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Dokumentenidentifikation DE102005042541A1 08.03.2007
Titel Fermentative Herstellung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte in fester Form
Anmelder BASF AG, 67063 Ludwigshafen, DE
Erfinder Pompejus, Markus, Dr., Seoul, KR;
Freyer, Stephan, Dr., 67434 Neustadt, DE;
Lohscheidt, Markus, Dr., 69121 Heidelberg, DE;
Zelder, Oskar, Dr., 67346 Speyer, DE;
Boy, Matthias, Dr., 63225 Langen, DE;
Scholten, Edzard, Dr., 68159 Mannheim, DE
Vertreter Reitstötter, Kinzebach & Partner GbR, 67059 Ludwigshafen
DE-Anmeldedatum 07.09.2005
DE-Aktenzeichen 102005042541
Offenlegungstag 08.03.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 08.03.2007
IPC-Hauptklasse C12P 1/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, DE
IPC-Nebenklasse C12P 13/08(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   A23K 1/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   A23L 1/09(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   A23L 1/105(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   
Zusammenfassung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung wenigstens eines nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts in fester Form durch zuckerbasierte mikrobielle Fermentation, wobei man einen die gewünschten Stoffwechselprodukte produzierenden Mikroorganismenstamm mit einem zuckerhaltigen Flüssigmedium, das einen Monosaccharidgehalt von mehr als 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Flüssigmediums, aufweist, kultiviert und anschließend die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe weitgehend entfernt, wobei man das zuckerhaltige Flüssigmedium herstellt durch:
a1) Vermahlen einer unter Getreidekörnern ausgewählten Stärkequelle; und
a2) Verflüssigen des Mahlguts in einer wässrigen Flüssigkeit in Gegenwart mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms und anschließendes Verzuckern unter Verwendung mindestens eines verzuckernden Enzyms, wobei man zum Verflüssigen mindestens eine Teilmenge des Mahlguts kontinuierlich oder diskontinuierlich zu der wässrigen Flüssigkeit gibt.
Weiterhin betrifft die Erfindung eine durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältliche feste Formulierung eines nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts; sowie die Verwendung einer solchen festen Formulierung als Zusatz- oder Ergänzungsstoff für die Tier- oder Humanernährung bzw. für die Textil-, Leder-, Zellstoff-, Papier- oder Oberflächenbehandlung.

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft die fermentative Herstellung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte in fester Form durch Vermahlen, Verflüssigen und Verzuckern von unter Getreidekörnern ausgewählten Stärkequellen und den Einsatz des dadurch gewonnenen zuckerhaltigen Flüssigmediums zur Fermentation.

Verfahren zur Herstellung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte wie z.B. Aminosäuren, Vitamine und Carotenoide durch mikrobielle Fermentation sind allgemein bekannt. In Abhängigkeit von den verschiedenen Verfahrensbedingungen werden dabei unterschiedliche Kohlenstoffquellen genutzt. Diese reichen von reiner Saccharose über Rüben- und Zuckerrohrmelasse, sogenannten „high test molasses" (invertierte Zuckerrohrmelasse) bis hin zu Glucose aus Stärkehydrolysaten. Für die biotechnologische Herstellung von L-Lysin werden darüber hinaus Essigsäure und Ethanol als großtechnisch einsetzbare Co-Substrate genannt (Pfefferle et al., Biotechnogical Manufacture of Lysine, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol. 79 (2003), 59-112).

Auf Basis der genannten Kohlenstoffquellen sind verschiedene Methoden und Vorgehensweisen zur zuckerbasierten, fermentativen Herstellung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte etabliert. Am Beispiel des L-Lysins werden diese beispielsweise von Pfefferle et al. (a.a.O.) im Hinblick auf Stammentwicklung, Prozessentwicklung und großtechnische Produktion beschrieben.

Eine wichtige Kohlenstoffquelle für die durch Mikroorganismen vermittelte fermentative Herstellung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte ist Stärke. Diese muss in vorgelagerten Reaktionsschritten zunächst verflüssigt und verzuckert werden, bevor sie als Kohlenstoffquelle in einer Fermentation genutzt werden kann. Hierzu wird die Stärke aus einer natürlichen Stärkequelle wie Kartoffeln, Cassava, Getreide, z.B. Weizen, Mais, Gerste, Roggen, Triticale oder Reis üblicherweise in vorgereinigter Form gewonnen und anschließend enzymatisch verflüssigt und verzuckert, um dann in der eigentlichen Fermentation zur Produktion der gewünschten Stoffwechselprodukte eingesetzt zu werden.

Neben dem Einsatz derartig vorgereinigter Stärkequellen ist auch die Verwendung nicht-vorbehandelter Stärkequellen zur Herstellung von Kohlenstoffquellen für die fermentative Produktion nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte beschrieben worden. Typischerweise werden die Stärkequellen dabei zunächst durch Mahlen zerkleinert. Das Mahlgut wird dann einer Verflüssigung und Verzuckerung unterworfen. Da dieses Mahlgut naturgemäß neben Stärke noch eine Reihe von nicht-stärkehaltigen Bestandteilen enthält, die die Fermentation nachteilig beeinflussen, werden diese Bestandteile üblicherweise vor der Fermentation abgetrennt. Die Entfernung kann entweder direkt nach dem Mahlen (WO 02/277252; JP 2001-072701; JP 56-169594; CN 1218111), nach der Verflüssigung (WO 02/277252; CN 1173541) oder im Anschluss an die Verzuckerung (CN 1266102; Beukema et al.: Production of fermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes; potatoe saccharification to give culture medium (Conference Abstract), Symp. Biotechnol. Res. Neth. (1983), 6; NL8302229) erfolgen. In allen Varianten wird jedoch ein weitgehend reines Stärkehydrolysat in der Fermentation eingesetzt.

Neuere Techniken befassen sich insbesondere mit verbesserten Methoden, die vor der Fermentation eine Aufreinigung z.B. von verflüssigten und verzuckerten Stärkelösungen (JP 57159500) und von Fermentationsmedien aus erneuerbaren Ressourcen (EP 1205557) ermöglichen sollen.

Unaufbereitete Stärkequellen finden hingegen bekanntermaßen in großem Umfang Einsatz bei der fermentativen Herstellung von Bioethanol. Dabei ist das als „Drymilling" bekannte Verfahren des trockenen Vermahlens, Verflüssigens und Verzuckerns von Stärkequellen technisch in großem Maßstab etabliert. Entsprechende Prozessbeschreibungen finden sich z.B. in „The Alcohol Textbook – A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries", Jaques et al. (Hg.), Nottingham Univ. Press 1995, ISBN 1-8977676-735, und in McAloon et al., „Determining the cost of producing ethanol from corn starch and lignocellulosic feedstocks" ,NREL/TP-580-28893, National Renewable Energy Laboratory, October 2000.

Bei den Dry-milling-Verfahren werden im ersten Schritt ganze Getreidekörner fein vermahlen, bevorzugt Mais, Weizen, Gerste, Hirse und Roggen. Im Gegensatz zum sogenannten „Wet-Milling"-Verfahren wird dabei keine zusätzliche Flüssigkeit zugesetzt. Das Zermahlen in feine Bestandteile dient dazu, die in den Körnern enthaltene Stärke in der nachfolgenden Verflüssigung und Verzuckerung der Einwirkung von Wasser und Enzymen zugänglich zu machen.

Da bei der fermentativen Herstellung von Bioethanol das Wertprodukt durch Destillation gewonnen wird, stellt der Einsatz von Stärkequellen aus dem Dry-Milling-Prozess in nicht vorgereinigter Form kein spezielles Problem dar. Bei der Anwendung eines Dry-Milling-Verfahrens zur Produktion nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte ist jedoch der über die Zuckerlösung in die Fermentation eingetragene Feststoffstrom problematisch, da dieser sich sowohl negativ auf die Fermentation auswirken kann als auch die anschließende Aufarbeitung nicht unerheblich erschweren kann.

So ist für viele Fermentationen die Sauerstoffversorgung der eingesetzten Mikroorganismen, insbesondere wenn diese einen hohen Sauerstoffbedarf haben, ein limitierender Faktor. Über den Einfluss hoher Feststoffkonzentrationen auf den Sauerstoffübergang von der Gas- in die Flüssigphase und somit auf die Sauerstofftransferrate ist allgemein wenig bekannt. Es ist andererseits bekannt, dass eine mit zunehmender Feststoffkonzentration ansteigende Viskosität zu einer verminderten Sauerstofftransferrate führt. Werden darüber hinaus oberflächenaktive Substanzen mit den Feststoffen in das Fermentationsmedium eingetragen, so beeinflussen diese die Koalugationsneigung der Gasblasen. Die dadurch resultierende Blasengröße beeinflusst ihrerseits maßgeblich den Sauerstofftransfer (Mersmann, A. et al.: Selection and Design of Aerobic Bioreactors, Chem. Eng. Technol. 13 (1990), 357-370).

Durch den Feststoffeintrag kann in Bezug auf die Viskosität der verwendeten Medien bereits bei der Herstellung der stärkehaltigen Suspension ein kritischer Wert erreicht werden, weil z.B. eine Suspension mit mehr als 30 Gew.-% Maismehl in Wasser nicht mehr homogen mischbar ist (Industrial Enzymology, 2. Aufl., T. Godfrey, S. West, 1996). Dadurch ist bei herkömmlichem Vorgehen die Glucosekonzentration begrenzt. Aus verfahrensökonomischen Gründen ist es in der Regel nachteilig, mit Lösungen geringerer Konzentration zu arbeiten, weil dies zu einer überproportionalen Verdünnung der Fermentationsbrühe führt. Dadurch sinkt die erreichbare Endkonzentration der Zielprodukte, was zusätzliche Kosten bei deren Gewinnung aus dem Fermentationsmedium verursacht, und die Raum-Zeit-Ausbeute nimmt ab, was bei gleicher Produktionsmenge zu einem größeren Volumenbedarf, d.h. zu höheren Investitionskosten, führt.

Aufgrund dieser Schwierigkeiten eignen sich bisher bekannte Varianten des Dry-Milling-Verfahrens nicht zur Bereitstellung von Stärkequellen für die fermentative Herstellung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte und sind daher ohne wesentliche wirtschaftliche Bedeutung. Versuche zur Übertragung des Dry-Milling-Konzepts und der mit diesem Verfahren verbundenen prinzipiellen Vorteile auf die großtechnische Herstellung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte sind bisher lediglich unter Verwendung von Cassava als Stärkequelle beschrieben worden.

So beschreibt die JP 2001/275693 ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren, bei dem man als Stärkequelle geschälte Cassavaknollen einsetzt, die trocken vermahlen wurden. Zur Durchführung des Verfahrens ist es jedoch erforderlich, eine Teilchengröße des Mahlgutes von ≤ 150 &mgr;m einzustellen. Bei der dazu angewendeten Filtration werden mehr als 10 Gew.-% des eingesetzten Mahlguts, einschließlich nicht-stärkehaltiger Bestandteile, vor der Verflüssigung/Verzuckerung der enthaltenen Stärke und der anschließenden Fermentation abgetrennt. Ein ähnliches Verfahren wird in der JP 2001/309751 zur Herstellung eines aminosäurehaltigen Futterzusatzes beschrieben.

Cassava sollte jedoch im Vergleich zu anderen Stärkequellen, insbesondere Getreide bzw. Getreidekörnern, für das Dry-Milling relativ unproblematisch sein. Während der Stärkeanteil der Cassavawurzel in trockenem Zustand typischerweise wenigstens 80 Gew.-% beträgt (Menezes et al., Fungal celluloses as an aid for the saccharification of Cassava, Biotechnology and Bioengineering, Bd. 20 (4), 1978, John Wiley and Sons, Inc., Tabelle 1, Seite 558), liegt der Trockengehalt an Stärke im Vergleich dazu bei Getreide deutlich niedriger, in der Regel unterhalb 70 Gew.-%, z.B. bei Mais bei etwa 68 Gew.-% und bei Weizen bei etwa 65 Gew.-% (Jaques et al., The Alcohol Textbook, s.o.). Dementsprechend enthält die nach Verflüssigung und Verzuckerung erhaltene Glucoselösung bei Einsatz von trocken vermahlener Cassava vergleichsweise wenig Fremdbestandteile und insbesondere wenig Feststoffe. Diese Fremdbestandteile und insbesondere die nicht-stärkehaltigen Feststoffe erweisen sich bei Einsatz von Getreidekörnern als Stärkequelle als problematisch, da ihr Anteil in diesen Stärkequellen deutlich höher ist als in Cassava. Durch die erhöhte Menge an Fremdbestandteilen wird nämlich die Viskosität der Reaktionsmischung wesentlich erhöht.

Durch eine erhöhte Menge an Fremdbestandteilen wird die Viskosität der Reaktionsmischung erhöht. Stärke aus Cassava sollte jedoch relativ leicht zu verarbeiten sein. Zwar weist sie im Vergleich zu Maisstärke eine höhere Viskosität bei der Quellungstemperatur auf, dafür nimmt die Viskosität jedoch bei ansteigender Temperatur bei Cassava schneller ab als beispielsweise bei Maisstärke (Menezes, T.J.B. de, Saccharification of Cassava for ethyl alcohol production, Process Biochemistry, 1978, Seite 24, rechte Spalte). Darüber hinaus sind die Quellungs- und Gelatinierungstemperaturen von Stärke aus Cassava niedriger als die von Stärke aus Getreide wie Mais, weshalb sie leichter für bakterielle &agr;-Amylase zugänglich ist als Getreidestärke (Menezes, T.J.B. de, a.a.O.).

Weitere Vorteile von Cassava gegenüber Stärkequellen aus Getreide sind ihr geringer Cellulosegehalt und ihr niedriger Phytatgehalt. Cellulose und Hemicellulose können insbesondere unter sauren Verzuckerungsbedingungen in Furfurale umgewandelt werden (Jaques et al., The Alcohol Textbook, s.o.; Menezes, T.J.B. de, s.o.), die ihrerseits auf die in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen eine inhibierende Wirkung haben können. Phytat inhibiert ebenfalls die für die Fermentation eingesetzten Mikroorganismen.

Während es somit technisch möglich ist, Cassava als Stärkequelle in einem dem Drymilling entsprechenden Verfahren zu verarbeiten, so ist ein solches Verfahren auf Basis von Cassava dennoch komplex, nicht optimiert und daher nicht weit verbreitet. Über den Einsatz von Getreide als Stärkequelle in einem dem Dry-Milling-Prozess entsprechenden Verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien wie nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukten wurde bislang nicht berichtet.

Die ältere Patentanmeldung PCT/EP2005/005728 der Anmelderin betrifft erstmalig ein zuckerbasiertes Fermentationsverfahren zur mikrobiellen Herstellung von Feinchemikalien, bei dem als Stärkequelle ein Mahlgut von Getreidekörnern oder anderen trockenen Kornfrüchten oder Samen eingesetzt wird, ohne dass die nicht-stärkehaltigen Bestandteile vor der Fermentation entfernt werden. Eine weitgehende Entfernung der flüchtigen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe unter Erhalt eines das Fermentationsprodukt enthaltenden Feststoffs wird nicht beschrieben.

Es war Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein effizientes Verfahren zur zuckerbasierten fermentativen Herstellung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte bereitzustellen, das die Verwendung von Getreide als Stärkequelle erlaubt. Das Verfahren sollte eine leichte Aufarbeitung des Fermentationsgemisches, insbesondere mittels eines Trocknungsverfahrens, ermöglichen. Außerdem sollte es sich durch eine leichte Handhabbarkeit der verwendeten Medien auszeichnen und insbesondere aufwändige Vor- oder Aufreinigungsschritte, wie etwa die Abtrennung fester nicht-stärkehaltiger Bestandteile, vor der Fermentation vermeiden.

Im Rahmen der von der Anmelderin durchgeführten Arbeiten wurde überraschend gefunden, dass ein solches Verfahren trotz des inhärent erhöhten Feststoffeintrags effizient durchführbar ist, indem man zur Herstellung eines zuckerhaltigen Flüssigmediums ein aus Getreidekörnern gewonnenes Mahlgut in einer wässrigen Flüssigkeit in Gegenwart mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms verflüssigt und anschließend unter Verwendung mindestens eines verzuckernden Enzyms verzuckert, wobei man zum Verflüssigen mindestens eine Teilmenge des Mahlguts kontinuierlich oder diskontinuierlich zu der wässrigen Flüssigkeit gibt.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung wenigstens eines nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts in fester Form durch zuckerbasierte mikrobielle Fermentation, wobei man einen das(die) gewünschte(n) Stoffwechselprodukt(e) produzierenden Mikroorganismenstamm mit einem zuckerhaltigen Flüssigmedium, das einen Monosaccharidgehalt von mehr als 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Flüssigmediums, aufweist, kultiviert und anschließend die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe weitgehend entfernt, wobei man das zuckerhaltige Flüssigmedium herstellt durch:

  • a1) Vermahlen einer unter Getreidekörnern ausgewählten Stärkequelle; und
  • a2) Verflüssigen des Mahlguts in einer wässrigen Flüssigkeit in Gegenwart mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms und anschließendes Verzuckern unter Verwendung mindestens eines verzuckernden Enzyms, wobei man zum Verflüssigen mindestens eine Teilmenge des Mahlguts kontinuierlich oder diskontinuierlich zu der wässrigen Flüssigkeit gibt.

Als Stärkequelle kommen vor allem trockene Kornfrüchte oder Samen in Betracht, die in getrocknetem Zustand mindestens 40 Gew.-% und bevorzugt mindestens 50 Gew.-% Stärkeanteil aufweisen. Diese finden sich in vielen der heutzutage in großem Maßstab kultivierten Getreidepflanzen wie Mais, Weizen, Hafer, Gerste, Roggen, Triticale, Reis sowie in Zuckerrüben und Kartoffeln und verschiedenen Hirsesorten, z.B. Sorghum und Milo. Bevorzugt ist die Stärkequelle unter Mais-, Roggen-, Triticale- und Weizenkörnern ausgewählt. Grundsätzlich lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch mit analogen Stärkequellen durchführen, wie beispielsweise einer Mischung verschiedener stärkehaltiger Kornfrüchte oder Samen.

Bei den in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium enthaltenen Zuckern handelt es sich vorzugsweise um Monosaccharide wie Hexosen und Pentosen, z.B. Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Sorbose, Xylose, Arabinose und Ribose, insbesondere um Glucose. Der Anteil an von Glucose verschiedenen Monosacchariden kann abhängig von der verwendeten Stärkequelle und den darin enthaltenen nicht-stärkehaltigen Bestandteilen variieren und durch die Verfahrensführung, beispielsweise durch Aufschluss von Cellulosebestandteilen durch Zusatz von Cellulasen, beeinflusst werden. Vorteilhafterweise umfassen die Monosaccharide des zuckerhaltigen Flüssigmediums einen Anteil an Glucose von mindestens 60 Gew.-%, bevorzugt mindestens 70 Gew.-% und besonders bevorzugt mindestens 80 Gew.-%, bezogen auf die in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium enthaltene gesamte Zuckermenge. Üblicherweise liegt der Glucoseanteil im Bereich von 75 bis 99 Gew.-%, insbesondere von 80 bis 97 Gew.-% und speziell von 85 bis 95 Gew.-%, bezogen auf die in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium enthaltene gesamte Zuckermenge.

Erfindungsgemäß enthält das zuckerhaltige Flüssigmedium, mit welchem der die gewünschten Stoffwechselprodukte produzierende Mikroorganismenstamm kultiviert wird, zumindest einen Teil, vorzugsweise wenigstens 20 Gew.-%, insbesondere wenigstens 50 Gew.-%, speziell wenigstens 90 Gew.-% und ganz speziell wenigstens 99 Gew.-% der in den vermahlenen Getreidekörnern enthaltenen nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile, entsprechend dem Ausmahlungsgrad. Bezogen auf die stärkehaltigen Bestandteile des Mahlguts (und damit auf die Menge an Monosaccharid im zuckerhaltigen Flüssigmedium) beträgt der Anteil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium vorzugsweise wenigstens 10 Gew.-% und insbesondere wenigstens 25 Gew.-%, z.B. zwischen 25 und 75 Gew.-% und speziell zwischen 30 und 60 Gew.-%.

Zur Herstellung des zuckerhaltigen Flüssigmediums wird im Schritt a1) die jeweilige Stärkequelle mit oder ohne Zusatz von Flüssigkeit, z.B. Wasser, vermahlen, bevorzugt ohne Zusatz von Flüssigkeit. Es kann auch eine Trockenvermahlung mit einer anschließenden Nassvermahlung kombiniert werden. Zur trockenen Vermahlung werden typischerweise Hammermühlen, Rotormühlen oder Walzen-Schrotmühlen eingesetzt; zur Nassvermahlung eignen sich Rührmixer, Rührwerkskugelmühlen, Zirkulationsmühlen, Scheibenmühlen, Ringkammermühlen, Schwingmühlen oder Planetenmühlen. Grundsätzlich kommen auch andere Mühlen in Betracht. Die zur Nassvermahlung erforderliche Flüssigkeitsmenge kann der Fachmann in Routineexperimenten ermitteln. Üblicherweise wird sie so eingestellt, dass der Gehalt an Trockensubstanz im Bereich von 10 bis 20 Gew.-% liegt.

Durch das Mahlen wird eine für die sich anschließenden Verfahrensschritte geeignete Korngröße eingestellt. Hierbei hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn das beim Vermahlen, insbesondere bei trockener Vermahlung, im Schritt a1) erhaltene Mahlgut Mehlpartikel, d.h. teilchenförmige Bestandteile, mit einer Korngröße im Bereich von 100 bis 630 &mgr;m in einem Anteil von 30 bis 100 Gew.-%, bevorzugt 40 bis 95 Gew.-% und besonders bevorzugt 50 bis 90 Gew.-% aufweist. Vorzugsweise enthält das erhaltene Mahlgut 50 Gew.-% an Mehlpartikeln mit einer Korngröße von mehr als 100 &mgr;m. In der Regel weisen mindestens 95 Gew.-% der ermahlenen Mehlpartikel eine Korngröße von weniger als 2 mm auf. Die Messung der Korngröße erfolgt dabei mittels Siebanalyse unter Verwendung einer Vibrations-Analysenmaschine. Eine geringe Korngröße ist grundsätzlich zur Erzielung einer hohen Produktausbeute vorteilhaft. Eine zu geringe Teilchengröße kann jedoch zu Problemen, insbesondere durch Klumpenbildung/Agglomeration, beim Anmaischen des Mahlguts während der Verflüssigung bzw. bei der Aufarbeitung, z.B. bei der Trocknung der Feststoffe nach dem Fermentationsschritt, führen.

Üblicherweise werden Mehle durch den Ausmahlungsgrad bzw. durch die Mehltype charakterisiert, wobei diese so miteinander korrelieren, dass mit zunehmendem Ausmahlungsgrad auch die Kennzahl der Mehltype zunimmt. Der Ausmahlungsgrad entspricht der Gewichtsmenge des gewonnenen Mehls bezogen auf 100 Gewichtsteile des eingesetzten Mahlguts. Während beim Mahlen zunächst reines, feinstes Mehl, z.B. aus dem Inneren des Getreidekorns, anfällt, nimmt beim weiteren Vermahlen, also mit steigendem Ausmahlungsgrad, der Anteil an Rohfaser- und Schalengehalt im Mehl zu, der Stärkeanteil wird dabei geringer. Der Ausmahlungsgrad spiegelt sich daher auch in der sogenannten Mehltype wider, die als Zahlenangabe zur Klassifizierung von Mehlen, insbesondere von Getreidemehlen, verwendet wird und die auf dem Aschegehalt des Mehles beruht (sogenannte Ascheskala). Die Mehltype bzw. die Typenzahl gibt hierbei die Menge Asche (Mineralstoffe) in mg an, die beim Verbrennen von 100 g Mehltrockensubstanz zurück bleibt. Für Getreidemehle bedeutet eine höhere Typzahl einen höheren Ausmahlungsgrad, da der Kern des Getreidekorns in etwa 0,4 Gew.-%, die Schale hingegen etwa 5 Gew.-% Asche enthält. Bei niederem Ausmahlungsgrad bestehen die Getreidemehle also überwiegend aus dem zerkleinerten Mehlkörper, d.h. dem Stärkebestandteil der Getreidekörner; bei höherem Ausmahlungsgrad enthalten die Getreidemehle auch die zerkleinerte, eiweißhaltige Aleuronschicht der Getreidekörner, bei Schrot auch die Bestandteile des eiweiß- und fetthaltigen Keimlings sowie der rohfaser- und aschehaltigen Samenschalen. Für die erfindungsgemäßen Zwecke sind grundsätzlich Mehle mit einem hohen Ausmahlungsgrad bzw. einer hohen Typzahl bevorzugt. Wird Getreide als Stärkequelle eingesetzt, so werden vorzugsweise die ganzen ungeschälten Körner vermahlen und weiter verarbeitet, gegebenenfalls nach vorheriger mechanischer Abtrennung von Keim und Spelzen.

Zum Verflüssigen des Stärkeanteils im Mahlgut gibt man im Schritt a2) wenigstens eine Teilmenge des Mahlgutes, vorzugsweise wenigstens 40 Gew.-%, insbesondere wenigstens 50 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt wenigstens 55 Gew.-% im Verlauf der Verflüssigung, jedoch vor der Verzuckerung in den Reaktor. Häufig wird die zugegebene Menge 90 Gew.-%, insbesondere 85 Gew.-% und besonders bevorzugt 80 Gew.-% nicht überschreiten. Vorzugsweise wird die im Verlauf zugegebene Teilmenge an Mahlgut dem Reaktor unter Bedingungen zugeführt, wie sie bei der Verflüssigung vorliegen. Die Zugabe kann diskontinuierlich, d.h. portionsweise in mehreren Teilportionen, die vorzugsweise jeweils nicht mehr als 20 Gew.-%, besonders bevorzugt nicht mehr als 10 Gew.-%, z.B. 1 bis 20 Gew.-% insbesondere 2 bis 10 Gew.-%, der Gesamtmenge des zu verflüssigenden Mahlgutes ausmachen, oder kontinuierlich erfolgen. Erfindungswesentlich ist, dass sich zu Beginn der Verflüssigung nur ein Teil des Mahlgutes, vorzugsweise nicht mehr als 60 Gew.-%, insbesondere nicht mehr als 50 Gew.-% und besonders bevorzugt nicht mehr als 45 Gew.-% des Mahlgutes, im Reaktor befindet und die Restmenge des Mahlgutes während des Verflüssigens zugegeben wird. Die Verflüssigung kann auch kontinuierlich, z.B. in einer mehrstufigen Reaktionskaskade, ausgeführt werden.

Erfindungsgemäß erfolgt das Verflüssigen in Schritt a2) in Gegenwart mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms, das vorzugsweise unter &agr;-Amylasen ausgewählt ist. Andere unter den Reaktionsbedingungen aktive und stabile Stärke verflüssigende Enzyme sind ebenfalls einsetzbar.

Die &agr;-Amylase (bzw. das verwendete Stärke verflüssigende Enzym) kann im Reaktionsgefäß vorgelegt oder im Verlauf des Schrittes a2) zugegeben werden. Vorzugsweise gibt man eine Teilmenge der in Schritt a2) benötigten &agr;-Amylase zu Beginn von Schritt a2) zu oder legt diese Teilmenge im Reaktor vor. Die Gesamtmenge an &agr;-Amylase liegt üblicherweise im Bereich von 0,002 bis 3,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,01 bis 1,5 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,02 bis 0,5 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle.

Die Verflüssigung kann oberhalb oder unterhalb der Gelierungstemperatur durchgeführt werden. Vorzugsweise erfolgt die Verflüssigung in Schritt a2) zumindest zeitweise oberhalb der Gelierungstemperatur der eingesetzten Stärke (sogenannter Cooking Prozess). In der Regel wird eine Temperatur im Bereich zwischen 70 und 165°C, bevorzugt zwischen 80 und 125°C und besonders bevorzugt zwischen 85 und 115°C gewählt, wobei die Temperatur vorzugsweise mindestens 5°C und besonders bevorzugt mindestens 10°C oberhalb der Gelierungstemperatur liegt.

Für eine optimale Wirkung der &agr;-Amylase wird Schritt a2) vorzugsweise zumindest zeitweise bei einem pH-Wert im schwach sauren Bereich, vorzugsweise zwischen 4,0 und 7,0, besonders bevorzugt zwischen 5,0 bis 6,5 durchgeführt, wobei üblicherweise vor oder zu Beginn von Schritt a2) die pH-Einstellung vorgenommen wird; dieser pH-Wert wird während der Verflüssigung vorzugsweise kontrolliert und gegebenenfalls nachgestellt. Die Einstellung des pH-Werts erfolgt vorzugsweise mit verdünnten Mineralsäuren wie H2SO4 oder H3PO4 bzw. mit verdünnten Alkalilaugen wie NaOH oder KOH.

In einer bevorzugten Ausführungsform führt man Schritt a2) des erfindungsgemäßen Verfahrens so durch, dass zunächst eine Teilmenge von höchstens 60 Gew.-%, bevorzugt höchstens 50 Gew.-% und besonders bevorzugt höchstens 45 Gew.-%, z.B. 10 bis 60 Gew.-%, insbesondere 15 bis 50 Gew.-% und besonders bevorzugt 20 bis 45 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge des Mahlguts, in einer wässrigen Flüssigkeit, z.B. Frischwasser, rückgeführtes Prozesswasser, z.B. aus der Fermentation oder der Aufarbeitung, oder in einer Mischung dieser Flüssigkeiten suspendiert wird und anschließend die Verflüssigung durchgeführt wird.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, die zur Erzeugung der Suspension verwendete Flüssigkeit auf eine leicht erhöhte Temperatur, z.B. im Bereich von 40 bis 60°C, vorzutemperieren. Es ist jedoch bevorzugt, die Flüssigkeiten bei Raumtemperatur einzusetzen.

Zu dieser Suspension wird dann das mindestens eine Stärke verflüssigende Enzym, vorzugsweise eine &agr;-Amylase, gegeben. Wird eine &agr;-Amylase verwendet, so gibt man vorteilhafterweise nur eine Teilmenge der &agr;-Amylase zu, z.B. 10 bis 70 Gew.-% und insbesondere 20 bis 65 Gew.-%, bezogen auf die insgesamt in Schritt a2) eingesetzte &agr;-Amylase. Die zu diesem Zeitpunkt zugegebene Menge an &agr;-Amylase richtet sich nach der Aktivität der jeweiligen &agr;-Amylase in Bezug auf die verwendete Stärkequelle unter den Reaktionsbedingungen und liegt üblicherweise im Bereich von 0,0004 bis 2,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,001 bis 1,0 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,02 bis 0,3 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle. Alternativ kann die Teilmenge der &agr;-Amylase vor dem Ansetzen der Suspension mit der verwendeten Flüssigkeit vermengt werden.

Hierbei wird vorzugsweise die Teilmenge an &agr;-Amylase vor dem Beginn des Aufheizens auf die zur Verflüssigung angewendete Temperatur, insbesondere bei Raumtemperatur oder nur leicht erhöhter Temperatur, z.B. im Bereich von 20 bis 30°C, zu der Suspension gegeben.

Vorteilhafterweise werden die Mengen an &agr;-Amylase und Mahlgut so ausgewählt sein, dass die Viskosität während des Gelierungsvorgangs ausreichend reduziert ist, um eine effektive Durchmischung der Suspension, z.B. mittels Rühren, zu ermöglichen. Bevorzugt beträgt die Viskosität der Reaktionsmischung während des Gelierens maximal 20 Pas, besonders bevorzugt maximal 10 Pas und ganz besonders bevorzugt maximal 5 Pas. Die Messung der Viskosität erfolgt in der Regel mit einem Haake Viskosimeter Type Roto Visko RV20 mit Messsystem M5 und Messeinrichtung MVDIN bei einer Temperatur von 50°C und einer Schergeschwindigkeit von 200 s–1.

Die so angesetzte Suspension wird dann vorzugsweise auf eine Temperatur oberhalb der Gelierungstemperatur der verwendeten Stärke erhitzt. In der Regel wird eine Temperatur im Bereich zwischen 70 und 165°C, bevorzugt zwischen 80 und 125°C und besonders bevorzugt zwischen 85 und 115°C gewählt, wobei die Temperatur vorzugsweise mindestens 5°C und besonders bevorzugt mindestens 10°C oberhalb der Gelierungstemperatur liegt. Unter Kontrolle der Viskosität werden nach und nach weitere Teilmengen der Stärkequelle, z.B. jeweils 2 bis 20 Gew.-% und insbesondere 5 bis 10 Gew.-% bezogen auf die gesamte eingesetzte Stärkemenge, zu der stärkehaltigen Suspension zugegeben. Es ist bevorzugt, die im Verlauf der Verflüssigung zuzugebende Teilmenge des Mahlgutes in mindestens 2, bevorzugt mindestens 4 und besonders bevorzugt mindestens 6 Teilportionen der Reaktionsmischung zuzugeben. Alternativ kann die Zugabe der beim Ansetzen der Suspension nicht eingesetzten Teilmenge des Mahlgutes kontinuierlich während der Verflüssigung erfolgen. Die Temperatur sollte bei der Zugabe vorteilhafterweise oberhalb der Gelierungstemperatur der Stärke gehalten werden.

Nach vollständiger Zugabe des Mehls wird das Reaktionsgemisch üblicherweise noch eine Zeit, z.B. 30 bis 60 Minuten oder länger, sofern erforderlich, bei der oberhalb der Gelierungstemperatur der Stärke eingestellten Temperatur gehalten, d.h. verkocht. Die Reaktionsmischung wird dann in der Regel auf eine etwas geringere Temperatur oberhalb der Gelierungstemperatur, z.B. 75 bis 90°C, abgekühlt, bevor eine weitere Teilmenge an &agr;-Amylase, vorzugsweise die Hauptmenge, zugesetzt wird. Je nach Aktivität der verwendeten &agr;-Amylase unter den Reaktionsbedingungen beträgt die Menge an zu diesem Zeitpunkt zugegebener &agr;-Amylase vorzugsweise 0,002 bis 2,0 Gew.-%, besonders bevorzugt von 0,01 bis 1,0 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt von 0,02 bis 0,4 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle.

Bei diesen Temperaturen wird die granuläre Struktur der Stärke zerstört (Gelieren), wodurch deren enzymatischer Abbau ermöglicht wird. Zum vollständigen Abbau der Stärke zu Dextrinen wird das Reaktionsgemisch so lange bei der eingestellten Temperatur gehalten oder gegebenenfalls weiter erhitzt, bis der Stärkenachweis mit Jod oder gegebenenfalls ein anderer Test zum Nachweis von Stärke negativ oder mindestens im Wesentlichen negativ ausfällt. Gegebenenfalls können hierbei noch eine oder mehrere weitere Teilmengen &agr;-Amylase, z.B. im Bereich von 0,001 bis 0,5 Gew.-% und bevorzugt 0,002 bis 0,2 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle, zu der Reaktionsmischung gegeben werden.

Nach abgeschlossener Verflüssigung der Stärke wird eine Verzuckerung der in dem Flüssigmedium enthaltenen Dextrine, d. h. deren Abbau zu Glucose, kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt, bevorzugt kontinuierlich. Das verflüssigte Medium kann in einem speziellen Verzuckerungstank vollständig verzuckert werden, bevor es dem Fermentationsschritt b) zugeführt wird. Es hat sich andererseits als vorteilhaft erwiesen, vor der Fermentation nur eine teilweise Verzuckerung vorzunehmen. Beispielsweise kann man so vorgehen, dass man eine Teilmenge der in dem Flüssigmedium enthaltenen Dextrine, z.B. im Bereich von 10 bis 90 Gew.-% und insbesondere im Bereich von 20 bis 80 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Dextrine (bzw. der ursprünglichen Stärke), verzuckert und das resultierende zuckerhaltige Flüssigmedium in der Fermentation einsetzt. Im Fermentationsmedium kann dann eine weitere Verzuckerung in situ erfolgen. Die Verzuckerung kann des Weiteren unter Wegfall eines separaten Verzuckerungstanks direkt im Fermenter (in situ) durchgeführt werden.

Vorteile der in-situ-Verzuckerung, d.h. einer teilweise oder vollständig im Fermenter erfolgenden Verzuckerung, sind einerseits reduzierte Investitionskosten, andererseits kann durch eine retardierte Freisetzung der Glucose gegebenenfalls eine höhere Glucosekonzentration im Ansatz (Batch) vorgelegt werden, ohne dass eine Inhibierung oder Stoffwechseländerung der eingesetzten Mikroorganismen auftritt. Bei E.coli führt eine zu hohe Glucosekonzentration z.B. zur Bildung von organischen Säuren (Acetat), während Saccharomyces cerevisae in diesem Fall z.B. auf Vergärung umschaltet, obwohl in belüfteten Fermentern ausreichend Sauerstoff vorhanden ist (Crabtree-Effekt). Eine retardierte Freisetzung von Glucose ist durch die Regelung der Glucoamylasekonzentration einstellbar. Hierdurch können die vorgenannten Effekte unterdrückt werden und es kann mehr Substrat vorgelegt werden, so dass die aus dem zugeführten Feed-Strom resultierende Verdünnung reduziert werden kann.

Im Fall der Verzuckerung in einem Verzuckerungstank wird die verflüssigte Stärkelösung üblicherweise auf das Temperaturoptimum des verzuckernden Enzyms oder leicht darunter, z.B. auf 50 bis 70°C, bevorzugt 60 bis 65°C abgekühlt bzw. temperiert und anschließend mit Glucoamylase versetzt.

Sofern man die Verzuckerung im Fermenter durchführt, wird man die verflüssigte Stärkelösung in der Regel auf Fermentationstemperatur, d. h. 32 bis 37°C, abkühlen, bevor man sie dem Fermenter zuführt. Die Glucoamylase (bzw. das mindestens eine verzuckernde Enzym) zur Verzuckerung wird in diesem Fall der Fermentationsbrühe direkt zugesetzt. Die Verzuckerung der verflüssigten Stärke gemäß Schritt a2) erfolgt hierbei parallel zur Verstoffwechselung des Zuckers durch die Mikroorganismen.

Vorteilhafterweise wird vor Zugabe der Glucoamylase der pH-Wert des Flüssigmediums auf einen Wert im optimalen Wirkungsbereich der eingesetzten Glucoamylase, vorzugsweise im Bereich zwischen 3,5 und 6,0; besonders bevorzugt zwischen 4,0 und 5,5 und ganz besonders bevorzugt zwischen 4,0 und 5,0 eingestellt. Es ist jedoch auch möglich, insbesondere bei Durchführung der Verzuckerung direkt im Fermenter, den pH-Wert außerhalb der vorgenannten Bereiche einzustellen, z.B. im Bereich von 6,0 bis 8,0. Dies kann z.B. bei der Herstellung von Lysin, Panthothenat und Vitamin B2 trotz der eingeschränkten Aktivität von Standard-Glucoamylasen in diesem pH-Bereich insgesamt vorteilhaft oder aufgrund der einzustellenden Fermentationsbedingungen erforderlich sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verzuckerung in einem speziellen Verzuckerungstank. Dazu wird die verflüssigte Stärkelösung auf eine für das Enzym optimale Temperatur oder leicht darunter temperiert und der pH-Wert in der oben beschriebenen Weise auf einen für das Enzym optimalen Wert eingestellt.

Die Glucoamylase wird dem dextrinhaltigen Flüssigmedium üblicherweise in einer Menge von 0,001 bis 5,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,005 bis 3,0 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,01 bis 1,0 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle, zugesetzt. Nach Zugabe der Glucoamylase wird die dextrinhaltige Suspension vorzugsweise für einen Zeitraum von z.B. 2 bis 72 Stunden oder länger, sofern erforderlich, insbesondere von 5 bis 48 Stunden bei der eingestellten Temperatur gehalten, wobei die Dextrine zu Monosacchariden verzuckert werden. Der Fortschritt der Verzuckerung kann mit dem Fachmann bekannten Methoden, z.B. HPLC, Enzymtests oder Glucose-Teststäbchen, verfolgt werden. Die Verzuckerung ist abgeschlossen, wenn die Konzentration der Monosaccharide nicht mehr wesentlich ansteigt oder wieder fällt.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die diskontinuierliche oder kontinuierliche, bevorzugt die diskontinuierliche und insbesondere portionsweise Zugabe des Mahlguts in Gegenwart der mindestens einen &agr;-Amylase sowie der mindestens einen Glucoamylase im Schritt a2) derart, dass die Viskosität des Flüssigmediums maximal 20 Pas, bevorzugt maximal 10 Pas und besonders bevorzugt maximal 5 Pas beträgt. Zur Unterstützung der Viskositätskontrolle hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn mindestens 25 Gew.-%, bevorzugt mindestens 35 Gew.-% und besonders bevorzugt mindestens 50 Gew.-% der Gesamtmenge des zugegebenen Mahlguts bei einer Temperatur oberhalb der Gelatinierungstemperatur der im Mahlgut enthaltenen Stärke zugegeben werden. Die Kontrolle der Viskosität kann des Weiteren dadurch beeinflusst werden, dass das mindestens eine Stärke verflüssigende Enzym, vorzugsweise eine &agr;-Amylase, oder/und das mindestens eine verzuckernde Enzym, vorzugsweise eine Glucoamylase, selbst portionsweise zugegeben werden.

Durch Anwendung der Schritte a1) und a2) ist es möglich, das zuckerhaltige Flüssigmedium mit einem Monosaccharidgehalt von vorzugsweise mehr als 25 Gew.-%, z.B. mehr als 30 Gew.-% oder mehr als 35 Gew.-%, besonders bevorzugt mehr als 40 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt mehr als 45 Gew.-% herzustellen.

Zur Verflüssigung des Stärkeanteils im Mahlgut können grundsätzlich alle &agr;-Amylasen (Enzymklasse EC 3.2.1.1) eingesetzt werden, insbesondere &agr;-Amylasen, die aus Bacillus lichenformis oder Bacillus staerothermophilus gewonnen wurden und speziell solche, die zum Verflüssigen von durch Dry-Milling-Verfahren gewonnenen Materialien im Rahmen der Herstellung von Bioethanol verwendet werden. Die zum Verflüssigen geeigneten &agr;-Amylasen sind auch kommerziell erhältlich, beispielsweise von Novozymes unter der Bezeichnung Termamyl 120 L, Typ L; oder von Genencor unter der Bezeichnung Spezyme. Es kann auch eine Kombination verschiedener &agr;-Amylasen zur Verflüssigung eingesetzt werden.

Zur Verzuckerung der Dextrine (d.h. Oligosaccharide) in der verflüssigten Stärkelösung können grundsätzlich alle Glucoamylasen (Enzymklasse EC 3.2.1.3) eingesetzt werden, insbesondere Glucoamylasen, die aus Aspergilus gewonnen wurden und speziell solche, die zum Verzuckern von durch Dry-Milling-Verfahren gewonnenen Materialien im Rahmen der Herstellung von Bioethanol verwendet werden. Die zum Verzuckern geeigneten Glucoamylasen sind auch kommerziell erhältlich, beispielsweise von Novozymes unter der Bezeichnung Dextrozyme GA; oder von Genencor unter der Bezeichnung Optidex. Es kann auch eine Kombination verschiedener Glucoamylasen verwendet werden.

Zur Stabilisierung der eingesetzten Enzyme kann gegebenenfalls die Konzentration an Ca2+-Ionen, z.B. mit CaCl2, auf einen enzymspezifischen optimalen Wert eingestellt werden. Geeignete Konzentrationswerte können vom Fachmann in Routineexperimenten bestimmt werden. Wird z.B. Termamyl als &agr;-Amylase eingesetzt, so ist es vorteilhaft, eine Ca2+-Konzentration von z.B. 50 bis 100 ppm, bevorzugt 60 bis 80 ppm und besonders bevorzugt etwa 70 ppm im Flüssigmedium einzustellen.

Da zur Herstellung des zuckerhaltigen Flüssigmediums gemäß a1) die ganze Stärkequelle, d.h. das ganze Korn, vermahlen wird, umfasst diese auch die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle. Dies bedingt oftmals den Eintrag eines nicht zu vernachlässigenden Anteils an Phytat aus der Kornfrucht. Um die daraus resultierende inhibierende Wirkung zu vermeiden, wird vorteilhafterweise in Schritt a2) dem Flüssigmedium mindestens eine Phytase zugesetzt, bevor das zuckerhaltige Flüssigmedium dem Fermentationsschritt zugeführt wird.

Die Zugabe der Phytase kann vor, während oder nach der Verflüssigung oder der Verzuckerung erfolgen, sofern sie die jeweils erforderliche Hitzestabilität aufweist.

Es können beliebige Phytasen eingesetzt werden, soweit deren Aktivität unter den Reaktionsbedingungen jeweils höchstens unwesentlich eingeschränkt ist. Bevorzugt sind Phytasen mit einer Temperaturstabilität (T50) > 50°C und besonders bevorzugt > 60 °C.

Die Menge an Phytase beträgt üblicherweise 1 bis 10000 Units/kg Stärkequelle und insbesondere 10 bis 2000 Units/kg Stärkequelle.

Zur Erhöhung der Gesamtzuckerausbeute bzw. zur Gewinnung freier Aminosäuren können dem Reaktionsgemisch während der Herstellung des zuckerhaltigen Flüssigmediums außerdem weitere Enzyme, zum Beispiel Pullulanasen, Cellulasen, Hemicellulasen, Glucanasen, Xylanasen, Glucosidasen oder Proteasen, zugesetzt werden. Der Zusatz dieser Enzyme kann die Viskosität positiv beeinflussen, d.h. herabsetzen (z.B. durch Spaltung längerkettiger Glucane und/oder von (Arabino-)Xylanen), die Freisetzung metabolisierbarer Glucoside und die Freisetzung von (Rest-)Stärke bewirken. Der Einsatz von Proteasen hat analoge positive Effekte, wobei zusätzlich Aminosäuren als Wachstumsfaktoren für die Fermentation freigesetzt werden können.

Das zuckerhaltige Flüssigmedium kann vorteilhaft zur fermentativen Herstellung eines nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts verwendet werden. Dazu wird das in den Schritten a1) und a2) hergestellte zuckerhaltige Flüssigmedium einer Fermentation zugeführt. In der Fermentation werden die nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukte von den Mikroorganismen produziert. Die Durchführung des Fermentationsverfahrens kann in der Regel in der dem Fachmann bekannten üblichen Art und Weise erfolgen. Dabei liegt das Volumenverhältnis von zugeführtem zuckerhaltigen Flüssigmedium zu dem vorgelegten und die Mikroorganismen enthaltenden Flüssigmedium im Allgemeinen im Bereich von etwa 1:10 bis 10:1, z.B. bei etwa 1:2 oder etwa 2:1 und insbesondere bei etwa 1:1. Insbesondere über die Zufuhrgeschwindigkeit des zuckerhaltigen Flüssigmediums kann der Zuckergehalt in der Fermentationsbrühe reguliert werden. In der Regel wird man die Zufuhrgeschwindigkeit so einstellen, dass der Monosaccharidgehalt in der Fermentationsbrühe im Bereich von ≥ 0 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-% liegt; die Fermentation kann jedoch auch bei deutlich höheren Monosaccharidgehalten in der Fermentationsbrühe, z.B. etwa 10 bis 20 Gew.-%, durchgeführt werden.

Sofern die Verzuckerung und die Fermentation separat durchgeführt wird, kann das in Schritt a) erhaltene, zuckerhaltige Flüssigmedium vor der Fermentation gegebenenfalls sterilisiert werden, wobei man die Mikroorganismen durch thermische, chemische oder mechanische Verfahren abtötet. Hierbei heizt man die Brühe üblicherweise auf Temperaturen oberhalb 80°C auf. Die Abtötung bzw. Lyse der Zellen kann unmittelbar vor der Fermentation erfolgen. Hierzu wird die gesamte zuckerhaltige Flüssigmedium der Lyse bzw. Abtötung zugeführt. Diese kann thermisch, mechanisch oder chemisch erfolgen. Es hat sich jedoch im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens als nicht notwendig erwiesen, vor der Fermentation einen Sterilisierungsschritt wie hier beschrieben durchzuführen, sondern es hat sich vielmehr als vorteilhaft erwiesen, keinen solchen Sterilisierungsschritt durchzuführen. Dementsprechend betrifft eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren, bei dem das in Schritt a) (bzw. den Schritten a1) und a2)) erhaltene Flüssigmedium unmittelbar, d.h. ohne vorherige Sterilisation, der Fermentation zugeführt oder eine zumindest teilweise in-situ-Verzuckerung durchgeführt wird.

Bei der Fermentation resultiert ein Flüssigmedium, das neben dem gewünschten nicht-flüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukt im Wesentlichen die während der Fermentation erzeugte Biomasse, die nicht verstoffwechselten Bestandteile der verzuckerten Stärkelösung und insbesondere die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle, wie z.B. Fasern und nicht verwertete Zucker, sowie nicht verwertete Puffer- und Nährsalze enthält. Dieses Flüssigmedium wird in der vorliegenden Anmeldung auch als Fermentationsbrühe bezeichnet, wobei der Ausdruck Fermentationsbrühe auch das (zuckerhaltige) Flüssigmedium umfasst, bei dem eine erst teilweise oder unvollständige fermentative Umsetzung der darin enthaltenen Zucker, d.h. eine teilweise oder unvollständige mikrobielle Verstoffwechselung der Monosaccharide, erfolgt ist.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden unter nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukten Verbindungen verstanden, die sich im Allgemeinen auf destillativem Weg nicht unzersetzt aus der Fermentationsbrühe entfernen lassen. Diese Verbindungen weisen in der Regel einen Siedepunkt oberhalb des Siedepunktes von Wasser, häufig oberhalb 150°C und insbesondere oberhalb 200°C bei Normaldruck auf. In der Regel handelt es sich um Verbindungen, die bei Normalbedingungen (298 K, 101,3 kPa) in festem Zustand vorliegen.

Es ist jedoch auch möglich, das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung nicht-flüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte einzusetzen, die bei Normaldruck einen Schmelzpunkt unterhalb des Siedepunktes von Wasser oder/und eine ölige Konsistenz aufweisen. In diesem Fall ist in der Regel eine Kontrolle der maximalen Temperaturen während der Aufarbeitung, insbesondere während der Trocknung erforderlich. Vorteilhaft können diese Verbindungen auch dadurch hergestellt werden, dass man sie in quasi fester Form (pseudofester Form) auf Adsorbentien formuliert.

Zu diesem Zweck geeignete Adsorbentien sind z.B. Aktivkohlen, Aluminiumoxide, Kieselgele, Kieselsäure, Ton, Ruße, Zeolithe, anorganische Alkali- und Erdalkalimetallsalze wie Natrium-, Kalium-, Magnesium- und Calciumhydroxide, -carbonate, -silikate, -sulfate, -phosphate, insbesondere Magnesium- und Calciumsalze, z.B. Mg(OH)2, MgCO3, MgSiO4, CaSO4, CaCO3, Erdalkalimetalloxide, z.B. MgO und CaO, andere anorganische Phosphate und Sulfate, z.B. ZnSO4, Salze organischer Säuren, insbesondere deren Alkali- und Erdalkalimetallsalze und speziell deren Natrium- und Kaliumsalze, z.B. Natrium- und Kaliumacetat, -formiat, -hydrogenformiate und -citrat, sowie höhermolekulare organische Träger wie Kohlenhydrate, z.B. Zucker, gegebenenfalls modifizierte Stärken, Cellulose, Lignin, sowie allgemein die weiter unten im Zusammenhang mit der Produktformulierung genannten Trägermaterialien. In der Regel werden die genannten Trägermaterialien keine oder nur geringe Anteile, insbesondere lediglich Spuren an Halogenen wie Chloridionen und an Nitraten aufweisen.

Beispiele für Verbindungen, die vorteilhaft auf diese Weise durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden können, sind &ggr;-Linolensäure, Dihomo-&ggr;-Linolensäure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure, weiterhin Propionsäure, Milchsäure, Propandiol, Butanol und Aceton. Auch diese Verbindungen in pseudofester Formulierung werden im Sinne der vorliegenden Erfindung als nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukte in fester Form verstanden.

Der Begriff nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukte umfasst im Folgenden insbesondere organische, gegebenenfalls 1 oder mehrere, z.B. 1, 2, 3 oder 4 Hydroxylgruppen tragende Mono-, Di- und Tricarbonsäuren mit vorzugsweise 3 bis 10 C-Atomen, z.B. Weinsäure, Itaconsäure, Bernsteinsäure, Propionsäure, Milchsäure, 3-Hydroxypnopionsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, 2,5-Furandicarbonsäure, Glutarsäure, Lävulinsäure, Gluconsäure, Aconitsäure und Diaminopimelinsäure, Zitronensäure; proteinogene und nicht-proteinogene Aminosäuren, z.B. Lysin, Glutamat, Methionin, Phenylalanin, Asparaginsäure, Tryptophan und Threonin; Purin- und Pyrimidinbasen; Nukleoside und Nukleotide, z.B. Nikotinamidadenindinukleotid (NAD) und Adenosin-5'-monophosphat (AMP); Lipide; gesättigte und ungesättigte Fettsäuren mit vorzugsweise 10 bis 22 C-Atomen, z.B. &ggr;-Linolensäure, Dihomo-&ggr;-Linolensäure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure; Diole mit vorzugsweise 3 bis 8 C-Atomen, z.B. Propandiol und Butandiol; höherwertige Alkohole mit 3 oder mehr, z.B. 3, 4, 5 oder 6 OH-Gruppen, z.B. Glycerin, Sorbitol, Manitol, Xylitol und Arabinitol; längerkettige Alkohole mit wenigstens 4 C-Atomen, z.B. mit 4 bis 22 C-Atomen, z.B. Butanol; Kohlenhydrate, z.B. Hyaluronsäure und Trehalose; aromatische Verbindungen, z.B. aromatische Amine, Vanillin und Indigo; Vitamine und Provitamine, z.B. Ascorbinsäure, Vitamin B6, Vitamin B12 und Riboflavin, Cofaktoren und sogenannte Nutrazeutika; Proteine, z.B. Enzyme wie Amylasen, Pektinasen, saure, hybride oder neutrale Zellulasen, Esterasen wie Lipasen, Pankreasen, Proteasen, Xylanasen und Oxidoreduktasen wie Laccase, Katalase und Peroxidase, Glucanasen, Phytasen; Carotenoide, z.B. Lycopin, &bgr;-Carotin, Astaxanthin, Zeaxanthin und Canthaxanthin; Ketone mit vorzugsweise 3 bis 10 C-Atomen und gegebenenfalls 1 oder mehreren Hydroxylgruppen, z.B. Aceton und Acetoin; Lactone, z.B. &ggr;-Butyrolacton, Cyclodextrine, Biopolymere, z.B. Polyhydroxyacetat, Polyester, z.B. Polylactid, Polysaccharide, Polyisoprenoide, Polyamide; sowie Vorstufen und Derivate der vorgenannten Verbindungen. Weitere als nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukte in Frage kommende Verbindungen sind von Gutcho in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), ISBN: 0818805086 beschrieben.

Der Begriff "Cofaktor" umfasst nicht-proteinartige Verbindungen, die für das Auftreten einer normalen Enzymaktivität nötig sind. Diese Verbindungen können organisch oder anorganisch sein; die erfindungsgemäßen Cofaktor-Moleküle sind vorzugsweise organisch. Beispiele solcher Moleküle sind NAD und Nikotinamidadenindinukleotidphosphat (NADP); die Vorstufe dieser Cofaktoren ist Niacin.

Der Begriff "Nutrazeutikum" umfasst Nahrungsmittelzusätze, die bei Pflanzen und Tieren, insbesondere dem Menschen, gesundheitsfördernd sind. Beispiele solcher Moleküle sind Vitamine, Antioxidantien und bestimmte Lipide, z.B. mehrfach ungesättigte Fettsäuren.

Insbesondere sind die hergestellten Stoffwechselprodukte unter Enzymen, Aminosäuren, Vitaminen, Disacchariden, aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, aliphatischen Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen, Alkanolen mit 4 bis 10 C-Atomen und Alkandiolen mit 3 bis 10 und insbesondere 3 bis 8 C-Atomen ausgewählt.

Es versteht sich für den Fachmann, dass die erfindungsgemäß auf fermentativem Weg hergestellten Verbindungen jeweils in der von den eingesetzten Mikroorganismen produzierten Enantiomerenform erhalten werden (sofern unterschiedliche Enantiomere existieren). So erhält man z.B. von den Aminosäuren in der Regel das jeweilige L-Enantiomer.

Die in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen richten sich in an sich bekannter Weise nach den jeweiligen mikrobiellen Stoffwechselprodukten, wie unten im einzelnen erläutert. Sie können natürlichen Ursprungs oder genetisch modifiziert sein. Beispiele für geeignete Mikroorganismen und Fermentationsverfahren sind in der folgenden Tabelle A angegeben:

Bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens betreffen die Herstellung von Enzymen wie Phytasen, Xylanasen, Glucanasen; Aminosäuren wie Lysin, Methionin, Threonin; Vitaminen wie Pantothensäure und Riboflavin, Vorläufern und Folgeprodukten davon, sowie die Herstellung von den vorgenannten Mono-, Di- und Tricarbonsäuren, insbesondere aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen wie Propionsäure, Fumarsäure und Bernsteinsäure, aliphatischen Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen wie Milchsäure; von den vorgenannten längerkettigen Alkanolen, insbesondere Alkanolen mit 4 bis 10 C-Atomen wie Butanol; von den vorgenannten Diolen, insbesondere Alkandiolen mit 3 bis 10 und insbesondere 3 bis 8 C-Atomen wie Propandiol; von den vorgenannten Ketonen, insbesondere Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen wie Aceton; und von den vorgenannten Kohlehydraten und insbesondere Disacchariden wie Trehalose.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen daher ausgewählt unter natürlichen oder rekombinanten Mikroorganismen, die wenigstens eines der folgenden Stoffwechselprodukte produzieren: Enzyme wie Phytase, Xylanase, Glucanase; Aminosäuren wie Lysin, Threonin und Methionin; Vitamine wie Pantothensäure und Riboflavin; Vorläufer und/oder Folgeprodukte davon; Disaccharide wie Trehalose; aliphatische Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen wie Propionsäure, Fumarsäure und Bernsteinsäure; aliphatische Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen wie Milchsäure; Ketone mit 3 bis 10 C-Atomen wie Aceton; Alkanole mit 4 bis 10 C-Atomen wie Butanol; und Alkandiole mit 3 bis 8 C-Atomen wie Propandiol.

Insbesondere sind die Mikroorganismen ausgewählt unter den Gattungen Corynebacterium, Bacillus, Ashbya, Escherichia, Aspergillus, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Lactobacillus, Propionibacterium, Rhizopus und Clostridium, insbesondere unter Stämmen von Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii, Escherichia coli, Aspergillus niger oder Alcaligenes latus, Anaerobiospirillum succiniproducens, Actinobacillus succinogenes, Lactobacillus delbrückii, Lactobacillus leichmannii, Propionibacterium arabinosum, Propionibacterium schermanii, Propionibacterium freudenreichii, Clostridium propionicum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium acetobutlicum, Rhizopus arrhizus und Rhizopus oryzae.

In einer speziellen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Lysin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in Pfefferle et al., a.a.O. und US 3,708,395. Prinzipiell kommen sowohl eine kontinuierliche als auch eine diskontinuierliche (Batch oder Fed-Batch) Betriebsweise in Betracht, bevorzugt ist die Fed-Batch Betriebsweise.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Methionin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in WO 03/087386 und WO 03/100072.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Pantothensäure. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der WO 01/021772.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Riboflavin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in WO 01/011052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1186664 und Fujioka, K.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31(3), 44-48.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Fumarsäure. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in Rhodes et al, Production of Fumaric Acid in 20-L Fermentors, Applied Microbiology, 1962, 10 (1), 9-15.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um eine Phytase. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der WO 98/55599.

Vor der weiteren Verarbeitung der Fermentationsbrühe wird gegebenenfalls ein Sterilisierungsschritt in der oben beschriebenen Weise durchgeführt.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst vorteilhafterweise die folgenden drei aufeinander folgenden Verfahrensschritten a), b) und c):

  • a) Herstellung des zuckerhaltigen Flüssigmediums mit einem Monosaccharidgehalt von mehr als 20 Gew.-% gemäß den Schritten a1) und a2), wobei das zuckerhaltige Flüssigmedium auch nicht-stärkehaltige feste Bestandteile der Stärkequelle umfasst;
  • b) Einsatz des zuckerhaltigen Flüssigmediums in einer Fermentation zur Produktion des(der) nichtflüchtigen Stoffwechselprodukte(s); und
  • c) Gewinnung des(der) nichtflüchtigen Stoffwechselprodukts(-produkte) in fester Form zusammen mit wenigstens einem Teil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle aus der Fermentationsbrühe durch wenigstens teilweises Entfernen der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe.

Das in Schritt a) erhaltene zuckerhaltige Flüssigmedium, mit welchem in Schritt b) der die gewünschten Stoffwechselprodukte produzierende Mikroorganismenstamm kultiviert wird, enthält zumindest einen Teil oder die Gesamtmenge, in der Regel jedoch wenigstens 90 Gew.-% und speziell etwa 100 Gew.-% der in den vermahlenen Getreidekörnern enthaltenen nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile, entsprechend dem Ausmahlungsgrad. Bezogen auf die stärkehaltigen Bestandteile des Mahlguts beträgt der Anteil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium vorzugsweise wenigstens 10 Gew.-% und insbesondere wenigstens 25 Gew.-%, z.B. zwischen 25 und 75 Gew.-% und speziell zwischen 30 und 60 Gew.-%. Diese nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile werden zusammen mit dem zuckerhaltigen Flüssigmedium der Fermentation gemäß Schritt b) zugeführt und sind somit auch in der resultierenden Stoffwechselprodukt-haltigen Fermentationsbrühe vorhanden.

Sofern gewünscht, kann vor dem Entfernen der flüchtigen Bestandteile gemäß Schritt c) ein Teil, z.B. 5 bis 80 Gew.-% und insbesondere 30 bis 70 Gew.-%, der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe abgetrennt werden, z.B. mittels Zentrifugation oder Filtration. Gegebenenfalls wird man eine solche Vorabtrennung durchführen, um gröbere Feststoffpartikel, die keine oder nur geringe Anteile an nichtflüchtigem mikrobiellen Stoffwechselprodukt enthalten, zu entfernen. Zur Vorfiltration können dem Fachmann bekannte, übliche Verfahren, z.B. unter Verwendung grobmaschiger Siebe, Netze, Lochbleche, oder dergleichen angewendet werden. Gegebenenfalls kann eine Abtrennung grober Feststoffpartikel auch in einem Fliehkraftabscheider erfolgen. Die hierbei eingesetzten Apparaturen wie Dekanter, Zentrifugen, Sedikanter und Separatoren sind dem Fachmann ebenfalls bekannt.

Bevorzugt gewinnt man das wenigstens eine nichtflüchtige Stoffwechselprodukt in fester Form im Wesentlichen ohne vorherige Abtrennung fester Bestandteile zusammen mit der Gesamtheit aller festen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe.

Erfindungsgemäß erfolgt im Anschluss an die Fermentation, gegebenenfalls nach teilweiser Abtrennung der festen nicht-stärkehaltigen Bestandteile, die weitgehende Entfernung der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe. Weitgehend bedeutet, dass nach Entfernung der flüchtigen Bestandteile ein fester oder zumindest halbfester Rückstand verbleibt, der sich gegebenenfalls durch Zusatz von Feststoffen in ein festes Produkt überführen lässt. In der Regel bedeutet dies, die flüchtigen Bestandteile bis zu einem Restfeuchtegehalt von nicht mehr als 20 Gew.-%, häufig nicht mehr als 15 Gew.-% und insbesondere nicht mehr als 10 Gew.-%, zu entfernen. In der Regel wird man die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe vorteilhafterweise bis auf einen Restfeuchtigkeitsgehalt im Bereich von 0,2 bis 20 Gew.-%, bevorzugt 1 bis 15 Gew.-%, besonders bevorzugt 2 bis 10 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt 5 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das nach Trocknung ermittelte Gesamtgewicht der festen Bestandteile, aus der Fermentationsbrühe entfernen. Der Restfeuchtigkeitsgehalt kann durch übliche dem Fachmann bekannte Verfahren bestimmt werden, z.B. mittels Thermogravimetrie (Hemminger et al., Methoden der thermischen Analyse, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, 1989).

Die Gewinnung des(der) nichtflüchtigen Stoffwechselprodukts(-produkte) in fester Form aus der Fermentationsbrühe in Schritt c) kann, gegebenenfalls nach vorgenannter Vorabtrennung, in ein, zwei oder mehreren Stufen erfolgen, insbesondere in einem ein- oder zweistufigen Vorgehen. In der Regel wird mindestens eine, insbesondere die abschließende Stufe zur Gewinnung des Stoffwechselprodukts in fester Form einen Trocknungsschritt umfassen.

Bei der einstufigen Vorgehensweise wird man die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe, gegebenenfalls nach vorgenannter Vorabtrennung, entfernen, bis der gewünschte Restfeuchtigkeitsgehalt erreicht ist.

Bei der zwei- oder mehrstufigen Vorgehensweise wird man die Fermentationsbrühe, gegebenenfalls nach vorgenannter Vorabtrennung, zunächst aufkonzentrieren, z.B: mittels (Mikro-, Ultra-)Filtration oder thermisch durch Verdampfen eines Teils der flüchtigen Bestandteile. Der Anteil der flüchtigen Bestandteile, die in dieser Stufe entfernt werden beträgt in der Regel 10 bis 80 Gew.-% und insbesondere 20 bis 70 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe. In einer oder mehreren sich anschließenden Stufen werden die restlichen flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe entfernt, bis der gewünschte Restfeuchtigkeitsgehalt erreicht ist.

Erfindungsgemäß erfolgt das Entfernen der flüchtigen Bestandteile des Flüssigmediums im Wesentlichen ohne eine vorherige Abreicherung oder gar Isolierung des Wertprodukts. Folglich wird bei der Entfernung der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe das nichtflüchtige Stoffwechselprodukt im Wesentlichen nicht zusammen mit den flüchtigen Bestandteilen des Flüssigmediums entfernt, sondern verbleibt mit wenigstens einem Teil, üblicherweise mit der Hauptmenge und insbesodere mit der Gesamtmenge der sonstigen festen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe im so erhaltenen Rückstand. Erfindungsgemäß können aber auch – vorzugsweise geringe – Anteile des gewünschten nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts, in der Regel maximal 20 Gew.-%, z.B. 0,1 bis 20 Gew.-%, bevorzugt nicht mehr als 10, insbesondere nicht mehr als 5 Gew.-%, besonders bevorzugt maximal 2,5 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt maximal 1 Gew.-%, bezogen auf das Gesamttrockengewicht des Stoffwechselprodukts, beim Entfernen der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe zusammen mit diesen entfernt werden. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform verbleibt das gewünschte nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukt zu wenigstens 90 Gew.-%, insbesondere wenigstens 95 Gew.-%, speziell 99 Gew.-% und ganz speziell etwa 100 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamttrockengewicht des Stoffwechselprodukts, als Feststoff in Mischung mit dem nach Entfernen der flüchtigen Bestandteile erhaltenen Teil oder der Gesamtheit der festen Bestandteile des Fermentationsmediums.

Auf diese Weise erhält man einen festen oder halbfesten, z.B. pastösen Rückstand, welcher das nichtflüchtige Stoffwechselprodukt und die nichtflüchtigen, in der Regel festen nicht-stärkehaltigen Bestandteile der Stärkequelle oder zumindest große Teile davon, häufig wenigstens 90 Gew.-% oder die Gesamtmenge der festen nicht-strärkehaltigen Bestandteile enthält.

Durch Zugabe von Formulierungshilfsmitteln wie Träger- und Coatingmaterialien, Bindemitteln sowie anderer Additive können die Eigenschaften des getrockneten und zusammen mit den festen Bestandteilen der Fermentation vorliegenden Stoffwechselprodukts gezielt hinsichtlich verschiedener Parameter wie Wirkstoffgehalt, Korngröße, Partikelform, Neigung zum Stauben, Hygroskopizität, Stabilität, insbesondere Lagerstabilität, Farbe, Geruch, Fließverhalten, Agglomerationsneigung, elektrostatischer Aufladung, Licht- und Temperaturempfindlichkeit, mechanischer Stabilität und Redispergierbarkeit in an sich bekannter Weise konfektioniert werden.

Zu den üblicherweise verwendeten Formulierungshilfsmitteln gehören z.B. Bindemittel, Trägermaterialien, Puderungs-/Fließhilfsmittel, ferner Farbpigmente, Biozide, Dispergiermittel, Antischaummittel, viskositätsregulierende Mittel, Säuren, Laugen, Antioxidantien, Enzymstabilisatoren, Enzyminhibitoren, Adsorbate, Fette, Fettsäuren, Öle oder Mischungen hieraus. Derartige Formulierungshilfsmittel werden vorteilhaft insbesondere bei Anwendung von Formulierungs- und Trocknungsverfahren wie Sprüh-, Wirbelschicht- und Gefriertrocknung als Trocknungshilfsmittel eingesetzt.

Beispiele für Bindemittel sind Kohlenhydrate, insbesondere Zucker wie Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide, z.B. Dextrine, Trehalose, Glucose, Glucosesirup, Maltose, Saccharose, Fructose und Lactose; kolloidale Substanzen wie tierische Proteine, z.B. Gelatine, Casein, insbesondere Natriumcaseinat, pflanzliche Proteine, z.B. Sojaprotein, Erbsenprotein, Bohnenprotein, Lupin, Zein, Weizenprotein, Maisprotein und Reisprotein, synthetische Polymere, z.B. Polyethylenglykol, Polyvinylalkohol und insbesondere die Kollidon-Marken der Fa. BASF, gegebenenfalls modifizierte Biopolymere, z.B. Lignin, Chitin, Chitosan, Polylactid und modifizierte Stärken, z.B. Octenylsuccinatanhydrid (OSA); Gummen, z.B. Gummi acacia; Cellulosederivate, z.B. Methylcellulose, Ethylcellulose, (Hydroxyethyl)methylcellulose (HEMC), (Hydroxypropyl)methylcellulose (HPMC), Carboxymethylcellulose (CMC); Mehle, z.B. Maismehl, Weizenmehl, Roggenmehl, Gerstenmehl und Reismehl.

Beispiele für Trägermaterialien sind Kohlenhydrate, insbesondere die als Bindemittel vorgenannten Zucker sowie Stärken, z.B. aus Mais, Reis, Kartoffel, Weizen und Cassava; modifizierte Stärken, z.B. Octenylsuccinatanhydrid; Cellulose und mikrokristalline Cellulose; anorganische Mineralien oder Lehm, z.B. Ton, Kohle, Kieselgur, Kieselsäure, Talg und Kaolin; Gries, z.B. Weizengries, Kleie, z.B. Weizenkleie, die als Bindemittel vorgenannten Mehle; Salze wie Metallsalze, insbesondere Alkali- und Erdalkalimetallsalze organischer Säuren, z.B. Mg-, Ca-, Zn-, Na-, K-citrat, -acetat, -formiat und -hydrogenformiate, anorganische Salze, z.B. Mg-, Ca-, Zn-, Na-, K-sulfate, -carbonate, -silikate oder -phosphate; Erdalkalimetalloxide wie CaO und MgO; anorganische Pufferungsmittel wie Alkalimetallhydrogenphosphate, insbesondere Natrium- und Kaliumhydrogenphosphate, z.B. K2HPO4, KH2PO4 und Na2HPO4; sowie allgemein die im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Herstellung von Stoffwechselprodukten mit niedrigem Schmelzpunkt bzw. öliger Konsistenz genannten Adsorbentien.

Beispiele für Puderungsmittel bzw. Fließhilfsmittel sind Kieselgur, Kieselsäure, z.B. die Sipernat-Marken der Fa. Degussa; Ton, Kohle, Talg und Kaolin; die als Trägermaterialien vorgenannten Stärken, modifizierten Stärken, anorganischen Salze, Salze organischer Säuren und Pufferungsmittel; Cellulose und mikrokristalline Cellulose.

Hinsichtlich sonstiger Additive seien als Beispiele genannt Farbpigmente wie TiO2, Carotenoide und deren Derivate, Vitamin B2, Capsanthin, Lutein, Kryptoxanthin, Canthaxanthin, Astaxanthin, Tartrazin, Sunsetgelb FCF, Indigotin, Pflanzenkohle, Bixin, Eisenoxid; Biozide wie Natriumbenzoat, Sorbinsäure, (Erd-)Alkalimetallsorbate wie Natriumsorbat, Kaliumsorbat und Calciumsorbat, 4-Hydroxybenzoesäureethylester, Alkalimetallbisulfite wie Natriumbisulfit und Natriummetabisulfit, Ameisensäure, Formiate und insbesondere Alkalimetallformiate wie Natriumformiat, Formaldehyd, Natriumnitrat, Acetate und insbesondere (Erd-)Alkalimetallacetate wie Natrium- und Kaliumacetat, Essigsäure, Milchsäure, Propionsäure,; Dispergiermittel und viskositätsregulierende Mittel wie Alginate, Lecithin, 1,2-Propandiol, Agar-Agar, Carragen, Gummi Arabikum, Guargummi, Xanthangummi, Gellangummi, Cássia-Gum, Sorbit, Polyethylenglykol, Glycerin, Pektin, modifizierte Stärken, modifizierte Cellulosen (z.B: Methylcellulose, HPMC, Ethylcellulose, Carboxymethylcellulose), Mikrokristalline Cellulose, Mono- und Digylceride, Sucroseester; Antischaummittel wie vinylfunktionelle Siliconöle, z.B. SILOFOAM®SC 155 der Fa. Wacker Chemie, und Fettalkoholalkoxylate, z.B. Plurafac® der Fa. BASF AG; anorganische Säuren wie Phosphorsäuren, Salpetersäure, Salzsäure, Schwefelsäure; organische Säuren wie gesättigte und ungesättigte Mono- und Dicarbonsäuren, z.B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure, Maleinsäure und Fumarsäure; Laugen wie Alkalimetallhydroxide, z.B. NaOH und KOH; Antioxidantien wie Vitamin C, 3 tert-Butyl-4-hydroxyanisole (BHA), 3,5-Ditertiär-4-hydroxytoluol (BHT), 6-Ethoxy-1,2-dihydroxy-2,2,4-trimenthylchinolin (Ethoxyquine); Enzymstabilisatoren wie Caliclimsalze, Zinksalze wie Zinksulfat, Magnesiumsalze wie Magnesiumsulfat, Aminosäuren; Enzyminhibitoren wie Pepstatin A oder Guanidin*HCl; Adsorbate wie Kieselsäure, Siliziumoxid, Zucker oder Salze; Fette wie Glyceride, z.B. Mono-, Di und Trigylceride; Fettsäuren wie Stearinsäure; Öle wie Sonnenblumenöl, Maiskernöl, Soyaöl und Palmöl.

Der Anteil an den vorgenannten Zusatzstoffen und gegebenenfalls weiteren Zusatzstoffen wie Coatingmaterialien kann je nach den speziellen Erfordernissen des jeweiligen Stoffwechselprodukts sowie in Abhängigkeit von den Eigenschaften der eingesetzten Zusatzstoffe stark variieren und z.B. im Bereich von 0,1 bis 80 Gew.-% und insbesondere im Bereich von 1 bis 30 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des fertig formulierten Produkts bzw. Stoffgemischs, liegen.

Die Zugabe von Formulierungshilfsmitteln kann vor, während oder nach der Aufarbeitung der Fermentationsbrühe (auch als Produktformulierung oder Feststoffdesign bezeichnet) und insbesondere während der Trocknung erfolgen. Eine Zugabe von Formulierungshilfsmitteln vor Aufarbeitung der Fermentationsbrühe bzw. des Stoffwechselprodukts kann insbesondere vorteilhaft sein, um die Prozessierbarkeit der aufzuarbeitenden Stoffe bzw. Produkte zu verbessern. Die Formulierungshilfsmittel können sowohl dem in fester Form erhaltenen Stoffwechselprodukt als auch einer dieses enthaltenden Lösung oder Suspension zugegeben werden, z.B. nach abgeschlossener Fermentation direkt zu der Fermentationsbrühe oder zu einer im Verlauf der Aufarbeitung erhaltenen Lösung oder Suspension vor dem abschließenden Trocknungsschritt.

So können die Hilfsstoffe z.B. in eine Suspension des mikrobiellen Stoffwechselprodukts eingemischt werden; eine solche Suspension kann auch auf ein Trägermaterial gegeben werden, z.B. durch Aufsprühen oder Untermischen. Die Zugabe von Formulierungshilfsstoffen während der Trocknung kann z.B. eine Rolle spielen, wenn eine das Stoffwechselprodukt enthaltende Lösung oder Suspension versprüht wird. Insbesondere nach der Trocknung erfolgt eine Zugabe von Formulierungshilfsmitteln z.B. beim Aufbringen von Überzügen bzw. Coatings/Coatingschichten auf getrocknete Partikel. Sowohl nach dem Trocknen als auch nach einem eventuellen Coatingschritt können dem Produkt weitere Hilfsmittel zugegeben werden.

Das Entfernen der flüchtigen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe erfolgt in an sich bekannter Weise durch übliche Verfahren zur Abtrennung fester Phasen von flüssigen Phasen, einschließlich Filtrationsverfahren und Verfahren zum Verdampfen flüchtiger Bestandteile der flüssigen Phasen. Derartige Verfahren, die auch Schritte zur Grobreinigung der Wertstoffe sowie Schritte zur Konfektionierung umfassen können, werden z.B. in Belter, P. A, Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Sons (1988), und Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5. Aufl. auf CD-ROM, Wiley-VCH, beschrieben. Im Rahmen der Produktformulierung bzw. der Aufarbeitung nach abgeschlossener Fermentation anwendbare, dem Fachmann bekannte Verfahren, Apparaturen, Hilfsstoffe bzw. allgemeine und spezielle Ausführungsformen sind ferner in EP 1038 527, EP 0648 076, EP 835613, EP 0219 276, EP 0394 022, EP 0547 422, EP 1088 486, WO 98/55599, EP 0758 018 und WO 92/12645 beschrieben.

In einer ersten Ausführungsform der Abtrennung der flüchtigen Bestandteile von dem Wertprodukt und den nicht-stärkehaligen Festen Bestandteilen der Fermentationsbrühe wird man das nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukt, sofern es in der flüssigen Phase gelöst vorliegt, aus der flüssigen Phase in die feste Phase überführen, z.B. durch Kristallisation oder Fällung. Anschließend erfolgt eine Abtrennung der nichtflüchtigen festen Bestandteile einschließlich des Stoffwechselprodukts, z.B. mittels Zentrifugation, Dekantieren oder Filtration. In ähnlicher Weise kann man auch ölige Stoffwechselprodukte abtrennen, wobei man die jeweiligen öligen Fermentationsprodukte durch Zusatz von Adsorbentien, z.B. Kieselsäure, Kieselgele, Lehm, Ton und Aktivkohle, in eine feste Form überführt.

Die Fällung der mikrobiellen Stoffwechselprodukte kann in an sich bekannter Weise erfolgen (siehe z.B. J. W. Mullin: Crystallization, 3. Aufl., Butterworth-Heinemann, Oxford 1993). Die Fällung kann beispielsweise durch Zugabe eines weiteren Lösungsmittels, Zugabe von Salzen und die Variation der Temperatur bewirkt werden. Der entstehende Niederschlag kann, zusammen mit den übrigen festen Bestandteilen, durch die hier beschriebenen üblichen Verfahren zur Abtrennung von Feststoffen von der Brühe separiert werden.

Die Kristallisation von mikrobiellen Stoffwechselprodukten kann ebenfalls in üblicher Weise durchgeführt werden. Übliche Kristallisations-Verfahren sind z.B. in Janeic, S.J., Grootscholten, P.A., Industrial Crystallization, New York, Academic, 1984; A. W. Bamforth: Industrial Crystallization, Leonard Hill, London 1965; G. Matz: Kristallisation, 2. Aufl., Springer Verlag, Berlin 1969; J. Nývlt: Industrial Crystallization – State of the Art. VCH Verlagsges., Weinheim 1982; S. J. Jancic', P. A. M. Grootscholten: Industrial Crystallization, Reidel, Dordecht 1984; O. Söhnel, J. Garside: Precipitation, Butterworth-Heinemann, Oxford, 1992; A. S. Myerson (Hg.): Handbook of Industrial Crystallization, Butterworth-Heineman, Boston 1993; J. W. Mullin: Crystallization, 3. Aufl., Butterworth-Heinemann, Oxford 1993; A. Mersmann (Hg.): Crystallization Technology Handbook, Marcel Dekker, New York 1995 beschrieben. Eine Kristallisation kann z.B. durch Kühlung, Verdampfung, Vakuumkristallisation (adiabate Kühlung), Reaktionskristallisation oder Aussalzen initiiert werden. Die Kristallisation kann z.B. in gerührten und ungerührten Kesseln, im Direkt-Kontakt-Verfahren, in Verdampfungskristallisatoren (R. K. Multer, Chem Eng. (N.Y.) 89 (1982) March, 87-89), in Vakuumkristallisatoren absatzweise oder kontinuierlich, z.B. in Zwangsumlauf-Kristallisatoren (Swenson forcedcirculation crystaller) oder Wirbelschicht-Kristallisatoren (Oslo-type) (A. D. Randolph, M. A. Larson: Theory of Particulate Processes, 2. Aufl. Academic Press, New York 1988; J. Robinson, J. E. Roberts, Can. J. Chem. Eng. 35 (1957) 105-112; J. Nývlt: Design of Crystallizers, CRC Press, Boca Raton, 1992) durchgeführt werden. Auch fraktionierte Kristallisation ist möglich (L. Gordon, M. L. Salutsky, H. H. Willard: Precipitation from Homogeneous Solution, Wiley-Interscience, New York 1959). Ebenso können Enantiomere und Racemate getrennt werden (J. Jacques, A. Collet, S. H. Willen: Enantiomers, Racemates and Resolutions, Wiley, New York 1981; R. A. Sheldon: Chirotechnology, Marcel Dekker, New York 1993; A. N. Collins, G. N. Sheldrake, J. Crosby (Hg.): Chirality in Industry, Wiley, New York 1985).

Übliche Filtrations-Verfahren sind z.B. die Kuchen- und Tiefenfiltration (z.B. beschrieben in A. Rushton, A. S. Ward, R. G. Holdich: Solid – Liquid Filtration and Separation Technology, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim 1996, pp. 177ff., K. J. Ives, in A. Rushton (Hg.): Mathematical Models and Design Methods in Solid-Liquid Separation, NATO ASI series E Nr. 88, Martinus Nijhoff, Dordrecht 1985, pp. 90ff.) und Cross-flow-Filtrationen, insbesondere die Mikrofiltration zur Abtrennung von Feststoffen > 0,1 &mgr;m (z.B. beschrieben in J. Altmann, S. Ripperger, J. Membrane Sci. 124 (1997) 119 – 128.).

Bei der Mikro- und Ultrafiltration können z.B. mikroporöse (A. S. Michaels: "Ultrafiltration," in E. S. Perry (ed.): Progress in Separation and Purification, vol. 1, Interscience Publ., New York 1968.), homogene (J. Crank, G. S. Park (eds.): Diffusion in Polymers, Academic Press, New York 1968; S. A. Stern: "The Separation of Gases by Selective Permeation," in P. Meares (ed.): Membrane Separation Processes, Elsevier, Amsterdam 1976.), asymetrische (R. E. Kesting: Synthetic Polymeric Membranes, A Structural Perspective, Wiley-Interscience, New York 1985.) und elektrisch geladene (F. Helfferich: Ion-Exchange, McGraw-Hill, London 1962.) Membranen eingesetzt werden, die nach verschiedenen Verfahren erzeugt werden (R. Zsigmondy, US 1 421 341, 1922; D. B. Pall, US 4 340 479, 1982; S. Loeb, S. Sourirajan, US 3 133 132, 1964.). Typische Werkstoffe sind Celluloseester, Nylon, Polyvinylchlorid, Acrylnitril, Polypropylen, Polycarbonat und Keramik. Der Einsatz dieser Membranen erfolgt als Plattenmodul (R. F. Madsen, Hyperfiltration and Ultrafiltration in Plate-and-Frame Systems, Elsevier, Amsterdam 1977), Spiralmodul (US 3 417 870, 1968 (D. T. Bray)), Rohrbündel bzw. Hohlfasermodul (H. Strathmann: "Synthetic Membranes and their Preparation," in M. C. Porter (ed.): Handbook of Industrial Membrane Technology, Noyes Publication, Park Ridge, NJ 1990, pp. 1 – 60). Daneben ist die Verwendung flüssiger Membranen möglich (N. N. Li: "Permeation Through Liquid Surfactant Membranes," AlChE J. 17 (1971) 459; S. G. Kimura, S. L. Matson, W. J. Ward III: "Industrial Applications of Facilitated Transport," in N. N. Li (ed.): Recent Developments in Separation Science, Bd. V, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1979, pp. 11-25). Die gewünschten Stoffe können sowohl feedseitig angereichert und über den Retentatstrom abgeführt als auch feedseitig abgereichert und über den Filtrat/Permeatstrom abgeführt werden.

Übliche Zentrifugations-Verfahren sind z.B. in G. Hultsch, H. Wilkesmann, "Filtering Centrifuges," in D.B. Purchas, Solid – Liquid Separation, Upland Press, Croydon 1977, pp. 493 – 559; und H. Trawinski, Die äquivalente Klärfläche von Zentrifugen, Chem. Ztg. 83 (1959) 606-612 beschrieben. Verschiedene Bauformen wie Röhren- und Korbzentrifugen sowie im speziellen Schub-, Stülpfilterzentrifugen und Tellerseparatoren können eingesetzt werden.

In dem Verfahren gemäße dieser ersten Ausführungsform kann sich gegebenenfalls der Abtrennung der festen von der Flüssigen Phase ein Trocknungsschritt anschließen, der in üblicher Weise durchgeführt wird. Übliche Verfahren zur Trocknung sind z.B. in O. Krischer, W. Kast: Die wissenschaftlichen Grundlagen der Trocknungstechnik, 3. Aufl., Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1978; R. B. Keey: Drying: Principles and Practice, Pergamon Press, Oxford 1972; K. Kröll: Trockner und Trocknungsverfahren, 2. Aufl., Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1978; Williams-Gardener, A.: Industrial Drying, Houston, Gulf, 1977; K. Kröll, W. Kast: Trocknen und Trockner in der Produktion, Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1989 beschrieben. Zu den Beispielen für Trocknungsverhafen zählen Verfahren zur Konvektionstrocknung, z.B. in einem Trockenofen, Tunneltrockner, Bandtrockner, Scheibentrockner, Jettrockner, Wirbelschichttrockner, belüftete sowie rotierende Trommeltrockner, Sprühtrockner, Stromtrockner, Zyklontrockner, Mischertrockner, Pasten-Mahltrockner, Mahltrockner, Ringtrockner, Schachttrockner, Drehrohrtrockner, Karusseltrockner. Weitere Verfahren nutzen die Kontakttrocknung, z.B. Schaufeltrockner; Vakuum- bzw. Gefriertrocknung, Konustrockner, Nutschtrockner, Scheibentrockner, Dünnschicht-Kontakttrockner, Walzentrockner, Zähphasen-Trockner, tellertrockner, Wendelfördertrockner, Doppelkonustrockner; oder Wärmestrahlung (Infrarot, z.B. Infrarot-Drehrohrtrockner) oder dielektrische Energie (Mikrowellen) zur Trocknung. Die für thermische Trocknungsverfahren verwendeten Trocknungsapparate werden meist durch Dampf, Öl, Gas oder elektrischen Strom beheizt und können, je nach Auslegung, zum Teil unter Vakuum betrieben werden.

In einer zweiten Ausführungsform der Abtrennung der flüchtigen Bestandteile von dem Wertprodukt und den nicht-stärkehaligen festen Bestandteilen der Fermentationsbrühe werden die flüchtigen Bestandteile, ggf. nach einem zuvor beschriebenen Vorabtrennungsschritt fester Bestandteile, durch Verdampfen entfernt. Das Verdampfen kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Beispiele für geeignete Verfahren zum Verdampfen flüchtiger Bestandteile sind die Sprühtrocknung, Wirbelschichttrocknung bzw. -agglomeration, Gefriertrocknung, Strom- und Kontakttrocknern sowie Extrusionstrocknung. Auch eine Kombination der vorgenannten Verfahren mit formgebende Verfahren wie Extrusion, Pelletierung oder Prilling kann vorgenommen werden. Beii diesen letztgenannten Verfahren werden vorzugtsweise teilweise oder weitgehend vorgetrocknete Stoffwechselprodukt-haltige Stoffgemische eingesetzt.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Entfernen der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe ein Verfahren zur Sprühtrocknung oder ein Verfahren der Wirbelschichttrocknung, einschließlich der Wirbelschichtgranulierung. Hierzu wird die Fermentationsbrühe, gegebenenfalls nach einer Vorabtrennung zur Entfernung grober Feststoffpartikel, die keine oder nur geringe Anteile an nichtflüchtigem mikrobiellen Stoffwechselprodukt enthalten, einer oder mehreren Sprüh- oder Wirbelschichttrocknungsapparaturen zugeführt. Der Transport bzw. die Zuführung der feststoffbeladenen Fermentationsbrühe erfolgt zweckmäßigerweise mittels üblicher Transportvorrichtungen für feststoffhaltige Flüssigkeiten, z.B. Pumpen wie Exzenterschneckenpumpen (z.B. der Fa. Delasco PCM) oder Hochdruckpumpen (z.B. der Fa. LEWA Herbert Ott GmbH).

Als Sprühtrocknungsvorrichtungen können alle herkömmlichen im Fachgebiet bekannten Sprühtrocknungsapparaturen zum Einsatz kommen, wie z.B. in der oben zitierten Literatur beschrieben, insbesondere Düsentürme, speziell mit Druckdüsen, und Scheibentürme; Sprühtrockner mit integriertem Wirbelbett und Wirbelschicht-Sprühgranulatoren werden vorzugsweise in der unten beschriebenen Ausführungsform unter Einsatz von Wirbelschicht-Trocknung eingesetzt.

Für die Trocknung mittels Sprühtrocknung, sind insbesondere Anlagen geeignet, in denen die feststoffbeladene Fermentationsbrühe im Gleich- oder Gegenstrom, bevorzugt im Gegenstrom getrocknet wird. Dabei wird die Fermentationsbrühe vorteilhafterweise am Kopf eines vertikal ausgerichteten Sprühturms durch eine Düse oder über eine rotierende Scheibe in diesen eingeleitet und gleichzeitig zerstäubt, während der zur Trocknung eingesetzte Gasstrom, z.B. Luft oder Stickstoff, im oberen bzw. unteren Bereich des Sprühturms in diesen eingeleitet wird. Die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe werden über den unteren Auslass bzw. den Kopf des Sprühturms ausgetragen, während die nichtflüchtigen bzw. festen Bestandteile einschließlich des gewünschten mikrobiellen Stoffwechselprodukts als im Wesentlichen trockenes Pulver unten ausgetragen bzw. dem Sprühturm entnommen und der Weiterverarbeitung zugeführt werden können.

Die gewünschte Restfeuchte der Produkte muss jedoch nicht bereits in diesem einen Trocknungsschritt erreicht werden, sondern kann in einem anschließenden weiteren Trocknungsschritt eingestellt werden. Hierzu kann z.B. eine Wirbelschichtrocknung an die Sprühtrocknung angeschlossen werden. Die Abluft des Sprühturms und/oder der Wirbelschicht wird vorteilhafterweise von mitgerissenen Partikeln bzw. Staub mittels Zyklon und/oder Filter befreit und zur Weiterverarbeitung aufgefangen; die flüchtigen Bestandteile können dann gegebenenfalls z.B. in einer Kondensationseinheit aufgefangen und weiter verwendet werden, z.B. als rückgeführtes Prozesswasser.

Bei Auslegung und Betrieb der verwendeten Apparatur wird ein Fachmann den teilweise erheblichen Feststoffanteil in der Fermentationsbrühe entsprechend berücksichtigen. So sind insbesondere die Innendurchmesser und/oder Austrittsöffnungen eingesetzter Sprühdüsen so auszuwählen, dass die Neigung zu Verstopfung oder Verblockung möglichst gering gehalten bzw. eliminiert wird. Eine angemessene Größe der Austrittsöffnungen bzw. des Innendurchmessers wird in der Regel bei mindestens 0,4 mm, bevorzugt mindestens 1 mm und üblicherweise, in Abhängigkeit von den Eigenschaften der Fermentationsbrühe und der darin enthaltenen Stoffe, vom Druck und von dem gewünschten Durchsatz, im Bereich von 0,6 bis 5 mm liegen.

Der zur Trocknung eingesetzte Gasstrom weist üblicherweise eine Temperatur oberhalb der Siedetemperatur der wässrigen Fermentationsbrühe bei dem gewünschten Druck auf, z.B. im Bereich von 110 bis 300°C, insbesondere von 120 bis 250°C und speziell 130 bis 220°C. Ein Erwärmen des wässrigen Fermentationsmediums auf eine Temperatur unterhalb seines Siedepunktes, z.B. im Bereich von 25 bis 85°C und insbesondere von 30 bis 70°C, ist ebenfalls möglich, um den Trocknungsprozess zu unterstützen. Ebenfalls möglich ist eine Überhitzung des wässrigen Fermentationsmediums über vorzugsweise 100°C, wobei das Flüssigmedium soweit erhitzt wird, dass es vor der Düse unter dem gewählten Druck noch nicht siedet und nach Entspannung durch die Düse eine spontane Verdampfung eintritt.

Die Fermentationsbrühe kann vor Einleitung in den Sprühturm zusätzlich mit einem gegebenenfalls vorgeheizten, z.B. auf eine Temperatur im Bereich von 30 bis 90°C, Gasstrom, z.B. Luft oder Stickstoff, vermischt werden. Bei Verwendung von Zweistoffstatt Einstoffdüsen kann diese Vermischung direkt vor Eintritt in den eigentlichen Trocknungsraum des Sprühturms erfolgen.

Bei der Auswahl der Temperaturen ist in jedem Fall die Hitzestabilität bzw. Siedetemperatur des jeweils gewünschten mikrobiellen Stoffwechselprodukts zu berücksichtigen. In der Regel ist es zweckmäßig, die Temperatur des zur Trocknung verwendeten Gasstroms auf eine Temperatur einzustellen, die um mindestens 20°C und bevorzugt mindestens 50°C unterhalb der Siede- oder Zersetzungstemperatur des betreffenden nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts liegt. Dabei ist zu berücksichtigen, dass die Temperatur des Trockenguts z.T. deutlich unter der Temperatur des zugeführten Gasstroms liegen kann, solange noch nicht alle flüchtigen Bestandteile abgedampft wurden. Insofern wird die Temperatur des Trockengutes auch über die Einstellung der Verweilzeit beeinflusst. Der Trocknungsvorgang kann daher, zumindest zeitweise, mit Zulufttemperaturen durchgeführt werden, die im Bereich des Siedepunktes der zu trocknenden Stoffwechselprodukte oder darüber liegen. Die geeigneten Temperaturbedingungen kann der Fachmann durch Routineexperimente ermitteln.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform führt man die Trocknung in einem vertikal ausgerichteten Sprühturm, der im Gleich- oder Gegenstrom, bevorzugt im Gegenstrom betrieben wird, durch. Die Einleitung der auf Raumtemperatur abgekühlten oder noch bei der Fermentationstemperatur oder darunter befindlichen, z.B. zwischen 18°C und 37°C, feststoffbeladenen Fermentationsbrühe erfolgt am Kopf des Sprühturms über eine oder mehrere, z.B. 1, 2, 3 oder 4, insbesondere 1 oder 2 Sprühdüsen. In den oberen bzw. unteren Bereich des Sprühturms leitet man den zur Trocknung vorgesehenen heißen Gasstrom, vorzugsweise Luft, ein. Das erhaltene Pulver wird am unteren Ende bzw. am Kopf des Sprühturms entnommen. Sofern gewünscht, kann hieran eine Wirbelschichttrocknung angeschlossen werden.

Die mittlere Teilchengröße der erhaltenen Pulver wird entscheidend durch den erreichten Grad an Zerstäubung bei Einleitung der feststoffbeladenen Fermentationsbrühe in den Sprühturm bestimmt. Der Zerstäubungsgrad hängt seinerseits vom aufgewendeten Druck an den Sprühdüsen bzw. der Rotationsgeschwindigkeit der rotierenden Scheibe ab. Der an den Sprühdüsen angelegte Druck liegt üblicherweise im Bereich von 5 bis 200 bar, z.B. bei etwa 10 bis 100 bar und insbesondere bei etwa 20 bis 60 bar, über Normaldruck. Die Rotationsgeschwindigkeit der rotierenden Scheibe liegt üblicherweise im Bereich von 5000 bis 30000 Upm. Die Durchsatzgeschwindigkeit des zur Trocknung eingeleiteten Gasstroms ist sehr stark vom Durchsatz des Flüssigmediums abhängig. Bei niedrigem Durchsatz an Flüssigmedium (z.B. im Bereich von 10 bis 1000 l/h) liegt sie üblicherweise im Bereich von 100 bis 10000 m3/h, bei höherem Durchsatz (z.B. im Bereich von 1000 bis 50000 l/h) üblicherweise im Bereich von 10000 bis 10000000 m3/h.

Gegebenenfalls können im Fachgebiet bekannte übliche Hilfsmittel zur Sprühtrocknung mit verwendet werden. Diese vermindern oder verhindern eine Agglomeration der im Sprühturm gebildeten primären Pulverteilchen, so dass die Eigenschaften der dem Sprühturm entnommenen Pulver gezielt beeinflusst werden können, z.B. bezüglich der Teilchengrößen, im Sinne eines verbesserten Trockengrades, einer verbesserten Rieselfähigkeit und/oder besseren Redispergierbarkeit in Lösungsmitteln wie Wasser. Als Beispiele üblicher Sprühhilfsmittel seien die oben erwähnten Formulierungshilfsmittel genannt. Diese werden in den üblicherweise verwendeten Mengen, z.B. im Bereich von 0,1 bis 50 Gew.-%, insbesondere 0,1 bis 30 Gew.-% und speziell 0,1 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamttrockengewicht der nichtflüchtigen festen Bestandteile der Fermentationsbrühe, eingesetzt.

Die im Einzelfall zweckmäßigerweise zu wählende Auslegung der jeweiligen Apparatur, insbesondere die Abmessungen der eingesetzten Sprühdüsen und die geeigneten Betriebsparameter, kann der Fachmann ohne Weiteres durch Routineexperimente ermitteln.

In einer weiteren Ausgestaltung der zweiten Ausführungsform erfolgt das Entfernen der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe unter Einsatz von Verfahren zur Wirbelschichttrocknung. Hierbei gelten die oben für den Einsatz von Verfahren zur Sprühtrocknung gemachten Angaben in analoger Weise, z.B. zum Transport der feststoffhaltigen Fermentationsbrühe, zur Auslegung der Apparaturen und zur Auswahl der Betriebsparameter, insbesondere der Betriebstemperatur. Als Wirbelschicht-Trocknungsvorrichtungen können alle herkömmlichen im Fachgebiet bekannten Wirbelschichttrockner, insbesondere Sprühtrockner mit integriertem Wirbelbett und Wirbelschicht-Sprühgranulatoren, z.B. der Firmen Allgaier, DMR, Glatt, Heinen, Hüttlin, Niro und Waldner, zum Einsatz kommen.

Wirbelschichttrockner können kontinuierlich oder batchweise betrieben werden. Beim kontinuierlichen Betrieb beträgt die Verweilzeit im Trockner mehrere Minuten bis zu mehreren Stunden. Der Apparat ist deshalb auch zur Langzeit-Trocknung, z.B. über einen Zeitraum von etwa 1 h bis 15 h geeignet. Wenn eine enge Verweilzeitverteilung gewünscht ist, kann die Wirbelschicht durch Trennbleche kaskadiert werden oder der Produktfluss durch meanderförmige Einbauten einer idealen Kolbenströmung angenähert werden. Insbesondere größere Trockner werden in mehrere Trocknungszonen, z.B. 2 bis 10 und insbesondere 2 bis 5 unterteilt, die mit unterschiedlicher Gasgeschwindigkeit und -temperatur betrieben werden. Die letzte Zone kann dann als Kühlzone genutzt werden; in diesem Fall wird üblicherweise eine Zulufttemperatur im Bereich von 10 bis 40°C eingestellt.

Im Aufgabebereich des Feuchtguts ist darauf zu achten, dass keine Verklumpungen auftreten. Dies kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden, z.B. durch eine lokal höhere Gasgeschwindigkeit oder Einsatz eines Rührwerks. Bei kleineren Anlagen oder zwecks leichter Reinigung der Anlage können die Filter zur Abgasreinigung in den Wirbelschichttrockner integriert werden.

Bei den batchweise betriebenen Wirbelschichttrocknern liegt die Verweilzeit ebenfalls zwischen mehreren Minuten und Stunden. Auch diese Apparate sind zur Langzeit-Trocknung geeignet.

Wirbelschichttrockner können vibriert betrieben werden, wobei die Vibration den Produkttransport bei niedrigen Gasgeschwindigkeiten (d.h. unterhalb der Minimalfluidisations-Geschwindigkeit) und niedriger Schichthöhe unterstützt und Verklumpungen verhindern kann. Neben der Vibration kann auch eine gepulste Gaszufuhr zur Reduzierung des Verbrauchs an Trocknungsgas angewendet werden. Das Feuchtgut wird im aufwärts gerichteten, heißen Gasstrom turbulent vermischt und trocknet dadurch bei hohen Wärme- und Stoffübergangskoeffizienten. Die erforderliche Gasgeschwindigkeit hängt im Wesentlichen von der Partikelgöße und -dichte ab. Beispielsweise können für Partikel mit Durchmessern von mehreren hundert Mikrometern Gasleerrohrgeschwindigkeiten im Bereich von 1 bis 10 m/s erforderlich sein. Ein perforierter Boden (Lochblech, Conidur-Blech, Böden aus Gewebe oder Sintermetall) verhindert das Durchfallen des Feststoffs in den Heißgas-Raum. Die Wärmezufuhr erfolgt entweder nur über das Trocknungsgas oder es werden zusätzlich Wärmetauscher (Rohrbündel oder Platten) in die Wirbelschicht eingebracht (K. Masters: Spray Drying Handbook, Longman Scientific & Technical 1991; Arun S. Mujumdar, Handbook of Industrial Drying, Marcel Dekker, Inc. 1995).

Im Übrigen gilt für die Wirbelschichttrocknung das für die Sprühtrocknung Gesagte in analoger Weise, z.B. hinsichtlich des Zusatzes von Trocknungshilfsmitteln und der dadurch möglichen Beeinflussung der Produkteigenschaften.

Im Fall öliger Stoffwechselprodukte kann eine Trocknung unter Einsatz eines Wirbelschichtapparats oder eines Mischers z.B. derart vorgenommen werden, dass man ein Adsorptionmittel in dem Wirbelschichtapparat oder Mischer vorlegt und durchmischt bzw. fluidisiert. Die Fermentationsbrühe mit den öligen Stoffwechselprodukten wird hierbei auf das Adsorptionsmittel aufgesprüht. Die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe können dann durch Energieeintrag in den Mischer abgedampft werden oder werden durch den erhitzten Luftstrom in der Wirbelschicht verdunstet.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Entfernen der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe unter Einsatz von Verfahren zur Gefriertrocknung. Dabei wird die feststoffhaltige Fermentationsbrühe vollständig eingefroren und die gefrorenen flüchtigen Bestandteile aus dem festen Zustand verdampft, d.h. sublimiert (Georg-Wilhelm Oetjen, Gefriertrocknen, VCH 1997). Als Gefriertrocknungsvorrichtungen können alle herkömmlichen im Fachgebiet bekannten Gefriertrockner, z.B. der Firmen Klein Vakuumtechnik und Christ, zum Einsatz kommen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Entfernen der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe unter Einsatz von Stromtrocknern. Dabei wird die feststoffhaltige Fermentationsbrühe in den unteren Teil eines vertikal stehenden Trocknungsrohrs gegeben. Das Trocknungsgas treibt mit Gasleerrohrgeschwindigkeiten von 10 bis 20 m/s die entstehenden Partikel nach oben. Die Aufgabe der feststoffhaltigen Fermentationsbrühe erfolgt mit Schnecken, Schleuderrädern oder durch pneumatischen Eintrag. Die Partikel werden am Kopf des Trocknungsrohrs mittels Zyklon abgeschieden und können, falls der gewünschte Trocknungsgrad noch nicht erreicht ist, in das Trocknungsrohr zurückgeführt werden oder in eine nachgeschaltete Wirbelschicht geleitet werden (K. Masters: Spray Drying Handbook, Longman Scientific & Technical 1991; Arun S. Mujumdar, Handbook of Industrial Drying, Marcel Dekker, Inc. 1995). Als Vorrichtungen können alle herkömmlichen im Fachgebiet bekannten Stromtrockner, z.B. der Firmen Nara und Orth, zum Einsatz kommen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Entfernen der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe unter Einsatz von Kontakttrocknern. Diese Art von Trocknern eignet sich besonders gut für das Trocknen von pastösen Medien. Die feststoffhaltige Fermentationsbrühe wird auf die Heizflächen des Trockners gegeben, über die der Energieeintrag erfolgt. Die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe verdampfen (K. Masters: Spray Drying Handbook, Longman Scientific & Technical 1991; Arun S. Mujumdar, Handbook of Industrial Drying, Marcel Dekker, Inc. 1995). Eine Vielzahl unterschiedlicher Bauformen von Kontakttrocknern existieren und kommen zum Einsatz, siehe hierzu die oben genannten Beispiele. Diese sind dem Fachmann insbesondere bekannt als: Dünnschicht-Kontakttrockner, z.B. der Firma BUSS-SMS, Walzentrockner, z.B. der Firma Gouda, Schaufeltrockner, z.B. der Firmen BTC-Technology und Drais, Kontaktbandtrockner, z.B. der Firmen Kunz und Merk.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der Formulierungshilfsstoffe vor der Trocknung eingesetzt werden, können z.B. Stabilisatoren oder Bindemittel wie Polyvinylalkohol und Gelatine, in eine Suspension des mikrobiellen Stoffwechselprodukts eingemischt werden, z.B. in einem Rührbehälter oder vor einem statischen Mischer. Eine solche Suspension kann auch auf ein Trägermaterial gegeben werden, z.B. durch Aufsprühen oder Untermischen in einem Mischer oder in einem Wirbelbett.

Eine weitere spezielle Ausführungsform, bei der Formulierungshilfsstoffe während der Trocknung zugegeben werden, betrifft die Puderung von feuchten, das Stoffwechselprodukt enthaltenden Tropfen (vgl. hierzu die EP 0648 076 und EP 835613), wobei die Stoffwechselprodukt-haltige Suspension versprüht wird, die Tropfen zur Stabilisierung mit Puderungsmittel, z.B. Kieselsäure, Stärke oder einem der zuvor genannten Puderungsmittel bzw. Fließhilfsmittel, gepudert und anschließend gegebenenfalls getrocknet werden, z.B. in einer Wirbelschicht.

In einer weiteren speziellen Ausführungsform, bei der Formulierungshilfsstoffe nach der Trocknung zugegeben werden, betrifft z.B. das Aufbringen von Überzügen bzw. Coatings/Coatingschichten auf getrocknete Partikel. Sowohl nach dem Trocknen als auch nach dem Coatingschritt können dem Produkt insbesondere Fließhilfsmittel zur Verbesserung der Fließeigenschaften, z.B. Kieselsäure, Stärken oder die anderen zuvor genannten Fließhilfsmittel, zugegeben werden.

Zur Gewinnung öliger Stoffwechselprodukte oder solcher mit einem Schmelzpunkt unterhalb des Siedepunktes von Wasser wird das betreffende Produkt vorteilhafterweise auf einem Adsorptionsmittel (Beispiele siehe oben) adsorbiert. Dabei geht man in der Regel so vor, dass man das betreffende Adsorptionsmittel am oder nach dem Ende der Fermentation der Fermentationsbrühe zugibt. Gegebenenfalls kann die Zugabe des Adsorptionsmittels nach vorheriger Aufkonzentration der Fermentationsbrühe erfolgen. Es können sowohl hydrophobe als auch hydrophile Adsorptionsmittel eingesetzt werden. Im ersteren Fall werden die Adsorptionsmittel zusammen mit dem adsorbierten Stoffwechselprodukt in gleicher Weise wie die festen Bestandteile zusammen mit diesen von den flüchtigen Bestandteilen der Fermentationsbrühe abgetrennt. Im letzteren Fall ist darauf zu achten, dass die gelöst oder suspendiert vorliegenden Adsorptionsmittel mit den adsorbierten Produkten durch die Aufarbeitung nicht ausgetragen werden. Bei Einsatz einer Filtration kann dies z.B. durch die Wahl einer genügend kleinen Porengröße der Filter erreicht werden. Bevorzugte hydrophobe bzw. hydrophile Adsorbentien sind die oben im Zusammenhang mit der Herstellung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte in pseudofester Form genannten Adsorbentien, insbesondere Kieselgur, Kieselsäure, Zucker und die oben genannten anorganischen und organischen Alkali- und Erdalkalimetallsalze.

Eine weitere Möglichkeit der Produktformulierung besteht in der Formgebung durch mechanische Einwirkung, z.B. mittels Extrusion, Pelletierung oder sogenanntem Prilling. Hierbei wird das Stoffwechselprodukt bzw. das dieses enthaltende Stoffgemisch, das vorzugsweise getrocknet, vorgetrocknet und/oder mit Formulierungshilfsmitteln versetzt wurde, in der Regel durch eine Matrize oder ein Sieb gepresst. Die Förderung des Produktes zu der Matrize erfolgt üblicherweise durch eine oder mehrere Schnecken, einen Kollergang oder andere mechanische, z.B. rotierende oder sich Iongitudinal bewegende, Bauteile. Die nach Durchgang durch die Matrize oder das Sieb anfallenden Stränge können mechanisch, z.B. mit einem Messer, abgetrennt werden oder gegebenenfalls quasi von selbst zu kleineren Partikeln zerfallen. Formgebende Verfahren zur Produktformulierung, die ohne Matrizen arbeiten, sind z.B. die Kompaktierung und Granulierung in Mischern, z.B. die sogenannte „high shear granulation".

Die genannten formgebenden Verfahren werden vorteilhaft eingesetzt, wenn durch Eindampfen einer Stoffwechselprodukt-haltigen Suspension und/oder durch Zugabe von Formulierungshilfsstoffen, z.B. Trägermaterialien wie Stärke und Klebermaterialien wie Lignin oder Polyvinylalkohol, zu einer solchen direkt ein Material erhältlich ist, das hochviskos, teigig bzw. granulierbar und somit unmittelbar in einem dieser Verfahren einsetzbar ist. Anderenfalls kann die erforderliche hochviskose bzw. teigige Konsistenz auch vor Extrusion, Pelletierung, Kompaktierung, Granulierung (z.b. high shear granulation) oder Prilling durch Trocknung bzw. Vortrocknung der Stoffwechselproduktenthaltenden Suspension, z.B. der Fermentationsbrühe, mittels der oben beschriebenen Trocknungsverfahren, bevorzugt mittels Sprühtrocknung eingestellt werden. Das so gewonnene Produkt wird gegebenenfalls mit üblichen, dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Formulierungshilfsstoffen gemischt und einer Extrusion, Pelletierung, Kompaktierung, Granulierung oder dem Prilling zugeführt. Diese Verfahren können auch so betrieben werden, dass vor dem formgebenden Schritt wenigstens ein Inhaltsstoff des Stoffwechselprodukt-haltigen Stoffgemischs aufgeschmolzen wird und nach dem formgebenden Schritt wieder erstarrt. Für eine derartige Ausführung ist in der Regel eine Zugabe von üblichen, dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Hilfsstoffen erforderlich. Die hierbei erhaltenen Produkte haben typischerweise Partikelgrößen im Bereich von 500 &mgr;m bis 0,05 m. Durch Zerkleinerungsverfahren wie Mahlung, gegebenenfalls in Kombination mit Siebverfahren, lassen sich hieraus, sofern gewünscht, kleinere Partikelgrößen erhalten.

Die durch die beschriebenen formgebenden Formulierungsverfahren gewonnen Partikel können durch die oben beschriebenen Trocknungsverfahren bis auf den gewünschten Restfeuchtigkeitsgehalt getrocknet werden.

Alle in einer der oben beschriebenen Weisen in fester Form erhaltenen Stoffwechselprodukte bzw. diese enthaltenden Stoffgemische, z.B. Partikel, Granulate und Extrudate, können mit einem Überzug bzw. einem Coating beschichtet werden, d.h. mit mindestens einer weiteren Stoffschicht überzogen werden. Das Coaten erfolgt z.B. in Mischern oder Wirbelschichten, in denen die zu beschichtenden Teilchen aufgewirbelt bzw. „fluidisiert" werden und dann mit dem Überzugs- bzw. Coatingmaterial besprüht werden. Das Coatingmaterial kann trocken, z.B. als Pulver, oder in Form einer Lösung, Dispersion, Emulsion oder Suspension in einem Lösungsmittel, z.B. Wasser, organische Lösungsmittel und Mischungen davon, insbesondere in Wasser, vorliegen. Sofern vorhanden, wird das Lösungsmittel während oder nach dem Aufsprühen auf die Teilchen durch Verdampfen entfernt. Des Weiteren können Coatingmaterialien wie Fette auch als Schmelzen aufgebracht werden.

Coatingmaterialien, die als wässrige Dispersion oder Suspension aufgesprüht werden können sind z.B. in der WO 03/059087 beschrieben. Hierzu gehören insbesondere Polyolefine wie Polyethylen, Polypropylen, Polyethylenwachse, Wachse, Salze wie (Erd-)Alkalimetallsulfate, -chloride und -carbonate, z.B. Natriumsulfat, Magnesiumsulfat, Calciumsulfat, Natriumchlorid, Magnesiumchlorid, Calciumchlorid, Natriumcarbonat, Magnesiumcarbonat und Calciumcarbonat; Acronale, z.B. Butylacrolat-Methylacrylat-Copolymer, die Styrofan-Marken der Fa. BASF, z.B. auf Basis von Styrol und Butadien, und hydrophobe Substanzen wie in der WO 03/059086 beschrieben. Bei Applikation derartiger Materialien liegt der Feststoffgehalt des Coatingmaterials typischerweise im Bereich von 0,1 bis 30 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 0,2 bis 15 Gew.-% und speziell im Bereich von 0,4 bis 5 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des formulierten Endprodukts.

Coatingmaterialien, die als Lösungen aufgesprüht werden können sind z.B. Polyethylenglykole, Cellulosederivate wie Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose und Ethylcellulose, Polyvinylalkohol, Proteine wie Gelatine, Salze wie (Erd-)Alkalimetallsulfate, -chloride und -carbonate, z.B. Natriumsulfat, Magnesiumsulfat, Calciumsulfat, Natriumchlorid, Magnesiumchlorid, Calciumchlorid, Natriumcarbonat, Magnesiumcarbonat und Calciumcarbonat; Kohlenhydrate wie Zucker, z.B. Glucose, Lactose, Fructose, Saccharose und Trehalose; Stärken und modifizierte Stärken. Bei Applikation derartiger Materialien liegt der Feststoffgehalt des Coatingmaterials typischerweise im Bereich von 0,1 bis 30 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 0,2 bis 15 Gew.-% und speziell im Bereich von 0,4 bis 10 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des formulierten Endprodukts.

Coatingmaterialien, die als Schmelze aufgesprüht werden können sind z.B. in der DE 199 29 257 und WO 92/12645 beschrieben. Hierzu gehören insbesondere Polyethylenglykole, synthetische Fette und Wachse, z.B. Polygen WE® der Fa. BASF, natürliche Fette wie tierische Fette, z.B. Bienenwachs, und pflanzliche Fette, z.B. Candelilawachs, Fettsäuren, z.B. tierische Wachse, Talgfettsäuren, Palmitinsäure, Stearinsäure, Triglyceride, Edenor-Produkte, Vegeole-Produkte, Montanesterwachse, z.B. Luwax E® der Fa. BASF. Bei Applikation derartiger Materialien liegt der Feststoffgehalt des Coatingmaterials typischerweise im Bereich von 1 bis 30 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 2 bis 25 Gew.-% und speziell im Bereich von 3 bis 20 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des formulierten Endprodukts.

Coatingmaterialien, die als Pulver beim Trockencoating verwandt werden können sind z.B. Polyethylenglykole, Cellulose und Cellulosederivate wie Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose und Ethylcellulose, Polyvinylalkohol, Proteine wie Gelatine, Salze wie (Erd-)Alkalimetallsulfate, -chloride und -carbonate, z.B. Natriumsulfat, Magnesiumsulfat, Calciumsulfat, Natriumchlorid, Magnesiumchlorid, Calciumchlorid, Natriumcarbonat, Magnesiumcarbonat und Calciumcarbonat; Kohlenhydrate wie Zucker, z.B. Glucose, Lactose, Fructose, Saccharose und Trehalose, Stärken und modifizierte Stärken, Fette, Fettsäuren, Talg, Mehl, z.B. aus Mais, Weizen, Roggen, Gerste oder Reis, Ton, Asche und Kaolin. Die Verklebung des als Coating aufzubringenden Pulvers mit den zu beschichtenden Produkten kann mit den Stoffen, die als Lösungen oder als Schmelzen aufgesprüht werden können, erfolgen. Das Sprühen dieser Lösungen oder Schmelzen kann alternierend zum Einbringen des Pulvers oder parallel erfolgen. Vorzugsweise wird das zu coatende Produkt in einer Wirbelschicht oder einem Mischer fluidisiert. Das Pulver wird dann, bevorzugt kontinuierlich, zum Coaten in die Wirbelschicht oder den Mischer geführt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird während der Pulverzugabe die Lösung oder Schmelze in den Prozessraum gegeben. Die Lösung kann z.B. über einen Stutzen zugeführt oder bevorzugt durch eine Düse (z.B. Einstoff- oder Zweistoffdüse) in den Prozessraum eingesprüht werden. Besonders bevorzugt sind die Aufgabestelle des Pulvers und die Position der Düse in dem Prozessraum räumlich voneinander getrennt, so dass die Lösung oder Schmelze vorwiegend das zu coatende Produkt und nicht das aufzubringende Pulver trifft.

Es ist ebenfalls möglich, Mischungen verschiedener Coatingmaterialien aufzubringen, insbesondere können mehrere gleiche oder unterschiedliche Coatingschichten sukzessive aufgebracht werden.

In einer alternativen Ausführungsform kann das gewünschte nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukt zusammen mit den festen Bestandteilen der Fermentationsbrühe ähnlich wie das bei der Herstellung von Bioethanol anfallende Nebenprodukt (das dort „Distiller's Dried Grains with Solubles (DDGS)" genannt und als solches vermarktet wird) aus der verbleibenden Fermentationsbrühe gewonnen werden. Hierbei kann eine im Wesentlichen vollständige oder nur teilweise Abtrennung der Fermentationsbrühe von den Feststoffen erfolgen. Das auf diese Weise erhaltene proteinhaltige Nebenprodukt kann sowohl vor als auch nach weiteren Be- bzw. Verarbeitungsschritten als Futtermittel oder Futtermitteladditiv zur Fütterung von Tieren, bevorzugt von landwirtschaftlichen Nutztieren, besonders bevorzugt von Rindern, Schweinen und Geflügel, ganz besonders bevorzugt von Rindern verwendet werden.

Üblicherweise wird hierzu die gesamte Brühe, d.h. einschließlich des nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts sowie der festen Bestandteile, in einer in der Regel mehrstufigen Verdampfung teilweise eingedampft und die enthaltenen Feststoffe anschließend z.B. mit einem Dekanter abgetrennt. Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann zunächst das gewünschte Stoffwechselprodukt, z.B. durch Kristallisation oder Fällung, aus der flüssigen Phase in die feste Form überführt werden, so dass es mit den Feststoffen zusammen gewonnen wird. Die hier abgetrennten Feststoffe weisen in der Regel einen Gehalt an Trockensubstanz im Bereich von 10 bis 80 Gew.-%, bevorzugt 15 bis 60 Gew.-% und besonders bevorzugt 20 bis 50 Gew.-% auf und können gegebenenfalls mit üblichen, z.B. den oben beschriebenen, Trocknungsverfahren weiter getrocknet werden. Die durch weitere Be- bzw. Verarbeitung erhaltene fertige Formulierung weist vorteilhafterweise einen Gehalt von mindestens etwa 90 Gew.-% Trockensubstanz auf, so dass die Gefahr von Verderb bei einer Lagerung reduziert ist.

Die abgetrennte flüssige Phase kann als Prozesswasser zurückgeführt werden. Der Anteil der nicht in den Prozess zurückgeführten flüssigen Phase kann in einer mehrstufigen Eindampfung zu einem Sirup aufkonzentriert werden. Wenn vor dem Dekantieren das gewünschte Stoffwechselprodukt nicht von der flüssigen in die feste Phase überführt wurde, dann enthält der so erhaltene Sirup auch das Stoffwechselprodukt. Der Sirup weist in der Regel einen Gehalt an Trockensubstanz im Bereich von 20 bis 90 Gew.-%, bevorzugt 30 bis 80 Gew.-% und besonders bevorzugt 40 bis 70 Gew.-% auf. Dieser Sirup wird mit den beim Dekantieren abgetrennten Feststoffen vermischt und anschließend getrocknet. Die Trocknung kann z.B. mittels Trommeltrockner, Sprühtrockner oder Schaufeltrockner erfolgen, bevorzugt wird ein Trommeltrockner eingesetzt. Die Trocknung wird bevorzugt so durchgeführt, dass der erhaltene Feststoff einen Gehalt an Restfeuchte von maximal 30 Gew.-%, bevorzugt maximal 20 Gew.-%, besonders bevorzugt maximal 10 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt maximal 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamttrockengewicht des erhaltenen Feststoffs, aufweist.

Nicht nur die in dieser alternativen Ausführungsform abgetrennte flüssige Phase kann als Prozesswasser zurückgeführt werden, sondern auch die bei den anderen oben beschriebenen Ausführungsformen gegebenenfalls aufgefangenen flüchtigen Bestandteile nach deren Kondensation. Diese rückgeführten Teile der flüssigen bzw. flüchtigen Phase können vorteilhaft z.B. ganz oder teilweise bei der Herstellung der zuckerhaltigen Flüssigkeit nach Schritt a) eingesetzt werden oder zum Ansetzen von Puffer- bzw. Nährsalzlösungen für den Einsatz in der Fermentation verwendet werden. Bei der Zumischung von rückgeführtem Prozesswasser in Schritt a) ist zu berücksichtigen, dass ein zu hoher Anteil die Fermentation durch ein Überangebot an bestimmten Mineralstoffen und Ionen, z.B. Natrium- und Lactationen, negativ beeinflussen kann. Vorzugsweise ist der Anteil an rückgeführtem Prozesswasser beim Ansetzen der Suspension zur Stärkeverflüssigung erfindungsgemäß daher auf maximal 75 Gew.-%, bevorzugt maximal 60 Gew.-% und besonders bevorzugt maximal 50 Gew.-% beschränkt. Vorteilhafterweise liegt der Anteil an Prozesswasser beim Ansetzen der Suspension in der bevorzugten Ausgestaltung von Schritt a2) im Bereich von 5 bis 60 Gew.-% und bevorzugt von 10 bis 50 Gew.-%.

Durch die hier beschriebenen Verfahren der Trocknung und Konfektionierung können die mittleren Teilchengrößen der erhaltenen Feststoffe in einem großen Bereich variiert werden, z.B. von relativ kleinen Teilchen im Bereich von etwa 1 bis 100 &mgr;m, über mittlere Teilchengrößen im Bereich von 100 bis zu mehreren hundert &mgr;m, bis hin zu relativ großen Teilchen von etwa wenigstens 500 &mgr;m oder etwa 1 mm und größer bis hin zu mehreren mm, z.B. bis 10 mm. Bei der Herstellung von Pulvern liegt die mittlere Teilchengröße in der Regel im Bereich von 50 bis 1000 &mgr;m. Bei Herstellung anderer fester Formen der Produkte, z.B. Extrudaten, Kompaktaten und insbesondere Granulaten, z.B. durch Wirbelschicht-Sprühtrockner und -Sprühgranulatoren hergestellten, werden in der Regel größere Dimensionen eingestellt, hierbei liegt die mittlere Teilchengröße häufig im Bereich von 200 bis 5000 &mgr;m. Der Begriff „mittlere Teilchengröße" bezieht sich hierbei auf den Durchschnittswert der maximalen Teilchenlängen bei den einzelnen Teilchen im Falle nicht-sphärischer Partikel bzw. auf den Durchschnittswert der Durchmesser sphärischer oder näherungsweise sphärischer Partikel. Zu beachten ist, dass durch Agglomeration der Primärpartikel während des Sprühtrocknungsprozesses größere Sekundärpartikel gebildet werden können. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die bei Sprühtrocknungen üblichen Teilchengrößenverteilungen erhalten.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren, wie oben beschrieben, dadurch gekennzeichnet, dass man

  • (i) dem in Schritt a2) erhaltenen zuckerhaltigen Flüssigmedium, das die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der unter Getreidekörnen ausgewählten Stärkequelle enthält, eine Teilmenge von nicht mehr als 50 Gew.-% entnimmt und mit der Restmenge eine Fermentation zur Herstellung eines ersten nichtflüchtigen Stoffwechselprodukts (A) in fester Form durchführt; und
  • (ii) von dieser Teilmenge die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle ganz oder teilweise abtrennt und mit dieser eine Fermentation zur Herstellung eines zweiten nichtflüchtigen Stoffwechselprodukts (B) in fester Form, das mit dem Stoffwechselprodukt (A) identisch oder davon verschieden ist, durchführt.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Abtrennung der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile gemäß (ii) so, dass der Feststoffgehalt des verbleibenden Anteils des zuckerhaltigen Flüssigmediums maximal 50 Gew.-%, bevorzugt maximal 30 Gew.-%, besonders bevorzugt maximal 10 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt maximal 5 Gew.-% beträgt.

Diese Vorgehensweise ermöglicht es, in der separaten Fermentation gemäß (ii) Mikroorganismen einzusetzen, für die bestimmte Mindestanforderungen erfüllt sein müssen, z.B. bezüglich der Sauerstofftransferrate. Für solche in der separaten Fermentation gemäß (ii) eingesetzten Mikroorganismen kommen z.B. Bacillus species, bevorzugt Bacillus subtilis in Betracht. Die durch derartige Mikroorganismen in der separaten Fermentation produzierten Verbindungen sind insbesondere unter Vitaminen, Cofaktoren und Nutrazeutika, Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleosiden und Nukleotiden, Lipiden, gesättigten und ungesättigten Fettsäuren, aromatischen Verbindungen, Proteinen, Carotenoiden, speziell unter Vitaminen, Cofaktoren und Nutrazeutika, Proteinen und Carotenoiden und ganz speziell unter Riboflavin und Calciumpantothenat ausgewählt.

Eine bevorzugte Ausgestaltung dieser Vorgehensweise betrifft die parallel betriebene Herstellung gleicher Stoffwechselprodukte (A) und (B) in zwei separaten Fermentationen. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn für verschiedene Anwendungen des gleichen Stoffwechselprodukts unterschiedliche Anforderungen an die Reinheit zu stellen sind. Demnach wird das erste Stoffwechselprodukt (A), z.B. eine als Futtermitteladditiv zu verwendende Aminosäure, z.B. Lysin, unter Einsatz der feststoffhaltigen Fermentationsbrühe und das gleiche zweite Stoffwechselprodukt (B), z.B. die gleiche als Nahrungsmitteladditiv zu verwendende Aminosäure, hier z.B. Lysin, unter Einsatz der gemäß (ii) feststoffabgereicherten Fermentationsbrühe hergestellt. Durch die vollständige oder teilweise Abtrennung der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile kann der Reinigungsaufwand bei der Aufarbeitung des Stoffwechselprodukts, dessen Anwendungsbereich eine höhere Reinheit erfordert, z.B. als Nahrungsmitteladditiv, reduziert werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Vorgehensweise handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt B um Riboflavin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der WO 01/011052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1186664 und Fujioka, K.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31(3), 44-48.

Zur Durchführung dieser Variante des Verfahrens kann z.B. wie folgt vorgegangen werden. Man implementiert eine vorzugsweise großvolumige Fermentation zur Herstellung von Stoffwechselprodukten A, z.B. von Aminosäuren wie Lysin, entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren, z.B. unter Anwendung der bevorzugten Verfahrensschritte a) bis c). Gemäß (i) wird ein Teil des nach Schritt a) erhaltenen, zuckerhaltigen Flüssigmediums entnommen und gemäß (ii) durch übliche Verfahren, z.B. Zentrifugation oder Filtration, vollständig oder teilweise von den Feststoffen befreit. Das daraus gewonnene, im Wesentlichen vollständig oder teilweise von den Feststoffen befreite, zuckerhaltige Flüssigmedium wird gemäß (ii) einer Fermentation zur Produktion eines Stoffwechselprodukts B, z.B. Riboflavin, zugeführt. Der gemäß (ii) abgetrennte Feststoffstrom wird vorteilhafterweise zum Strom des zuckerhaltigen Flüssigmediums der großvolumigen Fermentation zurück gegeben.

Die auf diese Art und Weise gemäß (ii) erzeugte, Riboflavin-haltige Fermentationsbrühe kann nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in DE 4037441, EP 464582, EP 438767 und DE 3819745. Nach Lyse der Zellmasse erfolgt die Abtrennung des kristallin vorliegenden Riboflavins vorzugsweise durch Dekantieren. Andere Arten der Feststoffabtrennung, z.B. Filtration, sind ebenfalls möglich. Anschließend wird das Riboflavin getrocknet, bevorzugt mittels Sprüh- und Wirbelschichttrocknern. Alternativ dazu kann das gemäß (ii) erzeugte, Riboflavin-haltige Fermentationsgemisch nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie z.B. in der EP 1048668 und EP 730034 beschrieben. Nach Pasteurisierung wird die Fermentationsbrühe hier zentrifugiert und die zurückbleibende feststoffhaltige Fraktion mit einer mineralischen Säure behandelt. Das gebildete Riboflavin wird aus dem wässrigsauren Medium filtriert, gegebenenfalls gewaschen und anschließend getrocknet.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Vorgehensweise handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt B um Pantothensäure. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der WO 01/021772.

Zur Durchführung dieser Variante des Verfahrens kann z.B. wie oben für Riboflavin beschrieben vorgegangen werden. Das gemäß (ii) vorgereinigte, vorzugsweise im Wesentlichen von den Feststoffen befreite, zuckerhaltige Flüssigmedium wird einer Fermentation gemäß (ii) zur Produktion von Pantothensäure zugeführt. Dabei ist die im Vergleich zum feststoffhaltigen Flüssigmedium verringerte Viskosität besonders vorteilhaft. Der abgetrennte Feststoffstrom wird vorzugsweise zum Strom des zuckerhaltigen Flüssigmediums der großvolumigen Fermentation zurückgegeben.

Die gemäß (ii) erzeugte, Pantothensäure-haltige Fermentationsbrühe kann nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der EP 1050219 und WO 01/83799. Nach Pasteurisieren der gesamten Fermentationsbrühe werden die verbleibenden Feststoffe z.B. durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt. Der Klarlauf der Feststoffabtrennung wird teilweise eingedampft, gegebenenfalls mit Calciumchlorid versetzt und getrocknet, insbesondere sprühgetrocknet.

Die abgetrennten Feststoffe werden im Rahmen des parallel betriebenen, großvolumigen Fermentationsverfahrens zusammen mit dem jeweiligen gewünschten nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukt (A) gewonnen.

Nach der Trocknung und/oder Formulierung können der Produktformulierung ganze oder gemahlene Getreidekörner, bevorzugt Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Triticale und/oder Roggen zugegeben werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind feste Formulierungen nichtflüchtiger Stoffwechselprodukte, die durch das hier beschriebene Verfahren erhältlich sind. Diese Formulierungen enthalten üblicherweise neben dem mindestens einen, nichtflüchtigen Stoffwechselprodukt (Bestandteil A) der Fermentation, Biomasse aus der Fermentation (Bestandteil B) und Teile oder die Gesamtmenge der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle (Bestandteil C). Daneben enthalten die erfindungsgemäßen Stoffgemische gegebenenfalls die oben erwähnten Formulierungshilfsmittel wie Bindemittel, Trägermaterialien, Puderungs-/Fließhilfsmittel, ferner Farbpigmente, Biozide, Dispergiermittel, Antischaummittel, viskositätsregulierende Mittel, Säuren, Laugen, Antioxidantien, Enzymstabilisatoren, Enzyminhibitoren, Adsorbate, Fette, Fettsäuren, Öle und dergleichen.

Die Menge an Stoffwechselprodukt macht typischerweise mehr als 10 Gew.-%, z.B. >10 bis 80 Gew.-%, insbesondere 20 bis 60 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der Bestandteile A, B und C aus. Bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung beträgt die Menge an Stoffwechselprodukt typischerweise 0,5 bis 80 Gew.-%, insbesondere 1 bis 60 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung.

Die Menge an Biomasse aus der das nichtflüchtige Stoffwechselprodukt produzierenden Fermentation beträgt typischerweise 1 bis 50 Gew.-%, insbesondere 10 bis 40 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der Bestandteile A, B und C, bzw. 0,5 bis 50 Gew.-%, insbesondere 2 bis 40 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung.

Die Menge an nicht-stärkehaltigen festen Bestandteilen der Stärkequelle aus der Fermentationsbrühe beträgt in der Regel mindestens 1 Gew.-% und insbesondere 5 bis 50 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der Bestandteile A, B und C, bzw. mindestens 0,5 Gew.-%, insbesondere wenigstens 2 Gew.-%, z.B. im Bereich von 2 bis 50 Gew.-%, insbesondere 5 bis 40 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung.

Die Menge an Formulierungshilfsmitteln wird in der Regel bis 400 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Komponenten A, B und C, betragen und liegt häufig im Bereich von 0 bis 100 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der Bestandteile A, B und C, bzw. im Bereich von 0 bis 80 und insbesondere 1 bis 30 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung.

Die erfindungsgemäßen Formulierungen liegen in fester Form vor und haben typischerweise die Form von Pulvern, Granulaten, Pellets, Extrudaten, Kompaktaten oder Agglomeraten.

Die erfindungsgemäßen Formulierungen weisen typischerweise Ballaststoffe (dietary fibers) auf, die zum einen aus den festen Bestandteilen der Stärkequelle resultieren und die außerdem als Streckmittel/Trägerstoffe bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Formulierungen eingesetzt werden. Hinsichtlich der Definition und der Komponenten, die im Sinne der Erfindung von dem Begriff „Ballaststoffe" umfasst werden sollen, wird auf den Bericht der American Association of Cereal Chemists (AACC) in Cereal Foods World (CFW), 46 (3), „The Definition of Dietary Fiber", 2001, S. 112-129, insbesondere S. 112, 113 und 118, Bezug genommen. Der Gehalt an Ballaststoffen beträgt in der Regel wenigstens 1 Gew.-%, insbesondere wenigstens 5 Gew.-%, speziell wenigstens 10 Gew.-% und liegt häufig im Bereich von 1 bis 60 Gew.-%, insbesondere 5 bis 50 Gew.-% und speziell im Bereich von 10 bis 40 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung. Die Bestimmung des Ballaststoffgehalts erfolgt im Allgemeinen nach einer Standardmethode der AACC (American Association of Cereal Chemists. 2000. Approved Methods of the American Association of Cereal Chemists, 10. Aufl., Method 32-25, Total dietary fiber determined as neutral sugar residues, uronic acid residues, and Klason lignin (Uppsala method). The Association, St. Paul, MN).

Die erfindungsgemäßen Stoffgemische besitzen einen hohen Proteingehalt, der im Wesentlichen der Biomasse B entspricht. Weitere Anteile am Proteingehalt können auch der eingesetzten Stärkequelle entstammen. Der Proteingehalt liegt typischerweise im Bereich von 20 bis 70 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung.

Der immanente Gehalt an Protein (speziell Komponente B) und an Ballaststoffen (speziell Komponente C) ist für verschiedene Formulierungsverfahren, z.B. im Fall öliger Stoffwechselprodukte, insbesondere im Hinblick auf hierbei angewendete Trocknungsschritte vorteilhaft.

Die erfindungsgemäßen Formulierungen enthalten vorteilhafterweise eine oder mehrere essentielle Aminosäuren, insbesondere wenigstens eine unter Lysin, Methionin, Threonin und Tryptophan ausgewählte Aminosäure. Die essentiellen Aminosäuren, insbesondere die genannten, liegen, sofern vorhanden, in der Regel jeweils in einer Menge vor, die gegenüber einem herkömmlichen DDGS-Nebenprodukt, das bei einer fermentativen Bioethanolproduktion anfällt, erhöht ist, insbesondere um einen Faktor von wenigstens 1,5. Sofern die jeweilige Aminosäure in der Formulierung enthalten ist, weist die Formulierung in der Regel einen Gehalt an Lysin von wenigstens 1 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 1 bis 10 Gew.-% und speziell im Bereich von 1 bis 5 Gew.-%, einen Gehalt an Methionin von wenigstens 0,8 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 0,8 bis 10 Gew.-% und speziell im Bereich von 0,8 bis 5 Gew.-%, einen Gehalt an Threonin von wenigstens 1,5 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 1,5 bis 10 Gew.-% und speziell im Bereich von 1,5 bis 5 Gew.-% und/oder einen Gehalt an Tryptophan von wenigstens 0,4 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 0,4 bis 10 Gew.-% und speziell im Bereich von 0,4 bis 5 Gew.-%, jeweils bezogen auf die gesamte Trockenmasse der Formulierung, auf.

Die erfindungsgemäßen Formulierungen enthalten üblicherweise noch einen geringen Anteil Wasser, häufig im Bereich von 0 bis 25 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 0,5 bis 15 Gew.-%, speziell im Bereich von 1 bis 10 Gew.-% und ganz speziell im Bereich von 1 bis 5 Gew.-% Wasser, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung.

Die erfindungsgemäßen Formulierungen sind zur Verwendung für die Tier- oder Humanernährung, z.B. als solche oder als Zusatz- oder Ergänzungsstoff, auch in Form von Prämixen, geeignet. Hierfür kommen insbesondere Formulierungen in Betracht, die Aminosäuren, z.B. Lysin, Glutamat, Methionin, Phenylalanin, Threonin oder Tryptophan; Vitamine, z.B. Vitamin B2 (Riboflavin), Vitamin B6, oder Vitamin B12; Carotenoide, z.B. Astaxanthin oder Cantaxanthin; Zucker, z.B. Trehalose; oder organische Säuren, z.B. Fumarsäure, enthalten.

Die erfindungsgemäßen Formulierungen sind auch für die Anwendung in der Textil-, Leder-, Zellstoff- und Papierindustrie geeignet. Hierbei werden im Textilbereich insbesondere Formulierungen zum Einsatz kommen, die als Stoffwechselprodukte Enzyme wie Amylasen, Pektinasen und/oder saure, hybride oder neutrale Zellulasen enthalten; in Bereich Leder insbesondere solche, die Enzyme wie Lipasen, Pankreasen oder Proteasen enthalten; und in der Zellstoff- und Papierindustrie insbesondere solche, die Enzyme wie Amylasen, Xylanasen, Zellulasen, Pectinasen, Lipasen, Esterasen, Proteasen, Oxidoreductasen, z.B. Laccase, Katalase und Peroxidase, enthalten.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung einzelner Aspekte der vorliegenden Erfindung, sie sind jedoch in keiner Weise als einschränkend zu verstehen.

1. Vermahlen der Stärkequelle

Die im folgenden eingesetzten Mahlgüter wurden wie folgt hergestellt. Ganze Maiskörner wurden unter Verwendung einer Rotormühle vollständig vermahlen. Unter Einsatz unterschiedlicher Schlägerwerke, Mahlbahnen bzw. Siebeinbauten wurden dabei drei verschiedene Feinheiten erzielt. Eine Siebanalyse des Mahlgutes mittels Labor-Vibrationssieb (Vibrations-Analysenmaschine: Retsch Vibrotronic Typ VE1; Siebzeit 5 min; Amplitude: 1,5 mm) ergab die in Tabelle 1 aufgeführten Ergebnisse.

II. Enzymatische Stärkeverflüssigung und -verzuckerung II.1. Ohne Phytase im Verzuckerungsschritt II.1a) Enzymatische Stärkeverflüssigung

Aus 320 g trocken vermahlenem Maismehl (T71/03) wurde unter stetem Rühren eine Suspension in 480 g Wasser angesetzt und mit 310 mg Calciumchlorid versetzt. Das Rühren wurde während der gesamten Versuchsdurchführung fortgesetzt. Nach Einstellung des pH-Wertes mit H2SO4 auf 6,5 und Erhitzen auf 35°C wurden 2,4 g Termamyl 120L Typ L (Novozymes A/S) zugegeben. Über 40 min wurde das Reaktionsgemisch auf eine Temperatur von 86,5°C erhitzt, wobei der pH gegebenenfalls mit NaOH auf den zuvor eingestellten Wert nachjustiert wurde. Innerhalb von 30 min wurden weitere 400 g des trocken vermahlenen Maismehls (T71/03) zugegeben, wobei die Temperatur auf 91°C erhöht wurde. Das Reaktionsgemisch wurde ca. 100 min bei dieser Temperatur gehalten. Anschließend wurden weitere 2,4 g Termamyl 120L zugegeben und die Temperatur ca. 100 min gehalten. Der Fortschritt der Verflüssigung wurde während der Durchführungsdauer mit der Jod-Stärke-Reaktion verfolgt. Die Temperatur wurde abschließend auf 100°C erhöht und das Reaktionsgemisch weitere 20 min gekocht. Zu diesem Zeitpunkt war keine Stärke mehr nachzuweisen. Der Reaktor wurde auf 35°C abgekühlt.

II.1 b) Verzuckerung

Die aus II.1a) erhaltene Reaktionsmischung wurde unter stetem Rühren auf 61°C erhitzt. Das Rühren wurde während der gesamten Versuchsdurchführung fortgesetzt. Nach Einstellung des pH-Wertes mit H2SO4 auf 4,3 wurden 10,8 g (9,15 ml) Dextrozyme GA (Novozymes A/S) zugegeben. Die Temperatur wurde ca. 3 h gehalten, wobei der Fortschritt der Reaktion mit Glucoseteststäbchen (S-Glucotest von Boehringer) verfolgt wurde. Die Ergebnisse sind in der unten stehenden Tabelle 2 aufgeführt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch auf 80°C erhitzt und danach abgekühlt. Es wurden ca. 1180 g flüssiges Produkt mit einer Dichte von ca. 1,2 kg/l und einem mittels Infrarottrockner bestimmten Gehalt an Trockenmasse von etwa 53,7 Gew.-% erhalten. Der Gehalt an Trockenmasse (ohne wasserlösliche Inhaltsstoffe) betrug nach Waschen mit Wasser etwa 14 Gew.-%. Der durch HPLC bestimmte Anteil an Glucose im Reaktionsgemisch betrug 380 g/l (vgl. Tab. 2, Probe Nr. 7).

II.2. Mit Phytase im Verzuckerungsschritt II.2a) Stärkeverflüssigung

Eine trocken vermahlene Maismehlprobe wird entsprechend II.1a) verflüssigt.

II.2b) Verzuckerung

Die aus II.2a) erhaltene Reaktionsmischung wird unter stetem Rühren auf 61°C erhitzt. Das Rühren wird während der gesamten Versuchsdurchführung fortgesetzt. Nach Einstellung des pH-Wertes mit H2SO4 auf 4,3 werden 10,8 g (9,15 ml) Dextrozyme GA (Novozymes A/S) und 70 &mgr;l Phytase (700 Units Phytase, Natuphyt Liquid 10000L von der BASF Aktiengesellschaft) zugegeben. Die Temperatur wird ca. 3 h gehalten, wobei der Fortschritt der Reaktion mit Glucoseteststäbchen (S-Glucotest von Boehringer) verfolgt wird. Anschließend wird das Reaktionsgemisch auf 80°C erhitzt und danach abgekühlt. Das erhaltene Produkt wird mittels Infrarottrockner getrocknet und mit Wasser gewaschen. Der Anteil an Glucose im Reaktionsgemisch wird durch HPLC bestimmt.

II.3 Weitere Arbeitsvorschriften zur enzymatischen Stärkeverflüssigung und -verzuckerung II.3a) Maismehl

360 g deionisiertes Wasser werden in einem Reaktionsgefäß vorgelegt. 1,54 ml CaCl2 Stammlösung (100 g CaCl2 × 2 H2O/l) werden bis zu einer Endkonzentration von etwa 70 ppm Ca2+ in der Maische zugegeben. Unter stetem Rühren lässt man 240 g Maismehl langsam in das Wasser einrieseln. Nach Einstellung des pH auf 6,5 mit 50 Gew.-%iger wässriger NaOH-Lösung gibt man 4,0 ml (= 2 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Termamyl 120 L Typ L (Novozymes A/S) zu. Die Maische wird dann schnell auf bis zu 85°C erhitzt. Hierbei muss der pH fortwährend kontrolliert und gegebenenfalls angepasst werden.

Nach Erreichen der endgültigen Temperatur beginnt man die Zugabe von weiterem Mehl, zunächst von 50 g Mehl. Zusätzlich gibt man der Maische 0,13 ml CaCl2 Stammlösung zu, um die Ca2+-Konzentration bei 70 ppm zu halten. Während der Zugabe hält man die Temperatur konstant bei 85°C. Man wartet mindestens 10 min ab, um eine vollständige Reaktion zu gewährleisten, bevor man eine weitere Portion (50 g Mehl und 0,13 ml CaCl2 Stammlösung) zugibt. Nach Zugabe von zwei Portionen gibt man 1,67 ml Termamyl zu; anschließend gibt man zwei weitere Portionen (jeweils 50 g Mehl und 0,13 ml CaCl2 Stammlösung) zu. Es wird ein Gehalt an Trockenmasse von 55 Gew.-% erreicht. Nach der Zugabe erhöht man die Temperatur auf 100°C und kocht die Maische 10 min.

Man entnimmt eine Probe und kühlt diese auf Raumtemperatur. Nach Verdünnung der Probe mit deionisiertem Wasser (etwa 1:10) gibt man einen Tropfen konzentrierte Lugolsche Lösung (Mischung von 5 g l und 10 g Kl pro Liter) zu. Eine tiefblaue Färbung zeigt einen Gehalt an verbleibender Stärke an; eine Braunfärbung tritt ein, wenn die Stärke vollständig hydrolysiert wurde. Wenn der Test einen Anteil verbleibender Stärke anzeigt, wird die Temperatur erneut auf 85°C erniedrigt und konstant gehalten. Man gibt weitere 1,67 ml Termamyl zu, bis die Iod-Stärke-Reaktion negativ ausfällt.

Die negativ auf Stärke getestete Mischung wird dann für die folgende Verzuckerungsreaktion auf 61°C gebracht. Der pH wird durch Zugabe von 50 %iger Schwefelsäure auf 4.3 eingestellt. Im Verlauf der Reaktion wird der pH bei diesem Wert gehalten. Die Temperatur wird bei 61°C gehalten. 5,74 ml (= 1,5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Dextrozym GA (Novozymes A/S) werden zugegeben, um die verflüssigte Stärke in Glucose umzuwandeln. Man lässt die Reaktion eine Stunde fortschreiten. Zur Inaktivierung des Enzyms erhitzt man die Mischung auf 85°C. Die heiße Mischung füllt man in sterile Behälter und lagert diese nach Abkühlung bei 4°C. Es wurde eine Endkonzentration an Glucose von 420 g/l erzielt.

II.3b) Roggenmehl (inklusive Cellulase/Hemicellulase-Vorbehandlung)

360 g deionisiertes Wasser werden in einem Reaktionsgefäß vorgelegt. Unter stetem Rühren lässt man 155 g Roggenmehl langsam in das Wasser einrieseln. Die Temperatur wird konstant bei 50°C gehalten. Nach Einstellung des pH auf 5,5 mit 50 Gew.-%iger wässriger NaOH-Lösung gibt man 3,21 ml (= 2,5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Viscozyme L (Novozymes A/S) zu. Nach 30 min startet man die Zugabe von weiterem Mehl, zunächst gibt man 55 g Mehl zu. Nach weiteren 30 min gibt man erneut 50 g Mehl hinzu; 30 min später noch einmal 40 g Mehl. 30 min nach der letzten Zugabe kann mit der Verflüssigung begonnen werden.

1,7 ml CaCl2 Stammlösung (100 g CaCl2 × 2 H2O/l) werden zugegeben. Nach Einstellung des pH auf 6,5 mit 50 Gew.-%iger wässriger NaOH-Lösung gibt man 5,0 ml (= 2 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Termamyl 120 L Typ L (Novozymes A/S) zu. Die Maische wird dann schnell auf 85°C erhitzt. Hierbei wird der pH fortwährend kontrolliert und gegebenenfalls angepasst.

Nach Erreichen der endgültigen Temperatur beginnt man die Zugabe von weiterem Mehl, zunächst von 60 g Mehl. Zusätzlich gibt man der Maische 0,13 ml CaCl2 Stammlösung zu, um die Ca2+-Koncentration bei 70 ppm zu halten. Während der Zugabe hält man die Temperatur konstant bei 85°C. Man wartet mindestens 10 min ab, um eine vollständige Reaktion zu gewährleisten, bevor man eine weitere Portion (40 g Mehl und 0,1 ml CaCl2 Stammlösung) zugibt. Man gibt 1,1 ml Termamyl zu; anschließend gibt man eine weitere Portionen (40 g Mehl und 0,1 ml CaCl2 Stammlösung) zu. Es wird ein Gehalt an Trockenmasse von 55 Gew.-% erreicht. Nach der Zugabe erhöht man die Temperatur auf 100°C und kocht die Maische 10 min.

Man entnimmt eine Probe und kühlt diese auf Raumtemperatur. Nach Verdünnung der Probe mit deionisiertem Wasser (etwa 1:10) gibt man einen Tropfen konzentrierte Lugolsche Lösung (Mischung von 5 g l und 10 g Kl pro Liter) zu. Eine tiefblaue Färbung zeigt einen Gehalt an verbleibender Stärke an; eine Braunfärbung tritt ein, wenn die Stärke vollständig hydrolysiert wurde. Wenn der Test einen Anteil verbleibender Stärke anzeigt, wird die Temperatur erneut auf 85°C erniedrigt und konstant gehalten. Man gibt weitere 1,1 ml Termamyl zu, bis die Iod-Stärke-Reaktion negativ ausfällt.

Die negativ auf Stärke getestete Mischung wird dann für die folgende Verzuckerungsreaktion auf 61°C gebracht. Der pH wird durch Zugabe von 50 %iger Schwefelsäure auf 4.3 eingestellt. Im Verlauf der Reaktion wird der pH bei diesem Wert gehalten. Die Temperatur wird bei 61°C gehalten. 5,74 ml (= 1.5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Dextrozyme GA (Novozymes A/S) werden zugegeben, um die verflüssigte Stärke in Glucose umzuwandeln. Man lässt die Reaktion eine Stunde fortschreiten. Zur Inaktivierung des Enzyms erhitzt man die Mischung auf 85°C. Die heiße Mischung füllt man in sterile Behälter und lagert diese nach Abkühlung bei 4°C. Es wurde eine Endkonzentration an Glucose von 370 g/l erzielt.

II.3c) Weizenmehl (inklusive Xylanase-Vorbehandlung)

360 g deionisiertes Wasser werden in einem Reaktionsgefäß vorgelegt. Das Wasser wird auf 55°C erhitzt und der pH mit 50 Gew.-%iger wässriger NaOH-Lösung auf 6,0 eingestellt. Nach Einstellung von Temperatur und pH gibt man 3,21 ml (= 2,5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Shearzyme 500L (Novozymes A/S) zu. Unter stetem Rühren lässt man 155 g Weizenmehl langsam in die Lösung einrieseln. Die Temperatur und der pH werden konstant gehalten. Nach 30 min startet man die Zugabe von weiterem Mehl, zunächst gibt man 55 g Mehl zu. Nach weiteren 30 min gibt man 50 g Mehl hinzu; 30 min später noch einmal 40 g Mehl. 30 min nach der letzten Zugabe kann mit der Verflüssigung begonnen werden.

Die Verflüssigung und Verzuckerung werden wie unter II.3b beschrieben durchgeführt. Es wurde eine Endkonzentration an Glucose von 400 g/l erzielt.

III. Stamm ATCC13032 IysCfbr

In einigen der nachfolgenden Beispiele wurde ein modifizierter Stamm von Corynebacterium glutamicum eingesetzt, der unter der Bezeichnung ATCC13032 IysCfbr in der WO 05/059144 beschrieben wurde.

Beispiel 1 a) Enzymatische Stärkeverflüssigung und -verzuckerung

500 g trocken vermahlenes Maismehl wurden in 750 ml Wasser suspendiert und in einem Rührmixer erneut fein vermahlen. Die Suspension wurde in 4 Proben Nr. 1 bis 4 geteilt, die jeweils mit ca. 3 g hitzestabiler &agr;-Amylase (Proben Nr. 1 und 2: Termamyl L; Proben Nr. 3 und 4: Spezyme) behandelt wurden. Die Proben Nr. 2 und 4 wurden nachfolgend mit ca. 7 g/l Glucoamylase (Probe Nr. 2: Dextrozyme GA; Probe Nr. 4: Optidex) behandelt. Es wurden gelbliche, viskose Proben erhalten, deren Feststoffanteil jeweils durch Zentrifugation abgetrennt wurde, wobei über der klaren Flüssigphase eine Schicht hydrophober Feststoffe aufschwamm.

Von den so erhaltenen Proben wurde unter Vernachlässigung bzw. unter Einbeziehung des abzentrifugierten Pellets jeweils der klare Überstand in konzentrierter Form und in 10-facher Verdünnung mittels HPLC analysiert. Bei Berücksichtigung des Pellets wurde ein Gehalt an Trockenmasse für das Pellet von 50 Gew.-% angenommen. Die Ergebnisse, bezogen auf die Ausgangsprobe, sind in der nachfolgenden Tabelle 3 aufgeführt.

b) Fermentation

Zwei gemäß Beispiel II.1 erhaltene Maismehlhydrolysate wurden in Schüttelkolbenversuchen unter Verwendung von Corynebacterium glutamicum eingesetzt (Kolben 4-9). Außerdem wurde parallel ein analog Beispiel II.1 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 1-3) verwendet.

b.1) Herstellung des Inokulums

Die Zellen werden nach dem Ausstreichen auf sterilem CM-Agar (Zusammensetzung: siehe Tabelle 4; 20 min bei 121°C) 48 h bei 30°C inkubiert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 25 ml des Mediums (siehe Tabelle 5) in 250 ml Erlenmeyerkolben werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von OD600 = 1 bei 600 nm erreicht.

b.2) Herstellung der Fermentationsbrühe

Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 9 sind in Tabelle 5 aufgeführt.

  • * mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen
  • ** Glucosekonzentration im Hydrolysat
  • *** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium

Nach dem Animpfen wurden die Kolben 48 h bei 30°C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Zuckern und Lysin per HPLC bestimmt. Die HPLC wurde mit einem 1100 Series LC System von Agilent durchgeführt. Eine Vorsäulenderivatisierung mit ortho-Phthalaldehyd erlaubt die Quantifizierung der gebildeten Aminosäure, die Auftrennung des Produktgemischs erfolgt mit einer Hypersil AA-Säule von Agilent. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengestellt.

In allen Kolben wurde Lysin in vergleichbaren Mengen in der Größenordnung von etwa 30 bis 40 g/l produziert, entsprechend der in einer standardmäßigen Fermentation mit Glucose-Nährlösung erreichten Ausbeute.

c) Herstellung von Trockenpulvern c.1) Sprühtrocknung

In einem Becherglas wurden bei Raumtemperatur 250 g einer Lysin-haltigen Brühe mit einem Feststoffgehalt von etwa 20 Gew.-% (erhalten aus einer Maismehlsuspension analog Beispiel 1a und 1b) vorgelegt und mittels einer Schlauchpumpe (Typ: ISM444, Ismatec) in eine Gleichstrom-Zweistoffdüse eines Sprühturms (Niro, Minor High Tec) gefördert. Der Sprühdruck betrug 4 bar. Während des Sprühvorgangs wurden schrittweise etwa 2 bis 3 g Sipernat S22 zudosiert. Die Eingangstemperatur lag zwischen 95 °C bis 100°C. Die Förderleistung der Pumpe wurde so eingestellt, dass die Temperatur des Produkts 50°C im Wesentlichen nicht unterschritt.

Die Wände des Sprühturms wurden während der Durchführung der Sprühtrocknung mäßig mit Lysin belegt. Das erhaltene Trockenpulver ist optisch fein und gut fließfähig. Es wurden 23 g Trockenpulver erhalten.

c.2) Extrusion

Zu 400 g einer Lysin-haltigen Brühe mit einem Feststoffgehalt von etwa 20 Gew.-% (erhalten aus einer Maismehlsuspension analog Beispiel 1a und 1b), die 60 min bei 80 °C getempert wurde, gab man eine durch Lösen von 14 g Polyvinylalkohol (PVA; Mw = 10000 bis 190000 g/mol) in 75 g Wasser hergestellte wässrige PVA-Lösung. Der pH-Wert der erhaltenen Suspension lag bei etwa 7. Diese wurde zu etwa 950 g in einem Lödigemischer vorgelegter Maisstärke (Fa. Roquette) gegeben und bei etwa 100-350 Upm untergemischt.

Das dem Mischer entnommene mehlige, feuchte teigartige Produkt mit einer Temperatur von etwa 30°C wurde anschließend einem DOME-Extruder (Fa. Fuji Paudal Co. Ltd.) zugeführt und bei einer Temperatur von weniger als 30°C extrudiert. Das bei der Extrusion erhaltene Produkt wurde in einem Wirbelbetttrockner der Fa. BÜCHI 120 min bei einer Produkttemperatur von weniger als 60°C getrocknet. Es wurden 600 g Granulat erhalten, welches bei Berührung pulverartig zerfällt. (Es wurde nicht die gesamte Menge des dem Extruder zugeführten Feuchtprodukts verarbeitet.)

c.3) Agglomeration im Wirbelbett

Im Konus einer Wirbelbettapparatur Aeromatic MP-1 (Fa. Niro Aeromatic; Lochfläche des Lochbodens: 12% (12% FF)) wurden 500 g Na2SO4 vorgelegt und auf eine Temperatur von 50°C erwärmt. Mittels einer Schlauchpumpe wurden 998 g einer Lysinhaltigen Brühe mit einem Feststoffgehalt von etwa 20 Gew.-% (erhalten aus einer Maismehlsuspension analog Beispiel 1a und 1b) einer Zweistoffdüse (d = 1,2 mm) zugeführt und über diese in „Topspray"-Position (d.h. von oben) auf den im Konus vorgelegten Feststoff aufgesprüht. Der Sprühdruck betrug 1,5 bar. Der Sprühvorgang wurde nach Zugabe von 278 g und nach Zugabe weiterer 320 g der Lysin-haltigen Brühe (entsprechend einem Anteil von 10 bzw. 20 Gew.-% aufgesprühtem Fermentationsfeststoff, bezogen auf den Gesamtteststoff in der Wirbelbettapparatur) jeweils zwecks Zwischentrocknung und Probenahme (je 50 g) unterbrochen. Die Zuluftmenge wurde im Bereich von etwa 45 bis 60 m3/h eingestellt und während der Trocknungsschritte reduziert. Die Temperatur der Zuluft lag im Bereich von etwa 46°C bis 80°C, während der abschließenden Trocknung zum Teil darunter. Die Förderleistung der Pumpe wurde so eingestellt, dass die Temperatur des Produkts bei etwa 50°C lag und 45°C im Wesentlichen nicht unterschritt. Nach Abkühlung wurden 513 g Produkt ausgetragen. Die Größe der Agglomerate aller drei entnommenen Produktproben lag im Bereich von einigen hundert Mikrometern.

Beispiel 2

Unter Verwendung eines gemäß Beispiel II.1 erhaltenen Maismehlhydrolysats wird eine Fermentation analog Beispiel 1 b) durchgeführt, wobei der in WO 05/059144 beschriebene Stamm ATCC13032 IysCfbr verwendet wurde. Die Zellen werden auf sterilem CM-Agar (Zusammensetzung Tabelle 4; 20 min bei 121°C) 48 h bei 30°C inkubiert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 25 ml des Mediums 1 bzw. 2 (siehe Tabelle 5) in 250 ml Erlenmeyerkolben werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von OD610 = 1 bei 610 nm erreicht. Die Proben werden dann bei 200 Upm und 30°C in einem befeuchteten Schüttelschrank (85% rel. Luftfeuchte) 48 h inkubiert. Die Konzentration des Lysins in den Medien wird mittels HPLC bestimmt. In allen Fällen wurden annähernd gleiche Mengen an Lysin produziert.

Die derart erhaltenen Lysin-haltigen Fermentationsbrühen können gemäß Beispiel 1c.1) bis 1c.3) weiter zu einem trockenen Produkt verarbeitet werden.

Beispiel 3

Ein gemäß Beispiel II.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenversuchen unter Verwendung von Corynebacterium glutamicum (ATCC13032 IysCfbr) eingesetzt (Kolben 1+2). Außerdem wurden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 3+4) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 5+6) verwendet.

3.1) Herstellung des Inokulums

Die Zellen werden nach dem Ausstreichen auf sterilem CM+CaAc-Agar (Zusammensetzung: siehe Tabelle 7; 20 min bei 121°C) 48 h bei 30°C inkubiert, dann auf eine neue Platte überimpft und über Nacht bei 30°C inkubiert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 23 ml des Mediums (siehe Tabelle 8) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von OD610 = 0,5 bei 610 nm erreicht.

3.2) Herstellung der Fermentationsbrühe

Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 6 sind in Tabelle 8 aufgeführt.

Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselösung verwendet.

  • * mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen
  • ** Glucosekonzentration im Hydrolysat
  • *** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium

Nach dem Animpfen wurden die Kolben 48 h bei 30°C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Glucose und Lysin per HPLC bestimmt. Die HPLC Analysen wurden mit Geräten der 1100 Series LC von Agilent durchgeführt. Die Aminosäurebestimmung erfordert eine Vorsäulenderivatisierung mit ortho-Phthalaldehyd, die Auftrennung erfolgt auf einer Zorbax Extend C18 Säule von Agilent. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengestellt.

In allen Kolben wurde Lysin in vergleichbaren Mengen in der Größenordnung von etwa 10 bis 12 g/l produziert, entsprechend der in einer standardmäßigen Fermentation mit Glucose-Nährlösung erreichten Ausbeute.

Die derart erhaltenen Lysin-haltigen Fermentationsbrühen können gemäß Beispiel 1c.1) bis 1c.3) weiter zu einem trockenen Produkt verarbeitet werden.

Beispiel 4

Ein gemäß Beispiel II.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenversuchen verwendet (Kolben 1-3). Als Panthothenat-produzierender Stamm wurde Bacillus PA824 eingesetzt (genaue Beschreibung in WO 02/061108). Außerdem wurden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 4-6) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 7-9) verwendet.

4.1) Herstellung des Inokulums

42 ml des Vorkulturmediums (siehe Tabelle 10) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit 0,4 ml einer Gefrierkultur angeimpft und 24 h bei 43°C unter Bewegen (250 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert.

  • * mit verdünnter wässriger KOH-Lösung einzustellen

42 ml des Hauptkulturmediums (siehe Tabelle 11) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit 1 ml Vorkultur angeimpft.

4.2) Herstellung der Fermentationsbrühe

Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 9 sind in Tabelle 11 aufgeführt.

Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselösung verwendet.

  • * mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen
  • ** Glucosekonzentration im Hydrolysat
  • *** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium

Nach dem Animpfen wurden die Kolben 24 h bei 43°C und unter Bewegen (250 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Glucose und Pantothensäure per HPLC bestimmt. Die Bestimmung der Glucose erfolgte mit Hilfe einer Aminex HPX-87H Säule der Firma Bio-Rad. Die Bestimmung der Pantothensäurekonzentration erfolgte mittels Auftrennung auf einer Aqua C18-Säule der Firma Phenomenex. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengestellt.

In allen Kolben wurde Pantothensäure in vergleichbaren Mengen in der Größenordnung von etwa 1,5 bis 2 g/l produziert, entsprechend der in einer standardmäßigen Fermentation mit Glucose-Nährlösung erreichten Ausbeute.

Die derart erhaltenen Pantothensäure-haltigen Fermentationsbrühen können gemäß Beispiel 1c.1) bis 1c.3) weiter zu einem trockenen Produkt verarbeitet werden.

Beispiel 5

Ein gemäß Beispiel II.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenversuchen unter Verwendung von Aspergillus niger eingesetzt (Kolben 1-3). Außerdem wurden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 4-6) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 7-9) verwendet.

5.1) Stämme

Ein Aspergillus niger Phytase-Produktionsstamm mit 6 Kopien des phyA-Gens aus Aspergillus ficuum unter der Kontrolle des glaA-Promotors wurde analog zur im Detail in WO98/46772 beschriebenen Herstellung von NP505-7 erzeugt. Als Kontrolle wurde ein Stamm mit 3 modifizierten glaA Ampikons (analog ISO 505), jedoch ohne integrierte phyA-Expressionskassetten verwendet.

5.2) Herstellung des Inokulums

20 ml des Vorkulturmediums (siehe Tabelle 13) in 100 ml Erlenmeyerkolben mit einer Schikane werden jeweils mit 100 &mgr;l einer Gefrierkultur angeimpft und 24 h bei 34°C unter Bewegen (170 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert.

  • * mit verdünnter Schwefelsäure einzustellen

50 ml des Hauptkulturmediums (siehe Tabelle 14) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit einer Schikane werden jeweils mit 5 ml Vorkultur angeimpft

5.3) Herstellung der Fermentationsbrühe

Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 9 sind in Tabelle 14 aufgeführt.

Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselösung verwendet.

  • * mit verdünnter Schwefelsäure einzustellen
  • ** Glucosekonzentration im Hydrolysat
  • *** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium

Nach dem Animpfen wurden die Kolben 6 Tage bei 34°C und unter Bewegen (170 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde die Phytaseaktivität mit Hilfe eines Assays bestimmt. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde die Phytaseaktivität mit Phytinsäure als Substrat und auf einem geeignetem Phytaseaktivitätsniveau (Standard: 0,6 U/ml) in 250 mM Essigsäure/Natriumacetat/Tween 20 (0,1 Gew.-%), pH 5,5 Puffer bestimmt. Der Assay wurde standardisiert für die Anwendung in Mikrotiterplatten (MTP). 10 &mgr;l der Enzymlösung wurden mit 140 &mgr;l 6,49 mM Phytatlösung in 250 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,5 (Phytat: Dodecanatriumsalz der Phytinsäure) gemischt. Nach einer Stunde Inkubation bei 37°C wurde die Reaktion durch Zugabe des gleichen Volumens (150 &mgr;l) Trichloressigsäure gestoppt. Ein Aliquot dieser Mischung (20 &mgr;l) wurde überführt in 280 &mgr;l einer Lösung, die 0,32 N H2SO4, 0,27 Gew.-% Ammoniummolybdat und 1,08 Gew.-% Ascorbinsäure enthält. Anschließend erfolgte eine 25-minütige Inkubation bei 50°C. Die Absorption der blau gefärbten Lösung wurde bei 820 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 zusammengestellt.

  • FTU = Formazin-Turbidity-Einheit

Die derart erhaltenen Phytase-haltigen Fermentationsbrühen können gemäß Beispiel 1c.1) bis 1c.3) weiter zu einem trockenen Produkt verarbeitet werden.

Beispiel 6

Ein gemäß Beispiel II.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenversuchen unter Verwendung von Ashbya gossypii eingesetzt (Kolben 1-4). Außerdem wurden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 5-8) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 9-12) verwendet.

6.1) Stamm

Bei dem eingesetzten Riboflavin-produzierenden Stamm handelt es sich um ein Ashbya gossypii ATCC 10895 (s.a. Schmidt G, et al. Inhibition of purified isocitrate lyase identified itaconate and oxalate as potential antimetabolites for the riboflavin overproducer Ashbya gossypii. Microbiology 142: 411-417, 1996).

6.2) Herstellung des Inokulums

Die Zellen werden nach dem Ausstreichen auf sterilem HMG-Agar (Zusammensetzung: siehe Tabelle 16; 20 min bei 121°C) 72 h bei 28°C inkubiert.

Anschließend werden 50 ml des Vorkulturmediums (siehe Tabelle 17) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen jeweils mit einer Impföse voll Zellen angeimpft und 24 h bei 28°C unter Bewegen (180 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert.

  • * mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen

50 ml des Hauptkulturmediums (siehe Tabelle 18) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit 5 ml Vorkultur angeimpft

6.3) Herstellung der Fermentationsbrühe

Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 12 sind in Tabelle 18 aufgeführt.

Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselösung verwendet.

  • * mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen
  • ** Glucosekonzentration im Hydrolysat
  • *** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium

Nach dem Animpfen wurden die Kolben 6 Tage bei 28°C und unter Bewegen (180 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Vitamin B2 per HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 zusammengestellt.

Die derart erhaltenen Vitamin B2-haltigen Fermentationsbrühen können gemäß Beispiel 1c.1) bis 1c.3) weiter zu einem trockenen Produkt verarbeitet werden.

Beispiel 7

Ein gemäß Beispiel II.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenversuchen unter Verwendung von Corynebacterium glutamicum eingesetzt (Kolben 1-3). Außerdem wurden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 4-6) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 7-9) verwendet.

7.1) Stämme

Stämme von Corynebacterium, die Methionin produzieren, sind dem Fachmann bekannt. Die Herstellung solcher Stämme ist z.B. in Kumar D. Gomes J. Biotechnology Advances, 23(1):41-61, 2005; Kumar D. et al., Process Biochemistry, 38:1165-1171, 2003; WO 04/024933 und WO 02/18613 beschrieben.

7.2) Herstellung des Inokulums

Die Zellen werden nach dem Ausstreichen auf sterilem CM+Kan-Agar (Zusammensetzung: siehe Tabelle 20; 20 min bei 121°C) 24 h bei 30°C inkubiert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 25 ml des Mediums (siehe Tabelle 5) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von OD610 = 0,5 bei 610 nm erreicht.

7.3) Herstellung der Fermentationsbrühe

Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 9 sind in Tabelle 21 aufgeführt. Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselösung verwendet.

  • * mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen
  • ** Glucosekonzentration im Hydrolysat
  • *** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium

Nach dem Animpfen wurden die Kolben bei 30°C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert, bis die Glucose aufgebraucht war. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Methionin per HPLC bestimmt (Säule: Agilent ZORBAX Eclipse AAA; Methode It. Eclipse AAA protocol, Technical Note 5980-1193). Die Ergebnisse sind in Tabelle 22 zusammengestellt.

Die derart erhaltenen Methionin-haltigen Fermentationsbrühen können gemäß Beispiel 1c.1) bis 1c.3) weiter zu einem trockenen Produkt verarbeitet werden.

Beispiel 8

Ein gemäß Beispiel II.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenversuchen unter Verwendung von Bacterium 130Z eingesetzt.

8.1) Stamm

Als Succinat-produzierender Stamm wurde Bacterium 130Z eingesetzt (ATCC No. 55618).

8.2) Herstellung der Fermentationsbrühe

50 ml des Hauptkulturmediums (siehe Tabelle 23) in 120 ml Serumflaschen werden jeweils mit 1 ml einer Gefrierkultur angeimpft. Vor dem Verschließen wird auf die Serumflaschen CO2 aufgepresst (0,7 bar).

Die Zusammensetzung des Mediums ist in Tabelle 23 aufgeführt (vgl. US 5,504,004). Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselösung verwendet (Endkonzentration Glucose: 100 g/l).

  • * begast mit und abgefüllt unter CO2/N2
  • ** Glucosekonzentration im Hydrolysat
  • *** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium

Nach dem Animpfen wurden die Serumflaschen 46 h bei 37°C und unter Bewegen (160 Upm) in einem Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Glucose und Succinat per HPLC bestimmt. Die Bestimmung erfolgte mit Hilfe einer Aminex HPX-87H Säule von Bio-Rad. Die Ergebnisse sind in Tabelle 24 zusammengestellt.

Die derart erhaltenen Succinat-haltigen Fermentationsbrühen können gemäß Beispiel 1c.1) bis 1c.3) weiter zu einem trockenen Produkt verarbeitet werden.

Beispiel 9

Ein gemäß Beispiel II.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wird in Schüttelkolbenversuchen unter Verwendung von Escherichia coli eingesetzt (Kolben 1-3). Ebenso werden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 4-6) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 7-9) verwendet.

9.1) Stamm

Escherichia coli-Stämme, die L-Threonin produzieren, sind dem Fachmann bekannt. Die Herstellung solcher Stämme ist z.B. in der EP 1013765 A1, EP 1016710 A2, US 5,538,873 beschrieben.

9.2) Herstellung des Inokulums

Die Zellen werden auf sterilem LB-Agar ausgestrichen. Dem LB-Agar werden Antibiotika zugefügt, wenn geeignete Resistenz-Gene als Marker in dem entsprechenden Stamm existieren. Hierfür können z.B. Kanamycin (40 &mgr;g/mL) oder Ampicillin (100 mg/l) verwendet werden. Die Stämme werden 24 h bei 30°C inkubiert. Die Zellen werden nach dem Ausstreichen auf sterilem M9 Glucose-Minimalmedium mit Methionin (50 &mgr;g/mL), Kanamycin (40 &mgr;g/mL) und Homoserin (10 &mgr;g/L) 24 h bei 30°C inkubiert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 25 ml des Mediums (siehe Tabelle 25) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von OD610 = 0,5 bei 610 nm erreicht.

9.3) Herstellung der Fermentationsbrühe

Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 9 sind in Tabelle 25 aufgeführt. Im Kontrollmedium wird statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselösung verwendet.

  • * mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen
  • ** Glucosekonzentration im Hydrolysat
  • *** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium

Nach dem Animpfen werden die Kolben bei 30°C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert, bis die Glucose aufgebraucht ist. Nach dem Abbruch der Fermentation kann der Gehalt an L-Threonin durch reversed-phase-HPLC bestimmt werden, wie von Lindroth et al., Analytical Chemistry 51:1167-1174, 1979 beschrieben.

Die derart erhaltenen Threonin-haltigen Fermentationsbrühen können gemäß Beispiel 1c.1) bis 1c.3) weiter zu einem trockenen Produkt verarbeitet werden.

Beispiel 10

In analoger Weise wie in Beispiel 9 beschrieben werden durch Einsatz entsprechender Stämme die weiteren L-Aminosäuren Glutamat, Lysin, Histidin, Prolin und Arginin hergestellt. Die jeweiligen Stämme sind z.B. in der EP 1016710 beschrieben.

Die derart erhaltenen Aminosäure-haltigen Fermentationsbrühen können gemäß Beispiel 1c.1) bis 1c.3) weiter zu einem trockenen Produkt verarbeitet werden.

Beispiel 11

Ein teilverzuckertes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenversuchen unter Verwendung von Aspergillus niger eingesetzt.

11.1) Verflüssigung und (Teil-)Verzuckerung

Die Verflüssigung wurde analog Beispiel II.3a durchgeführt. Nach Abkühlung der Suspension auf 61°C und Einstellung des pH auf 4,3 wurden 5,38 ml (= 1.5 Gew.-% Enzymi/Trockenmasse) Dextrozyme GA (Novozymes A/S) zugegeben. Jeweils 10, 15, 20, 30, 45 und 60 Minuten nach Zugabe des Enzyms wurden 50 g Probe entnommen und in 25 ml sterilem, eisgekühltem VE-Wasser suspendiert. Die Proben wurden in ein Eisbad gestellt und sofort im Kolbentest eingesetzt. Es erfolgte keine Inaktivierung des Enzyms.

11.2) Fermentation

Es wurde der in Beispiel 5.1) verwendete Stamm eingesetzt. Die Herstellung des Inokulums erfolgte wie in Beispiel 5.2) beschrieben.

Zur Herstellung der Fermentationsbrühe wurden die in Tabelle 29 aufgeführten Zusammensetzungen des Kolbenmediums verwendet. Aus jeder Probe wurden zwei Kolben angesetzt.

  • * mit verdünnter Schwefelsäure einzustellen
  • *** Einwaage an teilverzuckertem Hydrolysat pro Liter Medium

Nach dem Animpfen wurden die Kolben 6 Tage bei 34°C und unter Bewegen (170 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde die Phytaseaktivität mit Hilfe eines Assays (wie in Beispiel 5.3 beschrieben) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 30 zusammengestellt.

Die derart erhaltenen Phytase-haltigen Fermentationsbrühen können gemäß Beispiel 1c.1) bis 1c.3) weiter zu einem trockenen Produkt verarbeitet werden.

Beispiel 12

Ein teilverzuckertes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenversuchen unter Verwendung von Corynebacterium glutamicum eingesetzt.

12.1) Verflüssigung und (Teil-)Verzuckerung

Die Verflüssigung wurde analog Beispiel II.3a durchgeführt. Nach Abkühlung der Suspension auf 61°C und Einstellung des pH auf 4,3 wurden 5,38 ml (= 1.5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Dextrozyme GA (Novozymes A/S) zugegeben. Jeweils 10, 15, 20, 30, 45 und 60 Minuten nach Zugabe des Enzyms wurden 50 g Probe entnommen und in 25 ml sterilem, eisgekühltem VE-Wasser suspendiert. Die Proben wurden in ein Eisbad gestellt und sofort im Kolbentest eingesetzt. Es erfolgte keine Inaktivierung des Enzyms.

12.2) Fermentation

Es wurde der in Beispiel 3) verwendete Stamm eingesetzt. Die Herstellung des Inokulums erfolgte wie in Beispiel 3.1) beschrieben.

Zur Herstellung der Fermentationsbrühe wurden die in Tabelle 31 aufgeführten Zusammensetzungen des Kolbenmediums verwendet. Aus jeder Probe wurden drei Kolben angesetzt.

  • * mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen
  • *** Einwaage an teilverzuckertem Hydrolysat pro Liter Medium

Nach dem Animpfen wurden die Kolben 48 h bei 30°C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Glucose und Lysin per HPLC bestimmt. Die HPLC Analysen wurden mit Geräten der 1100 Series LC von Agilent durchgeführt. Die Glucose wurde mit Hilfe einer Aminex HPX-87H Säule von Bio-Rad bestimmt. Die Bestimmung der Aminosäurekonzentration erfolgte mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie auf einer Agilent 1100 Series LC System HPLC. Eine Vorsäulenderivatisierung mit Ortho-Pthalaldehyd erlaubt die Quantifizierung der gebildeten Aminosäuren, die Auftrennung des Aminosäuregemisches findet auf einer Hypersil AA-Säule (Agilent) statt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 32 zusammengestellt.

Die derart erhaltenen Lysin-haltigen Fermentationsbrühen können gemäß Beispiel 1c.1) bis 1c.3) weiter zu einem trockenen Produkt verarbeitet werden.


Anspruch[de]
Verfahren zur Herstellung wenigstens eines nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts in fester Form durch zuckerbasierte mikrobielle Fermentation, wobei man einen das(die) gewünschte(n) Stoffwechselprodukt(e) produzierenden Mikroorganismenstamm mit einem zuckerhaltigen Flüssigmedium, das einen Monosaccharidgehalt von mehr als 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Flüssigmediums, aufweist, kultiviert und anschließend die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe weitgehend entfernt, wobei man das zuckerhaltige Flüssigmedium herstellt durch:

a1) Vermahlen einer unter Getreidekörnern ausgewählten Stärkequelle; und

a2) Verflüssigen des Mahlguts in einer wässrigen Flüssigkeit in Gegenwart mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms und anschließendes Verzuckern unter Verwendung mindestens eines verzuckernden Enzyms, wobei man zum Verflüssigen mindestens eine Teilmenge des Mahlguts kontinuierlich oder diskontinuierlich zu der wässrigen Flüssigkeit gibt.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend:

a) Herstellung des zuckerhaltigen Flüssigmediums mit einem Monosaccharidgehalt von mehr als 20 Gew.-% gemäß den Schritten a1) und a2), wobei das zuckerhaltige Flüssigmedium auch nicht-stärkehaltige feste Bestandteile der Stärkequelle umfasst;

b) Einsatz des zuckerhaltigen Flüssigmediums in einer Fermentation zur Produktion des(der) nichtflüchtigen Stoffwechselprodukte(s); und

c) Gewinnung des(der) nichtflüchtigen Stoffwechselprodukts(-produkte) in fester Form zusammen mit wenigstens einem Teil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle aus der Fermentationsbrühe durch wenigstens teilweises Entfernen der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das in Schritt a) hergestellte zuckerhaltige Flüssigmedium wenigstens 20 Gew.-% der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle umfasst. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei man das Mahlgut in einer wässrigen Flüssigkeit in Gegenwart mindestens einer &agr;-Amylase verflüssigt und anschließend unter Verwendung mindestens einer Glucoamylase verzuckert. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt a2) eine Teilmenge der mindestens einen &agr;-Amylase während des Verflüssigens zu der wässrigen Flüssigkeit zugegeben wird. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Getreide ausgewählt ist unter Mais-, Roggen-, Triticale- und Weizenkörnern. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das beim Vermahlen im Schritt a1) erhaltene Mahlgut mindestens 50 Gew.-% an Mehlpartikeln mit einer Korngröße von mehr als 100 &mgr;m umfasst. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verflüssigen und Verzuckern des Mahlguts im Schritt a2) derart erfolgt, dass die Viskosität des Flüssigmediums maximal 20 Pas beträgt. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 25 Gew.-% der Gesamtmenge des während der Verflüssigung zugegebenen Mahlguts bei einer Temperatur oberhalb der Gelierungstemperatur der im Mahlgut enthaltenen Stärke zugegeben werden. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man ein zuckerhaltiges Flüssigmedium mit einem Monosaccharidgehalt von mehr als 45 Gew.-% herstellt. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man dem zuckerhaltigen Flüssigmedium vor dem Fermentationsschritt mindestens eine Phytase zusetzt. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das(die) hergestellten nichtflüchtige(n) Stoffwechselprodukt(e) unter organischen, gegebenenfalls Hydroxylgruppen tragenden Mono-, Di- und Tricarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, proteinogenen und nicht-proteinogenen Aminosäuren, Purinbasen, Pyrimidinbasen; Nukleosiden, Nukleotiden, Lipiden; gesättigten und ungesättigten Fettsäuren; Diolen mit 4 bis 10 C-Atomen, höherwertigen Alkoholen mit 3 oder mehr Hydroxylgruppen, längerkettigen Alkoholen mit wenigstens 4 C-Atomen, Kohlenhydraten, aromatischen Verbindungen, Vitaminen, Provitaminen, Cofaktoren, Nutrazeutika, Proteinen, Carotenoiden, Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen, Lactonen, Biopolymeren und Cyclodextrinen ausgewählt ist(sind). Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die hergestellten nichtflüchtigen Stoffwechselprodukte ausgewählt sind unter Enzymen, Aminosäuren, Vitaminen, Disacchariden, aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, aliphatischen Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen, Alkanolen mit 4 bis 10 C-Atomen und Alkandiolen mit 3 bis 10 C-Atomen. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen ausgewählt sind unter natürlichen oder rekombinanten Mikroorganismen, die wenigstens eines der folgenden Stoffwechselprodukte produzieren: Enzyme, Aminosäuren, Vitamine, Disaccharide, aliphatische Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, aliphatische Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, Ketone mit 3 bis 10 C-Atomen, Alkanole mit 4 bis 10 C-Atomen und Alkandiole mit 3 bis 10 C-Atomen. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen ausgewählt sind unter den Gattungen Corynebacterium, Bacillus, Ashbya, Escherichia, Aspergillus, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Lactobacillus, Propionibacterium, Clostridium und Rhizopus, insbesondere unter Stämmen von Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii, Escherichia coli, Aspergillus niger, Alcaligenes latus, Anaerobiospirillum succiniproducens, Actinobacillus succinogenes, Lactobacillus delbrückii, Lactobacillus leichmannii, Propionibacterium arabinosum, Propionibacterium schermanii, Propionibacterium freudenreichii, Clostridium propionicum, Clostridium acetobutlicum, Clostridium formicoaceticum, Rhizopus oryzae und Rhizopus arrhizus. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man das wenigstens eine nichtflüchtige Stoffwechselprodukt in fester Form ohne vorherige Abtrennung fester Bestandteile zusammen mit der Gesamtheit aller festen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe gewinnt. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe bis auf einen Restfeuchtigkeitsgehalt von 0,2 bis 20 Gew.-%, bevorzugt von 1 bis 15 Gew.-% und besonders bevorzugt von 5 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das trockene Gesamtgewicht der festen Bestandteile, aus der Fermentationsbrühe entfernt. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Entfernung der flüchtigen Bestandteile eine Sprühtrocknung, Wirbelschichttrocknung oder Gefriertrocknung der Fermentationsbrühe durchführt. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass man einen oder mehrere Trocknungshilfsstoffe verwendet. Feste Formulierung eines Stoffwechselprodukts, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19. Formulierung nach Anspruch 20, enthaltend:

A) >10 bis 80 Gew.-% mindestens eines nichtflüchtigen Stoffwechselprodukts;

B) 1 bis 50 Gew.-% an Biomasse aus der das nichtflüchtige Stoffwechselprodukt produzierenden Fermentation;

C) 1 bis 50 Gew.-% an nicht-stärkehaltigen festen Bestandteilen der Stärkequelle aus der Fermentationsbrühe; und

D) 0 bis 400 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Komponenten A, B und C, übliche Formulierungshilfsmittel;

wobei sich die Gewichtsanteile A, B und C zu 100 Gew.-% ergänzen.
Formulierung nach Anspruch 21, enthaltend wenigstens 5 Gew.-% Ballaststoffe, bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung. Verwendung einer Formulierung nach einem der Ansprüche 20 bis 22 für die Tier- oder Humanernährung. Verwendung einer Formulierung nach einem der Ansprüche 20 bis 22 für die Textil-, Leder-, Zellstoff-, Papier- oder Oberflächenbehandlung.






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