molekül umfasst, mit der Mikro-Anordnung unter Bedingungen in Kontakt zu bringen, welche die Ausbildung einer Bindung zwischen Rezeptor und Analyt und zwischen internem Standard und dem Reporter-Molekül ermöglichen,
  • (e) das Signal des Reporter-Moleküls, das an den internen Standard bindet, zu bestimmen,
  • (f) das Signal des Analyten, der an den Rezeptor bindet, zu bestimmen, und
  • (g) das Signal aus Schritt (f) für das Signal von Schritt (e) zu normalisieren.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft Verfahren und entsprechende Mikro-Anordnungen, die besonders geeignet sind, Signalfehler zu korrigieren, die aufgrund von Variationen bei der Probenherstellung entstehen. Die Verfahren und Zusammensetzungen zur Durchführung quantitativer, auf Mikro-Anordnung basierender Analysen werden zur Verfügung gestellt. In den vorliegenden Verfahren wird sowohl ein Reporter als auch ein Analyt verwendet, wobei der Reporter durch die selektive Bindung an einen internen Standard, der auf der Anordnung vorhanden ist, gekennzeichnet ist, das heißt, dass mindestens eine Untergruppe der Spots, wenn nicht sogar alle Spots, die auf der Anordnung vorhanden sind, die in dem Verfahren verwendet wird, einen internen Standard enthalten, der durch den Rezeptor gebunden werden kann.

In dieser Spezifikation und den beigefügten Ansprüchen schließen die singulären Formen "ein/eine" und "der/die/das" den Bezug zum Plural ein, außer der Zusammenhang schreibt deutlich etwas anderes vor. Wenn es nicht anders definiert wird, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke die gleiche Bedeutung, wie im Allgemeinen vom Fachmann verstanden wird, den diese Erfindung betrifft.

Um eine Probe auf einer Mikro-Anordnung zu analysieren, wird die Probe im Allgemeinen manipuliert, bevor sie mit der Mikro-Anordnung in Kontakt gebracht wird. Die Manipulationen schließen zum Beispiel die Herstellung von cDNA von RNA, die Herstellung und/oder Isolation von Nucleinsäuren, Antikörpern, Polypeptiden und dergleichen ein. Jeder Schritt dieser Manipulation einer Probe kann Fehler wie z.B. in der Menge oder der Integrität des Moleküls des Interesses einführen. Dieses Problem ist besonders offensichtlich, wenn zwei oder mehr Proben miteinander verglichen werden müssen. Die vorliegende Erfindung betrifft die Normalisierung von Signalen der Proben, die einen Analyten enthalten, mittels Zugabe einer vorweg bestimmten Menge eines Reporters zu dieser Probe. Der interne Standard wird schließlich zur Normalisierung der Probe-zu-Probe-Variation verwendet, die aufgrund der Verarbeitung der Proben entstanden ist (Normalisierung zwischen den Proben), sowie der Variationen, die bei einer vorliegenden Probe beobachtet werden, wie z.B. aufgrund einer Spot-zu-Spot-Variation in einer vorliegenden Mikro-Anordnung (Normalisierung innerhalb der Probe).

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Identifikation eines Analyten in einer Probe, welches die Schritte umfasst:

  • (a) eine Mikro-Anordnung zur Verfügung zu stellen, die ein Substrat umfasst, wobei jede bindende Substanz, die an dem Substrat immobilisiert ist, eine vorweg bestimmte Menge von Rezeptor und eine vorweg bestimmte Menge eines internen Standards umfasst,
  • (b) ein Reporter-Molekül zur Verfügung zu stellen, das selektiv an den internen Standard bindet,
  • (c) das Reporter-Molekül der Probe zuzusetzen,
  • (d) die Probe, die das Reporter-Molekül umfasst, mit der Mikro-Anordnung unter Bedingungen in Kontakt zu bringen, welche die Ausbildung einer Bindung zwischen dem Rezeptor und dem Analyt und zwischen dem internen Standard und dem Reporter-Molekül ermöglicht,
  • (e) das Signal des Reporter-Moleküls, das an den internen Standard bindet, zu bestimmen,
  • (f) das Signal des Analyten, der an den Rezeptor bindet, zu bestimmen, und
  • (g) das Signal aus Schritt (f) für das Signal von Schritt (e) zu normalisieren.

Der Ausdruck "Analyt in einer Probe" bezieht sich auf ein Molekül in einer Probe, das heißt ein Molekül, das analysiert werden soll und das in einer Probe vorliegt. Die Moleküle in einer Probe können z.B. Nucleinsäuren (sowohl DNA als auch RNA), Peptide, Polypeptide, Proteine, Antikörper, Kohlenhydrate und/oder kleine Biomoleküle (z.B. Kandidaten-Arzneistoffe) sein. Die Probe kann zum Beispiel eine physiologische oder eine biologische Probe sein.

Proben werden in Allgemeinen manipuliert, um den Analyten zu isolieren und/oder zu charakterisieren. Analyt-Nucleinsäuren werden zum Beispiel im Allgemeinen von einer biologischen Probe (von Zellen, Geweben, Organen etc.) isoliert, verarbeitet und zu anderen Nucleinsäuren wie z.B. mRNA, cDNA, PCR-Produkte, cRNA und dergleichen umgewandelt, wobei auf dem Fachgebiet bekannte Technologien wie z.B. PCR, reverse Transkription etc. verwendet werden. Die Analyt-Nucleinsäuren können von einem Gewebe oder Zelle des Interesses unter Verwendung jedes Verfahrens, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, isoliert werden. Gesamt-RNA oder ihre transkriptionell aktive Fraktion mRNA kann von einem Gewebe isoliert und markiert und direkt als eine Analyt-Nucleinsäure verwendet werden oder sie kann in eine markierte cDNA, cRNA etc. mittels Verfahren wie der reversen Transkription, Transkription, Tyras, NASBA und/oder PCR umgewandelt werden. Im Allgemeinen werden solche Verfahren die Verwendung von Oligonucleotid-Primern anwenden und die Primer können durch einen Promotor der Bakteriophagen-RNA-Polymerase verankert werden. Die Primer wie z.B. Oligo(dT)-Primer oder Zufalls-Hexamere können entworfen werden, um ein großes Spektrum von RNA-Spezies zu kopieren, oder sie werden entworfen, um spezifisch eine Untergruppe von Genen des Interesses zu kopieren. Nach dem Kopierschritt, das heißt die Umwandlung von mRNA zu cDNA, kann die cDNA durch PCR oder durch eine lineare Amplifikation unter Verwendung der Bakteriophagen-RNA-Polymerase vermittelten Transkription, von NASBA oder Tyras amplifiziert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Analyt-Nucleinsäuresequenzen wie bei den Reporter-Nucleinsäuren unter Verwendung einer Gruppe einer repräsentativen Anzahl von genspezifischen Primern hergestellt.

In der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck "Reporter" auf ein Molekül, das mit einer internen Kontrolle in Verbindung tritt, z.B. damit interagiert oder daran bindet, die kovalent an das Substrat der Anordnung gebunden ist. Der Reporter wird zu einer Probe zugegeben, bevor die Probe mit einer Anordnung in Kontakt gebracht wird. Der Reporter kann an verschiedenen Schritten der Manipulation der Probe zugegeben werden. Es wird offensichtlich sein, dass ein Reporter den gleichen oder den meisten Schritten der Manipulation ausgesetzt ist, welchen die Probe ausgesetzt ist, wenn der Reporter im ersten Schritt/in den ersten Schritten der selben Manipulation zugegeben wird.

Zum Beispiel können Reporter und Analyt-Nucleinsäuren an die Anordnung gleichzeitig hybridisiert und/oder nachgewiesen werden. Reporter und Analyt-Nucleinsäuren können daher vor der Hybridisierung kombiniert werden und die Anordnung kann gleichzeitig mit beiden hybridisieren, um eine mögliche Variabilität in den Hybridisierungsbedingungen zu minimieren. Eine bekannte Menge des markierten Reporters und der Analyt-Nucleinsäuren kann zu dem gleichen Hybridisierungspuffer zugegeben werden und anschließend mit einer oder mit mehreren Anordnungen gleichzeitig unter Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht werden. In einem anderen Beispiel werden eine bekannte Menge von markiertem Reporter und Analyt-Nucleinsäuren dem gleichen Hybridisierungsgemisch zugegeben und dieser Puffer wird für die getrennte Hybridisierung von verschiedenen Anordnungen aliquotiert. Durch die Lagerung der Allquote des Hybridisierungsgemisches (das heißt eine Lagerung bei –20°C oder –70°C) können verschiedene Anordnungen an verschiedenen Zeitpunkten mit ungefähr den gleichen Mengen des Gemisches hybridisiert werden.

Der Ausdruck "Ziel" bezieht sich auf eine zu analysierende Probe. Das Ziel kann den Analyten und/oder den Reporter umfassen.

Ein anderes Merkmal des Reporters, der in einer Probe dem Analyten zugegeben wird, ist, dass die Konzentration und/oder die Menge des Reporters bekannt ist.

In dem Moment der Zugabe des Reporters zu der Probe sollte der Reporter strukturell so ähnlich wie möglich zu dem Analyten in der Probe sein. Daher kann der Reporter z.B. Nucleinsäuren (sowohl DNA als auch RNA), Peptide, Polypeptide, Proteine, Antikörper, Kohlenhydrate und/oder kleine Biomoleküle sein. Wenn zum Beispiel der Analyt eine RNA ist, die zu cDNA umgewandelt wurde, dann sollte der Reporter vorzugsweise ebenfalls RNA sein. In anderen Worten, die Struktur des Reporter-Moleküls sollte so ähnlich wie möglich zu der des Analyten sein, um die Bindung wie z.B. die Hybridisierung des Analyten an z.B. die Ziel-Nucleinsäure maximal zu imitieren.

Reporter-Nucleinsäuren können die gleiche Länge wie ihre entsprechenden internen Standardsequenzen auf der Anordnung oder wie die Analyt-Nucleinsäure in der Probe (falls vorhanden) besitzen oder kürzer oder länger sein.

Jede Reporter-Nucleinsäure sollte jedoch mindestens teilweise komplementär zu ihrer entsprechenden internen Standard-Nucleinsäure sein. Zusätzlich sollte die Reporter-Nucleinsäure strukturelle und Hybridisierungskennzeichen besitzen, die denen der entsprechenden Analyt-Nucleinsäure sehr ähnlich sind, z.B. sollte sie ähnliche Hybridisierungseffizienzen, ähnliche Kinetiken mit den komplementären Sondensequenzen, eine ähnliche Hintergrundhybridisierung mit anderen Sequenzen etc. besitzen. Wenn zum Beispiel die Analytgruppe der Nucleinsäuren markierte cDNAs umfassen, die von einer Kontrollgruppe eines repräsentativen Pools synthetischer RNAs revers transkribiert werden, werden die Reporter-Nucleinsäuren ebenfalls im Allgemeinen markierte cDNAs sein, die von mRNAs wie z.B. synthetischen mRNAs revers transkribiert werden.

Jede interne Standard-Nucleinsäure kann die gleiche Länge wie ihre entsprechende Reporter-Nucleinsäure besitzen, länger als die entsprechende Reporter-Nucleinsäure oder kürzer als die entsprechende Reporter-Nucleinsäure sein. Im Allgemeinen beträgt die Länge jeder Reporter-Nucleinsäure oder Gruppe von Reporter-Nucleinsäuren in einer vorliegenden Probe mindestens etwa 25 Nucleotide oder mindestens etwa 50 Nucleotide oder mindestens etwa 100 Nucleotide, wobei die Länge 2 kb oder länger betragen kann, aber im Allgemeinen wird sie eine Länge von etwa 1 kb nicht überschreiten und wird im Allgemeinen eine Länge von 800 Nucleotiden nicht überschreiten.

Die Reporter-Nucleinsäure kann synthetische Nucleinsäuren sein oder von einer biologischen Quelle isoliert werden. Die Reporter-Nucleinsäuren können unter Verwendung jedes geeigneten Protokolls einschließlich Protokollen der reversen Transkription (z.B. unter Verwendung von AMV oder MoMLV reverse Transkriptase), der Bakteriophagen-RNA-Polymerase (T7-RNA-Polymerase, T3-RNA-Polymerase etc.) vermittelten Transkription, PCR-, NASBA- oder Tyras-Protokollen, Oligonucleotidsynthese-Protokollen (z.B. Nucleotid-Chemie) und dergleichen hergestellt werden. In einer Ausführungsform werden die Reporter-Nucleinsäuresequenzen unter Verwendung von cDNA-Fragmenten, die in geeignete Expressionsvektoren unter Verwendung einer Gruppe einer repräsentativen Anzahl von genspezifischen Primern cloniert wurden, hergestellt. Diese clonierten cDNAs werden anschließend verwendet, um RNA-Kontrollziele unter Verwendung von Techniken wie z.B. PCR und/oder Bakteriophagen-RNA-Polymerase vermittelte Transkription, NASBA oder Tyras herzustellen. Von Interesse sind Anwendungen, in denen die genspezifischen Primer, die verwendet werden, um den Reporter herzustellen, die gleichen sind wie die genspezifischen Primer, die verwendet werden, um die Analyt-Nucleinsäuren herzustellen.

Nach der Synthese wird jede Reporter-Nucleinsäure quantifiziert, wobei Verfahren wie z.B. Spektrophotometrie, Fluoreszenzmessung etc. verwendet werden. Bekannte quantitative Mengen von jeder Reporter-Nucleinsäure werden mit der Probe für die Probenherstellung gemischt oder direkt für die Hybridisierungsanalysen verwendet, wie hierin beschrieben wird. In einer anderen Ausführungsform werden die Reporter-Nucleinsäuren in gleichen molaren Mengen, in vorweg bestimmten Verhältnissen, in gleichen Gewichtsmengen etc. zusammen gemischt, wobei sie in vielen Ausführungsformen in gleichen Gewichtsmengen zusammen gemischt werden, so dass die Menge von jeder individuellen Reporter-Nucleinsäure in der Probe die gleiche wie die der Analyt-Nucleinsäure in der Probe ist.

Jedes Reporter-Molekül sollte seinen entsprechenden internen Standard mit Selektivität und Empfindlichkeit binden. Bei einer Reporter-Nucleinsäure, die selektiv an die entsprechende interne Standard-Nucleinsäure bindet, ist die Wahrscheinlichkeit zum Beispiel mindestens 10-mal, mindestens 100-mal oder mindestens 1000-mal größer, dass sie mit ihrer bestimmten internen Standard-Nucleinsäure als mit einer nicht spezifischen Nucleinsäure und vorzugsweise mit jeder anderen Sequenz, die auf der Anordnung vorliegt, bindet. Nicht-spezifische Nucleinsäuren schließen solche mit einer Zufallssequenz, von codierenden Sequenzen, die in einer bestimmten Anordnung gefunden werden und die anders als die bestimmte interne Standard-Nucleinsäure sind, und von codierenden Sequenzen von nicht-internen Standardsequenzen ein, die spezifisch für die Organismen sind, von denen die interne Standard-Nucleinsäuren stammen.

Reporter-Nucleinsäuren der Erfindung zeigen ebenfalls eine ausreichende Empfindlichkeit für die Bindung mit ihren bestimmten internen Standard-Nucleinsäuren. Mit einer "ausreichenden Empfindlichkeit" ist gemeint, dass die Bindung der Reporter-Nucleinsäure deutlich größer als die Bindung der Hintergrund-Nucleinsäuren mit einer Zufallssequenz ist, wobei die Stärke der Bindung zum Beispiel mindestens 10-mal, mindestens 100-mal oder mindestens 500-mal größer ist als die Erkennung von Hintergrund-Nucleinsäuren mit einer Zufallssequenz. In vielen Ausführungsformen werden die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Reporter-Nucleinsäuren mit Algorithmen ausgewählt, wobei solche Algorithmen detailliert in der PCT-Veröffentlichung WO 97/10365 und PCT/US96/14839 beschrieben werden.

Eine große Vielfalt von verschiedenen Molekülen kann auf dem Substrat der vorliegenden Anordnungen immobilisiert werden. Auf ähnliche Weise sind die vorliegenden Verfahren für eine große Vielfalt von verschiedenen Molekülen oder Rezeptoren anwendbar, die auf dem Substrat der Anordnungen aufgebracht werden. Die Verfahren und Anordnungen werden hierin besonders beispielhaft im Sinne von Polynucleotiden, die auf einem Substrat immobilisiert werden, dargestellt, aber sie sind gleichermaßen für andere Arten von Molekülen anwendbar. Der Fachmann kann zum Beispiel leicht die vorliegenden Verfahren und Anordnungen adaptieren, um sie für andere Nucleinsäuren (sowohl DNA als auch RNA), Peptide, Polypeptide, Proteine, Antikörper, Kohlenhydrate, kleine Biomoleküle (z.B. Kandidaten-Arzneistoffe) oder andere Arten von Molekülen, die auf einem Substrat durch jedes Verfahren immobilisiert werden können, anzuwenden.

Die Ausdrücke "vorweg bestimmte Region" oder "Spot" werden in der gesamten vorliegenden Erfindung austauschbar verwendet. Der zweite Ausdruck bezieht sich auf individuelle, räumlich adressierbare Positionen auf einer Anordnung.

In der vorliegenden Erfindung wird eine bindende Substanz auf dem Substrat an einer räumlich vorweg bestimmten Region, das heißt an einem bestimmten Spot, immobilisiert. Die bindende Substanz umfasst mindestens einen Rezeptor und eine vorweg bestimmte Menge von einem internen Standard. Die bindende Substanz bezieht sich nicht auf eine Bindung zwischen dem Rezeptor und dem internen Standard oder schließt diese aus.

Der Rezeptor und der interne Standard sind zum Beispiel getrennte Moleküle.

In diesem Sinne bezieht sich der Ausdruck "Rezeptor" auf jedes Molekül, das stabil mit einem Substrat assoziiert ist, das einem Zielmolekül des Interesses oder einem Analyten in einer Probe, wenn vorhanden, entspricht. Rezeptoren sind keine Zufallsmoleküle, sondern sie sind vorweg bestimmt.

Der Ausdruck "interner Standard" bezieht sich auf jedes Molekül, das stabil mit einem Substrat assoziiert ist, das einem Reporter-Molekül entspricht. Das Reporter-Molekül wird entworfen, um spezifisch den internen Standard zu binden oder sich daran anzulagern.

Die internen Standards sind strukturell so ähnlich wie möglich zu den Rezeptoren, die in den Analysen verwendet werden, z.B. sind beide Gruppen von internen Standards und Rezeptoren Nucleinsäuren. Mit anderen Worten, die Struktur des internen Standards sollte ähnlich zu der des Rezeptors sein, um die Bindung, z.B. die Hybridisierung, maximal zu imitieren.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren, wie sie hierin beschrieben werden, wobei der interne Standard Nucleinsäuren, Polynucleinsäuren oder (Poly)Peptide oder chemische Verbindungen umfasst.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren, wie sie hierin beschrieben werden, wobei das Reporter-Molekül Polynucleinsäuren oder (Polypeptide) oder chemische Verbindungen umfasst.

Ein kritisches Merkmal der Anordnungen der Erfindung sind die vorweg bestimmten Mengen des Rezeptors und des internen Standards. Der Fachmann wird zu schätzen wissen, dass der Rezeptor und der interne Standard ein Hybrid sein können, das heißt der Rezeptor und der interne Standard sind kovalent aneinander gebunden oder der Rezeptor und der interne Standard liegen auf dem gleichen Molekül, z.B. als ein Fusionsprotein. Eine Nucleinsäure kann zum Beispiel zwei Regionen enthalten, z.B. ein Hybrid, wobei eine Region, das heißt der interne Standard, dem Reporter entspricht, während eine andere Region, das heißt der Rezeptor, dem Analyten entspricht. Im Fall von einem Hybrid entspricht die Menge des internen Standards direkt der Menge des Rezeptors.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, wie es hierin beschrieben wird, wobei jede bindende Substanz, die auf dem Substrat immobilisiert wird, mindestens 1 % bis höchstens 99% des internen Standards umfasst.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, wie es hierin beschrieben wird, wobei jede bindende Substanz, die auf dem Substrat immobilisiert ist, die gleiche, vorweg bestimmte Menge des internen Standards umfasst.

Nicht-Rezeptor-Sequenzen, z.B. Kontroll-Nucleinsäuren, auf der Anordnung müssen keine Ziel-Nucleinsäure oder eine entsprechende Nucleinsäure in der Gruppe des Analyten oder des Reporters enthalten, z.B. Sequenzen der Anordnung wie z.B. Orientierungssequenzen, Negativ- und Positivkontrollsequenzen etc., die auf der Anordnung vorliegen können.

Der Ausdruck "Nucleinsäure", wie er hierin verwendet wird, bedeutet ein Polymer, das aus Nucleotiden, z.B. Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden, zusammengesetzt ist. Die Ausdrücke "Ribonucleinsäure" und "RNA", wie sie hierin verwendet werden, bedeuten ein Polymer, das aus Ribonucleotiden zusammengesetzt ist. Die Ausdrücke "Desoxyribonucleinsäure" und "DNA", wie sie hierin verwendet werden, bedeuten ein Polymer, das aus Desoxyribonucleotiden zusammengesetzt ist. Der Ausdruck "Oligonucleotid", wie er hierin verwendet wird, beschreibt ein Einzelstrang-Nucleotidmultimer von etwa 10 bis etwa 100 Nucleotiden in der Länge. Der Ausdruck "Polynucleotid", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Einzel- oder Doppelstrang-Polymer, das aus Nucleotidmonomeren von etwa 10 bis etwa 100 Nucleotiden in der Länge, im Allgemeinen von mehr als etwa 100 Nucleotiden in der Länge bis etwa 1000 Nucleotiden in der Länge zusammengesetzt ist.

Die Mikro-Anordnungen der vorliegenden Erfindung können von jeder gewünschten Größe sein, von etwa zwei Spots bis 106 oder noch mehr Spots sein. Die oberen und unteren Grenzen der Größe des Substrats werden ausschließlich durch die praktischen Erwägungen bei der Arbeit mit sehr kleinen oder großen Substraten bestimmt.

Für eine bestimmte Substratgröße wird die obere Grenze nur durch die Fähigkeit bestimmt, Spots in der Mikro-Anordnung zu erzeugen und nachzuweisen. Die bevorzugte Anzahl der Spots auf einer Mikro-Anordnung ist im Allgemeinen von der bestimmten Verwendung abhängig, für welche die Mikro-Anordnung verwendet wird. Die Sequenzierung durch Hybridisierung wird zum Beispiel im Allgemeinen große Anordnungen benötigen, während der Mutationsnachweis nur eine kleine Anordnung benötigen kann. Im Allgemeinen enthalten Mikro-Anordnungen von 2 bis etwa 106 Spots oder von etwa 4 bis etwa 105 Spots oder von etwa 8 bis etwa 104 Spots oder zwischen etwa 10 und etwa 2000 Spots oder von etwa 20 bis etwa 200 Spots.

Des weiteren müssen nicht alle Spots auf der Mikro-Anordnung einzigartig sein. Vielmehr sind in vielen Anwendungen Redundanzen bei den Spots mit dem Ziel, als interne Kontrollen zu dienen, erwünscht.

Eine Vielfalt von Techniken wurde für die Synthese und/oder Immobilisierung von Anordnungen von Polynucleotiden, einschließlich der in-situ-Synthese beschrieben, wobei die Polynucleotide direkt auf der Oberfläche des Substrats synthetisiert werden (vergl. z.B. US-Pat. Nr.: 5,744,305 von Fodor et al.) und das Anheften von vorsynthetisierten Polynucleotiden auf der Oberfläche eines Substrats an bestimmten Orten erfolgt (vergl. z.B. WO 98/31836). Zusätzliche Verfahren werden in WO 98/31836 auf den Seiten 41-45 und 47-48 u.a. beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist für die Verwendung mit jeder dieser derzeitig erhältlichen oder später entwickelten Techniken geeignet.

Die Immobilisierung von vorsynthetisierten Polynucleotiden an verschiedenen räumlichen Adressen ergibt eine Anordnung von Polynucleotiden, deren Sequenzen durch ihre räumlichen Adressen identifizierbar sind.

In Ausführungsformen, welche die in-situ-Synthese von Polynucleotiden beinhalten, werden die Polynucleotide in ihrer üblichen Weise synthetisiert. Das Syntheseschema ergibt eine Anordnung von Polynucleotiden, deren Sequenzen durch ihre räumlichen Adressen identifizierbar sind.

Während das vorstehende Verfahren die Markierung des letzten Nucleotids des Polynucleotids enthält, wird es der Fachmann zu schätzen wissen, dass andere Positionen oder zusätzliche Positionen auf ähnliche Weise markiert werden können, um Informationen über die Anteile der verkürzten Polynucleotide, die synthetisiert werden, zur Verfügung zustellen. In diesen Ausführungsformen sollten die Markierungen, die bei verschiedenen Schritten verwendet werden, von einander unterscheidbar sein.

Während das in-situ-Syntheseverfahren unter Verwendung von Phosphoramdit-Reagenzien beschrieben wird, wird man des weiteren erkennen, dass andere Reagenzien, bei denen andere Synthesestrategien verwendet werden, ebenfalls verwendet werden können und unter bestimmten Bedingungen in Abhängigkeit von der Stabilität der gewählten Markierung bei den Synthesebedingungen vorzuziellen sind. Beispiele von geeigneten Chemikalien und Reagenzien, die nicht einschränkend sein, sollen, werden zum Beispiel in Oligonuclotide Synthesis A Practical Approach, M.J. Gait, Hrsg., IRL Press, Oxford, England, 1985, beschrieben.

Die Zusammensetzung der immobilisierten Polynucleotide, z.B. Rezeptoren und interne Standards, ist nicht kritisch. Die einzige Notwendigkeit ist, dass sie in der Lage sind, an eine Ziel-Nucleinsäure mit einer komplementären Sequenz, z.B. Reporter oder Analyte, wenn welche vorhanden sind, zu hybridisieren. Die Polynucleotide können zum Beispiel nur aus natürlichen oder nur aus synthetischen Nucleotidbasen zusammengesetzt oder eine Kombination von beiden sein. Beispiele von modifizierten Basen, die nicht einschränkend sein sollen und die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden zum Beispiel in Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, G. Fasman, Hrsg. ORC Press, 1989, S. 385-392, beschrieben. Während in den meisten Fällen die Polynucleotide ausschließlich aus den natürlichen Basen (A, C, G, T oder U) zusammengesetzt sind, kann unter bestimmten Umständen die Verwendung von synthetischen Basen bevorzugt werden.

Während des weiteren die Rückgrate der Polynucleotide typischerweise ausschließlich aus "naturlichen" Phosphodiesterbindungen zusammengesetzt sind, können sie eine oder mehrere modifizierte Bindungen wie z.B. eine oder mehrere Phosphorthioat, Phosphoramidit oder andere modifizierte Bindungen enthalten. Als ein spezifisches Beispiel können ein oder mehrere immobilisierte Polynucleotide eine Peptidnucleinsäure (PNA) sein, die Amid-Zwischenbindungen enthält. Zusätzliche Beispiele von modifizierten Basen und Rückgraten, die in Zusammenhang mit der Erfindung verwendet werden können, sowie Verfahren für ihre Synthese können zum Beispiel in Uhlman & Peyman, 1990, Chemical Review 90(4): 544-584; Goodchild, 1990, Bioconjugate Chem 1(3): 165-186; Engholm et al., 1992, J Am Chem Soc 114: 1895-1897; Gryanznov et al., J Am Chem Soc 116: 3143-3144 sowie alle Referenzen, die vorstehend zitiert wurden, gefunden werden.

So können der interne Standard und die Rezeptor-Nucleinsäuren Polymere von Ribonucleotiden und Desoxyribonucleotiden einschließen, wobei die Ribonucleotide und/oder die Desoxyribonucleotide über 5' zu 3'-Bindungen miteinander verbunden sind. Der interne Standard und die Rezeptor-Nucleinsäuren der Erfindung können Ribonucleinsäuren sein, zum Beispiel Sense- oder Antisense-Ribonucleinsäuren, cRNA in vollständiger Länge oder Teilfragmente davon, mRNA in vollständiger Länge oder Teilfragmente davon und/oder Ribo-Oliognucleotide. In einer anderen Ausführungsform können der interne Standard und die Rezeptor-Nucleinsäuren der Erfindung Desoxyribonucleinsäuren sein, vorzugsweise Einzelstränge in vollständiger Länge oder Fragmente von Sequenzen, welche die entsprechenden mRNAs codieren. Die Form des internen Standards und der Rezeptor-Nucleinsäuren sollte so gewählt werden, dass sie komplementär sind zu und geeignete Watson-Crick-Wasserstoffbindungen mit Rezeptor und Analyt, die in der Probe vorhanden sind, erzeugen. Wenn zum Beispiel Analytsequenzen in einer Probe der Sequenz einer mRNA entsprechen, dann sollten der interne Standard und die Rezeptorsequenzen komplementär sein, z.B. eine Antisense- oder eine komplementäre RNA (cRNA).

Wie vorstehend erwähnt wurde, können der interne Standard und die Rezeptor-Nucleinsäuren Polymere von synthetischen Nucleotidanaloga sein. Ein solcher interner Standard und solche Rezeptor-Nucleinsäuren können in bestimmten Ausführungsformen wegen ihrer überragenden Stabilität unter Analysebedingungen verwendet werden. Es wurde gezeigt, dass Modifikationen in der nativen Struktur, einschließlich Veränderungen im Rückgrat, der Zucker oder heterozyklischen Basen, die intrazelluläre Stabilität und die Bindungsaffinität erhöhen. Zu den nützlichen Veränderungen in der Rückgratchemie gehören die Phosphorthioate; Phosphordithioate, wobei beide Nicht-Brücken-Sauerstoffe durch Schwefel ersetzt werden; Phosphoramidite; Alkylphosphotriester und Boranophosphate. Ein chirales Phosphatderivat schließt 3'-O-5'-S-Phosphorthioat, 3'-S-S'-O-Phosphorthioat, 3'-CH2-5'-O-Phosphonat und 3'-NH-5'-O-Phosphoramidat ein. Peptidnucleinsäuren ersetzen das gesamte Ribose-Phosphodiester-Rückgrat mit einer Peptidbindung. Eingeschlossene Nucleinsäuren geben eine zusätzliche konformative Stabilität des Zuckerteils aufgrund zusätzlicher Bindungen zwischen den 2'-Carboxyl- und 5'-Carboxyl- oder 4'-Carboxylgruppen der Desoxyribose. Zucker-Modifikationen werden ebenfalls verwendet, um die Stabilität und Affinität zu erhöhen. Das a-Anomer von Desoxyribose kann verwendet werden, wobei die Base in Bezug auf das natürliche p-Anomer invertiert ist. Die 2'-OH-Gruppe des Ribosezuckers kann verändert werden, um 2'-O-Methyl- oder 2'-O-Allyl-Zucker zu erzeugen, die eine Resistenz gegen die Degradation zur Verfügung stellen, ohne die Affinität zu gefährden. Die Modifikation der heterozyklischen Basen, die in dem Verfahren der Erfindung Verwendung finden, sind solche, die in der Lage sind, eine angemessene Basenpaarung durchzuführen. Einige nützliche Substitutionen schließen Desoxyuridin für Desoxythymidin; 5-Methyl-2'-desoxycytidin und 5-Brom-2'-desoxycytidin für Desoxycytidin ein. Es wurde gezeigt, dass 5-Propinyl-2'-desoxyuridin und 5-Propinyl-2'-desoxycytidin die Affinität und die biologische Aktivität erhöhen, wenn sie für Desoxythymidin beziehungsweise Desoxycytidin eingetauscht werden.

Beispiele von nicht natürlich vorkommenden Basen, die in der Lage sind, Basenpaarungsverhältnisse zu erzeugen, schließen Aza- und Deazapyrimidin-Analoga, Aza- und Deazapurin-Analoga und andere heterozyklische Basenanaloga ein, in denen ein oder mehrere Kohlenstoff- oder Stickstoffatome des Purin- und Pyrimidinrings durch Heteroatome, z.B. Sauerstoff, Schwefel, Selen, Phosphor und dergleichen, ausgetauscht werden, sind aber nicht darauf beschränkt.

Die immobilisierten Polynucleotide können so wenige wie vier oder so viele wie Hunderte oder noch mehr Nucleotide in der Länge besitzen. Als Polynucleotide werden gemäß der Erfindung Nucleinsäuren bezeichnet, die typischerweise auf dem Fachgebiet als Oligonucleotide bezeichnet werden, und ebenfalls solche, die als Nucleinsäuren bezeichnet werden. Die Anordnungen der vorliegenden Erfindung sind daher nicht nur in Anwendungen nützlich, in denen Ziel-Nucleinsäuren an immobilisierte Anordnungen von relativ kurzen Sonden (wie z.B. solche, die eine Länge von etwa 6, 8, 10, 20, 40, 60, 80 oder 100 Nucleotiden besitzen), hybridisieren, sondern auch in Anwendungen, in denen relativ kurze Sonden an Anordnungen von immobilisierten Nucleinsäuren hybridisieren.

Die Polynucleotide der Anordnung können jede gewünschte Sequenz besitzen. In einer bevorzugten Ausführungsform können sie alle möglichen Polynucleotide von einer bestimmten Länge N umfassen, was zu einer Anordnung von 4N einzigartigen Elementen führen würde. Für alle Polynucleotide mit einer Länge von zum Beispiel 6 Basen würden die Sequenzen eine Anordnung mit 4096 einzigartigen Elementen umfassen.

In einer anderen Ausführungsform können die Polynucleotide eine "universelle Gruppe" zur Sequenzierung einer Nucleinsäure darstellen, wie in WO 98/31836, besonders auf den Seiten 27-29, diskutiert wird.

In einer anderen Ausführungsform kann die Gruppe von Polynucleotiden bestimmten Mutationen entsprechen, die in einer bekannten Sequenz identifiziert werden sollen. Wenn zum Beispiel von einer bestimmten Nucleinsäure bekannt ist, dass sie eine nicht identifizierte Mutation an einer bestimmten Position enthält, dann kann die mutierte Position mit einer Anordnung von acht Polynucleotiden identifiziert werden, wobei drei den drei möglichen Substitutionen an dieser Position entsprechen, eine der Deletion der Base an dieser Position entspricht und vier den Insertionen der vier möglichen Basen an dieser Position entsprechen. In einer anderen Ausführungsform kann die Anordnung für ein bekanntes Gen, das jede von verschiedenen möglichen identifizierten Mutationen enthalten kann, Polynucleotide umfassen, die den verschiedenen möglichen Mutationen entsprechen. Diese Ausführungsform ist zum Beispiel nützlich für Gene wie z.B. Onkogene und Tumorsuppressoren, die häufig eine Vielfalt von bekannten Mutationen in verschiedenen Positionen besitzen. Die Verwendung von Anordnungen erleichtert die Bestimmung, ob diese Gene Mutationen enthalten oder nicht, indem sie das gleichzeitige Absuchen mit Polynucleotiden ermöglichen, die jeder dieser verschiedenen Positionen entsprechen.

In einer anderen Ausführungsform kann jeder Spot der Anordnung ein Gemisch von Polynucleotiden mit unterschiedlichen Sequenzen umfassen. Diese Gemische können degenerierte Polynucleotide der Struktur Nx By Nz umfassen, wobei N jede der vier Basen repräsentiert und für die Polynucleotide in einem vorliegenden Gemisch variiert, B jede der vier Basen repräsentiert, aber die gleiche für jedes der Polynucleotide in einem vorliegenden Gemisch ist, und x, y und z ganze Zahlen sind.

Anordnungen, die diese Art des Gemisches umfassen, sind zum Beispiel nützlich für die Sequenzierung durch Hybridisierung. In einer anderen Ausführungsform können die Spots Gemische von Polynucleotiden umfassen, die verschiedenen Regionen einer bekannten Nucleinsäure entsprechen; diese Regionen können überlappend, angrenzend oder nicht angrenzend sein. Anordnungen, die diese Arten von Gemischen umfassen, sind zum Beispiel nützlich für die Identifizierung spezifischer Nucleinsäuren, einschließlich solcher von bestimmten Pathogenen oder anderen Organismen. Beide Arten von Gemischen werden in WO 98/31836, besonders auf den Seiten 123-128 diskutiert.

Die Polynucleotide, die für Rezeptoren bestimmt sind, können von biologischen Proben isoliert, durch PCR-, NASBA-, Tyras-Reaktionen oder durch andere Matrizen spezifischen Reaktionen hergestellt oder synthetisch hergestellt werden. Verfahren für die Isolierung von Polynucleotiden von biologischen Proben und/oder PCR-, Tyras-, NASBA-Reaktionen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt, ebenso wie die Verfahren zur Synthese und Reinigung von synthetischen Polynucleotiden. Sonden, die von biologischen Proben und/oder PCR-, Tyras-, NASBA-Reaktionen isoliert werden, können in Abhängigkeit von der gewünschten Art der Immobilisierung Modifikationen an dem 3'- oder 5'-Ende oder an einer oder an mehreren Basen benötigen, wie nachfolgend ausführlicher diskutiert wird. Da die Polynucleotide in der Lage sein müssen, an eine Ziel-Nucleinsäure zu binden, müssen sie, wenn sie nicht schon als Einzelstrang vorliegen, des weiteren vorzugsweise entweder vor oder nach der Immobilisierung auf dem Substrat zu Einzelsträngen gemacht werden.

Die Polynucleotide können auf dem Substrat immobilisiert werden, wobei eine große Vielfalt von Techniken verwendet wird. Die Polynucleotide können zum Beispiel adsorbiert oder auf eine andere Weise nicht kovalent mit dem Substrat assoziiert werden (zum Beispiel die Immobilisierung auf Nylon- oder Nitrocellulosefiltern unter Verwendung von Standardtechniken); sie können kovalent an das Substrat gebunden werden oder ihre Assoziation kann durch spezifische Bindungspaare wie z.B. Biotin und Streptavidin vermittelt werden.

Um eine kovalente Bindung zu bewirken, muss das Substrat zunächst aktiviert werden, das heißt es wird so behandelt, dass reaktive Gruppen auf oder im Substrat erzeugt werden, die mit einer reaktiven Gruppe auf dem Polynucleotid reagieren können, um eine kovalente Bindung zu erzeugen. Der Fachmann wird erkennen, dass die erwünschte reaktive Gruppe von der Chemie, die verwendet wird, um die Polynucleotide an das Substrat zu binden, und von der Zusammensetzung des Substrats abhängig ist. Typische reaktive Gruppen, die für die Erzeugung einer kovalenten Bindung von Polynucleotiden an die Substrate nützlich sind, schließen Hydroxyl-, Aldehyd-, Sulfonyl-, Amino-, Epoxy-, Isothiocyanat- und Carboxylgruppen ein; andere reaktive Gruppen, wie für den Fachmann offensichtlich sein wird, können jedoch ebenfalls verwendet werden und sind ebenfalls im Umfang der Erfindung eingeschlossen.

Für einen Übersichtsartikel der unzähligen Techniken, die verwendet werden können, um die Substrate mit geeigneten reaktiven Gruppen zu aktivieren, vergleiche Wiley Encyclopedia of Packaging Technology, 2. Ausg., Brody & Marsh, Hrsg., "Surface Treatment", S. 867-874, John Wiley & Sons (1997) und die darin zitierten Referenzen (nachfolgend "Surface Treatment"). Chemische Verfahren, die für die Erzeugung von Aminogruppen auf Silikonoxid-Substraten geeignet sind, werden in Atkinson & Smith, "Solid Phase Synthesis of Oligodeoxyribonucleotides by the Phosphite Triester Method", in: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, MJ Gait, Hrsg. 1984, IRL Press, Oxford, besonders auf S. 45-49 (und in den darin zitierten Referenzen) beschrieben; chemische Verfahren, die für die Erzeugung von Hydroxylgruppen auf Silikonoxid-Substraten geeignet sind, werden in Pease et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91: 5022-5026 (und in den darin zitierten Referenzen) beschrieben; chemische Verfahren zur Erzeugung von funktionellen Gruppen auf Polymeren wie z.B. Polystyrol, Polyamide und transplantierte Polystyrole werden in Lloyd-Williams et al., 1997, Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Kapitel 2, CRC Press, Boca Raton, Fla (und in den darin zitierten Referenzen) beschrieben.

Es wird in Erwägung gezogen, dass im Allgemeinen die bindende Substanz kovalent an das Substrat gebunden ist. Dieses minimiert den Verlust der bindenden Substanz von dem Substrat. Die kovalente Bindung einer organischen Verbindung an ein Metalloxid ist auf dem Fachgebiet gut bekannt, zum Beispiel unter Verwendung des Verfahrens, das von Chu CW et al. (J Adhesion Sci Technol, 7, S. 417-433, 1993) und Fadda MB et al. (Biotechnology and Applied Biochemistry, 16, S. 221-227, 1992) beschrieben wird. Nach der Aktivierung eines Metalloxidträgers durch ein silanisierendes Mittel und der Bindung der Biomoleküle kann jedoch eine Anzahl der Aminogruppen des silanisierenden Mittels noch als ungeladene Aminogruppen vorliegen. Dieses kann zu ungewollten Interaktionen der Aminogruppen mit verschiedenen Substanzen, die in dem Medium vorhanden sind, in dem der beladene Träger verwendet wird, führen, was zu hohen Hintergrundsignalen führt. Die ungeladenen Aminogruppen können von dem Träger durch die anschließende Behandlung des beladenen Trägers mit einer sauren Lösung entfernt werden, ohne dass der beladene Teil des Trägers beeinflusst wird. Auf ähnliche Weise kann ein aktivierter und beladener Träger mit einer basischen oder neutralen Lösung behandelt werden, vorausgesetzt, dass das Verfahren nicht für die Derivatisierung von Aluminiumoxid-Nanopartikel, die mit (3-Aminopropyl)-triethoxysilan aminiert wurden, verwendet wird, wobei die basische Lösung des weiteren einen großen Überschuss an N-Acetylhomocysteinlacton enthält. In diesen Sinn ist die Europäische Patentanmeldung PCT/EP00/07736 beispielhaft.

Der Fachmann wird erkennen, dass in Ausführungsformen, welche die kovalente Bindung verwenden, die kovalente Bindung, die zwischen dem Polynucleotid und dem Substrat erzeugt wird, im Wesentlichen stabil gegen verschiedene Bedingungen, unter denen die Anordnung analysiert wird, sein muss, um einen Verlust des Polynucleotids während der Analyse zu vermeiden. Eine solche stabile Bindung ist die Phosphodiesterbindung, welche die verschiedenen Nucleotide in einem Polynucleotid verbindet und die in geeigneter Weise unter Verwendung von gut bekannten Chemien (vergl. z.B. Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, 1984, vorstehend) erzeugt werden kann. Andere stabile Bindungen, die zur Verwendung mit Hydroxyl aktivierten Substraten geeignet sind, schließen Phosphorthioat, Phosphoramidit oder andere modifizierte Nucleinsäureverbindungen ein. Für Substrate, die mit Aminogruppen modifiziert sind, können die Bindungen eine Phosphoramidat-, Amid- oder Peptidbindung sein. Wenn Substrate mit funktionellen Epoxygruppen aktiviert sind, kann eine stabile C-N-Bindung erzeugt werden. Geeignete Reagenzien und Bedingungen zur Erzeugung solcher stabilen Bindungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Andere stabile Bindungen, die für die Verwendung bei den Anordnungen der Erfindung geeignet sind, werden dem Fachmann bekannt sein.

In Ausführungsformen, in denen vorsynthetisierte Polynucleotide kovalent an das Substrat gebunden sind, können die Polynucleotide über das 3'-Ende, das 5'-Ende oder über eine reaktive Gruppe an eine der Basen gebunden sein. Syntheseträger und Synthesereagenzien, die nützlich für die Modifizierung des 3'- und/oder des 5'-Endes von synthetischen Polynucleotiden oder für den Einbau einer modifizierten Base mit einer reaktiven Gruppe in ein synthetisches Polynucleotid sind, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und sind außerdem im Handel erhältlich.

Verfahren für die Synthese von 5'-modifizierten Polynucleotiden werden zum Beispiel in Agarwal et al., 1986, Nucl Acids Res 14: 6227-6245 und Connelly, 1987, Nucl Acids Res 15: 3131-3139 beschrieben. Im Handel erhältliche Produkte für die Synthese von 5'-Amino modifizierten Polynucleotiden schließen die Reagenzien N-TFA-C6-AminoModifier, N-MMT-C6-AminoModifier und N-MMT-C12-AminoModifier ein, die von Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, Kalifornien erhältlich sind.

Verfahren für die Synthese von 3'-modifizierten Polynucleotiden werden in Nelson et al., 189, Nucl Acids Res 17: 7179-7186 und Nelson et al., 1989, Nucl Acids Res 17: 7187-7194 beschrieben. Im Handel erhältliche Produkte für die Synthese von 3'-modifizierten Polynucleotiden schließen die Reagenzien 3'-Amino-ON.TM. Glass mit kontrollierter Porengröße und Amino Modifier II.TM. ein, die von Clonetech Laboratories, Inc, Palo Alto, Kalif. erhältlich sind.

Andere Verfahren für die Modifizierung der 3'- und/oder 5'-Enden von Polynucleotiden sowie für die Synthese von Polynucleotiden, die geeignete modifizierte Basen enthalten, werden von Goodchild 1990, Bioconjugate Chem 1: 165-186, und den darin zitierten Referenzen zur Verfügung gestellt. Die Chemie für das Anheften solcher modifizierter Polynucleotide an Substrate, die mit geeigneten reaktiven Gruppen aktiviert sind, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (vergl. z.B. Ghosh & Musso, 1987, Nucl Acids Res 15: 5353-5372; Lund et al., 1988, Nucl Acids Res 16: 10861-10880; Rasmussen et al., 1991, Anal Chem 198: 138-142; Kato & Ikada, 1996, Biotechnology and Bioengineering 51: 581-590; Timofeev et al., 1996, Nucl Acids Res 24: 3142-3148; O'Donnell et al., 1997 Anal Chem 69: 2438-2443).

Verfahren und Reagenzien für die Modifizierung der Enden von Polynucleotiden, die von biologischen Proben isoliert werden, und/oder für den Einbau von Basen, die mit reaktiven Gruppen modifiziert sind, in naszierende Polynucleotiden sind ebenfalls gut bekannt und im Handel erhältlich. Ein isoliertes Polynucleotid kann zum Beispiel am 5'-Ende mit einer Phosphorkinase phosphoryliert werden und dieses phosphorylierte Polynucleotid kann kovalent an ein Amino-aktiviertes Substrat durch eine Phosphoramidat- oder Phosphodiesterbindung gebunden werden. Andere Verfahren werden dem Fachmann bekannt sein.

In einer günstigen Ausführungsform werden vorsynthetisierte Polynucleotide, die an ihren 3'- oder 5'-Enden mit einer primären Aminogruppe modifiziert sind, an ein Carboxy-aktiviertes Substrat konjugiert. Die Chemie, die für die Erzeugung von Carboxamid-Bindungen zwischen funktionellen Carboxyl- und Aminogruppen geeignet ist, ist auf dem Fachgebiet der Peptidchemie gut bekannt (vergl. z.B. Atherton & Sheppard, Knorr et al., 1989, Tet Lett 30(15): 1927-1930; Bannworth & Knorr, 1991, Tet Lett 32(9): 1157-1160; und Wilchek et al., 1994, Bioconjugate Chem 5(5): 491-492; Solid Phase Peptides Synthesis, 1989, IRL Press, Oxford, England und Lloyd-Williams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins; 1997, CRC Press, Boca Raton, FL und die darin zitierten Referenzen). Jedes dieser Verfahren kann verwendet werden, um Aminomodifizierte Polynucleotide an ein Carboxylaktiviertes Substrat zu konjugieren.

Unabhängig davon, ob die Polynucleotide direkt auf dem aktivierten Substrat synthetisiert wurden oder ob sie auf dem aktivierten Substrat nach der Synthese oder der Isolation immobilisiert wurden, können sie gegebenenfalls mittels eines oder mehrerer Linkern in einem Abstand von dem Substrat gehalten werden. Der Fachmann wird es zu schätzen wissen, dass solche Linker mindestens zweifach funktionell sein werden, das heißt, sie werden eine funktionelle Gruppe oder einen funktionellen Teil haben, die/der in der Lage ist, eine Bindung mit dem aktivierten Substrat zu erzeugen, und eine andere funktionelle Gruppe oder einen funktionellen Teil, die/der in der Lage ist, eine Bindung mit einem anderen Linker-Molekül oder den Polynucleotiden zu erzeugen.

Strecken von Nucleotiden können durch ein oder durch mehrere Linker-Moleküle, die nicht an den sequenzspezifischen Basenpaarinteraktionen mit einer Ziel-Nucleinsäure teilnehmen, unterbrochen werden. Die Linker-Moleküle können flexibel, semistarr oder starr, lang oder kurz, geladen oder ungeladen, hydrophob oder hydrophil in Abhängigkeit von der gewünschten Anwendung sein. Eine Vielfalt von Linker-Molekülen, die nützlich für die Einhaltung eines Abstands von einem Molekül zu einem anderen oder von einer festen Oberfläche sind, wurden auf dem Fachgebiet beschrieben; jedes dieser Linker-Moleküle kann verwendet werden, um Regionen von immobilisierten Polynucleotiden von einander in einem Abstand zu halten. In einer Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung beträgt der Linker-Anteil von eins zu zehn, von eins zu sechs Alkylenglykolteile, z.B. Ethylenglykolteile.

Unter bestimmten Umständen können solche Linker verwendet werden, um eine funktionelle Gruppe in eine andere "umzuformen". Ein Amino-aktiviertes Substrat kann zum Beispiel in ein Hydroxyl-aktiviertes Substrat durch Reaktion mit zum Beispiel 3-Hydroxy-Propionsäure umgeformt werden. Auf diese Weise können Substratmaterialien, die nicht leicht mit einer spezifischen reaktiven funktionellen Gruppe aktiviert werden können, in ein geeignet aktiviertes Substrat umgeformt werden. Chemie und Reagenzien, die für die "Umformung" solcher reaktiver Gruppen geeignet sind, sind gut bekannt und werden dem Fachmann offensichtlich sein.

Linker können ebenfalls verwendet werden, wenn es notwendig ist, um die Anzahl der reaktiven Gruppen auf dem aktivierten Substrat zu erhöhen oder zu "vervielfältigen". Für diese Ausführungsform wird der Linker drei oder mehr funktionelle Gruppen besitzen. Nach der Bindung an ein aktiviertes Substrat mittels einer der funktionellen Gruppen stehen die übrigen zwei oder mehr Gruppen für die Bindung der Polynucleotide zur Verfügung. Die Vervielfältigung der Anzahl der funktionellen Gruppen auf dem aktivierten Substrat auf diese Weise ist besonders geeignet, wenn das Substrat nicht leicht mit einer ausreichenden Anzahl von reaktiven Gruppen aktiviert werden kann.

Reagenzien für die Vervielfältigung der Anzahl der reaktiven Gruppen sind gut bekannt und werden dem Fachmann offensichtlich sein. Eine besonders geeignete Klasse von Reagenzien zur Vervielfältigung sind die multifunktionellen Epoxide, die unter dem Handelsnamen DENACOL.TM (Nagassi Kasei Kogyo KK) verkauft werden. Diese Epoxide enthalten so viele wie vier, fünf oder noch mehr Epoxy-Gruppen und können verwendet werden, um Substrate zu vervielfältigen, die mit reaktiven Gruppen aktiviert sind, die mit Epoxiden reagieren, einschließlich zum Beispiel Hydroxyl-, Amino- und Sulfonyl-aktivierte Substrate. Das so erhaltene Epoxy-aktivierte Substrat kann in geeigneter Weise in ein Hydroxyl-aktiviertes Substrat, ein Carboxyl-aktiviertes Substrat oder ein anders aktiviertes Substrat durch gut bekannte Verfahren umgeformt werden.

Linker, die für die Einhaltung eines Abstandes biologischer Moleküle wie z.B. Polynucleotide von festen Oberflächen geeignet sind, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und schließen als ein Beispiel Polypeptide wie z.B. Polyprolin oder Polyalanin, gesättigte oder ungesättigte zweifach funktionelle Kohlenwasserstoffe wie z.B. 1-Aminohexansäure, Polymere wie z.B. Polyethylenglykol etc. ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. 1,4-Dimethoxytrityl-polyethylenglykol-phosphoramidite, die für die Erzeugung von Phosphodiesterbindungen mit Hydroxylgruppen nützlich sind, sowie Verfahren für ihre Verwendung in der Nucleinsäuresynthese auf festen Substraten werden zum Beispiel in Zhang et al., 1991, Nucl Acids Res 19: 3929-3933 und Durand et al., 1990, Nucl Acids Res 18: 6353-6359 beschrieben. Andere nützliche Linker sind im Handel erhältlich.

Die Natur und die Geometrie des festen Substrats wird von einer Vielfalt von Faktoren, unter anderem einschließlich der Art der Anordnung (z.B. eindimensional, zweidimensional oder dreidimensional) und der Art der Bindung (z.B. kovalent oder nicht kovalent), abhängig sein. In Allgemeinen kann das Substrat aus jedem Material zusammengesetzt sein, das eine Immobilisierung des Rezeptors, z.B. eines Polynucleotids, erlaubt und das nicht schmilzt oder auf eine andere Weise im Wesentlichen unter den Bedingungen degradiert, die verwendet werden, um den Rezeptor zu binden, z.B. Hybridisieren oder Denaturieren von Nucleinsäuren. Wenn eine kovalente Immobilisierung in Betracht gezogen wird, sollte das Substrat zusätzlich mit reaktiven Gruppen aktivierbar sein, die in der Lage sind, eine kovalente Bindung mit dem zu immobilisierenden Rezeptor zu erzeugen.

Eine Anzahl von Materialien, die für die Verwendung als Substrate in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, wurden auf dem Fachgebiet beschrieben. Beispiele von geeigneten Materialien schließen zum Beispiel Akryl, Styren-Methylmethacrylat-Kopolymere, Ethylen/Akrylsäure, Akrylnitrilbutadienestyrol (ABS), ABS/Polycarbonat, ABS/Polysulfon, ABS/Polyvinylchlorid, Ethylenpropylen, Ethylenvinylacetat (EVA), Nitrocellulose, Nylon (einschließlich Nylon 6, Nylon 6/6, Nylon 6/6-6, Nylon 6/9, Nylon 6/10, Nylon 6/12, Nylon 11 und Nylon 12), Polyacrylnitril (PAN), Polyacrylat, Polycarbonat, Polybutylenterephthalat (PBT), Polyethylenterephthalat (PET), Polyethylen (einschließlich niedriger Dichte, linearer niedriger Dichte, hoher Dichte, vernetzt und ultrahohen Molekulargewichtsgraden), Polypropylen-Homopolymer, Polypropylen-Kopolymere, Polystyrol (einschließlich Grade für die allgemeine Verwendung und hohe Schlagfestigkeit), Polytetrafluorethylen (PTFE), fluoriniertes Ethylenpropylen (FEP), Ethylentetrafluorethylen (ETFE), Perfluoralkoxyethylen (PFA), Polyvinylfluorid (PVF), Polyvinylidenfluorid (PVDF), Polychlortrifluorethylen (PCTFE), Polyethylenchlortrifluorethylen (ECTFE), Polyvinylalkohol (PVA), Silkonstyrolacrylnitril (SAN), Styrolmaleinsäureanhydrid (SMA) und Glass ein.

Andere Beispiele von geeigneten Materialien für die Verwendung als ein Substrat für die vorliegende Erfindung schließen Metalloxide ein. Metalloxide stellen ein Substrat zur Verfügung, das sowohl eine hohe Kanaldichte als auch eine hohe Porosität besitzt, was Anordnungen mit hoher Dichte erlaubt, die verschiedene erste bindende Substanzen pro Einheit auf der Oberfläche für die Probenanwendung erlauben. Zusätzlich sind Metalloxide hoch transparent für sichtbares Licht. Metalloxide sind relativ preiswerte Substrate, die nicht die Verwendung einer typischen Technologie der Mikroherstellung benötigen, und dieses ermöglichet eine verbesserte Kontrolle über die Flüssigkeitsverteilung auf der Oberfläche des Substrats wie z.B. elektrochemisch hergestellte Metalloxidmembranen. Metalloxidmembranen, die durchgehende orientierte Kanäle besitzen, können durch das elektrochemische Ätzen eines Metallblatts hergestellt werden. Die in Betracht gezogenen Metalloxide sind unter anderen Oxide von Tantal, Titan und Aluminium sowie Gemische von zwei oder mehr Metalloxide und dotierte Metalloxide und Gemische, die Metalloxide enthalten. Die Metalloxidmembranen sind transparent, besonders wenn sie nass sind, was für die Analysen die Verwendung von verschiedenen optischen Techniken ermöglicht. Solche Membranen besitzen orientierte, durchgehende Kanäle mit einem gut kontrollierten Durchmesser und nützlichen chemischen Oberflächeneigenschaften. Die Patentanmeldung EP-A-0 975 427 ist diesbezüglich ein Beispiel.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, wie es hierin beschrieben wird, wobei die Mikro-Anordnung eine Durchfluss-Mikro-Anordnung ist.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, wie es hierin beschrieben wird, wobei das Substrat ein poröses Substrat ist.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, wie es hierin beschrieben wird, wobei das Substrat eine elektrochemisch hergestellte Metalloxid-Membran ist.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, wie es hierin beschrieben wird, wobei das Substrat ein Aluminiumoxid umfasst.

Das Substrat kann in der Form von Perlen, Partikeln, Blättern oder Membranen vorliegen und kann in Abhängigkeit von der Art der Anordnung durchlässig oder undurchlässig sein. Für lineare oder dreidimensionale Anordnungen kann das Substrat zum Beispiel aus Perlen oder Partikeln (wie z.B. herkömmliche Festphasen-Synthese-Träger), Fasern (wie z.B. Glaswolle oder andere Glas- oder Plastikfasern), Glas- oder Plastikkapillarröhren oder Metalloxid-Membranen bestehen. Für zweidimensionale Anordnungen kann das Substrat in der Form von Plastik- oder Glasscheiben vorliegen, in denen mindestens eine Oberfläche im Wesentlichen flach ist.

Der Nachweis des Reporters ist ein Anzeichen für das Vorhandensein, die Menge und/oder die Integrität des Analyten. Daher ist es wichtig, dass die Effizienz der Bindung zwischen Analyten und Rezeptor sowie Reporter und internem Standard im Wesentlichen ähnlich ist. Auf ähnlicher Weise ist es wichtig, dass der Nachweis des als Komplex vorliegenden Analyten und Rezeptors sowie des als Komplex vorliegenden Reporters und internen Standards im Wesentlichen ähnlich ist.

Die Verwendung der Anordnungen der vorliegenden Erfindung zieht die Verwendung der Reporter-Polynucleotide und/oder der Analyt-Nucleinsäuren in Betracht, die in der Lage sind, ein Signal herzustellen, wenn sie auf eine geeignete Weise an die Anordnung gebunden, z.B. hybridisiert, sind.

Das durch den internen Standard hergestellte Signal wird durch eine Bindungsreaktion, zum Beispiel eine Hybridisierungsreaktion, mit einem markierten Reporter gemessen oder bestimmt. Das durch die Bindung des Reporters an den internen Standard hergestellte Signal ist vorzugsweise von dem Signal unterscheidbar, das durch die Bindung des Analyten an den Rezeptor hergestellt wird.

In Abhängigkeit von dem bestimmten Analyseprotokoll, indem die vorliegenden Analyt- und Reporter-Nucleinsäuren verwendet werden, können die Analyt- und Reporter-Nucleinsäuren mit der gleichen Markierung markiert sein, so dass der Analyt und der Reporter nicht von einander unterschieden werden können, oder die Analyt- und Reporter-Nucleinsäuren können unterschiedlich markiert sein, so dass die zwei Gruppen leicht und/oder gleichzeitig von einander unterscheidbar sind.

Als solches sind in bestimmten Ausführungsformen die Analyt- und Reporter-Nucleinsäuren unterschiedlich markiert. Der Ausdruck "unterschiedlich markiert" bedeutet, das die Reporter- und Analyt-Nucleinsäuren von einander unterschiedlich markiert sind, so dass sie gleichzeitig von einander unterscheidbar sind. Wenn zum Beispiel Reporter-Nucleinsäuren und Analyt-Nucleinsäuren vorliegen, wird jede Reporter-Nucleinsäure in der Probe mit der gleichen ersten Markierung markiert und jede Analyt-Nucleinsäure in der Probe wird mit der gleichen zweiten Markierung, die unterschiedlich zu und unterscheidbar von der ersten Markierung ist, markiert. Wenn zwei unterschiedliche Gruppen von Reporter-Nucleinsäuren in dem Verfahren verwendet werden, wird gleichermaßen jede Reporter-Nucleinsäure in der zweiten Gruppe mit einer dritten Markierung markiert, die unterschiedlich zu und unterscheidbar von der ersten und zweiten Markierung ist.

Fast jede Markierung, die ein nachweisbares, quantifizierbares Signal herstellt und die an einen Analyten oder/und einen Reporter, z.B. Polynucleotide, angeheftet werden kann, kann in Verbindung mit den Anordnungen der Erfindung verwendet werden. Geeignete Markierungen schließen zum Beispiel Radioisotope, Fluorophore, Chromophore, chemilumineszierende Teile etc. ein, sind aber nicht darauf begrenzt. In Ausführungsformen, in denen die Markierung an ein Polynucleotid gebunden ist, kann die Markierung an jeden Anteil des Polynucleotids gebunden sein, einschließlich des freien Endes oder einer oder mehrerer der Basen. Vorzugsweise wird der Ort der Markierung nicht die Hybridisierung, den Nachweis oder andere Modifikationen des markierten Polynucleotids nach der Hybridisierung stören. Eine Vielfalt von unterschiedlichen Protokollen kann verwendet werden, um die markierten Nucleinsäuren herzustellen, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind, wobei solche Verfahren üblicherweise auf der enzymatischen Herstellung einer markierten Nucleinsäure unter Verwendung eines Anfangs-Primers und einer Matrizen-Nucleinsäure beruhen. Markierte Primer können verwendet werden, um das markierte Ziel herzustellen. In einer anderen Ausführungsform kann die Markierung in die Nucleinsäure während der Erststrangsynthese oder der nachfolgenden Synthese-, Markierungs- oder Amplifikationsschritte eingebaut werden, um ein markiertes Ziel herzustellen. Die Markierung kann ebenfalls direkt in die mRNA eingebaut werden, wobei eine chemische Modifikation der RNA mit reaktiven Markierungsderivaten oder eine enzymatische Modifikation unter Verwendung von markierten Substraten verwendet wird. Repräsentative Verfahren der Herstellung eines markierten Ziels werden in den US-Anmeldungs-Seriennummern 08/859,998; 08/974,298; 09/225,998 offenbart.

Die Reporter-Polynucleotide oder die Analyt-Nucleinsäuren können zum Beispiel durch die Markierungen und Techniken markiert werden, die vorstehend beschrieben wurden. In einer anderen Ausführungsform können sie durch jede andere Technik, die auf dem Fachgebiet bekannt ist, markiert werden. Bevorzugte Techniken schließen direkte chemische Markierungsverfahren und enzymatische Markierungsverfahren wie z.B. Kinasebehandlung und Nick-Translation ein.

Eine Vielfalt von verschiedenen Markierungen kann verwendet werden, wobei solche Markierungen fluoreszierende Markierungen, Isotopen-Markierungen, enzymatische Markierungen, partikuläre Markierungen etc. einschließen. Geeignete Markierungen schließen zum Beispiel Fluorochrome wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Rhodamin, Texas-rot, Phycoerythrin, Allophycocyanin, 6-Carboxyfluorescein (6-FAM), 2',7'-Dimethoxy-4',5'-dichlor-6-carboxyfluorescein (JOE), 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX), 6-Carboxy-2',4',7',4,7-Hexachlorfluorescein (HEX), 5-Carboxyfluorescein (5-FAM), oder N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA), Cyaninfarbstoffe wie z.B. Cy5, Cy3, BODIPY-Farbstoffe wie z.B. BODIPY 630/650, Alexa542 etc. ein. Geeignete Isotopen-Markierungen schließen radioaktive Markierungen wie z.B. 32P, 33P, 35S, 3H ein. Andere geeignete Markierungen schließen Größenpartikel ein, die Lichtstreuungs- oder Fluoreszenzeigenschaften besitzen oder eingeschlossene multiple Fluorophore enthalten. Die Markierung kann ein Zwei-Stadium-System sein, wobei die Ziel-DNA an Biotin, Haptene etc. gebunden ist, die einen hoch affinen Bindungspartner wie z.B. Avidin, spezifische Antikörper etc. besitzen. Der Bindungspartner ist an eine nachweisbare Markierung wie z.B. eine enzymatische Markierung, die in der Lage ist, ein Substrat zu einem chromogenen Produkt umzuwandeln, eine fluoreszierende Markierung, eine Isotopen-Markierung etc. gebunden. Gleichermaßen kann der Nachweis der Bindung zwischen Analyten und Rezeptor sowie zwischen dem Reporter und dem internen Standard indirekt sein. In der vorliegenden Erfindung bezieht sich der indirekte Nachweis auf den Nachweis einer möglichen Interaktion zwischen Analyten und Rezeptor oder zwischen dem Reporter und dem internen Standard, bei dem entweder der Analyt und Rezeptor und/oder der Reporter und der interne Standard nicht markiert sind. Zum Beispiel betrifft die vorliegende Erfindung eine Sandwich-Analyse, in welcher der Analyt und der Reporter Antikörper sind und in welcher der Analyt und der Reporter von verschiedenen Spezies stammen.

Es wird in Erwägung gezogen, dass der Fachmann das Format der Anordnung der vorliegenden Erfindung für seine spezifischen Bedürfnisse adaptieren kann. Der Fachmann kann zum Beispiel das Format der Anordnung so adaptieren, dass die Bindung des Analyten an den Rezeptor direkt nachgewiesen werden kann, während die Bindung des Reporters an den internen Standard indirekt nachgewiesen wird. Jede Kombination von Markierungen wie z.B. erste und zweite Markierungen, erste, zweite und dritte Markierungen etc. kann für die Gruppen der Reporter und für den Analyten in einer Probe verwendet werden, vorausgesetzt dass die Markierungen von einander unterscheidbar sind. Beispiele von unterscheidbaren Markierungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und schließen ein: zwei oder mehr Fluoreszenzfarbstoffe mit verschiedenen Emissionswellenlängen wie z.B. Cy3 und Cy5 oder Alexa 542 und Bodipy 630/650; zwei oder mehr Isotope mit einer unterschiedlichen Emissionsenergie wie z.B. 32P und 33P; Markierungen, die Signale unter verschiedenen Behandlungsbedingungen wie z.B. Temperatur, pH-Wert, Behandlung mit zusätzlichen chemischen Stoffen etc. herstellen, und Markierungen, die Signale zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Behandlung herstellen.

Die Verwendung von einem oder mehreren Enzymen für die Signalherstellung erlaubt die Verwendung einer noch größeren Vielfalt von unterscheidbaren Markierungen, die auf der unterschiedlichen Substratspezifität von Enzymen wie z.B. alkalischer Phosphatase/Peroxidase basieren.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, wie es hierin beschrieben wird, wobei der Reporter eine Markierung umfasst.

Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren, wie es hierin beschrieben wird, in dem der Analyt markiert ist.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, wie es hierin beschrieben wird, in dem die Markierung des Analyten und/oder Reporters von enzymatischer, fluoreszierender, phosphoreszierender oder radioaktiver Art ist.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, wie es hierin beschrieben wird, in dem die Markierung des Analyten sich von der Markierung des internen Standards unterscheidet.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, wie es hierin beschrieben wird, in dem die Markierung des Analyten Texas-rot ist und die Markierung des internen Standards Fluorescein ist.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, wie es hierin beschrieben wird, in dem die Markierung des internen Standards Texas-rot ist und die Markierung des Analyten Fluorescein ist.

In Ausführungsformen, die eine in-situ-Synthese verwenden, ist eine bevorzugte Markierung ein fluoreszenzmarkiertes Nucleinsäure-Synthesereagens wie z.B. ein markiertes Nucleosid-Phosphoramidit. Die Position, an der das Fluorophor an das Nucleosid-Phosphoramidit gebunden ist, wird davon abhängen, ob die Markierung an die endständigen oder internen Nucleotide der naszierenden Polynucleotide angefügt wird. Wenn eine endständige Markierung erwünscht wird, kann das Fluorophor in geeigneter Weise an das 5'-Hydroxyl gebunden werden. Wenn interne Markierungen erwünscht sind, ist das Fluorophor vorzugsweise an der Base gebunden, gegebenenfalls durch einen Linker. Verfahren, die zur Herstellung von Fluoreszenz markierten Phosphoramidit-Synthesereagenzien geeignet sind, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und werden zum Beispiel in Goodchild, 1990, vorstehend, beschrieben.

Die vorliegende Erfindung zieht in Erwägung, dass die hierin verwendeten Moleküle molekulare Leuchtsignale („beacons") sind. Zum Beispiel können der Rezeptor und/oder der interne Standard molekulare Leuchtsignale sein, wobei in diesem Fall der Analyt beziehungsweise der Reporter Ziel-Nucleinsäuren sind. In einer anderen Ausführungsform können der Reporter und/oder der Analyt molekulare Leuchtsignale sein, wobei in diesem Fall der interne Standard beziehungsweise Rezeptor Ziel-Nucleinsäuren sind. Eine andere Möglichkeit ist, dass der Reporter und der Rezeptor molekulare Leuchtsignale sind, wobei in diesem Fall der interne Standard beziehungsweise der Analyt Ziel-Nucleinsäuren sind. Molekulare Leuchtsignale sind haarnadelförmige Moleküle mit einem intern gedämpften Fluorophor, dessen Fluoreszenz nach der Bindung an eine Ziel-Nucleinsäure wiederhergestellt wird. Der Schleifenanteil des molekularen Leuchtsignals ist komplementär zu einem Ziel, wohingegen der Stamm durch das Anlagern der komplementären Armsequenzen erzeugt wird. Eine Fluoreszenzmarkierung und eine dämpfende Gruppe sind an den jeweiligen Enden des molekularen Leuchtsignals gebunden. Der Stamm hält diese beiden Gruppen in einer großen Nähe zueinander, was dazu führt, dass die Fluoreszenz des Fluorophors durch den Energietransfer gedämpft wird. Die zur Dämpfung führende Gruppe ist ein nichtfluoreszierendes Chromophor und emittiert die Energie, die sie von dem Fluorophor erhält, als Wärme. Wenn das molekulare Leuchtsignal auf ein Zielmolekül stößt, erzeugt das molekulare Leuchtsignal ein Hybrid, das stabiler als der Stamm ist. Daher vollzieht das molekulare Leuchtsignal eine spontane konformative Reorganisation, die den Stamm auseinander zwingt und dazu führt, dass sich das Fluorophor und die zur Dämpfung führende Gruppe von einander entfernen, was zur Wiederherstellung der Fluoreszenz führt, die nachgewiesen werden kann. Offenbarungen von Tyagi und Kramer (1996, Nature Biotechnology 14: 303-308) und van Beuningen et al. (Proceedings of SPIE, Band 4264 (2001), 66-71) sind in diesem Zusammenhang beispielhaft. Der zur Dämpfung führende Anteil des molekularen Leuchtsignals kann mit einer Anzahl von unterschiedlichen Fluorophoren kombiniert werden. Wenn zum Beispiel zwei Fluorophore verwendet werden, können diese Fluorophore unterschiedlich sein, z.B. das Fluorophor des Rezeptors kann unterschiedlich zum Fluorophor des internen Standards sein.

Die vorliegende Erfindung zieht die Verwendung von Nucleinsäure-Aptameren zum Nachweis in Erwägung. Ein Aptamer ist ein Oligonucleotid mit einer einzigartigen Sequenz, die sich in eine einzigartige sekundäre und tertiäre Struktur faltet, die als Konsequenz eine einzigartige Bindungsoberfläche für ihre Liganden präsentiert. In diesem Zusammenhang betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Leuchtsignal-Aptamer.

Molekulare Leuchtsignale und Leuchtsignal-Aptamere können bei einem indirekten Nachweis verwendet werden, das heißt ein Nachweis mit einem molekularen Lichtsignal oder Lichtsignal-Aptamer eines Analyten, der an einen Rezeptor gebunden ist, und/oder eines Reporters, der an seinen internen Standard gebunden ist.

Für Ausführungsformen, welche die Immobilisierung von vorsynthetisierten Polynucleotiden verwenden, ist eine bevorzugte Markierung ein markiertes Polynucleotid. Die Primärsequenzen der markierten und unmarkierten Polynucleotide an einem bestimmten Spot können gleich oder unterschiedlich sein. Tatsächlich kann das gleiche markierte Polynucleotid an jedem Spot in der Anordnung verwendet werden. Die einzige Bedingung ist, dass im Wesentlichen „ein Schub" des gleichen Anteils des markierten Polynucleotids zu den auf jedem Spot in der Anordnung abgelagerten Polynucleotid-Reagenzien „zugesetzt" („spiked") wird.

In einer Ausführungsform wird das gleiche Gemisch von markierten Polynucleotiden als Schuß zu dem auf jedem Spot abgelagerten Polynucleotidreagens zugesetzt. Die Verwendung des gleichen Gemisches von markierten Polynucleotiden an jedem Spot stellt sicher, dass die Markierungen an verschiedenen Spots keine sequenzspezifischen Anomalien in Hybridisierungsanalysen induziert, das heißt, es ist sichergestellt, dass die Markierungen an jedem Spot der Anordnung auf eine ähnliche Weise mit der Ziel-Nucleinsäure in den Hybridisierungsanalysen interagiert. Des weiteren vermindert die Verwendung der gleichen Markierung an jedem Spot die Anzahl der markierten Polynucleotide, die hergestellt werden müssen.

Die Menge der Markierung, die dem Polynucleotidreagens „als Schuß" „zugesetzt" wird, das auf einem bestimmten Spot abgelagert werden soll, ist für den Erfolg nicht entscheidend. Die verwendete Menge sollte jedoch ausreichend sein, um ein nachweisbares Signal herzustellen, das nicht zu einem Verlust des dynamischen Bereichs führt, wenn die Anordnung in einer Analyse verwendet wird.

Für die Verwendung in einer Hybridisierungs-Anordnung werden die Hintergrundsignale von einer Polynucleotid-Anordnung gemäß der Erfindung quantifiziert und erfasst. Die Art des Nachweises wird von der Natur der Markierung abhängen. Für Fluoreszenzmarkierungen können Hintergrundsignale in geeigneter Weise durch das Absuchen der Anordnung mit einer konfokalen Kamera oder mit einer CCD-Kamera quantifiziert werden, wie es auf dem Fachgebiet gut bekannt ist.

Die Anordnung wird mit einer Reporter- und einer Analyt-Nucleinsäure, die in Abhängigkeit des bestimmten Formats der Anordnung markiert oder unmarkiert sein können, unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die zwischen vollständig komplementären Hybriden und Hybriden, die eine oder mehrere Fehlpaarungen enthalten, unterscheiden. Die tatsächlich verwendeten Hybridisierungsbedingungen werden unter anderem von dem G+C-Gehalt der Sequenz des Interesses und der Länge der immobilisierten Polynucleotide, welche die Anordnung umfassen, abhängig sein. Die Hybridisierungsbedingungen, die für die Unterscheidung zwischen perfekten komplementären Sequenzen und Fehlpaarungen für eine Vielfalt von Hybridisierungs-Anordnungen nützlich sind, wurden auf dem Fachgebiet beschrieben. Hybridisierungsbedingungen, die für die Unterscheidung von komplementären Hybriden und Hybriden mit Fehlpaarungen in einer Vielfalt von Anwendungen nützlich sind, werden zum Beispiel in US-Pat.-Nr.: 5,525,464 von Drmanac et al., WO 95/09248 und WO 98/31836 beschrieben. Eine detaillierte Diskussion der theoretischen und praktischen Erwägungen, die bei der Bestimmung der Hybridisierungsbedingungen involviert sind und die eine Diskussion der Vorteile von Waschschritten mit einer niedrigen Temperatur einschließen, können in WO 98/31836, besonders auf den Seiten 50-62 gefunden werden. Eine zusätzliche Anleitung kann in Harmes und Higgins, Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, 1985, IRL Press, Oxford, England, gefunden werden.

Wie vorstehend erwrähnt wurde, werden bei der Durchführung der vorliegenden Verfahren die Analyt- und Reporter-Nucleinsäuren an eine Anordnung hybridisiert, wobei das Ziel, das die Analyt- und Reporter-Nucleinsäuren umfasst, an die gleiche Anordnung oder an verschiedenen Anordnungen hybridisieren kann, wobei, falls die Analyt- und Reporter-Nucleinsäuren an verschiedene Anordnungen hybridisiert sind, jede der verschiedenen Anordnungen mindestens gemeinsame Anordnungen, Spots oder Bindungssubstanzen der Rezeptor- und/oder internen Standardnucleinsäuren teilen können, z.B. werden sie mit Bezug auf ihre Rezeptor- und/oder internen Standardnucleinsäuren identisch sein.

In den vorstehenden Ausführungsformen, in denen die Analyt- und Reporter-Nucleinsäuren gleichzeitig an eine vorliegende Anordnung hybridisiert werden, werden die markierten Analyt- und Reporter-Nucleinsäuren vorher gemischt oder vereint, bevor sie mit der Anordnung in Kontakt gebracht werden. In einer Ausführungsform besitzen Gemische von Analyt- und Reporter-Nucleinsäuren Mengen der Analyt- und Reporter-Nucleinsäuren, die ausreichend sind, um Signale zu erzeugen, die mindestens 1,5-fach, im Allgemeinen mindestens 3-fach und noch häufiger mindestens 5-fach höher als die Hintergrundsignale sind, die bei der Anordnung beobachtet werden. Die relativen Mengen der Analyt- und Reporter-Nucleinsäuren in dem Gemisch werden so gewählt, dass sie ausreichend sind, um einen verlässlichen Nachweis der Testsequenzen, die komplementär zu der jeweiligen Rezeptor- und internen Standard-Nucleinsäure sind, zu ermöglichen, während sie zur gleichen Zeit die vollständige Bindung der Reporter-Nucleinsäuren mit einem nullfachen Überschuss der ungebundenen Reporter-Nucleinsäure auf der Anordnung ermöglichen. Die Menge der Reporter-Nucleinsäure, die in dem Gemisch vorhanden ist, wird im Allgemeinen durch die zur Verfügung stehende Menge der Probe und der Sensitivität der Technologie, die in einem bestimmten Protokoll verwendet wird, bestimmt. Die Menge der Reporter-Nucleinsäure, die in dem Gemisch vorhanden ist, liegt zum Beispiel in einem Bereich von etwa 0,01-100 &mgr;g Nucleinsäure, z.B. cDNA, und noch häufiger bei etwa 0,1-10 &mgr;g Nucleinsäure, z.B. cDNA. In vielen Ausführungsformen ist die Menge der Reporter-Nucleinsäure, die in dem Hybridisierungsprotokoll verwendet wird, etwa die gleiche Menge oder weniger als die Menge der Analyt-Nucleinsäure, die verwendet wird, wobei weniger üblicherweise 10-fach weniger, im Allgemeinen 100-fach weniger und noch häufiger 1000-fach weniger bedeutet. Von Interesse sind Gemische von markierten Nucleinsäuren, die eine Signalintensität von jeder Sonden-Nucleinsäure in dem Kontrollnachweiskanal zur Verfügung stellen, die in einem Bereich von etwa 0,001 bis 0,1 %, im Allgemeinen von etwa 0,001 bis 0,01 % des Häufigkeitsspiegels liegt.

Die Reporter- und Analyt-Nucleinsäuren werden an die Anordnungen) hybridisiert, indem die Analyt- und Reporter-Nucleinsäuren mit der Anordnung/den Anordnungen unter Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht werden. Mit "Hybridisierungsbedingungen" sind Bedingungen gemeint, die ausreichend sind, um die Ausbildung einer Watson-Crick-Wasserstoffbindung zwischen den Ziel- und Sonden-Nucleinsäuren zu fördern. Die Hybridisierungsbedingungen wie z.B. die Hybridisierungszeit, Temperatur, verwendete Waschpuffer etc. können verändert werden, um die effiziente und spezifische Bindung der Zielsequenzen zu optimieren. Test-Ziel-Nucleinsäuren, die eine Sequenz besitzen, die ähnlich zu den Sonden ist, können durch die Hybridisierung unter Bedingungen mit einer niedrigen Stringenz, zum Beispiel bei 50°C und 6 × SSC (0,9 M Natriumchlorid/0,09 M Natriumcitrat, 1 % SDS) nachgewiesen werden und sie bleiben gebunden, wenn sie bei 55°C in 1 × SSC (0,15 M Natriumchlorid/0,015 M Natriumcitrat, 1 % SDS) gewaschen werden. Test-Zielsequenzen mit einer Sequenzidentität können durch Hybridisierung unter stringenten Bedingungen nachgewiesen werden, zum Beispiel bei 60°C oder höher und 6 × SSC (15 M Natriumchlorid/01,5 M Natriumcitrat, 1% SDS). Die Analyt- und Reporter-Nucleinsäuren besitzen zum Beispiel eine Region mit einer wesentlichen Identität zu den auf der Anordnung zur Verfügung stehenden Rezeptor- bzw.

internen Standardsequenzen und binden selektiv an ihre jeweiligen Rezeptor- und internen Standardsequenzen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen. Andere geeignete Hybridisierungsbedingungen für verschiedene Nucleinsäurepaare sind dem Fachmann gut bekannt und werden in Sambrook et al., 1989 (vergl. vorstehend) und in PCT WO 95/2144 zusammengefasst.

Die Analyse der Unterschiede in den Signalen, die von zwei oder mehr Quellen hergestellt werden, kann durch die Verwendung von multiplen Anordnungen mit der gleichen oder einer ähnlichen Zusammensetzung von Rezeptor und internem Standard durchgeführt werden, jede Anordnung für jede Gruppe von Analyt- und Reporter-Nucleinsäuren. Jede Anordnung wird anschließend mit markierten Reporter-Ziel-Nucleinsäuren und markierten Analyt-Nucleinsäuren hybridisiert. Die Markierungseffizienz und die Menge der Analyt-Sequenzen und Reporter-Sequenzen ist zum Beispiel zwischen den Anordnungen ungefähr äquivalent, z.B. wird eine gleiche Menge von markierten Analyt-Nucleinsäuren verwendet, um an jede Anordnung zu hybridisieren. Dies ist jedoch nicht essentiell, da die Hybridisierung der Gruppe von markierten Reporter-Nucleinsäuren als eine unabhängige interne Kontrolle für jede untersuchte Anordnung funktioniert.

Die Spiegel der Hybridisierung von Reporter-RNA an die bindenden Substanzen kann durch den Vergleich des Hybridisierungssignals des Reporter mit den internen Standardsequenzen auf jeder Anordnung standardisiert werden.

Unterschiede bei der Hybridisierung der vorweg bestimmten Reportersequenzen an die vorweg bestimmten internen Standards ermöglichen einen Vergleich der relativen Hybridisierungsspiegel zwischen den Anordnungen.

Nach der Hybridisierung wird die nicht hybridisierte markierte Nucleinsäure von dem Substrat entfernt, geeigneterweise durch das Waschen, wobei ein Muster von hybridisierter Nucleinsäure auf der Oberfläche des Substrats erzeugt wird. Eine Vielfalt von Waschlösungen und Protokollen sind dem Fachmann bekannt und können verwendet werden. Vergl. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989).

Wenn der Analyt und/oder der Reporter markiert sind/ist, kann die Anordnung abgesucht oder auf eine andere Weise nach nachweisbaren Analysesignalen untersucht werden und das Signal von jedem markierten Spot oder in einer anderen Ausführungsform von allen Spots wird quantifiziert. Nur bei diesen Spots, bei denen eine Bindung, z.B. Hybridisierung, stattgefunden hat, wird ein nachweisbares Analysesignal erzeugt. Die so erhaltenen Hybridisierungsmuster der markierten Nucleinsäuren können auf vielfältige Weise visualisiert oder nachgewiesen werden, wobei die bestimmte Art des Nachweises basierend auf der bestimmte Markierung der Ziel-Nucleinsäure ausgewählt wird, wobei repräsentative Nachweismittel die Szintillationszählung, Autoradiographie, Fluoreszenzmessung, kolometrische Messung, Lichtemissionsmessung, Lichtstreuung und dergleichen (vergleiche vorstehend) sind.

Nach dem Nachweis, der Bestimmung oder Visualisierung können die Bindungsmuster, z.B. die Hybridisierungsmuster, die durch Analyt und Reporter, zum Beispiel Analyt- und Reporternucleinsäuren, erzeugt wurden, verglichen werden, um Unterschiede zwischen den Signalen zu identifizieren. Wenn Anordnungen verwendet werden, in denen jeder der verschiedenen Rezeptoren einem bekannten Gen entspricht, können Unterschiede in der Signalintensität auf eine unterschiedliche Analyt-Konzentration eines bestimmten Gens bezogen werden.

Die Intensität des Signals, das auf die Bindung einer Analyt-Nucleinsäure an einen Rezeptor zurückzuführen ist, kann mit der Intensität des Signals, das auf die Bindung der entsprechenden Reporter-Sequenz an die Sequenz des internen Standards zurückzuführen ist, verglichen werden und die gemessenen Werte können zu einer relativen quantitativen Konzentration der Nucleinsäure für die Analyt-Probe umgewandelt werden. Die relativen quantitativen Nucleinsäure-Spiegel des Analyten können innerhalb einer Anordnung und zwischen Anordnungen verglichen werden, um eine differentielle Expression von Genen in bestimmten Proben zu identifizieren, zu bestimmen oder zu bestätigen.

Wenn jeder Spot in der Anordnung die gleiche Menge immobilisiertes Polynucleotid enthält, dann ist in der Theorie die Analysesignalintensität an jedem Spot proportional zu dem Ausmaß der Hybridisierung an diesem Spot. Von Spots, die vollständig komplementäre Hybride enthalten, wird zum Beispiel erwartet, dass sie stärkere Analysesignale erzeugen als Spots, die Hybride mit Fehlpaarungen enthalten. In der Praxis jedoch können Unterschiede bei der Signalintensität zwischen verschiedenen Spots stattdessen auf Unterschiede bei den Mengen an Polynucleotid, das an dem jeweiligen Spot immobilisiert ist, oder den Mengen des Analyten aufgrund der Probenherstellung zurückzuführen sein.

Weil jeder Spot auf der Anordnung der Erfindung eine Menge eines internen Standards enthält, der proportional zur Menge des Rezeptors ist, der an einem bestimmten Spot immobilisiert ist, können die Analysesignale, die von der Anordnung der Erfindung erhalten werden, normalisiert werden. Als eine Konsequenz können Signalintensitäten von Spots innerhalb einer einzelnen Anordnung, innerhalb Spots oder über viele Anordnungen ohne Beachtung der Genauigkeit der bestimmten Anordnungssynthese oder der Probenherstellung direkt verglichen werden.

Das Verfahren, durch das die Signale normalisiert werden, wird davon abhängen, ob die Reporter- oder Hintergrundsignale die gleichen wie die Analysesignale sind, wie z.B. wenn der Reporter und der Analyt mit dem gleichen Fluorophor markiert sind. In dieser Ausführungsform wird ein normalisiertes Signal eines bestimmten Spots durch (Ia-Ib)/Ib definiert, wobei Ia die Intensität des Analysesignals des Spots (z.B. Intensität des Spots nach der Hybridisierung) ist und Ib die Intensität des Hintergrundsignals des Spots (z.B die Intensität des Spots vor der Hybridisierung) ist.

In Ausführungsformen, in denen die Reporter- und die Analysesignale unterschiedlich sind, z.B. bei denen der Reporter und der Analyt unterschiedlich markiert sind, z.B. mit verschiedenen Fluorophoren, wird das normalisierte Signal für einen Spot durch Ia/Ib beschrieben, wobei Ia die Intensität des Analysesignals ist und Ib die Intensität des Rezeptorsignals des gleichen Spots ist.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Normalisierung einer Anordnung, das die Schritte umfasst:

  • (i) das Immobilisieren einer bindenden Substanz, die einen Rezeptor und eine vorweg bestimmte Menge eines internen Standards umfasst, auf die Anordnung; und
  • (ii) die Bestimmung des Signals, das durch den internen Standard mittels eines Reporter-Moleküls, das selektiv an den internen Standard bindet, erzeugt wird.

Während die Anordnung unter Verwendung von markierten Analyt- und Reporter-Nucleinsäuren dargestellt wird, wird der Fachmann erkennen, dass die Anordnungen der Erfindung auch für Analysen nützlich sind, die unmarkierte Ziel-Nucleinsäuren verwenden. Die einzige Anforderung ist, dass irgendeine Komponente der bestimmten Analyse ein nachweisbares Signal an Spots erzeugt, an denen eine Bindung, z.B. Hybridisierung, erfolgt.

Die vorliegenden Verfahren finden unter anderen Anwendungen eine Verwendung bei der Standardisierung von Analysen differentieller Genexpression. Daher kann man die vorliegenden Verfahren in Analysen differentieller Expression verwenden: (a) erkranktes und normales Gewebe, z.B. neoplastische und normale Gewebe; (b) verschiedene Gewebe oder Gewebearten; (c) Entwicklungsstadium; (d) Antwort auf externen oder internen Stimulus; (e) Antwort auf eine Behandlung; und dergleichen. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung finden daher bei dem Absuchen der Expression zur Arzneistoffentdeckung im großen Maßstab, Diagnose und Forschung, wie z.B. die Wirkung eines bestimmten Wirkstoffs auf das Expressionsmuster der Gene in einer bestimmten Zelle, wobei solche Informationen verwendet werden können, um die Toxizität, Karzinogenität etc. von Arzneistoffen zu offenbaren, Beobachtung der Umwelt, Erkrankungsforschung und dergleichen, Verwendung. Eine Anzahl von verschiedenen Aufgaben können mit der vorliegenden Erfindung erreicht werden, wobei die Aufgaben einschließen, aber nicht begrenzt sind auf: Nachweisen der relativen Hybridisierung der Ziel-Sequenzen, Kalibrierung einer Hybridisierungsanalyse, Harmonisierung von Daten zwischen Hybridisierungsanalysen und Testen von Reagenzien, die in Hybridisierungsanalysen verwendet werden. Die vorliegenden Verfahren, in denen Kontroll- und Testgruppen von Ziel-Nucleinsäuren verwendet werden, können ebenfalls bei der Erzeugung von Genexpressionsdatenbanken verwendet werden, weil die Daten, die von den vorliegenden Verfahren erzeugt werden, relativ quantitativ sind, eher die relativen RNA-Konzentrationen als die Signalintensität widergeben und unabhängig von der Art der Analyse sind. Jeder dieser unterschiedlichen Aspekte der Erfindung wird getrennt nachfolgend diskutiert.

Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind für den Nachweis der relativen Spiegel der Hybridisierung von verschiedenen Genen in einer Probe nützlich, indem sie eine Gruppe von internen Hybridisierungskontrollen, das heißt den Reporter, zur Verfügung stellen. Weil die Reporter-Nucleinsäuren eine bekannte Sequenz in einer bekannten Menge besitzen und von einer bekannten spezifischen Aktivität sind (wobei in einer beispielhaften Ausführungsform der Reporter und der Analyt mit der gleichen spezifischen Aktivität markiert sind), kann der Hybridisierungsspiegel der Reporter-Nucleinsäuren verwendet werden, um den Expressionsspiegel von jedem Gen in einer Testprobe basierend auf seinem Spiegel der Bindung an eine Rezeptor-Sequenz zu bestimmen. Die Bestimmung, dass jede Probe ihre eigene interne Kontrolle (Reporter) besitzt, ermöglicht ebenfalls den Nachweis von möglichen Expressionsunterschieden zwischen den Proben und von Unterschieden bei den Bindungsaffinitäten zwischen den Rezeptor-Sequenzen sowohl auf einer einzelnen Anordnung als auch zwischen den Anordnungen. Die Intensität des Hybridisierungsspiegels einer Reporter-Sequenz kann somit verwendet werden, um den Expressionsspiegel eines Gens in einer Probe basierend auf der Intensität der Analyt-Hybridisierung mit der entsprechenden Reporter-Sequenz zu berechnen.

Die Verfahren der vorliegenden Erfindung finden ebenfalls bei der Kalibrierung von Hybridisierungsanalysen Verwendung. Die Verwendung von bekannten Konzentrationen der Rezeptor-Nucleinsäure, der Analyt-Nucleinsäuren, der internen Standard-Nucleinsäuren und Reporter-Nucleinsäuren ermöglicht, die Hybridisierungsbedingungen für eine bestimmte Verwendung zu optimieren, wie z.B. das Erhöhen der Stringenz, um einen besseren Nachweis von Nucleinsäuren mit einem gewissen Grad an Sequenz-Homologie zu ermöglichen (z.B. differentielle Expression zwischen Genen von einer einzelnen Familie oder alternative Spleißformen des gleichen Gens). Die Verwendung des internen Standards des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ermöglicht, die Hybridisierung, Verfahren zur Markierung und dergleichen für eine bestimmte Verwendung zu optimieren, was besonders wertvoll für die Standardisierung von Hybridisierungsanalysen im großen Maßstab wie z.B. das Absuchen von biologischen Proben mit hohem Durchsatz ist. Die Optimierung bedeutet daher, dass die Hybridisierungsbedingungen geändert werden können, um eine maximale Intensität von spezifischen Hybridisierungssignalen mit komplementären Sonden-Sequenzen und einen minimalen Grad an unspezifischer Hybridisierung mit nichtkomplementären Sonden-Sequenzen zu erhalten.

Die Verfahren der vorliegenden Erfindung finden ebenfalls Verwendung bei der Harmonisierung von Daten zwischen Hybridisierungsanalysen, wobei sie damit einen direkten Vergleich der Expressionsspiegel trotz möglicher Unterschiede aufgrund von Variablen wie z.B. Unterschiede bei den Hybridisierungsbedingungen, Unterschiede bei der Probenherstellung und sogar zwischen verschiedenen Arten von Anordnungen, Unterschiede bei der Qualität und der Durchführung innerhalb und zwischen verschiedenen Anordnungen, Unterschiede bei der spezifischen Aktivität der markierten Ziel-Sequenzen und so weiter ermöglichen. Weil jede Hybridisierungsanalyse eine interne Kontrolle für mindestens eine Untergruppe der Sonden-Sequenzen auf der Anordnung besitzt, können die Daten unter Verwendung von Verhältnissen der Intensität der Reporter-Nucleinsäuren und der Intensität der Analyt-Nucleinsäuren verglichen werden. Die Verwendung von einfachen mathematischen Formulierungen, um die Unterschiede zwischen den Analysen zu korrigieren, ermöglicht daher, die Spiegel der Genexpression in diesen verschiedenen Analysen auf den gleichen Spiegel anzugleichen und sie anschließend in einer biologisch relevanten Weise zu vergleichen.

Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls bei der Bestimmung der Effizienz von Hybridisierungsreagenzien nützlich. Solche Reagenzien können zum Beispiel neue Reagenzien, z.B. unterschiedliche Pufferlösungen für die Prähybridisierung und Hybridisierung, oder etablierte Reagenzien, z.B. neue Chargen eines bekannten, im Handel erhältlichen Reagens sein. Die interne Kontrolle der Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt zwei Ebenen der Qualitätssicherheit beim Testen der Reagenzien zur Verfügung, im Grunde wird eine zusätzliche Kontrolle zur Bestimmung der Effizienz eines Reagens in einer einzelnen Hybridisierung zur Verfügung gestellt. Die Effizienz bedeutet ein maximales, spezifisches Signal mit einem minimalen Spiegel eines unspezifischen Signals und von Hintergrundbindung an die feste Oberfläche. Andere Parameter wie z.B. Temperatur, Pufferzusammensetzung, Länge der Hybridisierungszeit und/oder der Waschzeit etc. können unter Verwendung der Kalibrierungskontrollen optimiert werden. Die gleiche Kalibrierungs-Reporter-Nucleinsäure kann ebenfalls routinemäßig verwendet werden, um die Nachweisausstattung zu testen und auf erwartete Intensitätsspiegel der Signale zu kalibrieren, wodurch die Variabilität aufgrund der Funktionalität der Ausstattung, Variationen aufgrund von Daten, die in verschiedenen Laboren oder zu verschiedenen Zeitpunkten erzeugt werden, oder sogar aufgrund der Verwendung von unterschiedlichen Arten der Anordnungen begrenzt wird.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, wie es hierin beschrieben wird, für die Verwendung bei Analysen zur Expressionsdarstellung, Verfahren zur Bestimmung des Genotyps, Sequenzbestimmung durch Hybridisierung, für die Genquantifizierung, für die Analyse auf-Gen-Abnormalität (Multiplex Amplifiable Probe Hybridisation, MAPH), PCR, NASBA oder TYRAS.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Anordnung für die Normalisierung einer Analytvariation, wobei die Anordnung ein Substrat mit vordefinierten Regionen umfasst, wobei jede bindende Substanz, die an einer vordefinierten Region des Substrats immobilisiert ist, einen Rezeptor und eine vorweg bestimmte Menge eines internen Standards umfasst, wobei das Signal, das durch den internen Standard erzeugt wird, durch ein Reporter-Molekül bestimmt wird und wobei das Reporter-Molekül selektiv an den internen Standard bindet.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Anordnung in einem Verfahren, wie es hierin beschrieben wird.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung eine Anordnung zur Verwendung in einem Verfahren, wie es hierin beschrieben wird, wobei die Anordnung ein Substrat mit vorweg bestimmten Regionen umfasst, wobei jede bindende Substanz, die an einer vordefinierten Region des Substrats immobilisiert ist, einen Rezeptor und eine vorweg bestimmte Menge eines internen Standards umfasst, wobei das Signal, das durch den internen Standard erzeugt wird, mittels eines Reporter-Moleküls bestimmt wird und wobei das Reporter-Molekül selektiv an den internen Standard bindet.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung eine Anordnung, die ein Substrat mit vorweg bestimmten Regionen umfasst, wobei jede bindende Substanz, die an einer vordefinierten Region des Substrats immobilisiert ist, einen Rezeptor und eine vorweg bestimmte Menge eines internen Standards umfasst, wobei das Signal, das durch den internen Standard erzeugt wird, mittels eines Reporter-Moleküls bestimmt wird und wobei das Reporter-Molekül selektiv an den internen Standard bindet.

Tyras ist ein Verfahren zur Amplifikation von RNA durch die Erzeugung von multiplen RNA-Kopien in einer nicht spezifischen Weise, wobei von Nucleinsäure ausgegangen wird, die Startmaterial enthält, das einen Pool von mRNAs umfasst, wobei jede mRNA einen Poly-A-Schwanz umfasst, wobei das Material gleichzeitig mit einem Oligonucleotid umfassend eine Oligo-dT-Sequenz, die Sequenz eines Promotors, die von einer RNA-Polymerase erkannt wird, und eine Transkriptions-Startregion, die zwischen der Oligo-dT-Sequenz und der Sequenz des Promotors liegt und des weiteren mit einem Enzym, das eine reverse Transkriptaseaktivität besitzt, einem Enzym, das eine RNase H-Aktivität besitzt, und einem Enzym, das eine RNA-Polymerase-Aktivität besitzt, und den notwendigen Nucleotiden in Kontakt gebracht wird, und das so erhaltene Reaktionsgemisch wird unter den geeigneten Bedingungen für eine ausreichende Zeit gehalten, damit die enzymatischen Prozesse stattfinden können. Dies wird zu der Erzeugung von multiplen Antisense-RNA-Kopien der mRNAs führen, die in dem Reaktionsgemisch vorhanden sind. Tyras benötigt nicht die Herstellung von cDNA-Zwischenformen. Die RNA wird direkt von der mRNA, die in dem zu untersuchenden Material vorhanden ist, kopiert. Tyras benötigt keine cDNA als eine Basis für die Amplifikation der RNA. Die RNA wird durch eine RNA-Polymerase direkt von der mRNA-Matrize synthetisiert. Die Aktivität der RNA-Polymerase ist unabhängig von den Sekundärstrukturen, die in der mRNA vorliegen, und daher bestehen in Abhängigkeit von den Strukturen in den mRNAs keine Unterschiede in der Weise, in der die verschiedenen mRNAs amplifiziert werden. Die hergestellten Kopien repräsentieren die ursprüngliche mRNA-Population, wie sie im Startmaterial vorliegt. Die Oligonucleotide, die bei Tyras verwendet werden, umfassen eine Oligo-dT-Sequenz, die mit dem polyadenylierten Schwanz am 3'-Ende der mRNAs hybridisiert. Die Oligonucleotide umfassen des weiteren die Sequenz eines Promotors, der von einer RNA-Polymerase erkannt wird, und eine Transkriptions-Startregion, die zwischen der Oligo-dT-Sequenz und der Sequenz des Promotors liegt. Der Promotor kann der Promotor für jede geeignete RNA-Polymerase sein. Beispiele von RNA-Polymerasen sind Polymerasen von E. coli und von den Bakteriophagen T7, T3 und SP6. In diesem Zusammenhang ist WO 99/43850 von Pam Gene exemplarisch.

Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Kits zur Durchführung der vorliegenden, auf einer Anordnung basierenden Hybridisierungsanalysen zur Verfügung. Die vorliegenden Kits schließen mindestens Reporter-Nucleinsäuren, wie sie vorstehend definiert wurden, oder einen Vorläufer davon ein. Mit "Nucleinsäure-Vorläufer" ist jede Nucleinsäure gemeint, mit der die Kontrollgruppe hergestellt werden kann, z.B. eine Gruppe von RNAs, welche die Nucleinsäuren der Kontrollgruppe codieren, Plasmide, welche die Nucleinsäuren zur Herstellung der Kontrollgruppe enthalten, und dergleichen.

Eine markierte cDNA kann von diesen Vorläufern durch eine enzymatische Synthese abgeleitet werden oder Oligonucleotide können basierend auf der Sequenzinformation dieser Vorläufer chemisch synthetisiert werden. Die Kits können RNAs enthalten, die jede Sondenzusammensetzung auf einer Anordnung erkennen, und solche RNAs können vormarkiert werden oder sie können zur Verwendung mit den Analyt-Nucleinsäuren markiert werden oder sie können zu markierten cDNAs für die Hybridisierung umgewandelt werden. Die Kits der vorliegenden Erfindung können ebenfalls cDNAs oder Oligonucleotide enthalten, die selektiv an die Rezeptorzusammensetzungen der Anordnung, die abgesucht werden soll, binden. Die cDNAs oder Oligonucleotide können vormarkiert werden oder sie können von dem Verwender durch jedes geeignete Protokoll markiert werden, wie z.B. das Protokoll, das verwendet wird, um die markierten Reporter-Nucleinsäuren herzustellen. Ein Kit, der eine Gruppe von Kontroll-Ziel-RNAs enthält, kann des weiteren Oligonucleotide zur Herstellung von cDNA enthalten. In einer beispielhaften Ausführungsform sind diese Oligonucleotide genspezifische Primer, besonders genspezifische Primer, die eine Sequenz besitzen, die identisch zu denen ist, die bei der Herstellung der Rezeptor-Zusammensetzungen auf der Anordnung verwendet werden, um in der bestimmten Analyse verwendet zu werden. In einer anderen Ausführungsform können die Primer Oligo-dT-Primer oder Zufallsprimer sein, wenn diese Primer zur Herstellung eines Test-Probenziels verwendet werden.

Kits zur Durchführung von Untersuchungen zur Analyse der differentiellen Genexpression werden in Erwägung gezogen. Solche Kits werden gemäß der vorliegenden Erfindung mindestens die vorliegenden Gruppen der Nucleinsäuren wie z.B. Rezeptoren und interne Standards umfassen. Die Kits können des weiteren eine oder mehrere Anordnungen umfassen, die der Gruppe der Reporter-Nucleinsäuren entsprechen.

Die Kits können des weiteren ein oder mehrere zusätzliche Reagenzien umfassen, die in den verschiedene Verfahren verwendet werden, wie z.B.: Primer zur Erzeugung der Ziel-Nucleinsäuren, dNTPs und/oder rNTPs, die entweder vorweg gemischt oder einzeln vorliegen können, ein oder mehrere einzigartig markierte dNTPs und/oder rNTPs wie z.B. biotinylierte oder Cy3- oder Cy5-markierte dNTPs; oder andere Markierungsreagenzien, die nach der Synthese eingesetzt werden, wie z.B. chemisch aktive Derivate von Fluoreszenzfarbstoffen, Enzyme wie z.B. reverse Transkriptasen, DNA-Polymerasen, RNA-Polymerasen und dergleichen; verschiedene Puffermedien wie z.B. Hybridisierungs- und Waschpuffer; vorgefertigte Sonden-Anordnungen, markierte Sonden-Reinigungsreagenzien und Komponenten wie z.B. Zentrifugensäulen etc; Reagenzien zur Signalerzeugung und zum Signalnachweis wie z.B. Konjugate von Streptavidin-alkalische Phosphatase, chemifluoreszierende und chemilumineszierende Substrate und dergleichen.

Zusätzlich zu den Gruppen der Nucleinsäuren, Anordnungen und anderen Komponenten, die vorstehend in der allgemeinen Beschreibung von Kits beschrieben wurden, kann der Analyse-Kit weiterhin eine Gruppe von genspezifischen Primern enthalten, die verwendet werden, um markierte Analyt-Nucleinsäuren herzustellen. In vielen Ausführungsformen wird die Gruppe der genspezifischen Primer die gleichen Primer sein, die verwendet werden, um die Polynucleotid-Rezeptoren herzustellen, die auf der abzusuchenden Anordnung vorhanden sind.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung oder einen Kit, die/der eine Anordnung auf Durchfluss-Basis umfasst, wie hierin beschrieben wird.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Vorrichtung oder eines Kits, wie hierin beschrieben wird, für Analysen zur Expressionsdarstellung, Verfahren zur Bestimmung des Genotyps, Sequenzbestimmung durch Hybridisierung, Gen-Quantifizierung, Analyse auf Gen-Abnormalität (MAPH), PCR, NASBA oder TYRAS.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Reporter-Moleküls für die Herstellung von einer Vorrichtung oder einem Kit oder den Einbau darin, wie hierin beschrieben wird.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines internen Standards für die Herstellung von einer Vorrichtung oder einem Kit oder den Einbau darin, wie hierin beschrieben wird.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Korrelation von Variationen in den Analyten, die umfasst:

  • • Bereitstellen von mindestens zwei Analyten, wobei jeder Analyt gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert wird.
  • • Vergleich der Werte der normalisierten Analyten, wie in der vorliegenden Erfindung definiert ist, wobei die Variation bei den Analyten korreliert wird.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Berichts, der die Variation der Analyten korreliert, die durch ein Verfahren der vorliegenden Erfindung bestimmt wird.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Computersystem, das Daten umfasst, die gemäß einem Verfahren, einer Analyse, einer Anordnung oder einem Kit der vorliegenden Erfindung erhalten werden.

Bevor die vorliegende Erfindung weiter beschrieben wird, sollte es selbstverständlich sein, dass die Erfindung nicht auf die bestimmten Ausführungsformen der Erfindung, die hierin beschrieben werden, beschränkt ist, da Variationen der bestimmten Ausführungsformen durchgeführt werden können, die immer noch im Umfang der angehängten Ansprüche liegen. Es sollte ebenso selbstverständlich sein, dass die Fachausdrücke mit dem Ziel der Beschreibung der bestimmten Ausführungsformen verwendet wurden und diese nicht einschränkend sein sollen. Stattdessen wird der Umfang der vorliegenden Erfindung durch die angehängten Ansprüche festgelegt.

Die nachfolgenden Beispiele werden zur Erläuterung gegeben und sollen nicht einschränkend sein.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

1: Fluorophor für die Reporter-Sonde

(A) Übersicht über die Anordnung; (B) Signal nachgewiesen mit einem NBB-Filter g5f20 (Schmalband-Blaufilter); (C) Signal nachgewiesen mit einem WIGfilterg0f1_125 (Superbreitband-Grünfilter).

2: Optimierung des IRP/Rezeptor-Verhältnisses

(A) Übersicht über die Anordnung; (B) Fluorescein-Signal der Probe mit einem Schmalband-Blaufilter nach 30 min bei einer Integrationszeit von 770 ms; (C) IRP-Texas-rot-Signal mit einem Breitband-Grünfilter nach 30 min bei einer Integrationszeit von 440 ms.

3: Normalisierung des PamChips

(A) Übersicht über die Anordnung; (B) Signal der Probe mit einem Narrow-band-Blaufilter nach 30 min bei einer Integrationszeit von 440 ms (inhomogen durch Beleuchtungsfehler); (3C) IRP-Signal mit einem Breitband-Blaufilter nach 30 min bei einer Integrationszeit von 27,5 ms (inhomogen durch Beleuchtungsfehler); (D). Signal der Probe mit einem Narrow-band-Blaufilter nach 30 min bei einer Integrationszeit von 770 ms; (E) gesamte beleuchtete Fläche mit einem Anzeichen einer Luftblase auf der linken Seite des Bildes entsprechend (D); (F) IRP-Signal mit einem Breitband-Grünfilter nach 30 min bei einer Integrationszeit von 200 ms; (G) gesamte beleuchtete Fläche mit einem Anzeichen einer Luftblase auf der linken Seite des Bildes entsprechend (F);

BEISPIELE Beispiel 1, Materialien

Nachweise werden unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie (Olympus, Tokyo, Japan) durchgeführt.

Oligonucleotide werden hergestellt und an das Substrat gebunden, wie zuvor in PCT/EP98/04938 beschrieben wurde. Eine Sequenz eines nichtmenschlichen Pflanzenvirus von Kartoffel-Blattroll-RNA-Virus (PLRV)-S2-Sequenz wurde als ein interner Standard IRP verwendet (vergl. Klerks et al., J Vir Methods 93 (2001)115-125).

Beispiel 2: Fluorophore für Reporter-Sonden

Um gleichzeitig die Reporter-Bindung an den internen Standard (IRP) beziehungsweise die Analyt-Bindung an den Rezeptor zu unterscheiden, sollten Reporter und Analyt unterschiedlich markiert sein. Nachstehend wird ein Experiment mit Spots einer PamGene-Mikroanordnung mit 300 pl von Rhodamin (Rho), ROX (Rox) und Texas-rot (Tx) markierten Oligonucleotiden (jeweils 10 &mgr;M) und 1 &mgr;M Fluorescein markiertem Oligonucleotid (F2) beschrieben.

Der experimentelle Aufbau war im Wesentlichen, wie in WO 99/02266 beschrieben wurde.

Kurz zusammengefasst, Oligonucleotid-Sonden wurden kovalent an die Anopore-Membranen gebunden, wobei 3-Aminopropyltriethoxysilan (APS) als ein Linker zwischen Aluminiumoxid und den Oligonucleotiden verwendet wurde.

Nach dem Waschen mit Wasser wurden die Membranen getrocknet und in eine 0,25% (V/V) APS in Wasser-Lösung für 2 Stunden eingetaucht. Überschüssiges APS wurde durch das Waschen mit Wasser entfernt. Nach dem Trocknen bei 120°C unter vermindertem Druck wurden die Membranen gelagert. Die Konzentration der Aminogruppen, aufgrund der Bindung der APS-Moleküle, betrug üblicherweise 2 – 3 &mgr;Mol/m2.

Vor der Bindung wurden die mit einer Aminogruppe endenden Oligonucleotide durch eine Reaktion mit Disuccinimidylsuberat (DSS, vergl. z.B. PIERCE BV, Immunotechnologie Catalog & Handbook, 1990) aktiviert. Die so erhaltene Succinimidyl-Gruppe am Ende des Oligonucleotids wurde zur Bindung an die APSaktivierte Membran verwendet. Die Bindung von einer Oligonucleotid-Lösung an eine Anopore-Membran über 60 Minuten führte zu einer Bindungsausbeute von 1 × 10–10 Mol/m2 Oligonucleotiden.

Für den Nachweis wurde Fluoreszenz-Mikroskopie verwendet, wie in Beispiel 1 beschrieben wurde (Olympus, Tokyo, Japan).

1A stellt die Übersicht über die Anordnung dar. 1B stellt das Signal dar, das von einem NBB-Filter g5f20 (Schmalband-Blaufilter) stammt. 1C stellt das Signal dar, das von einem WIGfilterg0f1_125 (Superbreitband-Grünfilter) stammt.

Um Nebensignaleffekte („cron-talk") zwischen den Fluorophoren zu minimieren, sollte das Fluorophor, das für die Reporter-Sonde verwendet wird, vorzugsweise ein anderes Anregungs- und Emissionsprofil im Vergleich zu dem Fluorophor, das für das Ziel (Analyten) verwendet wird, besitzen. Als Fluorophor der Reporter-Sonde sollte vorzugsweise Texas-rot > ROX > Rhodamin in Kombination mit einem Fluorescein-Proben-Fluorophor (Analyt) verwendet werden.

Beispiel 3. Optimierung des IRP/Rezeptor-Verhältnisses

Der IRP (PLRV-s2, SEQ ID Nr.: 1) wurde in verschiedenen Konzentrationen mit dem vorliegenden Rezeptor (HIVpol7p41-4; SEQ ID Nr.: 8) gemäß Tabelle 1 gemischt. Die Gemische wurden anschließend kovalent gebunden, wie in Beispiel 2 dargestellt wurde.

Die verschiedenen Verhältnisse von IRP und Rezeptor wurden auf eine Anordnung auf jeweils drei Spots aufgebracht, wie in 2A dargestellt wird. Anschließend wurde die Mikro-Anordnung mit einem Gemisch von Tx.R. und dem Fluorescein markiertem HIV-Oligo F2 hybridisiert, das heißt 20 &mgr;l der 1 nM Standard-Sonde comPLRV-Texas-rot (Tx.R.; Analyt) und 20 &mgr;l der 1 nM Standard-Sonde HIV-Oligo F2 (Reporter) wurden in 0,6 × SSPE bei 45°C für 30 Minuten mit 2 Pumpschritten pro Minute mit anschließendem Waschschritt in 0,6 SSPE bei 45°C behandelt. Das Signal von Fluorescein (von F2) wurde mit einem Schmalband-Blaufilter (2B) bestimmt, während das Signal von Texas-rot (durch Tx.R.) mit einem Breitband-Grünfilter (2C) bestimmt wurde.

Eine Interferenz von dem Signal, das auf den IRP-Reporter zurückzuführen ist, mit dem Signal, das auf den Rezeptor-Reporter zurückzuführen ist, ist nicht nachweisbar. Des weiteren ist eine Interferenz zwischen dem Signal, das auf die Bindung des Analyten an den Rezeptor zurückzuführen ist, und dem Signal, das auf die Bindung von IRP an den Reporter zurückzuführen ist, nicht nachweisbar. Eine Menge von 10 – 90% IRP, die dem Rezeptor zugegeben wird, kann verwendet werden.

Beispiel 4. Normalisierung des PamChips

Eine Anordnung mit 11 verschiedenen spezifischen Rezeptoren, das heißt Sonden, wobei jede eine unterschiedliche Menge von Fehlpaarungen zu dem Fluorescein markiertem Ziel-Oligo (Analyt) besitzt, wurde hergestellt. Die spezifischen Rezeptoren werden in Tabelle 2 dargestellt. Bevor die Spots aufgetragen werden, wurden diese Rezeptor-Sonden mit dem IRP PLRV-s2 mit einem Verhältnis von 70/30 in Prozent gemischt. Eine Übersicht über die Anordnung wird in 3A dargestellt.

Die Hybridisierung, wie sie in Beispiel 3 erläutert wurde, wurde durchgeführt, wobei die gleichen Bedingungen verwendet wurden, wie vorstehend erläutert wurde. Die Anwendung der IRP-Normalisierung wurde von absichtlich inhomogenen Beleuchtungen der Anordnungen durchgeführt. Die zwei verwendeten Verfahren basierten auf einer inhomogenen Lichtquellenbeleuchtung und inhomogenen Signalen durch die Zugabe einer Luftblase unter der Anordnung. Das Bild und die Bestimmung der Spotsignalintensität wurde mit Array-Pro (MediaCybernetics) durchgeführt.

Die Normalisierung wurde durch (Netto-Probensignal/Netto-IRP)/Durchschnitts-IRP durchgeführt, wobei das Netto-Probensignal das Signal ist, das auf den Analyten an den Rezeptor zurückzuführen ist. Die Wirkungen der Normalisierung wurden als durchschnittliche Variation zwischen Spot-Duplikaten ausgedrückt.

4.1 Die ersten Serien von Experimenten sind in 3B nach 30 Minuten bei einer Integrationszeit von 440 ms (inhomogen durch Beleuchtungsfehler) dargestellt, wobei auf das Probensignal mit Schmalband-Blaufilter Bezug genommen wird, und in 3C nach 30 min bei einer Integrationszeit von 27,5 ms (inhomogen durch Beleuchtungsfehler) dargestellt, wobei auf das IRP-Signal mit einem Breitband-Grünfilter Bezug genommen wird. Die Ergebnisse der ersten Serie von Experimenten sind in Tabelle 3 zusammengefasst.

Die Normalisierung vermindert die Variation zwischen den Spots von 29 ± 12% auf 21 ± 14%. Die Normalisierung mit dem IRP führte zu einer 33% niedrigeren Variation zwischen den Duplikaten.

4.2 Die zweite Serie von Experimenten betrifft die Einflüsse der Umgebung auf das Bild, was zu schlechten Duplikaten führt. In diesem Fall wurde eine Luftblase unter dem Dia erzeugt. Die Ergebnisse sind in den 3D-3G dargestellt.

3D stellt das Signal der Probe mit einem Schmalband-Blaufilter nach 30 min bei einer Integrationszeit von 770 ms dar. 3E, die der 3D entspricht, zeigt eine vollständige belichtete Region mit einem Anzeichen einer Luftblase auf der linken Seite des Bildes.

3F stellt das IRP-Signal mit einem Breitband-Grünfilter nach 30 min bei einer Integrationszeit von 200 ms dar. 3G, die der 3F entspricht, stellt die vollständige belichtete Region mit einem Anzeichen einer Luftblase auf der linken Seite des Bildes.

Man sollte beachten, dass während der Bilderstellung der Anordnungen während der ersten und der zweiten Serie von Experimenten die Luftblase sich leicht, weniger als 50 &mgr;m, zwischen den beiden Bildern, die von der Anordnung gemacht wurden, verschiebt.

Die Ergebnisse der zweiten Serie von Experimenten sind in Tabelle 4 zusammengefasst.

Die Normalisierung vermindert die Variation zwischen den Duplikaten von 34 ± 21 % auf 15 ± 6%. Die Normalisierung mit dem IRP führte zu einer 50% geringeren Variation zwischen den Duplikaten.


Anspruch[de]
Verfahren zur Identifizierung eines Analyten in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) eine Mikro-Anordnung (microarray) zur Verfügung zu stellen, die ein Substrat mit definierten Regionen umfasst, wobei jede bindende Substanz, die an einer definierten Region an dem Substrat immobilisiert ist, eine vorweg bestimmte Menge von Rezeptor und eine vorweg bestimmte Menge eines internen Standards umfasst,

(b) ein Reporter-Molekül zur Verfügung zu stellen, das selektiv an den internen Standard bindet,

(c) das Reporter-Molekül der biologischen Probe zuzusetzen,

(d) die biologische Probe, die das Reporter-Molekül umfasst, mit der Mikro-Anordnung unter Bedingungen in Kontakt zu bringen, die die Ausbildung einer Bindung zwischen Rezeptor und Analyt und zwischen internem Standard und dem Reporter-Molekül ermöglicht,

(e) das Signal des Reporter-Moleküls, das an den internen Standard bindet, zu bestimmen,

(f) das Signal des Analyten, der an den Rezeptor bindet, zu bestimmen, und

(g) das Signal aus Schritt (f) für das Signal von Schritt (e) zu normalisieren, wobei der Analyt identifiziert wird.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mikro-Anordnung eine Durchfluss-Mikro-Anordnung ist. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Substrat ein poröses Substrat ist. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Substrat eine elektrochemisch hergestellte Metalloxid-Membran ist. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Substrat Aluminiumoxid umfasst. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der interne Standard Polynukleinsäuren oder (Poly)Peptide oder chemische Verbindungen umfasst. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei jede bindende Substanz, die an dem Substrat immobilisiert ist, mindestens 1 % bis maximal 99% des internen Standards umfasst. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei jede bindende Substanz, die an dem Substrat immobilisiert ist, dieselbe vorab bestimmte Menge des internen Standards umfasst. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Rezeptor und der interne Standard verschiedene Moleküle sind. Verfahren für die Normalisierung einer Mikro-Anordnung, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) eine bindende Substanz, die einen Rezeptor und eine vorweg bestimmte Menge eines internen Standards umfasst, an der Anordnung zu immobilisieren und

(b) das durch den internen Standard mittels eines Reporter-Moleküls, das an den internen Standard selektiv bindet, erzeugte Signal zu bestimmen.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Reporter-Molekül Polynukleinsäuren, (Poly)Peptide oder chemische Verbindungen umfasst. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Reporter-Molekül eine Markierung umfasst. Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Markierung eine enzymatische, eine Fluoreszenz-, eine Phosphoreszenz- oder eine Radioaktiv-Markierung ist. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der interne Standard Nukleinsäuren umfasst. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der Analyt markiert ist. Das Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Markierung eine enzymatische, eine Fluoreszenz-, eine Phosphoreszenz- oder eine Radioaktiv-Markierung ist. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Markierung des Analyten und die Markierung des internen Standards unterschiedlich sind. Das Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Markierung des Analyten Texas-rot ist, und die Markierung des internen Standards fluorescein ist. Das Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Markierung des internen Standards Texas-rot ist, und die Markierung des Analyten fluorescein ist. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19 für die Verwendung in einem Assay zur Expressionsdarstellung (expression profiling) in einem Verfahren zur Bestimmung des Genotyps, bei der Sequenz-Bestimmung durch Hybridisierung, für die Gen-Quantifizierung, für die Analyse auf Gen-Abnormalität (MAPH), für PCR, für NASBA oder für TYRAS. Verwendung einer Mikro-Anordnung für die Normalisierung einer Variation von Analyt, wobei die Mikro-Anordnung ein Substrat mit vorweg definierten Regionen umfasst, wobei jede bindende Substanz, die an einer vorweg definierten Region des Substrates immobilisiert ist, einen Rezeptor und eine vorweg bestimmte Menge eines internen Standards umfasst, wobei das Signal, das durch den internen Standard erzeugt wird, mittels eines Reporter-Moleküls bestimmt wird, und wobei das Reporter-Molekül den internen Standard selektiv bindet. Verwendung einer Mikro-Anordnung in dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20. Mikro-Anordnung für die Verwendung in dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die Mikro-Anordnung ein Substrat mit vorweg definierten Regionen umfasst, wobei jede bindende Substanz, die an einer vorweg definierten Region des Substrates immobilisiert ist, einen Rezeptor und eine vorweg bestimmte Menge eines internen Standards umfasst, wobei das Signal, das durch den internen Standard erzeugt wird, mittels eines Reporter-Moleküls bestimmt wird, und wobei das Reporter-Molekül den internen Standard selektiv bindet. Vorrichtung oder Kit umfassend eine Mikro-Anordnung auf Durchfluss-Basis nach Anspruch 23. Verwendung einer Vorrichtung oder eines Kits nach Anspruch 24 in einem Assay zur Expressionsdarstellung in einem Verfahren zur Bestimmung des Genotyps, bei der Sequenz-Bestimmung durch Hybridisierung, für die Gen-Quantifizierung, für die Analyse auf Gen-Abnormalität (MAPH), für PCR, für NASBA oder für TYRAS. Verwendung eines Reporter-Moleküls für die Herstellung einer Vorrichtung oder eines Kits nach Anspruch 24. Verwendung eines internen Standards für die Herstellung eines Kits oder einer Vorrichtung nach Anspruch 24. Verfahren um die Variation in Analyten zu korrelieren, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) wenigstens zwei Analyte zur Verfügung zu stellen, wobei jeder Analyt nach dem Verfahren nach Anspruch 1 identifiziert wird,

(b) die Werte der Analyten in gemäß Anspruch 1 definiertem Schritt (g) zu vergleichen, wobei die Variation in den Analyten korreliert wird.
Verfahren zur Erstellung eines Berichts, der die Variation der Analyte korreliert, wie sie mittels eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche bestimmt wurde.






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