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Dokumentenidentifikation DE69736486T2 08.02.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0000939763
Titel GERICHTETE UMSCHALT-VERMITTELTE DNS-REKOMBINATION
Anmelder Amgen Fremont Inc., Fremont, Ca., US;
Japan Tobacco Inc., Tokio/Tokyo, JP
Erfinder JAKOBOVITS, Aya, Menlo Park, CA 94025, US
Vertreter LEINWEBER & ZIMMERMANN, 80331 München
DE-Aktenzeichen 69736486
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 19.03.1997
EP-Aktenzeichen 979175486
WO-Anmeldetag 19.03.1997
PCT-Aktenzeichen PCT/US97/04380
WO-Veröffentlichungsnummer 1997034912
WO-Veröffentlichungsdatum 25.09.1997
EP-Offenlegungsdatum 08.09.1999
EP date of grant 09.08.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 08.02.2007
IPC-Hauptklasse C07H 21/04(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C07K 14/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 5/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/79(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen Verfahren und Zusammensetzungen zur Verwendung in DNA-Rekombinationsverfahren, insbesondere in Verfahren zur Manipulation von DNA-Sequenzen, die für Antikörper, Proteine oder Teile davon kodieren.

Hintergrund der Erfindung

Die grundlegende Immunglobulin-(Ig-)Struktureinheit in Wirbeltiersystemen setzt sich aus zwei identischen "leichten" Polypeptidketten (mit etwa 23 kDa) und zwei identischen "schweren" Ketten (mit etwa 53 bis 70 kDa) zusammen. Die vier Ketten werden über Disulfidbindungen in einer "Y"-Konfiguration verbunden, und die "Schwanz"-Abschnitte der zwei schweren Ketten sind über kovalente Disulfidbindungen gebunden, wenn die Immunglobuline entweder von B-Zell-Hybridomen oder anderen Zelltypen gebildet werden.

Eine schematische Darstellung der allgemeinen Antikörperstruktur ist in 1 gezeigt. Die leichten und schweren Ketten setzen sich jeweils aus einer variablen Region am N-terminalen Ende und einer konstanten Region am C-terminalen Ende zusammen. In der leichten Kette setzt sich die variable Region (bezeichnet als "VLJL") aus einer variablen (VL)-Region, die über die Bindungs-(JL-)Region an die konstante Region (CL) gebunden ist, zusammen. In der schweren Kette setzt sich die variable Region (VHDHJH) aus einer variablen (VH-)Region, die über eine Kombination aus der Diversitäts-(DH-)Region und der Bindungs-(JH-)Region an die konstante Region (CH) gebunden ist, zusammen. Die VLJL- und VHDHJH-Regionen der leichten bzw. schweren Ketten sind an den Spitzen des Y miteinander assoziiert, um den Antigen-Bindungsabschnitt des Antikörpers zu bilden, und bestimmen Antigen-Bindungsspezifität.

Die (CH)-Region definiert den Isotyp des Antikörpers, d.h. seine Klasse oder Subklasse. Antikörper verschiedener Isotypen unterscheiden sich signifikant in ihren Effektorfunktionen, wie z.B. der Fähigkeit, das Komplement zu aktivieren, sich an spezifische Rezeptoren (z.B. Fc-Rezeptoren) zu binden, die an zahlreichen verschiedenen Zelltypen vorhanden sind, Schleimhaut- und Plazentabarrieren zu überwinden und Polymere des vierkettigen Grund-IgG-Moleküls zu bilden.

Antikörper werden gemäß dem CH-Typ, der im Immunglobulinmolekül verwendet wird, in "Klassen" eingeteilt (IgM, IgG, IgD, IgE oder IgA). Es gibt zumindest fünf Typen von CH-Genen (C&mgr;, C&ggr;, C&dgr;, C&egr; und C&agr;), und manche Spezies (einschließlich Menschen) weisen mehrere CH-Subtypen auf (z.B. C&ggr;1, C&ggr;2, C&ggr;3 und C&ggr;4 in Menschen). Insgesamt gibt es neun CH-Gene im haploiden Genom von Menschen, acht in Mäusen und Ratten und um einige weniger in zahlreichen anderen Spezies. Dahingegen gibt es normalerweise nur zwei Typen von konstanten Leichtkettenregionen (CL), kappa (&kgr;) und lambda (&lgr;), und nur eine dieser konstanten Regionen ist in einem einfachen Leichtkettenprotein vorhanden (d.h. es gibt nur eine mögliche konstante Leichtkettenregion für jede produzierte VLJL). Jede Schwerkettenklasse kann mit einer der beiden Leichtkettenklassen assoziiert sein (z.B. kann eine CH&ggr;-Region im selben Antikörper vorhanden sein als entweder eine &kgr;- oder &lgr;-Leichtkette), auch wenn die konstanten Regionen der schweren und leichten Ketten innerhalb einer bestimmten Klasse nicht mit der Antigen-Spezifität variieren (z.B. weist ein IgG-Antikörper stets eine konstante C&ggr;-Schwerkettenregion auf, unabhängig von der Antigen-Spezifität des Antikörpers).

Jede der V-, D-, J- und C-Regionen der schweren und leichten Ketten wird von einer anderen genomischen Sequenz kodiert. Antikörperdiversität wird durch Rekombination zwischen den verschiedenen VH-, DH- und JH-Gensegmenten in der schweren Kette und VL- und JL-Gensegmenten in der leichten Kette gebildet. Die Rekombination der verschiedenen VH-, DH- und JH-Gene erfolgt über DNA-Rekombination während B-Zelldifferenzierung. Kurz zusammengefasst rekombiniert zuerst die Schwerkettensequenz, um einen DHJH-Komplex zu bilden, und anschließend bringt ein zweites Rekombinationsereignis einen VHDHJH-Komplex hervor. Eine funktionelle Schwerkette wird im Rahmen von Transkription produziert, woraufhin Spleißen des RNA-Transkripts folgt. Die Produktion einer funktionellen Schwerkette löst Rekombination in den Leichtkettensequenzen aus, um eine neu angeordnete VLJL-Region zu produzieren, die wiederum eine funktionelle VLJLCL-Region, d.h. die funktionelle Leichtkette, bildet.

Während B-Zelldifferenzierung stattfindet, kann die Nachkommenschaft einer einzelnen B-Zelle den exprimierten Immunglobulin-Isotyp von IgM auf IgG oder andere Immunglobulinklassen umschalten, ohne die durch die variable Region festgelegte Antigen-Spezifität zu verändern. Dieses Phänomen, das auch als Immunglobulin-Klassenumschaltung bzw. -wechsel bekannt ist, geht mit der DNA-Neuanordnung einher, die zwischen Umschaltungs- bzw. Schalter-(S-)Regionen, die 5' von jedem CH-Gen (außer zu C&ggr;) angeordnet sind, stattfindet (siehe Honjo, Annu. Rev. Immunol. 1, 499–528 (1983); und Shimizu & Honjo, Cell 36, 801–803 (1984)). S-S-Rekombination bringt das VHDHJH-Exon durch Deletion dazwischen liegender CH-Gene, die am selben Chromosom angeordnet sind, in die Nähe des zu exprimierenden CH-Gens. Der Klassenwechselmechanismus wird durch Cytokine gesteuert (Mills et al., J. Immunol. 155, 3021–3036 (1995)). Schalterregionen variieren in ihrer Größe von 1 kb (S&egr;) bis 10 kb (S&ggr;1) und setzen sich aus Tandemwiederholungen zusammen, die sowohl in ihrer Länge als auch ihrer Sequenz variieren (Gritzmacher, Crit. Rev. Immunol. 9, 173–200 (1989)). Mehrere Schalterregionen wurden bereits charakterisiert, einschließlich der murinen S&mgr;-, S&egr;-, S&agr;-, S&ggr;3-, S&ggr;1-, S&ggr;2b- und S&ggr;2a-Schalterregionen und der menschlichen S&mgr;-Schalterregion (Mills et al. (1995), s.o.; Nikaido et al., Nature 292, 845–848 (1981); Marcu et al., Nature 298, 87–89 (1982); Takahashi et al., Cell 29, 671–679 (1982); Mills et al., Nucleic Acids Res. 18, 7305–7316 (1990); Nikaido et al., J. Biol. Chem. 257, 7322–7329 (1982); Stanton et al., Nucleic Acids Res. 10, 5993–6006 (1982); Gritzmacher (1989), s.o.; Davis et al., Science 209, 1360 (1980); Obata et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2437–2441 (1981); Kataoka et al., Cell 23, 357 (1981); Mowatt et al., J. Immunol. 136, 2674–2683 (1986); Szurek et al., J. Immunol. 135, 620–626 (1985); und Wu et al., EMBO J. 3, 2033–2040 (1984)).

Beobachtungen, dass eine einzelne B-Zelle mehr als einen Isotyp gleichzeitig an ihrer Oberfläche exprimieren kann, werden nicht durch den Klassenwechselmechanismus erklärt, da S-S-Rekombination auf intrachromosomale Rekombination eingeschränkt ist und zur Deletion des ausgetauschten CH-Gens führt. Auch ein zweiter Mechanismus, der als trans-Spleißen bezeichnet wird, wurde beschrieben, in dem zwei Transkripte, die aus verschiedenen Chromosomen gebildet wurden, verbunden werden, um ein einzelnes, zusammenhängendes Transkript zu bilden (Shimizu et al., J. Exp. Med. 173, 1385–1393 (1991)). Für transgene Mäuse, die ein neu angeordnetes, exprimierbares VHDHJH-Schwerketten-&mgr;-Gen in sich tragen, das außerhalb des Maus-IgH-Locus angeordnet ist, wurde erkannt, dass sie mRNA produzieren, die die VHDHJH-Region des Transgens korrekt zur endogenen CH-Region gespleißt aufweist. Wie im Fall der S-S-Rekombination ist die Häufigkeit von trans-Spleißen gering, und die beide Mechanismen regulierenden Faktoren sind bisher nicht gut erforscht.

Der Wert und das Potenzial von Antikörpern als diagnostische und therapeutische Reagenzien sind auf dem Gebiet der Erfindung bereits lang anerkannt. Unglücklicherweise sah sich die Entwicklung auf diesem Gebiet durch die langsamen, aufwendigen Verfahren behindert, die erforderlich sind, um große Mengen eines Antikörpers einer erwünschten Spezifität zu produzieren. Die klassischen Zellfusionsverfahren ermöglichten die wirksame Produktion monoklonaler Antikörper durch Fusion der den Antikörper produzierenden B-Zelle mit einer sich unbegrenzt vermehrenden Zelllinie. Die resultierende Zelllinie wird als Hybridomzelllinie bezeichnet. Die meisten dieser monoklonalen Antikörper werden jedoch in murinen Systemen produziert und werden vom menschlichen Immunsystem als "Fremd"-Proteine erkannt. Somit löst das Immunsystem des Patienten eine Reaktion gegen die Antikörper aus, die zur Antikörperneutralisierung und Clearance und/oder zu potenziellen schwerwiegenden Nebenwirkungen in Verbindung mit der Anti-Antikörper-Immunantwort führt.

Ein Lösungsvorschlag für dieses Problem lautete, menschliche oder "humanisierte" monoklonale Antikörper zu entwickeln, die nicht so leicht als Fremdepitope "erkannt" werden, und eine Anti-Antikörper-Immunantwort im Patienten zu vermeiden. Anwendungen von monoklonalen, von menschlichem B-Zell-Hybridom produzierten Antikörpern zeigen vielversprechendes Potenzial zur Behandlung von Krebs, Mikroben- und Virusinfektionen, B-Zellimmunmängeln in Verbindung mit anormal niedriger Antikörperproduktion, Autoimmunerkrankungen, Entzündungen, Transplantatabstoßung und anderen Störungen des Immunsystems sowie anderen Erkrankungen. Es bleiben jedoch mehrere Hindernisse für die Entwicklung solcher menschlicher monoklonaler Antikörper aufrecht. Zahlreiche menschliche Tumorantigene beispielsweise können in Menschen nicht immunogen sein, und es kann daher schwierig sein, menschliche B-Zellen, die Antikörper gegen menschliche Antigene produzieren, zu isolieren.

In Versuchen, diesen Problemen in Verbindung mit Antikörpern für menschliche Therapeutika beizukommen, wurden bisher DNA-Rekombinationsverfahren eingesetzt. Die meisten dieser Bemühungen konzentrierten sich auf die Produktion chimärer Antikörper mit einer menschlichen CH-Region und nichtmenschlichen (z.B. murinen) (variablen) Antigen-Kombinationsregionen. Diese chimären Antikörper werden im Allgemeinen durch Klonieren der erwünschten variablen Region und/oder konstanten Region des Antikörpers, Kombinieren der klonierten Sequenzen zu einem einzelnen Konstrukt, das für den gesamten funktionellen chimären Antikörper mit den erwünschten variablen und konstanten Regionen oder für einen Teil davon kodiert, Einführen des Konstrukts in eine Zelle, die in der Lage ist, Antikörper zu exprimieren, und Selektieren von Zellen, die den chimären Antikörper stabil exprimieren, hergestellt. Alternativ dazu wird der chimäre Antikörper durch Klonieren der erwünschten variablen Region oder konstanten Region, Einführen des Konstrukts in eine Antikör-perproduzierende Zelle und Selektieren auf chimäre, Antikörper-produzierende Zellen, die aus homologer Rekombination zwischen der erwünschten variablen Region und der endogenen variablen Region oder der erwünschten konstanten Region und der endogenen konstanten Region resultieren, hergestellt. Beispiele für Verfahren, die auf DNA-Rekombinationsverfahren wie jenen, die oben beschrieben wurden, beruhen, um chimäre Antikörper zu produzieren, werden in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 86/01533 (Neuberger et al.) und in den US-Patenten Nr. 4.816.567 (Cabilly et al.) und 5.202.238 (Fell et al.) beschrieben. Diese Verfahren erfordern den Transfer von DNA aus einer Zelle in eine andere, wodurch sie von ihrem natürlichen Locus entfernt wird, und erfordern somit vorsichtige In-vitro-Manipulation der DNA, um sicherzustellen, dass das letztendliche, für den Antikörper kodierende Konstrukt funktionell ist (z.B. in der Lage zu Transkription und Translation des erwünschten Genprodukts ist).

Es gibt auf dem Gebiet der Erfindung einen eindeutigen Bedarf an einem Verfahren zur Produktion eines erwünschten Proteins oder Antikörpers, das keine mehrfachen Klonierungsschritte erfordert, wirksamerer als die herkömmliche homologe Rekombination arbeitet und in Hybridomzellen ausgeführt werden kann.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, in dem eine DNA-Sequenz durch eine andere unter Verwendung von Schalter- (S-) Regionen, die aus einem Immunglobulin-(Ig-)Gen stammen, ersetzt wird. Das Verfahren der Erfindung ermöglicht es, jegliche zwei Teile von DNA "auszuwechseln" oder einen Teil von exogener DNA in eine Stelle zu insertieren, die eine natürliche oder künstliche S-Region enthält. Somit ermöglicht das Verfahren der Erfindung das Eintreten gerichteter Rekombination und eliminiert zahlreiche Klonierungsschritte, die im Rahmen herkömmlicher DNA-Rekombinationsverfahren erforderlich sind.

Im Verfahren der Erfindung wird direkte Rekombination zwischen einem Targeting-Konstrukt und einem Target-Locus stattfinden gelassen. Das Nucleinsäure-Targeting-Konstrukt umfasst:

  • a) eine einzelne Schalterregion;
  • b) einen Promotor, der zur Schalterregion heterolog ist, worin der Promotor operabel an die Schalterregion gebunden und 5' von ihr angeordnet ist; und
  • c) eine heterologe modifizierende Sequenz, die operabel an die Schalterregion gebunden und 3' von ihr angeordnet ist, worin die modifizierende Sequenz für eine konstante Region, einer Schwerkette eines menschlichen Antikörpers kodiert, worin die konstante Region aus C&ggr;, C&mgr;, C&agr;, C&dgr; und C&egr; ausgewählt ist.

Exogene DNA, die für die konstante oder variable Region einer leichten oder schweren Kette eines Antikörpers kodiert, kann beispielsweise durch die konstante oder variable Region einer endogenen Sequenz ausgewechselt werden, um eine Sequenz zu schaffen, die für einen Antikörper mit einer anderen konstanten oder variablen Region kodiert. Im weiteren Sinne ist das Verfahren der Erfindung umfassend einsetzbar, um DNA-Sequenzen zur Produktion eines erwünschten Proteins oder einer Proteinkomponente, einschließlich der Produktion chimärer Antikörper mit einer erwünschten variablen Region, die an ein Nicht-Antikörper-Polypeptid (z.B. eine nachweisbare Polypeptidmarkierung oder ein Polypeptid mit einer erwünschten Aktivität) gebunden ist, zu manipulieren.

In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren für gerichtete, Schalter-vermittelte Rekombination bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

  • a) das Einführen eines Targeting-Konstrukts in eine B-Zelle oder ein B-Zell-Hybridom, worin das Targeting-Konstrukt eine Targeting-Konstrukt-Schalterregion und einen Promotor (P1), der operabel an die Targeting-Konstrukt-Schalterregion gebunden und 5' von ihr angeordnet ist, umfasst, und

    worin die Zelle einen Target-Locus umfasst, der eine Target-Locus-Schalterregion, eine Targetsequenz benachbart zu und 3' von der Target-Locus-Schalterregion angeordnet und einen Promotor (P2), der operabel innerhalb des Target-Locus angeordnet ist, umfasst, um Transkription der Target-Locus-Schalterregion und der Targetsequenz bereitzustellen; und
  • b) das Kultivieren der Zelle, um Transkription des Target-Locus und des Targeting-Konstrukts zu ermöglichen und dadurch Rekombination zwischen der Target-Locus-Schalterregion und der Targeting-Konstrukt-Schalterregion zu fördern; und
  • c) das Selektieren einer Zelle, die einen modifizierten Target-Locus umfasst, der den Targeting-Konstrukt-Promotor P1, eine Schalterregion und die Targetsequenz umfasst,
worin P1, die Schalterregion und die Targetsequenz operabel gebunden sind und worin die Targetsequenz unter der Steuerung von P1 steht.

In einer anderen Ausführungsform setzt sich das Targeting-Konstrukt (P1-S1-M) aus einem Promotor (P1), einer Schalterregion (S1) und einer modifizierenden Sequenz (M) zusammen, und der Target-Locus (P2-S2-T) setzt sich aus einem Promotor (P2), einer natürlich auftretenden oder künstlich insertierten Schalterregion (S2) und einer Targetsequenz (T) zusammen. Gerichtete S-S-Rekombination zwischen den S-S-Regionen führt zu zwei möglichen Rekombinationsproduktsequenzen, wovon eine den P1-Promotor des Targeting-Konstrukts, eine Schalterregion, die DNA-Sequenzen aus einer oder beiden der S1- und S2-Regionen enthält, und die T-Sequenz (P1-S1/S2-T) aufweist und eine zweite Sequenz einen P2-Promotor, eine Schalterregion, die DNA-Sequenzen aus einer oder beiden der S1- und S2-Regionen enthält, und die M-Sequenz (P1-S1/S2-M) aufweist. In dieser Ausführungsform werden Zellen, die die M-Sequenz exprimieren, mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, einschließlich Southern- oder Northern-Blot-Analyse, selektiert.

In einer dritten Ausführungsform setzt sich das Targeting-Konstrukt (P1-Z-S1-M) aus einem Promotor (P1), DNA-Sequenzen 5' zur Schalterregion (Z), der Schalterregion (S1) und einer modifizierenden Sequenz (M) zusammen. Der Target-Locus (P2-S2-T) setzt sich aus einem Promotor (P2), einer natürlich vorkommenden oder künstlich insertierten Schalterregion (S2) und einer Targetsequenz (T) zusammen. Gerichtete S-S-Rekombination zwischen den Schalterregionen führt zu einer DNA-Sequenz, die den P1-Promotor des Targeting-Konstrukts, die Z-DNA-Sequenzen, eine Schalterregion, die DNA-Sequenzen aus einer oder beiden Schalterregionen enthält, und die T- oder M-Sequenz enthält (P1-Z-S1/S2-T oder P1-Z-S1/S2-M).

Der Target-Locus ist eine DNA-Sequenz mit einer Schalterregion und kann eine native, natürlich vorkommende Sequenz (z.B. ein Ig-Locus einer Antikörperproduzierenden Zelle), ein neu angeordneter Ig-Locus oder eine rekombinant produzierte DNA-Sequenz, die an einer erwünschten Stelle künstlich insertiert ist, sein. Der Target-Locus kann entweder ein extrachromosomales Element oder ein stabil integriertes chromosomales Element sein. Vorzugsweise kodiert der Target-Locus für ein Antikörper-Schwerketten-Gen. Das Targeting-Konstrukt ist entweder ein extrachromosomales Element oder ein stabil integriertes chromosomales Element. Ist der Target-Locus ein Antikörper-Schwerketten-Gen, so kodiert die modifizierende Sequenz des Targeting-Konstrukts vorzugsweise für eine andere oder modifizierte konstante Schwerkettenregion oder eine Nicht-Antikörper-Sequenz von Interesse (z.B. für eine nachweisbare Polypeptidmarkierung, ein Enzym, ein Toxin oder einen Wachstumsfaktor).

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Modifikation einer DNA-Sequenz durch gerichtete S-S-Rekombination bereit. Die Erfindung ermöglicht es, DNA-Rekombination auf jede beliebige Stelle zu richten, die eine natürlich vorkommende Schalterregion oder synthetische Schalterregion, einschließlich einer Stelle, in die eine S-Region künstlich insertiert wurde, enthält.

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Ersetzung oder Modifikation einer ersten DNA-Sequenz (einer Targetsequenz) mit einer zweiten DNA-Sequenz (einer modifizierenden Sequenz) ohne erforderliches Isolieren der Nucleotidsequenz, die die Targetsequenz enthält, Ausschneiden der Targetsequenz und Ligieren der modifizierenden Sequenz anstelle der Targetsequenz bereit. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Ersetzung von Teilen einer für ein Polypeptid kodierenden Sequenz mit einer heterologen Aminosäuresequenz bereit, worin das Polypeptid aus zwei unterschiedlichen Komponenten (z.B. einer N-terminalen Komponente und einer C-terminalen Komponente) besteht, die dem Polypeptid beispielsweise verschiedene funktionelle oder strukturelle Eigenschaften (z.B. Ligandenbindung oder Zellbindung) verleihen. Die Erfindung ermöglicht beispielsweise die Substitution entweder des N-terminalen Teils mit einer anderen, heterologen Aminosäure-kodierenden Sequenz oder des C-terminalen Teils mit einer anderen, heterologen Aminosäure-kodierenden Sequenz.

Gerichtete, Schalter-vermittelte Rekombination ermöglicht das Auftreten der Rekombination an einer spezifischen, im Vorhinein selektierten Region mit einer höheren Effizienz im Vergleich mit dem natürlich vorkommenden Mechanismus, der auf die Immunglobulinschwerkette limitiert ist. Das Verfahren der Erfindung hebt für Schaltervermittelte Rekombination die Einschränkungen ihrer normalen Regulationsumgebung auf, was die Steuerung von Rekombination, je nach Bedarf, beispielsweise durch die Verwendung konstitutiver oder induzierbarer Promotoren ermöglicht.

Durch die Fähigkeit, gerichtete S-vermittelte In-vivo-Rekombination durchzuführen, kann arbeitsreiche, zeitaufwendige Manipulation von DNA unter Verwendung herkömmlicher DNA-Rekombinationsverfahren umgangen und gleichzeitig ein effizientes Verfahren zur Insertion einer DNA-Sequenz bereitgestellt werden. Das Verfahren ermöglicht beispielsweise das einfache Austauschen des nachweisbaren Markierungsabschnitts von Fusionsproteinen (z.B. &bgr;-Galactosidase) durch eine andere Aminosäuresequenz (z.B. alkalische Phosphatase).

In einer spezifischen Anwendung des Verfahrens der Erfindung wird gerichtete S-S-Rekombination verwendet, um die konstante Region eines Antikörper-Schwerketten-Gens durch eine andere oder modifizierte konstante Region zu ersetzen, ohne dass ausführliche Manipulation des Antikörper-Schwerketten-Gens erforderlich ist. Darüber hinaus ermöglicht das Verfahren der Erfindung, dass das Antikörper-Gen in seinem nativen Locus gehalten wird

Diese und andere Ziele, Vorteile und Eigenschaften der vorliegenden Erfindung werden Fachleuten anhand der Lektüre der Details der Zusammensetzungen, Zusammensetzungskomponenten, Verfahren und Verfahrensschritte der Erfindung, wie sie nachstehend erläutert werden, ersichtlich sein.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

1 ist eine schematisch Darstellung, die die Grundstruktur von Immunglobulin zeigt.

3B ist eine schematische Darstellung, die die Grundkomponenten eines Targeting-Konstrukts, bestehend aus einem Promotor (P1), einer Schalterregion (S1) und modifizierenden Sequenzen, zeigt.

3D ist eine schematische Darstellung, die die Grundkomponenten eines Targeting-Konstrukts, bestehend aus einem Promotor (P1), DNA-Sequenzen, die 3' vom Promotor und 5' von der Schalterregion angeordnet sind (Z), einer Schalterregion (S1) und modifizierenden Sequenzen, die zusätzliche Komponenten wie z.B. ein selektierbares Markergen und/oder ein Amplifikationsgen umfassen können, zeigt.

4B ist eine schematische Darstellung, die Schalter-vermittelte Rekombination zwischen dem Targeting-Konstrukt P1-S1-M und dem Target-Locus P2-S2-T veranschaulicht.

5 ist eine schematische Darstellung eines gerichteten Targeting-Konstrukts der Erfindung (pTSW-1.4) mit dem gesamten, 23 kb umfassenden, menschlichen &ggr;2-Locus (5'-Kontrollelemente, I-Exon, Schalterregionen, Kodiersequenzen, Membran- und Sekretionsexone, polyA), der Maus-3'-Enhancersequenz, der CMV-Promotor/Enhancer-Kassette und dem selektierbaren SV2-Hygromycin-Marker.

6 ist eine schematische Darstellung eines Targeting-Konstrukts der Erfindung (pTSW-1.9) mit den wie in der Legende zu 5 beschriebenen Elementen, wobei die CMV-Promotor/Enhancer-Kassette die entgegengesetzte Ausrichtung zu jener von pTSW-1.4 aufweist.

7 ist eine schematische Darstellung eines Targeting-Konstrukts der Erfindung (pTSW-2) mit einem 12-kb-BamHI-Fragment, das aus dem menschlichen 23-kb-&ggr;2-Keimlinienklon kloniert wurde (einschließlich der Schalterregionen und des menschlichen offenen &ggr;2-Leserasters; das I-Exon und die 5'-Kontrollelemente sind nicht eingebunden), der CMV-Promotor/Enhancer-Kassette, die die Spleißdonorstelle bereitstellt, und dem selektierbaren SV2-Hygromycinmarker; der Maus-3'-Enhancer ist nicht eingebunden.

8 ist eine schematische Darstellung eines Targeting-Konstrukts der Erfindung (pTSW-3.1) mit 10 kb von kloniertem genomischem HindIII-EcoRI-Maus-&ggr;1-Schalterfragment (5'-Kontrollelemente, I-Exon und Maus-&ggr;1-Schaltersequenzen), CMV-Promotorkassette (SFFV-Promotorkassette in der pTSW-3.2-Reihe), genomischem Klon von menschlichem offenem &ggr;2-Leseraster und Spleißakzeptor, selektierbarem SV2-Hygromycinmarker und gegebenenfalls der Maus-3'-Enhancersequenz.

9 ist eine schematische Darstellung eines Targeting-Konstrukts der Erfindung (pTSW-3.1 BglII) mit 7,9 kb genomischem BglII-EcoRI-Maus-&ggr;1-Schalterfragment (I-Exon und Maus-&ggr;1-Schaltersequenzen; 5'-Kontrollelemente nicht eingebunden), CMV-Promotorkassette (SFFV-Promotorkassette in der pTSW-3.2-Reihe), genomischem Klon von menschlichem offenem &ggr;2-Leseraster und Spleißakzeptor, selektierbarem SV2-Hygromycinmarker und gegebenenfalls der Maus-3'-Enhancersequenz.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Es gilt anzumerken, dass, wie in dieser Beschreibung und den beiliegenden Ansprüchen verwendet, die Singularformen "ein/eine/eines" und "der/die/das" auch Plurale umfassen, außer der Kontext verlangt es eindeutig anders. Somit umfassen beispielsweise Verweise auf "eine DNA-Sequenz" auch eine Vielzahl von DNA-Sequenzen und verschiedene Typen von DNA-Sequenzen.

Außer anders definiert, tragen alle hierin verwendeten fachlichen und wissenschaftlichen Bezeichnungen dieselbe Bedeutung, die normalerweise Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung geläufig ist. Auch wenn jegliche Materialien oder Verfahren, die jenen hierin beschriebenen ähnlich sind oder entsprechen, zur praktischen Durchführung oder Testung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien nun beschrieben. Die oben diskutierten Veröffentlichungen sind nur für ihre Offenbarung vor dem Anmeldetag der vorliegenden Anmeldung bereitgestellt. Nichts hierin ist als Zustimmung auszulegen, dass der Erfinder nicht berechtigt ist, solch eine Offenbarung durch eine frühere Erfindung vorwegzunehmen.

Definitionen

Die Bezeichnung "künstlich", verwendet in "künstliches Konstrukt" oder "künstliche Schalterregion" und dergleichen, bezieht sich auf ein isoliertes natürliches oder natürlich vorkommendes Material, z.B. eine Nucleotidsequenz, die durch menschliches Zutun, z.B. durch Fusionieren von natürlichen Sequenzen oder chemisches Synthetisieren natürlicher Sequenzen in Isolation, hergestellt wird.

Die Bezeichnung "Schalterregion" bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz, die aus Tandem-Wiederholungssequenzen besteht, die in der Natur 5' zur konstanten Immunglobulin-Schwerkettenregion auftreten und im Rahmen von intrachromosomalem Klassenwechsel, d.h. der Rekombination von DNA-Sequenzen, die für spezifische Abschnitte von konstanten Immunglobulin-Schwerkettenregionen kodieren, funktionieren. Beispiele für spezifische Schalterregionsequenzen sind in Mills et al., J. Immunol. 155, 3021–3036 (1995), hierin insbesondere durch Verweis aufgenommen, offenbart. "Schalterregion" umfasst sowohl Volllängen-Schaltersequenzen nativer Immunglobulinsequenzen als auch rekombinante und synthetische Nucleotidsequenzen, die bezogen auf eine native Immunglobulinschalterregion modifiziert sind (z.B. Nucleotidsubstitutionen, -additionen, -mutationen und/oder andere Modifikationen enthalten), mit der Maßgabe, dass die Schalterregion ihre Funktion zur Erleichterung von Rekombination beibehält, wenn sie transkribiert wird.

Die Bezeichnungen "Schalter-vermittelte Rekombination" oder "gerichtete S-S-Rekombination" werden synonym verwendet und beziehen sich auf interchromosomale, intrachromosomale oder extrachromosomale DNA-Rekombination, die durch eine Schalterregion erleichtert wird. S-S-Rekombination beispielsweise resultiert aus einer Wechselwirkung zwischen 1) einer ersten Schalterregion, die 3' von einem Promotor angeordnet ist (Targeting-Konstrukt), und 2) einer zweiten Schalterregion, die 3' von einem Promotor und 5' von einer DNA-Sequenz angeordnet ist (Target-Locus). Nach der Aktivierung von Transkription der ersten und zweiten Schalterregionen tritt Rekombination zwischen den Schalterregionen ein, was zu einer Veränderung der Target-Locus-DNA-Sequenz führt. Die gerichtete S-S-Rekombination der Erfindung führt zu Wechselwirkung zwischen DNA-Sequenzen an zwei verschiedenen Chromosomen, am selben Chromosom, zwischen einem Chromosom und einem extrachromosomalen Element oder zwischen zwei extrachromosomalen Elementen.

Die Bezeichnung "Targeting-Konstrukt" bezieht sich auf ein Nucleinsäurekonstrukt, das in eine Zelle eingeführt wird, um gerichtete S-S-Rekombination an einer natürlichen oder künstlichen Schalterregion auszulösen. Ein Targeting-Konstrukt umfasst mindestens: 1) eine Schalterregion und 2) einen Promotor, der operabel an die Schalterregion gebunden und 5' davon angeordnet ist. Gegebenenfalls umfasst das Targeting-Konstrukt ferner 3) eine modifizierende Sequenz, die operabel an die Schalterregion gebunden und 3' davon angeordnet ist. Das Targeting-Konstrukt kann auch 4) eine oder mehrere DNA-Sequenzen zwischen der Schalterregion und dem Promotor umfassen. Je nach dem tatsächlich verwendeten Targeting-Konstrukt kodiert die resultierende mRNA für die Schalterregion oder die Schalterregion und die modifizierende Sequenz oder die Schalterregion und DNA-Sequenzen zwischen der Schalterregion und/oder einer modifizierenden Sequenz.

Die Bezeichnung "Target-Locus" bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, die mindestens 1) eine Schalterregion, 2) eine Targetsequenz benachbart zur und 3' von der Schalterregion und 3) einen Promotor, der operabel im Target-Locus angeordnet ist, um für Transkription der Schalterregion und der Targetsequenz als eine oder mehrere translatierbare mRNA(s) zu sorgen, umfasst. Der Target-Locus kann ferner eine zusätzliche DNA-Sequenz enthalten, die benachbart zur und 5' von der Schalterregion angeordnet ist; in solchen Konstrukten sorgt der Promotor für Transkription der zusätzlichen DNA-Sequenz, der Schalterregion und der Targetsequenz als eine oder mehrere translatierbare mRNA(s). "Target-Loci" können entweder natürlich vorkommen (z.B. ein Immunglobulingen, das sich aus einer neu angeordneten VDJ-Region, 5' von einer Schalterregion und einem CH-Gen angeordnet, zusammensetzt) oder rekombinant oder synthetisch produziert werden und können entweder chromosomal oder extrachromosomal angeordnet sein. Ein Beispiel für eine Targetsequenz umfasst eine Promotorsequenz, die operativ 5' zu einer Schalterregion angeordnet ist, die wiederum operativ 5' zu einer Kodierregion angeordnet ist, die vorzugsweise eine Sequenz ist, die für eine konstante Region eines menschlichen Antikörpers kodiert.

Die Bezeichnung "Targetsequenz" bezieht sich auf die Nucleinsäuresequenz, die benachbart zu einer Schalterregion liegt, an der gerichtete S-S-Rekombination stattfindet. In einer Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird nach Schaltervermittelter Rekombination eine Targetsequenz durch die modifizierende Sequenz ersetzt. "Targetsequenzen" können natürlich vorkommende Sequenzen, die zu einer chromosomalen Sequenz endogen sind, oder rekombinante Sequenzen (d.h. eine Sequenz, die unter Verwendung von genetischer Rekombinationsmanipulation produziert wurde) sein, die in Form eines extrachromosomalen Elements (z.B. eines Vektors) oder eines stabil integrierten Elements innerhalb einer chromosomalen Sequenz vorhanden sind. Targetsequenzen liegen benachbart zu einer Schalterregion, die eine natürlich vorkommende Schalterregion oder aber eine Schalterregion, die mittels DNA-Rekombinationsverfahren 5' zu einer erwünschten Targetsequenz insertiert ist, sein kann. Beispiele für Targetsequenzen unterscheiden sich von der modifizierenden Sequenz und umfassen Sequenzen, die für eine konstante Immunglobulin-Schwerkettenregion eines bestimmten Isotyps, Subtyps und/oder Ursprungs kodieren.

Die Bezeichnung "Immunglobulin-(Ig-)Locus" benennt eine Nucleotidsequenz, die für die gesamte konstante Region und/oder variable Region eines Antikörpermoleküls oder einen Teil davon kodiert, einschließlich der gesamten Regulationssequenzen oder Teilen davon, die die Expression eines Antikörpermoleküls aus dem Locus oder seinen Fortsätzen steuern. Schwerkettengene in Ig-Loci umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die gesamten VH-, DH-, JH- und Konstantregionen oder Teile davon sowie die Schalterregionen, in einem Intron liegende Sequenzen und Flankiersequenzen, die mit dem Schwerkettengen assoziiert sind oder benachbart zu diesem liegen. Ig-Loci für Leichtkettengene umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die VL-, JL- und Konstantregionen sowohl von &kgr;- als auch &lgr;-Allelen, in einem Intron liegende Sequenzen und Flankiersequenzen, die mit dem Leichtkettengen assoziiert sind oder benachbart zu diesem liegen.

Die Bezeichnung "modifizierter Target-Locus" bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, die durch Schalter-vermittelte DNA-Rekombination modifiziert wurde, sodass die modifizierte Targetsequenz mindestens aus einer Schalterregion besteht, die wiederum aus Schaltersequenzen zusammengesetzt ist, die aus der unmodifizierten Target-Locus-Schalterregion oder aus dem unmodifizierten Target-Locus und dem Targeting-Konstrukt stammen. In einer Ausführungsform der Erfindung setzt sich der modifizierte Target-Locus auch aus dem Promotor der unmodifizierten Targetsequenz, der ersten DNA-Sequenz der unmodifizierten Targetsequenz (sofern im ursprünglichen Target-Locus vorhanden) und der modifizierenden Sequenz des Targeting-Konstrukts zusammen. Transkriptionsaktivierung durch den Promotor führt zur Transkription der ersten DNA-Sequenz, der Schalterregion und der modifizierenden Sequenz in einer oder mehreren translatierbaren mRNA(s).

Die Bezeichnung "Promotor" bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz, die, sofern sie operabel an eine DNA-Sequenz von Interesse gebunden ist, Transkription dieser DNA-Sequenz fördert.

Die Bezeichnung "nachweisbare Polypeptidmarkierung" bezieht sich auf eine Aminosäuresequenz, die, sofern sie kovalent an eine andere Aminosäuresequenz gebunden ist, eine heterologe Sequenz bereitstellt, die leicht nachgewiesen werden kann. Beispielsweise kann das Polypeptid durch Bindung an einen Polypeptid-spezifischen Antikörper, mittels enzymatischer Aktivität des Polypeptids oder mittels Reaktion des Polypeptids mit einem chemischen Reagens nachgewiesen werden. Beispiele für nachweisbare Polypeptidmarkierungen umfassen &bgr;-Galactosidase, alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase, enzymatisch aktive Abschnitte dieser Enzyme oder jegliche Aminosäuresequenz, die immunologisch nachweisbar ist und zur Aminosäuresequenz, mit der sie assoziiert ist, heterolog ist.

Gerichtete S-S-Rekombination (allgemein)

Das Verfahren gerichteter, Schalterregion-vermittelter Rekombination verwendet Schalterregionen (z.B. jene, die aus einem Immunglobulin-Locus isoliert und abgeleitet sind), um Rekombination an einer spezifischen Nucleinsäuresequenz zu erleichtern. Die Nucleinsäuresequenz, auf die S-S-Rekombination gerichtet ist, enthält eine S-Region und wird als "Target-Locus" bezeichnet, während die eingeführte Nucleinsäuresequenz, die eine S-Regionsequenz enthält, als "Targeting-Konstrukt" bezeichnet wird. Transkription von jeder S-Region ermöglicht das Auftreten von S-S-Rekombination zwischen den zwei vorselektierten DNA-Regionen. Die Gegenwart eines selektierten Promotors sorgt für konstitutive oder induzierbare Transkription, wodurch die Häufigkeit des Auftretens von S-S-Rekombination gesteigert wird.

Die grundlegenden Komponenten eines beispielhaften Target-Locus, der zur Verwendung in der Erfindung geeignet ist, sind in 2A veranschaulicht. Die minimalen Komponenten des Target-Locus sind (von 5' nach 3'): 1) ein Promotor (P2, worin der Pfeil die Transkriptionsrichtung anzeigt), 2) eine Schalterregion (S2) und 3) eine Targetsequenz (T). Alternativ dazu kann der Target-Locus ferner eine zusätzliche DNA-Sequenz (Y), angeordnet 3' zum Promotor und 5' zu der Schalterregion, enthalten (2B). Unabhängig von seiner Position sind die Target-Locus-Komponenten so angeordnet, dass der Promotor Transkription der 5'-DNA-Sequenz (optional), der Schalterregion und der Targetsequenz (optional) aktiviert. Der Target-Locus kann entweder eine endogene, natürlich vorkommende chromosomale Sequenz (z.B. ein Ig-Schwerkettenlocus, in dem die 5'-DNA-Sequenz ein VHDHJH-Gen ist und die Targetsequenz ein CH-Gen ist) oder eine künstlich konstruierte Sequenz (d.h. eine rekombinant produzierte Sequenz oder eine synthetisierte Sequenz) sein, die entweder als ein extrachromosomales Element (z.B. ein Vektor oder Plasmid) oder als ein stabiler chromosomaler Integrant vorhanden ist.

Die grundlegenden Komponenten eines beispielhaften Targeting-Konstrukts zur Verwendung in der Erfindung sind in den 3A3D veranschaulicht. Die Mindestkomponenten des Targeting-Konstrukts sind (von 5' nach 3'): 1) ein Promotor (P1, worin der Pfeil die Transkriptionsrichtung anzeigt) und 2) eine Schalterregion (S) (3A). Das Targeting-Konstrukt kann zusätzlich 3) eine modifizierende Sequenz 3' zu S (3B) und/oder 4) eine oder mehrere DNA-Sequenzen 5' zu S (3C) enthalten. Darüber hinaus kann das Targeting-Konstrukt einen selektierbaren Marker umfassen (3D). Die Targeting-Konstrukt-Komponenten sind so angeordnet, dass der Promotor Transkription der Schalterregionen und der modifizierenden Sequenz aktiviert. Das Targeting-Konstrukt besteht normalerweise aus mittels Rekombination oder Synthese produzierten Nucleinsäuresequenzen und kann in dem Verfahren der Erfindung entweder als ein extrachromosomales Element (z.B. ein Plasmid oder Vektor) oder als ein stabiler chromosomaler Integrant verwendet werden. Beispiele für modifizierende Sequenzen umfassen das CH-Gen zur Verwendung beim Isotypenumschalten (d.h. Ersetzung des CH-Gens des Target-Locus durch ein CH-Gen eines anderen Isotyps oder Subtyps).

Der exakte Mechanismus, durch den intrachromosomale, S-vermittelte Rekombination (auch als S-S-Rekombination bezeichnet) im Klassenumschaltungs-Phänomen eintritt, konnte bis heute noch nicht vollständig hinterleuchtet werden (ein Bericht zu diesem Thema ist in Coffman et al., Adv. Immunol. 54, 229–271 (1993), zu finden). Ohne hier eine Einschränkung auf eine bestimmte Theorie zu beabsichtigen, wird natürlich vorkommende, S-vermittelte Rekombination durch gleichzeitige Transkription von zwei intrachromosomalen Schalterregionen ausgelöst (Xu & Stavnezer, Develop. Immunol. 1, 11–17 (1990); Rothman et al., Mol. Cell Biol. 10, 1672–1679 (1990); Jung et al., Science 159, 984–987 (1993)). Beispielsweise wird in einer Zelle, die IgM-Antikörper produziert, das IgM-Schwerkettengen (das eine VHDHJH-Region, eine Schalterregion (S&mgr;) und ein C&mgr;-Gen umfasst) konstitutiv transkribiert und translatiert. Klassenumschaltung bzw. -wechsel (z.B. zur Produktion von IgG) tritt ein, wenn eine zweite Schalterregion (z.B. S&ggr;) transkribiert wird. Es wird angenommen, dass Transkription einer zweiten Schalterregion durch Steuerelemente reguliert wird, die mit jeder der Schalterregionen des CH-Locus assoziiert sind. Jedes dieser Steuerelemente wird durch eine andere Kombination von Zellsignalen (d.h. durch ein oder mehrere Zellsignale) aktiviert, die normalerweise mit Cytokinen assoziiert sind, die beispielsweise in einer Mikrobeninfektion oder Entzündung aktiviert werden können (z.B. Cytokine wie beispielsweise Interleukine, Interferone und Tumornekrosefaktor). Die Produktion von Zellsignalen wiederum ist mit spezifischen Infektions- und Entzündungstypen assoziiert. Somit führt ein spezifischer Infektions- oder Entzündungstyp zur: 1) Produktion einer spezifischen Kombination zellulärer Signale, die wiederum bestimmt, 2) welches der Schalterregionsteuerelemente aktiviert wird und, infolge dessen, 3) welche Schalterregion transkribiert wird, um Rekombination ihrer assoziierten CH-Region mit den konstitutiv transkribierten S&mgr; und C&mgr;-Regionen zu fördern, um einen anderen spezifischen Antikörper-Isotyp zu produzieren (Coffman et al. (1993), s.o.).

Die vorliegende Erfindung verwendet Schalterregionen, um ein Verfahren zum Ausrichten von Rekombination auf vorselektierte Stellen von Interesse auf eine Weise bereitzustellen, die nicht durch die normalen zellulären Regulationsmechanismen, wie oben beschrieben, gesteuert wird. Wie in den 4A4C veranschaulicht, verwendet die gerichtete S-S-Rekombination der vorliegenden Erfindung ein Targeting-Konstrukt, das mindestens eine Schalterregion (S1) und einen Promotor (P1) enthält, und einen Target-Locus, der eine Schalterregion (S2) und die Targetsequenz (T) unter der Steuerung eines Promotors (P2) enthält, um Schalterstellen-gerichtete Rekombination, die durch die zwei Transkriptions-aktivierten Schalterregionen vermittelt wird, zu erleichtern. Das resultierende Rekombinationsprodukt enthält mindestens eine Schalterregion mit Sequenzen aus einer oder beiden Schalterregionen, z.B. S1 oder S1/S2. Enthält das Targeting-Konstrukt einen Promotor P1 und S1, so besteht das erwünschte Rekombinationsprodukt aus dem P1-Promotor, der Schalterregion und der Targetsequenz, nun unter der Steuerung von P1 anstelle von P2 (4A). Das erwünschte Rekombinationsprodukt wird auf zahlreiche verschiedene, auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Weisen, einschließlich PCR, erkannt. Ist P1 ein induzierbarer Promotor, so kann eine Zelle, die das erwünschte Rekombinationsprodukt enthält, durch Induktion von Transkription erkannt werden. Besteht das Targeting-Konstrukt aus P1, S1 und einer modifizierenden Sequenz, so besteht das erwünschte Rekombinationsprodukt aus dem P2-Promotor, der Schalterregion und der modifizierenden Sequenz, die die Targetsequenz ersetzt (4B). Die Schalterregion kann Sequenzen aus einer oder beiden Schalterregionen, z.B. S1 oder S1/S2, enthalten. Kodiert die modifizierende Sequenz für ein Protein oder Peptid, so kann das erwünschte Rekombinationsprodukt mittels Synthese des erwünschten Produkts erkannt werden. Besteht das Targeting-Konstrukt aus P1, DNA-Sequenzen 5' zu S1 und S1, so enthält das erwünschte Rekombinationsprodukt P1 und die DNA-Sequenzen 5' zu der S1-Region, die in den Target-Locus insertiert sind (4C). Das erwünschte Rekombinationsprodukt kann auf zahlreiche verschiedene Weisen identifiziert werden, einschließlich PCR-Detektion der Gegenwart der 5'-DNA-Sequenzen und/oder P1 oder mittels Immundetektionsverfahren.

Darüber hinaus kann das Targeting-Konstrukt verwendet werden, um einen Teil von DNA 3' zu einem Target-Locus, der in einem spezifischen Chromosom enthalten ist, zu insertieren. In dieser Ausführungsform trägt das Targeting-Konstrukt homologe Sequenzen, was die Insertion in das selektierte Chromosom durch homologe Rekombination ermöglicht. Das resultierende modifizierte Chromosom enthält eine DNA des Targeting-Konstrukts an einer Stelle 3' zum Target-Locus. Diese Ausführungsform ist zur Induktion von intrachromosomaler, S-vermittelter Rekombination nützlich.

Schalterregionen

Klassenwechsel (oder Isotypenwechsel) wird erzielt, wenn B-Lymphozyten, die anfänglich IgM exprimieren, im Laufe der Reifung ihren Schwerketten-Isotyp zu IgG, IgA oder IgE wechseln. Isotypenwechsel resultiert aus einem Deletions-DNA-Rekombinationsereignis, in dem die konstante C&mgr;-Region der Schwerkette, die anfänglich stromab der VHDHJH-Region angeordnet ist, durch eine konstante C&ggr;, C&agr;- oder C&egr;-Region ersetzt wird (Rabbitts et al., Nature 283, 351 (1980); Davis et al. (1980), s.o.; Kataoka et al. (1981), s.o.).

Mehrere Schalterregionen wurden bereits charakterisiert, einschließlich der murinen S&mgr;, S&egr;-, S&agr;-, S&ggr;3-, S&ggr;1-, Sy2b- und S&ggr;2a-Schalterregionen und der menschlichen S&mgr;-Schalterregion wie z.B. S&mgr; und S&ggr;4 (Mills et al., J. Immunol. 155, 3021–3036 (1995), hierin spezifisch durch Verweis aufgenommen). Die murine S&mgr;-Region umfasst etwa 3 kb und kann in eine 3'-Region mit Sequenzen von [(GAGCT)nGGGGT]m, worin n = 1–7 und m = 150 (Nikaido et al. (1981), s.o.), und eine 5'-Region, in der diese zwei Parameter durch die Pentamersequenz (C/T)AGGTTG unterbrochen sind (Marcu et al. (1982), s.o.), aufgeteilt werden. Der menschliche S&mgr;-Locus unterscheidet sich darin geringfügig, dass die Heptamersequenz über die gesamte Region aufgeteilt ist (Takahashi et al. (1982), s.o.; Mills et al. (1990), s.o.). Auch wenn andere Schalterregionen komplexere Muster von Wiederholungssequenzen enthalten, enthalten alle Schaltersequenzen Mehrfachkopien der Pentamersequenzen GAGCT und GGGGT (Nikaido et al. (1982), s.o.; Stanton et al. (1982), s.o.). Die Pentamere ACCAG, GCAGC und TGAGC sind ebenfalls üblicherweise in Schalterregionen zu finden (Gritzmacher (1989), s.o.). Darüber hinaus ist die Heptamerwiederholung (C/T)AGGTTG in Schalterregionsequenzen häufig vorhanden und ist in der Nähe von zahlreichen, jedoch nicht aller, Schalterrekombinationsstellen zu finden, die bereits in Plasmozytomen und Hybridomen charakterisiert wurden (Marcu et al. (1982), s.o.).

Die murinen S&egr;- und S&agr;-Loci enthalten 40 bp bzw. 80 bp umfassende Sequenzen, die im Tandem wiederholt werden. Diese Sequenzen sind zu S&mgr; homolog, insbesondere in Bereichen der Wiederholungen, die das GAGCT-Pentamer enthalten. Sowohl menschliche als auch marine S&ggr;-Regionen sind viel weniger homolog zu S&mgr; als die S&egr;- und S&agr;-Regionen. Die Homologie von murinen S&ggr;-Regionen zu S&mgr; geht mit wachsender Distanz 3' von der variablen Region zurück (S&ggr;3 > S&ggr;1 > S&ggr;2b > S&ggr;2a). Die murinen S&ggr;-Regionen setzen sich aus Tandemwiederholungen mit 49 bp oder 52 bp (S&ggr;2a) zusammen, innerhalb derer die Pentamersequenzen TGGGG, GCAGC und ACCAG üblicherweise zu finden sind (Kataoka et al. (1981), s.o.; Mowatt et al. (1986), s.o.; Nikaido et al. (1982), s.o.; Nikaido et al. (1981), s.o.; Stanton et al. (1982), s.o.; Szurek et al. (1985), s.o.; Wu et al. (1984), s.o.).

Schalterregionen, die zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind, können natürlich vorkommende Sequenzen, z.B. eine Schalterregion, die direkt aus einem Ig-Locus, vorzugsweise aus einem murinen oder menschlichen Ig-Locus, kloniert ist, sein. Alternativ dazu kann die Schalterregion eine synthetisch oder rekombinant produzierte Sequenz sein. Rekombinante Schalterregionen können dieselbe Sequenz wie eine native, natürlich vorkommende Schalterregion aufweisen oder sie können im Vergleich zu einer nativen Schalterregion modifiziert sein (z.B. Nucleotidsubstitutionen, -additionen, -mutationen und/oder andere Modifikationen enthalten), mit der Maßgabe, dass die Schalterregion ihre Funktion zur Erleichterung von Rekombination beibehält. Rekombinante Schalterregionen können so entworfen werden, dass sie eine minimale Nucleotidsequenz aufweisen, die für Schalter-vermittelte Rekombination auf demselben Niveau (oder darunter, jedoch akzeptabel) wie jene einer nativen Schalterregion oder auf einem Niveau über der Rekombination, die durch eine Wildtyp-Schalterregion gefördert wird, erforderlich ist.

Die Schalter-vermittelte Rekombination der vorliegenden Erfindung stellt verbesserte Effizienz von S-S-Rekombination im Vergleich zum natürlich vorkommenden Mechanismus sowie ein umfassend einsetzbares Verfahren zur Produktion eines erwünschten Proteins bereit. Dies wird teilweise durch die Verwendung von Promotoren erzielt, die konstitutive oder induzierbare Transkription des Targeting-Konstrukts, des Target-Locus oder sowohl des Targeting-Konstrukts als auch des Target-Locus bereitstellen. Die verbesserte Effizienz des Schalter-vermittelten Rekombinationsverfahrens der Erfindung sorgt für eine Rekombinationshäufigkeit auf einem höheren Niveau als jenem, das auf natürliche Weise eintritt, d.h. für eine um 1 % bis 100 % verbesserte Effizienz; noch bevorzugter für eine Verbesserung um 20 % bis 100 %; und noch bevorzugter für eine Verbesserung um 50 % bis 100 %.

Targeting-Konstrukte

Wie zuvor erläutert, setzen sich Targeting-Konstrukte der Erfindung mindestens aus den folgenden Komponenten zusammen: 1) einer Schalterregion und 2) einem Promotor, der operabel an und 5' zu der Schalterregion gebunden ist. Zusätzliche optionale Komponenten des Targeting-Konstrukts umfassen 3) eine modifizierende Sequenz, die operabel an und 3' zu der Schalterregion gebunden ist, einschließlich Proteine, selektierbarer Marker und/oder Kontrollelemente, und/oder 4) DNA-Sequenzen 3' zum Promotor und 5' zu der Schalterregion. Transkriptionsaktivierung des Promotors resultiert in der Produktion einer oder mehrerer translatierbarer mRNA(s).

Der Targeting-Konstrukt-Promotor

Der Promotor des Targeting-Konstrukts wird gemäß dem Zelltyp, in dem gerichtete S-S-Rekombination durchzuführen ist, (z.B. eine eukaryotische oder prokaryotische Zelle, normalerweise eine eukaryotische Zelle) selektiert. Da gerichtete S-S-Rekombination von Transkription der Schalterregionen des Targeting-Konstrukts und des Target-Locus abhängt, kann der Promotor des Targeting-Konstrukts ein konstitutiver oder ein induzierbarer Promotor sein. Geeignete konstitutive und starke konstitutive Promotoren für DNA-Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt. Ist die Zelle, in der gerichtete S-S-Rekombination stattfinden soll, eine eukaryotische Zelle, so kann der Promotor der Schwerketten-Ig-Promotor oder ein viraler Promotor, wie z.B. CMV-, SV40-, murines-Moloney-Sarkomvirus- (MMLV-) und Spleen-Focus-Forming-Virus- (SFFV-) Promotor, oder ein induzierbarer Promotor, wie z.B. MMTV und &agr;-Inhibin, sein.

Die modifizierende Sequenz

Die modifizierende Sequenz kann jegliche Nucleinsäuresequenz sein, die zum Ersetzen einer Targetsequenz in einem Target-Locus geeignet ist. Beispielsweise kann sich die modifizierende Sequenz aus einer Nucleotidsequenz zusammensetzen, die für ein Translationsprodukt kodiert, um die gesamte Targetsequenz oder einen Teil davon zu ersetzen. Ist die Targetsequenz beispielsweise ein CH-Gen, so kann die modifizierende Sequenz ein anderes natives CH-Gen, ein modifiziertes CH-Gen (z.B. eines, das für eine, bezogen auf das Wildtyp-CH-Gen, geänderte Effektorfunktion kodiert) oder eine native oder modifizierte konstante Leichtkettenregion sein. Alternativ dazu kann die modifizierende Sequenz für ein nicht von einem Antikörper abgeleitetes Polypeptid kodieren, das dem Polypeptid, für das die modifizierte Targetsequenz kodiert, eine Funktion verleiht. Beispielsweise kann die modifizierende Sequenz für Toxin, Hormon, Wachstumsfaktor oder Teile davon kodieren. Die modifizierende Sequenz kann auch für einen Linker kodieren, um kovalente oder nicht kovalente Bindungen zwischen anderen (z.B. ähnlich modifizierten) Schwerkettengenprodukten oder Nicht-Antikörper-Polypeptiden (z.B. Toxinen, Wachstumsfaktoren, Hormonen oder anderen biologisch wichtigen Polypeptiden oder anderen Molekülen) bereitzustellen. Wiederum ein anderes Beispiel für eine modifizierende Sequenz ist eine Nucleotidsequenz, die für eine(n) nachweisbare(n) Polypeptidmarker oder Polypeptidmarkierung, z.B. &bgr;-Galactosidase, alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase, oder ein immunologisch nachweisbares Polypeptid kodiert, an das sich ein Antikörper binden kann, um Polypeptidnachweis und/oder -isolierung (z.B. durch Immunaffinitätschromatographie) zu erleichtern.

Alternativ oder zusätzlich dazu kann die modifizierende Sequenz Regulationssequenzen (z.B. einen Promotor, ein Enhancer-Element, ein Intron oder eine Ribosomenbindungsstelle) enthalten, die verwendet werden können, um entweder Regulationssequenzen an einer Position 3' von einer Schalterregion einzuführen oder um Regulationssequenzen, die bereits in der Targetsequenz vorhanden sind, zu ersetzen. Schalter-vermittelte Rekombination kann beispielsweise verwendet werden, um einen schwachen Promotor durch einen starken Promotor in einem Target-Locus zu ersetzen, wobei der schwache Promotor 3' oder 5' zu der Target-Locus-Schalterregion angeordnet ist. Beispiele für Regulationssequenzen von besonderem Interesse für die Modifikation eines Ig-Locus umfassen eine Schwerketten-Enhancersequenz, eine &kgr;-Ketten-Enhancersequenz oder einen Promotor, der von MMLV, Rous-Sarkomvirus (RSV) oder SFFV abgeleitet ist.

Das Targeting-Konstrukt kann auch ein Amplifikationsgen enthalten, das es dem modifizierten Target-Locus ermöglicht, ein amplifiziertes Schalter-vermitteltes Produkt zu sein. Es gibt zahlreiche geeignete Amplifikationsgene, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und in der Erfindung nützlich sind, beispielsweise das Gen, das für Dihydrofolatreductase (DHFR) kodiert.

Die modifizierende Sequenz wird gemäß zahlreichen Faktoren selektiert, einschließlich der zu modifizierenden Targetsequenz und/oder der diagnostischen oder therapeutischen Verwendung, die für das resultierende Rekombinationsprodukt vorgesehen ist.

Zusätzliche Sequenzen die 3' zum Promotor und 5' zu der Schalterregion vorhanden sind

Das Targeting-Konstrukt kann eine zusätzliche, transkribierbare und translatierbare DNA-Sequenz enthalten, die operabel zwischen dem Promotor und der Schalterregion des Target-Locus angeordnet ist. Diese zusätzliche Sequenz kann für einen N-terminalen Abschnitt des Polypeptids, für das der Target-Locus kodiert, kodieren. Das Targeting-Konstrukt kann beispielsweise für ein erwünschtes VHDHJH-Polypeptid kodieren. Bei gerichteter, Schalter-vermittelter Rekombination mit einem Target-Locus, der für einen Ig-Schwerketten-Locus mit einem erwünschten CH-Gen an der Targetsequenz kodiert, enthält das Rekombinationsprodukt die erwünschte VHDHJH-Region und die erwünschte CH-Kodierregion, zwischen denen die Schalterregion angeordnet ist.

Andere Komponenten

Das Targeting-Konstrukt kann auf jedem beliebigen aus zahlreichen verschiedenen Vektoren, die auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt und im Handel erhältlich sind (z.B. pBR322-, pACYC-Vektoren, Plasmide und virale Vektoren), aufbauen. "Vektoren" umfassen jegliches DNA- oder RNA-Molekül (selbstreplizierend oder nicht), das verwendet werden kann, um eine erwünschte Zelle zu transformieren oder transfizieren. Das Targeting-Konstrukt kann andere Komponenten wie z.B. einen selektierbaren Marker umfassen, um das Screenen und Selektieren von Zellen, die das Targeting-Konstrukt als ein extrachromosomales oder chromosomal integriertes Element enthalten, zu erleichtern und/oder um auf Zellen zu selektieren, die erfolgreich gerichteter S-S-Rekombination unterzogen worden sind, z.B. einen selektierbaren Marken, der mit der modifizierenden Sequenz assoziiert ist, die zusätzlich zur modifizierenden Sequenz in den Target-Locus rekombiniert ist. Geeignete selektierbare Markergene umfassen Gene, die für einen nachweisbaren Marken kodieren (z.B. &bgr;-Galactosidase), oder Arzneimittel-resistente Gene, z.B. Hygromycinresistenz (hyg), Guanosinphosphoryltransferase (gpt), Neomycinresistenz (neo), Dihydrofolatreductase (DHFR), Puromycin (spt) und Ampicillinresistenz (Amp). Das Konstrukt kann auch einen Replikationsursprung für stabile Replikation des Konstrukts in einer Bakterienzelle (vorzugsweise einen Replikationsursprung mit hoher Kopienzahl), ein Kernlokalisierungssignal oder andere Elemente, die die Produktion des DNA-Konstrukts erleichtern, das dadurch kodierte Protein oder auch beides umfassen. Für eukaryotische Expression kann das Konstrukt auch ein Amplifikationsgen umfassen, das Expressionsniveaus der DNA von Interesse steigern kann, insbesondere, wenn die DNA von Interesse eine cDNA ist (z.B. keine Introne der natürlich vorkommenden Sequenz enthält). Jedes beliebige von zahlreichen verschiedenen Amplifikationsgenen, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, kann verwendet werden, einschließlich DHFR.

Target zur Verwendung mit Targeting-Konstrukten

Wie zuvor erläutert, setzt sich ein Target-Locus, der für die Verwendung im Verfahren der Erfindung geeignet ist, mindestens aus den folgenden Elementen zusammen: 1) einer Schalterregion, 2) einer Target-DNA-Sequenz, die benachbart und 3' zu der Schalterregion liegt, und 3) einem Promotor, der im Konstrukt operabel angeordnet ist, um für Transkription der Schalterregion und Targetsequenz als ein mRNA-Molekül zu sorgen. Der Target-Locus kann ferner eine zusätzliche DNA-Sequenz enthalten, die benachbart und 5' zu der Schalterregion angeordnet ist; in solchen Konstrukten sorgt der Promotor für Transkription der zusätzlichen DNA-Sequenz, der Schalterregion und der Targetsequenz als eine oder mehrere translatierbare mRNA(s).

Im Allgemeinen können Target-Loci, die für die Verwendung mit den Targeting-Konstrukten der Erfindung geeignet sind, jegliche einen Schalter enthaltende Sequenz sein, in der die Schalterregion transkribiert ist und Schalter-vermittelte Rekombination erleichtern kann. Der Target-Locus kann jede beliebige native endogene chromosomale Sequenz sein, die eine Schalterregion enthält (z.B. ein Ig-Schwerkettenlocus). Alternativ dazu kann der Target-Locus eine künstlich, rekombinant produzierte Sequenz sein, die entweder als ein extrachromosomales Element (z.B. ein Vektor oder Plasmid) oder als ein chromosomal integriertes Element vorhanden ist.

In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung, in der es wünschenswert ist, einen Teil eines Targeting-Konstrukts 3' zum Target-Locus am selben Chromosom zu insertieren, trägt das Targeting-Konstrukt homologe Sequenzen, die Rekombination an einer Stelle 3' zu einem Target-Locus ausrichten. S-vermittelte Rekombination findet dann intrachromosomal statt, was gesteuerte Induktion von intrachromosomaler Rekombination ermöglicht.

Der Promotor

Der Promotor des Target-Locus (P2) kann der Promotor sein, der in der nativen, natürlich vorkommenden Target-Locus-Sequenz und/oder der Targetsequenz vorhanden ist, oder ein Promotor, der zur Target-Locus-Sequenz und/oder der Targetsequenz heterolog ist. Da S-S-Rekombination mit Transkription der Schalterregion assoz ert ist, sorgt der Target-Locus-Promotor vorzugsweise zumindest für ein niedriges Expressionsniveau, noch bevorzugter sorgt er für konstitutive Expression, und sogar noch bevorzugter sorgt er für hohe Niveaus an konstitutiver Expression des Target-Locus, insbesondere der für die Schalterregion kodierenden DNA. Stellt der mit dem Target-Locus assoziierte Promotor nur unangemessene oder unerwünscht niedrige Transkriptionsniveaus der Schalterregion bereit, so kann der native Target-Locus-Promotor mit einem anderen Promotor unter Verwendung von S-vermittelter Rekombination oder anderen Rekombinationsverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, z.B. mittels Klonieren oder homologer Rekombination, modifiziert oder ersetzt werden.

Zusätzliche Sequenzen, die 3' zum Promotor und 5' zu der Schalterregion vorhanden sind Wie zuvor erläutert, kann der Target-Locus eine zusätzliche, transkribierbare und translatierbare DNA-Sequenz enthalten, die operabel zwischen dem Promotor und der Schalterregion des Target-Locus angeordnet ist. Beispielsweise können die zusätzlichen Sequenzen für einen N-terminalen Abschnitt des Polypeptids kodieren, und der Target-Locus enthält eine Targetsequenz, die für den C-terminalen Abschnitt eines Polypeptids kodiert. Nach gerichteter, Schalter-vermittelter Rekombination enthält der modifizierte Target-Locus sowohl N- als auch C-terminate Abschnitte des Polypeptids.

Andere Komponenten

Der Target-Locus kann zusätzliche Komponenten umfassen, um Replikation in prokaryotischen und/oder eukaryotischen Zellen und Integration des Konstrukts in ein eukaryotisches Chromosom zu erleichtern, und Marker, um die Selektion von und/oder das Screenen auf Zellen, die das Konstrukt enthalten, zu unterstützen (z.B. die nachweisbaren Marken und Arzneimittelresistenzgene, die vorangehend im Zusammenhang mit dem Targeting-Konstrukt erläutert wurden). Für eukaryotische Expression sollte das Konstrukt vorzugsweise zusätzlich eine Polyadenylierungssequenz enthalten, die 3' zum zu exprimierenden Gen angeordnet ist. Die Polyadenylierungssignalsequenz kann aus jeder beliebigen von zahlreichen verschiedenen Polyadenylierungssignalsequenzen, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, ausgewählt sein. Vorzugsweise ist die Polyadenylierungssignalsequenz die frühe SV40-Polyadenylierungssignalsequenz. Expression des Target-Locus kann auch durch Einbindung von in einem Intron liegenden Sequenzen, wie zuvor für das Targeting-Konstrukt erläutert, gesteigert werden.

Ein beispielhafter, rekombinanter Target-Locus der Erfindung setzt sich (von 5' zu 3') aus: 1) einem Promotor, 2) einer ersten Mehrfach-Klonierungsstelle zur Insertion einer DNA-Sequenz 5' zu der Schalterregion, 3) einer Schalterregion und 4) einer zweiten Mehrfach-Klonierungsstelle zur Insertion einer Target-DNA-Sequenz zusammen. Ist beispielsweise der Target-Locus ein rekombinantes Ig-Schwerkettengen, so wird eine VHDHJH-DNA-Sequenz 5' zu der Schalterregion an der ersten Mehrfach-Klonierungsstelle insertiert, und die Targetsequenz ist eine CH-Region, die in die zweite Klonierungsstelle insertiert wird.

Zelllinien die zur Verwendung im Verfahren der Erfindung geeignet sind

Jegliche Säugetierzelllinie, die in der Lage ist, den Target-Locus von Interesse zu exprimieren, ist zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Ist beispielsweise der Target-Locus ein Ig-Schwerkettengen, so ist die Zelllinie jegliche Säugetierzelle, die in der Lage ist, einen funktionellen Antikörper zu exprimieren. Von besonderem Interesse ist die Verwendung des Schalter-vermittelten Rekombinationsverfahrens der Erfindung zur Erleichterung von Klassenwechsel in Antikörperproduzierenden Zellen oder Zellen mit Antikörper-produzierendem Potenzial (z.B. Stammzellen). Die Zelllinie kann z.B. eine Hybridomzelllinie, die menschliche Antikörper exprimiert, eine embryonale Stammzelle (z.B. eine murine embryonale Stammzelle), eine Hybridomzelllinie, die aus B-Zellen aus einem transgenen Tier (z.B. einer transgenen Maus) produziert wird, oder jegliche andere Zelle (normalerweise eine Säugetierzelle) sein, die in der Lage ist, zumindest einen funktionellen Teil eines Schwerketten-Ig-Locus oder zumindest einen funktionellen Teil eines Leichtketten-Ig-Locus zu exprimieren. Ein Beispiel für eine Zelllinie, die im Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine Hybridomzelllinie, die menschliche Antikörper exprimiert, die aus B-Zellen aus der Xenomouse (Green et al., Nature Genetics 7, 13 (1994), und die PCT-Patentanmeldung Nr. WO 94/02602, beide hierin insbesondere durch Verweis aufgenommen) stammen. Die Xenomouse trägt große Segmente der menschlichen Schwerketten- und &kgr;-Ketten-Loci integriert in ihrer Keimlinie sowie funktionell deaktivierte Maus-Schwer- und -&kgr;-Leichtketten-Allele. Die Xenomouse produziert B-Zellen, die menschliche Schwerkette (h&mgr;) und menschliche &kgr;-Leichtkette (m&kgr;) oder h&mgr; und Maus-&lgr;-(m&lgr;-)Leichtkette exprimieren. Co-Expression von h&kgr; und m&lgr; tritt nicht auf, da Expression einer Leichtkette die Expression der anderen vollkommen ausschließt (Green et al. (1994), s.o.). Durch Immunisierung produziert die Xenomouse eine breite Palette an menschlichem Ig, die jener im erwachsenen Stadium ähnlich ist, und lässt Antigen-spezifische, menschliche monoklonale Antikörper entstehen. Die Xenomouse ermöglicht die Bildung von Maus-Hybridomen, die Antigen-spezifische, menschliche monoklonale Antikörper bilden. Verfahren zur Herstellung von Hybridomzelllinien sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt (siehe beispielsweise Harlow & Lane (Hrsg.), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)). Verfahren zur Produktion von Zelllinien, die menschliche oder "humanisierte" Antikörper exprimieren, sind auf dem Gebiet der Erfindung ebenfalls durchwegs bekannt (siehe beispielsweise die PCT-Veröffentlichungen Nr. WO 94/02602 und WO 91/10741).

Ist die Zelllinie eine Antikörper-produzierende Lymphzelllinie, so kann die Zelllinie den Antikörper entweder aus einer genomischen Sequenz, einer modifizierten Sequenz, einer heterologen Sequenz (z.B. einer Ig-Sequenz aus einer anderen Spezies), einer modifizierten heterologen Sequenz oder einer chimären Sequenz (die z.B. sowohl aus murinen als auch aus menschlichen Ig-Sequenzen zusammengesetzt ist) exprimieren. Somit kann die Zelllinie beispielsweise eine murine Hybridomzelllinie sein, die entweder einen murinen, einen menschlichen oder einen chimären Antikörper produziert. Die Hybridomzelllinie kann menschliche Antikörper beispielsweise durch Expression von menschlichen Ig-Genen produzieren. In einer Ausführungsform ist die Zelle eine murine Lymphzelle, die einen menschlichen Antikörper durch Expression menschlicher Ig-Gene produziert. In einer Variante der Ausführungsform ist das Konstantregiongen der genomischen Sequenz ein menschliches Gen der konstanten Region (hCH), z.B. ein hCH-Gen der &mgr;-Klasse (hCH&mgr;), und die modifizierende Sequenz ist eine menschliche konstante Region der &ggr;-Klasse (hCH&ggr;).

Verfahren die Schalter-vermittelte Rekombination einsetzen

Schalter-vermittelte Rekombination unter Verwendung des/der Konstrukts/e der Erfindung kann auf zahlreiche verschiedene Weisen erfolgen. Beispielsweise 1) kann der Target-Locus natürlich vorkommend (chromosomal angeordnet) sein, und das Targeting-Konstrukt kann entweder als ein extrachromosomales oder als ein chromosomal integriertes Element verwendet werden; oder 2) der Target-Locus kann eine natürlich vorkommende oder eine rekombinant produzierte Sequenz sein, die entweder als ein extrachromosomales oder als ein chromosomal integriertes Element vorhanden ist, und das Targeting-Konstrukt kann entweder als ein extrachromosomales oder chromosomal integriertes Element verwendet werden. Sind sowohl Targeting-Konstrukt als auch Target-Locus chromosomal integriert, so sind sie am selben oder an unterschiedlichen Chromosomen integriert.

Schalter-vermittelte Rekombination unter Verwendung eines chromosomalen Target-Locus und eines chromosomal integrierten Targeting-Konstrukts

In dieser Ausführungsform enthält die Zelllinie, die verwendet wird, um gerichtete, Schalter-vermittelte Rekombination auszuführen, entweder: 1) einen endogenen, natürlich vorkommenden Target-Locus oder 2) einen chromosomal integrierten, rekombinanten Target-Locus. Verfahren zum Einführen von DNA in eine Wirtszelle und zur Selektion auf stabile chromosomale Integranten, die eine spezifische DNA-Sequenz von Interesse enthalten, sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt (siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Gold Spring Harbor, NY (1989); hierin hinsichtlich der Verfahren und Zusammensetzungen für DNA-Rekombinationsverfahren zur Bereitstellung einer transformierten Zelle, die eine stabil integrierte DNA von Interesse enthält, sowie von Expression der DNA von Interesse durch Verweis aufgenommen).

Das Targeting-Konstrukt kann z.B. durch Verdau mit (einer) Restriktionsendonuclease(n) linearisiert und die lineare DNA in die Wirtszelle unter Verwendung eines jeden beliebigen von zahlreichen verschiedenen Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind (z.B. Elektroporation, Mikroinjektion, Liposomenfusion, Fusionen von leeren Erythrozytenmembranen, Protoplastenfusion, Hefezellfusion oder jegliches andere, auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren (siehe z.B. Sambrook et al., s.o.)), eingeführt werden. Der lineare Vektor wird dann entweder nach dem Zufallsprinzip oder spezifisch durch gerichtete homologe Rekombination in das Zellgenom integriert, und stabile Integranten werden beispielsweise durch Expression eines selektierbaren Markers, der mit dem Targeting-Konstrukt assoziiert ist, oder durch Expression der modifizierenden Sequenz im Targeting-Konstrukt selektiert.

Gerichtete, Schalter-vermittelte Rekombination erfolgt durch gleichzeitige Transkription der Schalterregionen in Target-Locus und Targeting-Vektor. Zellen, die das Rekombinationsprodukt enthalten, beispielsweise den modifizierten Target-Locus, werden durch Expression des modifizierten Target-Locus-Genprodukts (z.B. durch ELISA-Reaktivität oder fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren (FACS)) identifiziert und selektiert.

Schalter-vermittelte Rekombination unter Verwendung eines chromosomalen Target-Locus und eines extrachromosomalen Targeting-Konstrukts

In dieser Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird das Targeting-Konstrukt in die Zelle, die einen chromosomal integrierten Target-Locus enthält, mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt sind (siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989), s.o.), eingeführt. Im Gegensatz zum unmittelbar zuvor beschriebenen Verfahren wird das Targeting-Konstrukt für eine ausreichend lange Zeit, um Transkription der Schalterregion des Targeting-Konstrukts und Rekombination mit der transkriptionsaktiven Schalterregion des Target-Locus durchzuführen, als extrachromosomales Element gehalten. Zellen, die das erwünschte Rekombinationsprodukt, z.B. einen modifizierten Target-Locus, enthalten, können wie zuvor beschrieben identifiziert und selektiert werden, z.B. mittels Selektion auf Expression eines selektierbaren Markers, der mit der integrierten Targetsequenz assoziiert ist, oder Detektion von Zellen, die das erwünschte modifizierte Target-Locus-Genprodukt exprimieren.

Screening und Selektion

Detektion von korrekt rekombinierten Sequenzen kann, je nach der Beschaffenheit des erwünschten Rekombinationsprodukt, auf zahlreiche verschiedene Weisen erfolgen. Ist beispielsweise die mit einem selektierbaren Marken assoziierte, modifizierende Sequenz in den Target-Locus hinein mit der modifizierenden Sequenz rekombiniert, so wird ein anfänglicher Screen auf jene Zellen selektieren, die den Marker exprimieren. Ein zweiter Screen kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob die Arzneimittel-resistenten Zellen den in geeigneter Weise modifizierten Target-Locus exprimieren.

Das für den zweiten Screen verwendete Verfahren variiert mit der Beschaffenheit der modifizierenden Sequenz, die in den Target-Locus insertiert ist. Die modifizierende Sequenz kann mittels Southern-Blot unter Verwendung eines Teils der modifizierenden Sequenz als Sonde oder mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung amplifizierter Primer, die aus den modifizierenden und modifizierten Regionen stammen, nachgewiesen werden. Die Zellen, die eine in geeigneter Weise integrierte, modifizierende Sequenz aufweisen, können auch mittels Detektion von Expression eines funktionellen modifizierten Target-Locus-Produkts, z.B. mittels Immundetektion der neuen CH-Region in einem modifizierten Antikörper-Schwerketten-Locus, identifiziert werden. Alternativ dazu kann das Expressionsprodukt des modifizierten Target-Locus unter Verwendung eines Biotests, um auf eine bestimmte Effektorfunktion zu testen, die durch die modifizierende Sequenz verliehen wird, nachgewiesen werden. Beispielsweise wird die Expression von modifizierender Sequenz, die für ein biologisch aktives Molekül wie z.B. ein Enzym, ein Toxin, einen Wachstumsfaktor oder andere Peptide kodiert, auf diese bestimmte biologische Aktivität getestet.

Ist der Target-Locus ein Ig-Gen, so kann das Produkt des modifizierten Target-Locus auch auf geeignete Antigen- oder Liganden-Erkennung mittels jedes beliebigen herkömmlichen immunologischen Screeningverfahrens, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, z.B. mittels ELISA, FACS, Tests zu antikörpervermittelter Zellzytotoxizität oder Immunfällungstests (siehe beispielsweise Harlow & Lane, s.o.), getestet werden.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele werden dargeboten, um durchschnittlichen Fachleuten eine vollständige Offenbarung und Beschreibung davon bereitzustellen, wie verschiedene Konstrukte gebildet und verwendet und die verschiedenen Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können, und sind nicht als Einschränkung des Umfangs dessen gedacht, was die Erfinder als ihre Erfindung betrachten. Außer anders angegeben, stehen die Teile für Gewichtsteile, die Temperatur ist in °C angegeben, und der Druck liegt bei oder nahe bei Atmosphärendruck. Es wurde selbstverständlich darauf geachtet, hinsichtlich der verwendeten Zahlen Exaktheit zu garantieren (z.B. bezüglich der Länge von DNA-Sequenzen, Molekulargewichten, Mengen, bestimmter Komponenten usw.), mit gewissen Abweichungen sollte jedoch gerechnet werden.

BEISPIEL 1. Targeting-Konstrukt für Schalter-vermittelte Rekombination (pTSW-1.4 und pTSW-1.9)

Alle gebildeten Vektoren basierten auf einem pACYC177-Plasmid (NEB) mit geringer Kopienzahl. Der Vektor pTSW-1.4 wurde aus dem p1bYAC&dgr;Not-Plasmid, das ein 23 kb umfassendes, genomisches EcoRI-Fragment der gesamten menschlichen &ggr;2-Schalterregion, isoliert aus menschlicher genomischer Plazenta-Bibliothek, enthielt, gebildet. Dieses Fragment enthielt 2 kb Kodiersequenzen, 12 kb Stromauf-Sequenzen, einschließlich des I-Exons und der &ggr;2-Schalterregion, und 9 kb Stromab-Sequenzen (Flanagan & Rabbitts, Nature 300, 709-713 (1982)). Dieses Plasmid enthält auch den Maus-3'-Enhancer (Dariavach et al., Eur. J. Immunol. 21, 1499–1504 (1991)). Der Vektor wurde so modifiziert, dass er einen selektierbaren Hygromycinmarker und eine menschliche CMV-Promotor-Enhancer-Kassette enthielt, die an ihrem 3'-Ende prokaryotische Terminatorsequenzen (nachstehend beschrieben) umfasste. Die prokaryotischen Terminatorsequenzen wurden verwendet, um zufällige prokaryotische Transkripte von der Aktivierung der Schaltersequenzen und dadurch von der Destabilisierung dieser Sequenzen während des Klonierens in Bakterien abzuhalten (Mowatt & Dunnick, J. Immunology 136, 2674–2683 (1986)). Für diese Sequenzen wurde bestätigt, dass sie nur sehr geringe Wirkung auf eukaryotische Transkription zeigten.

Das Hygromycingen, das vom SV40-Promotor gesteuert wird (Giordano & McAllister, Gene 88, 285–288 (1990)), wurde als ein 1,7 kb umfassendes HindIII-BamHI-Fragment aus dem pUC219.TG76-Plasmid kloniert und in HindIII- und BamHI-Stellen in pACYC177 insertiert, um das pACYC.hyg-Plasmid zu bilden.

Der Terminator wurde als GCATGCCCGCGGGAATAGGCGGGCTTTTTTNNNGCCGCGGCTCGA (Seq.-ID Nr. 1) mit flankierenden SphI-Stellen und einer innen liegenden XhoI-Stelle als das 3'-Ende für Klonierungszwecke synthetisiert. Diese Sequenz wurde in die SphI-Stelle von plK1.1 Cat-Plasmid, stromab von den menschlichen CMV-Promotor-Enhancer-Sequenzen, kloniert.

Die CMV-Expressionskassette wurde zusammen mit den Terminatorsequenzen als ein 900 bp umfassendes HindIII-XhoI-Fragment kloniert, das in die HindIII- und XhoI-Stellen im pACYC.hyg-Plasmid, wie oben beschrieben, platziert wurde, um pA-CYC.hyg.CMVt zu bilden, in dem die CMV-Transkriptionsausrichtung jener des Hygromycingens genau entgegengesetzt ist.

Das 2,6 kb umfassende Fragment, das sowohl Hygromycin- als auch CMV-Terminator-Kassetten enthält, wurde durch BamHI- und XhoI-Verdau aus pA-CYC.hyg-CMVt ausgeschnitten. Beide Enden dieses Fragments wurden unter Verwendung von Linkern zu NotI-Stellen konvertiert, und das Fragment wurde in die einmalige NotI-Stelle im p1 bYAC&dgr;Not-Plasmid, das 23 kb umfassende menschliche &ggr;2-Sequenzen und Maus-3'-Enhancer enthielt, kloniert. pTSW-1.4-Plasmid (5) wurde mit einer CMV-Transkriptionsausrichtung in derselben Richtung wie jener der menschlichen &ggr;2-Kodiersequenzen gebildet. pTSW-1.9-Plasmid (6) wurde mit einer CMV-Transkriptionsausrichtung, die jener der menschlichen &ggr;2-Kodiersequenzen entgegengesetzt war, gebildet.

Ein Beispiel für ein Targeting-Konstrukt der Erfindung, das als pTSW-1.4 bezeichnet wird, ist in 5 gezeigt. pTSW-1.4 wird zur Verwendung bei Schalter-vermittelter Ersetzung eines konstanten Ig-Schwerkettengens durch ein menschliches konstantes Schwerketten-IgG2-Gen (hCH&ggr;2) konstruiert. Das pTSW-1.4-Konstrukt enthält einen CMV-Promotor, der, in 5'-zu-3'-Ausrichtung, operabel an die menschliche IgG2-Schwerkettenregion (etwa 23 kb) gebunden ist, die das IgG2-Schwerketten-I-Exon und seine 5'-Flankiersequenzen, die menschliche IgG2-Schalterregion, das vollständige menschliche hCH&ggr;2-Gen und Sequenzen, die die IgG2-Schwerkettenregion flankieren, enthält. Die hCH&ggr;2-Region ist an einen murinen Enhancer gebunden, der benachbart und 3' zum hCH&ggr;2-Gen angeordnet ist. Der CMV-Promotor ist ein starker konstitutiver Promotor. Andere konstitutive Promotoren können anstelle des CMV-Promotors verwendet werden (z.B. SFFV, MMLV, MCV, RSV, SV40 usw.). Beide hCH&ggr;2-Regionen wurden bereits kloniert und sequenziert (Mills et al. (1995), s.o.). Muriner 3'-Enhancer ist auf dem Gebiet der Erfindung ebenfalls durchwegs bekannt (Dariavach et al. (1991), s.o.).

BEISPIEL 2. Targeting-Konstrukt für Schalter-vermittelte Rekombination (pTSW-2)

Um pTSW-2-Plasmid zu bilden, wurde ein 13 kb umfassendes BamHI-Fragment aus dem 23 kb umfassenden, menschlichen genomischen EcoRI-&ggr;2-Fragment in p1 bYAC&dgr;Not-Plasmid, wie in Beispiel 1 beschrieben, kloniert, woraufhin teilweise Auffüllreaktion mit Klenow erfolgte, um Fragmentenden zu bilden, die mit XhoI kompatibel sind. Dieser Klon wurde in die einmalige XhoI-Stelle in pACYC.hyg.CMVt-Plasmid insertiert, die ebenfalls teilweise mit Klenow aufgefüllt war, um die Stelle mit BamHI kompatibel zu machen. Die korrekte Ausrichtung des Klons, in dem die Transkriptionsausrichtung menschlicher &ggr;2-Kodiersequenzen dieselbe ist wie jene des CMV-Promotors, wurde selektiert.

Ein anderes beispielhaftes Targeting-Konstrukt der Erfindung, bezeichnet als pTSW-2, ist in 7 gezeigt. Wie pTSW-1.4 wird pTSW-2 zur Verwendung in Schaltervermittelter Ersetzung eines konstanten Ig-Schwerkettengens durch ein menschliches konstantes Schwerketten-IgG2-Gen (hCH&ggr;2) konstruiert. Das pTSW-2-Konstrukt wird unter Verwendung eines CMV-Promotors, der, in 5'-zu-3'-Ausrichtung, operabel an die menschliche IgG2-Schwerkettenregion (etwa 13 kb) gebunden ist, die die menschliche IgG2-Schalterregion und 200 bp umfassende 5'-Flankiersequenzen der Schalterregion sowie menschlichen offenen &ggr;2-Leseraster enthält, hergestellt. Manche der flankierenden Sequenzen, die in pTSW-1.4 vorhanden sind, sind in pTSW-2 nicht vorhanden. Das pTSW-2-Konstrukt enthält auch den selektierbaren Marken SV2hyg und einen prokaryotischen Transkriptionsterminator (um die Schalterregion zu stabilisieren). Das pTSW-2-Konstrukt kann entweder mit oder ohne einem/n murinen Enhancer, 3' zum hCH&ggr;2-Gen angeordnet, hergestellt werden.

BEISPIEL 3. Targeting-Konstrukt für Schalter-vermittelte Rekombination (pTSW-3.1)

Um das pTSW-3.1-Plasmid (8) zu bilden, wurden 2 kb menschlicher &ggr;2-Kodiersequenzen mittels PCR aus p1bYAC&dgr;Not als ein XhoI-SalI-Fragment kloniert (Beispiel 1). Dieses Fragment wurde in die einmalige XhoI-Stelle im pA-CYC.hyg.CMVt-Plasmid, 3' zu den Terminatorsequenzen, kloniert. Maus-&ggr;1-Schaltersequenzen wurden als ein 10 kb umfassendes HindIII-EcoRI-Fragment aus p-gamma-1/EH10.0-Plasmid (Mowatt & Dunnick (1986), s.o.) ausgeschnitten, und die Enden wurden zu XhoI bzw. SalI konvertiert. Das modifizierte Plasmid wurde 5' von der menschlichen &ggr;2-Region über die einmalige XhoI-Stelle in pACYC.hyg.CMVt kloniert. pTSW-3.1dBglII-Plasmid (9) wurde auf ähnliche Weise wie pTSW-3.1 gebildet, außer dass eine 7,9 kb umfassende BglII-EcoRI-Maus-&ggr;1-Schaltersequenz eingebunden wurde.

pTSW-3.2 wurde wie für pTSW-3.1 beschrieben konstruiert, außer dass die CMV-Promotor-Enhancer-Kassette durch den Spleen-Focus-Forming-Virus- (SFFV-) Promotor ersetzt wurde.

pTSW-3-Plasmide enthielten einmalige NotI- und MluI-Stellen (konvertiert durch einen Linker aus der einmaligen BamHI-Stelle). HindIII wird zum Linearisieren und Klonieren des 3'-Enhancers verwendet.

Ein weiteres beispielhaftes Targeting-Konstrukt der Erfindung, bezeichnet als pTSW-3.1, ist in 8 gezeigt. Wie pTSW-1.4 und TSW-2 wird pTSW-3.1 zur Verwendung bei Schalter-vermittelter Ersetzung eines konstanten Ig-Schwerkettengens durch ein menschliches konstantes Schwerketten-IgG2-Gen (hCH&ggr;2) konstruiert. Das pTSW-3.1-Konstrukt wird unter Verwendung eines CMV-Promotors, der, in 5'-zu-3'-Ausrichtung, operabel an eine murine &ggr;1-Schalterregion gebunden ist, die auch das Maus-&ggr;1-I-Exon und flankierende Sequenzen enthalten kann, und einer menschlichen genomischen konstanten hCH&ggr;1-, hCH&ggr;2- oder hCH&ggr;4-Kodiersequenz, die den 5'-Flankierungsverzweigungspunkt und Spleißakzeptor umfasst, hergestellt. Das pTSW-3.1-Konstrukt kann gegebenenfalls ferner ein murines &ggr;1-Steuerelement (mI&ggr;1), benachbart und 5' zu der mS&ggr;1-Sequenz angeordnet, enthalten. Alternativ dazu können die menschliche Schalterregion des &ggr;1-Gens (hS&ggr;1) und ihre 5'-Flankiersequenzen, wie z.B. das I-Exon (hI&ggr;1), anstelle von mI&ggr;1 und mS&ggr;1 verwendet werden. In Konstrukten, die kein I-Exon enthalten, wird eine Spleißdonorstelle 3' zu den Promotorsequenzen bereitgestellt. Das pTSW-3.1-Konstrukt kann ferner gegebenenfalls einen murinen 3'-Enhancer, der benachbart und stromab zum hCH&ggr;-Gen angeordnet ist, und/oder einen eukaryotischen 3'-Transkriptionsterminator, der 3' und benachbart zum hCH&ggr;-Gen angeordnet ist, enthalten. Jedes dieser Elemente des pTSW-3-Konstrukts ist auf dem Gebiet der Erfindung bekannt (Maus-S&ggr;4, -S&mgr;, Mills et al. (1991), s.o.; Maus-S&ggr;1, MowDunnick (1986), s.o.; menschliches S&ggr;, Mills et al. (1995), s.o.; Maus-3'-Enhancer, Dariavach et al. (1991), s.o.). Das pTSW-3.1-Konstrukt enthält auch den selektierbaren Marken SV2&ggr;2hyg und eine HindIII-Linearisierungsstelle. Andere selektierbare Marken können verwendet werden, beispielsweise Pyromycin.

BEISPIEL 4. Schalter-vermittelte Rekombination in einer Hybridomzelllinie

Wie zuvor erläutert ist eines der Probleme in Verbindung mit der Produktion menschlicher monoklonaler Antikörper, dass die sich unbegrenzt vermehrende Zelllinie, die mit den menschlichen B-Zellen fusioniert ist, murinen Ursprungs ist. Dies kann zu einem Rekombinationsereignis führen, wobei der resultierende Antikörper eine menschliche variable Region (menschliche Leichtketten und menschliche variable Schwerkettenregion (hVHDHJH)), jedoch eine murine konstante Schwerkettenregion (mCH&ggr;) aufweist (siehe 8). Schalter-vermittelte Rekombination wird verwendet, um das mCH&ggr;-Gen durch ein menschliches konstantes Schwerkettenregion- (hCH&ggr;-) Gen zu ersetzen.

Eine Hybridomzelllinie, die einen monoklonalen IgG-Antikörper gegen Antigene, einschließlich menschlicher Antigene, mit einer menschlichen variablen Schwerkettenregion (hVHDHJH) und einer murinen konstanten Schwerkettenregion (mCH&ggr;) exprimiert, wird unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt sind (siehe beispielsweise Green et al. (1994), s.o.), produziert. Ein Targeting-Konstrukt, das einen operabel an eine Schalterregion und das hCH&ggr;-Gen gebundenen Promotor enthält, wird wie oben beschrieben konstruiert. Jeder beliebige der in den vorangehenden Beispielen als beispielhaft beschriebenen Vektoren (pTSW-1.4, pTSW-2 oder pTSW-3.1) ist zur Verwendung in diesem Verfahren geeignet. Das Konstrukt wird linearisiert, und das lineare Konstrukt wird in die Hybridomzelle beispielsweise mittels Elektroporation, Lipofektion oder anderer Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, eingeführt. Die transfizierten Hybridomzellen, die stabile Integranten des Konstrukts enthalten, werden aufgrund ihrer Fähigkeit, in Hygromycin zu wachsen, selektiert. Hygromycin-resistente Zellen werden dann weiter kultiviert, um Transkription des Target-Konstrukts aus dem CMV-Promotor und das resultierende, Schalter-vermittelte Rekombinationsereignis zu ermöglichen. Hybridomeinzellkulturen werden anschließend durch Amplifikation einer rekombinierten Antikörper-Nachricht oder unter Verwendung eines Anti-Mensch-IgG2-Antikörpers in einem Sandwich-ELISA-Test oder isoliert durch FACS-Sortieren auf Expression von hCHy2 gescreent.

BEISPIEL 5. Schalter-vermittelte Rekombination in einer transgenen Maus, die menschliche Antikörper produziert

Schalter-vermittelte Rekombination kann in einer transgenen Maus in vivo wie im Folgenden beschrieben stattfinden. Der Targeting-Vektor wird als ein Transgen in eine menschlichen Antikörper produzierende Maus eingeführt, und die rekombinierten Antikörper, die von Maus-B-Zellen oder den davon abgeleiteten Hybridomen produziert werden, werden wie beschrieben gescreent.


Anspruch[de]
Künstliches Nucleinsäure-Targeting-Konstrukt, umfassend:

a) eine einzelne Schalterregion;

b) einen Promotor, der zur Schalterregion heterolog ist, worin der Promotor operabel an die Schalterregion gebunden und 5' von ihr angeordnet ist; und

c) eine heterologe modifizierende Sequenz, die operabel an die Schalterregion gebunden und 3' von ihr angeordnet ist, worin die modifizierende Sequenz für eine konstante Region einer Schwerkette eines menschlichen Antikörpers kodiert, worin die konstante Region aus C&ggr;, C&mgr;, C&agr;, C&dgr; und C&egr; ausgewählt ist.
Targeting-Konstrukt nach Anspruch 1, ferner umfassend eine zusätzliche DNA-Sequenz, die 5' von der Schalterregion und 3' vom Promotor angeordnet ist. Targeting-Konstrukt nach Anspruch 1, worin der heterologe Promotor ein konstitutiver Promotor ist. Targeting-Konstrukt nach Anspruch 1, worin der heterologe Promotor ein induzierbarer Promotor ist. Targeting-Konstrukt nach Anspruch 1, worin der Promotor aus einem Zytomegalievirus-Promotor, einem Spleen-Focus-Forming-Virus- (SFFV-) Promotor, einem Rous-Sarkomvirus-Promotor, einem SV40-Promotor und einem murinen Moloney-Virus-Promotor ausgewählt ist. Verfahren zur gerichteten, Schalter-vermittelten Rekombination, worin das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) das Einführen eines Targeting-Konstrukts in eine B-Zelle oder ein B-Zell-Hybridom, worin das Targeting-Konstrukt eine Targeting-Konstrukt-Schalterregion und einen Promotor (P1), der operabel an die Targeting-Konstrukt-Schalterregion gebunden und 5' von ihr angeordnet ist, umfasst und

worin die Zelle einen Target-Locus umfasst, der eine Target-Locus-Schalterregion, eine Targetsequenz neben der und 3' zur Target-Locus-Schalterregion und einen Promotor (P2) operabel innerhalb des Target-Locus angeordnet umfasst, um Transkription der Target-Locus-Schalterregion und der Targetsequenz bereitzustellen; und

b) das Kultivieren der Zelle, um Transkription des Target-Locus und des Targeting-Konstrukts zu ermöglichen und dadurch Rekombination zwischen der Target-Locus-Schalterregion und der Targeting-Konstrukt-Schalterregion zu fördern; und

c) das Selektieren einer Zelle, die einen modifizierten Target-Locus umfasst, der den Targeting-Konstrukt-Promotor P1, eine Schalterregion und die Targetsequenz umfasst,

worin P1, die Schalterregion und die Targetsequenz operabel gebunden sind und worin die Targetsequenz unter der Steuerung von P1 steht.
Verfahren zur gerichteten, Schalter-vermittelten Rekombination, worin das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) das Einführen eines Targeting-Konstrukts in eine B-Zelle oder ein B-Zell-Hybridom, worin das Targeting-Konstrukt eine Targeting-Konstrukt-Schalterregion und einen Promotor (P1), der operabel an die Targeting-Konstrukt-Schalterregion gebunden und 5' von ihr angeordnet ist, und eine modifizierende Sequenz, die operabel an die Targeting-Konstrukt-Schalterregion gebunden und 3' von ihr angeordnet ist, umfasst,

worin die Zelle einen Target-Locus umfasst, der eine Target-Locus-Schalterregion, eine Targetsequenz neben der und 3' zur Target-Locus-Schalterregion und einen Promotor (P2) operabel innerhalb des Target-Locus angeordnet umfasst, um Transkription der Target-Locus-Schalterregion und der Targetsequenz bereitzustellen; und

b) das Kultivieren der Zelle, um Transkription des Target-Locus und des Targeting-Konstrukts zu ermöglichen und dadurch Rekombination zwischen der Target-Locus-Schalterregion und der Targeting-Konstrukt-Schalterregion zu fördern; und

c) das Selektieren einer Zelle, die einen modifizierten Target-Locus umfasst, der den Targeting-Konstrukt-Promotor P2, eine Schalterregion und die modifizierende Sequenz umfasst,

worin P2, die Schalterregion und die modifizierende Sequenz operabel gebunden sind.
Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers durch Schalter-vermittelte Rekombination, worin das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) das Einführen eines Targeting-Konstrukts in eine B-Zelle oder ein B-Zell-Hybridom, worin das Targeting-Konstrukt eine Targeting-Konstrukt-Schalterregion (S1), einen Targeting-Konstrukt-Promotor, der operabel an die Targeting-Konstrukt-Schalterregion gebunden und 5' von ihr angeordnet ist, und eine modifizierende Sequenz, die operabel an die Targeting-Konstrukt-Schalterregion gebunden und 3' von ihr angeordnet ist, umfasst und

worin die Zelle eine Antikörper-Schwerkette exprimiert und worin die Antikörper-Schwerkette, die durch die Zelle exprimiert wird, von einem Antikörper-Schwerketten-Locus kodiert wird, der einen Schwerketten-Locus-Promotor, eine variable Antikörper-Schwerkettenregion, die operabel an den Promotor gebunden und 3' von ihm angeordnet ist, eine Schalterregion (S2), die neben der variablen Region und 3' von ihr liegt, und eine konstante Antikörper-Schwerkettenregion, die neben der Schalterregion und 3' von ihr liegt, umfasst,

b) das Kultivieren der Zelle, um Antikörperexpression und Transkription des Targeting-Konstrukts zu ermöglichen, worin Schalter-vermittelte Rekombination zwischen S1 und S2 gefördert wird und worin die konstante Antikörper-Schwerkettenregion durch die modifizierende Sequenz des Targeting-Konstrukts ersetzt wird; und

c) das Selektieren einer Zelle, die einen modifizierten Schwerketten-Locus umfasst, worin der modifizierte Schwerketten-Locus den Schwerketten-Locus-Promotor, die variable Antikörper-Schwerkettenregion, eine Schalterregion und die modifizierende Sequenz des Targeting-Konstrukts umfasst, worin der Schwerketten-Locus-Promotor, die variable Schwerkettenregion, die Schalterregion und die modifizierende Sequenz operabel gebunden sind.
Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Antikörperschwerkette durch Schalter-vermittelte Rekombination, worin das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) das Einführen eines Targeting-Konstrukts in eine isolierte B-Zelle oder ein B-Zell-Hybridom, das Schalter-vermittelte Rekombination erleichtert, worin das Targeting-Konstrukt, in der Reihenfolge von 5' nach 3' und in operabler Bindung, einen Targeting-Konstrukt-Promotor, eine Targeting-Konstrukt-Antikörper-Schwerkettenvariabelregion-Sequenz und eine Schalterregion (S1) umfasst und worin eine Antikörper-Schwerkette, die von der Zelle exprimiert wird, von einem Antikörper-Schwerketten-Target-Locus kodiert wird, der in der Reihenfolge von 5' nach 3' und in operabler Bindung einen Target-Locus-Promotor, eine variable Target-Locus-Antikörper-Schwerkettenregion, eine Schalterregion (S2) und eine konstante Antikörper-Schwerkettenregion umfasst;

b) das Kultivieren der Zelle, um Transkription des Targeting-Konstrukts zu ermöglichen, worin Schalter-vermittelte Rekombination zwischen S1 und S2 gefördert wird; und

c) das Selektieren einer Zelle, die einen modifizierten Target-Locus umfasst, der in der Reihenfolge 5' nach 3' und in operabler Bindung den Targeting-Konstrukt-Promotor, die variable Targeting-Konstrukt-Schwerkettenregion, eine Schalterregion und die konstante Target-Locus-Antikörper-Schwerkettenregion umfasst; worin eine modifizierte Antikörper-Schwerkette gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, worin das Targeting-Konstrukt und der Target-Locus chromosomal integriert sind. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, worin der Target-Locus für eine Antikörper-Schwerkette kodiert. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, worin der Target-Locus ferner eine Nicht-Target-Sequenz umfasst, die zwischen dem Target-Locus-Promotor und der Target-Locus-Schalterregion angeordnet ist. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, worin das Targeting-Konstrukt vor dem Einführen linearisiert wird und eine Zelle, die einen stabilen Integranten des Targeting-Konstrukts enthält, vor dem Kultivieren ausgewählt wird, um Target-Locus-Transkription zu ermöglichen. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, worin das Targeting-Konstrukt extrachromosomal ist. Verfahren nach Anspruch 10, worin Rekombination zwischen der ersten Schalterregion und der zweiten Schalterregion mit Deletion von Nucleinsäure, die zwischen der ersten und der zweiten Schalterregion angeordnet ist, einhergeht. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Nicht-Target-Sequenz für eine menschliche variable Antikörper-Schwerkettenregion kodiert und die Targetsequenz für eine murine konstante Antikörper-Schwerkettenregion kodiert. Verfahren nach Anspruch 16, worin die modifizierende Sequenz des Targeting-Konstrukts für eine menschliche konstante Antikörper-Schwerkettenregion kodiert. Verfahren nach Anspruch 7, worin der Target-Locus für eine murine Antikörper-Schwerkette kodiert und die modifizierende Sequenz des Targeting-Konstrukts für eine menschliche konstante Antikörper-Schwerkettenregion kodiert.






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