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Dokumentenidentifikation DE69535314T2 08.03.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0000719336
Titel Modifizierte Pflanzenviren als Vektore für Heterologe Peptide
Anmelder Dow Global Technologies, Inc., Midland, Mich., US
Erfinder LOMONOSSOFF, Peter, George, Colney Lane Norwich NR4 7UH, GB
Vertreter Weickmann & Weickmann, 81679 München
DE-Aktenzeichen 69535314
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 10.07.1995
EP-Aktenzeichen 959244369
WO-Anmeldetag 10.07.1995
PCT-Aktenzeichen PCT/GB95/01618
WO-Veröffentlichungsnummer 1996002649
WO-Veröffentlichungsdatum 01.02.1996
EP-Offenlegungsdatum 03.07.1996
EP date of grant 29.11.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 08.03.2007
IPC-Hauptklasse C12N 15/40(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 15/41(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/42(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/49(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/62(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 7/01(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 39/12(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Viren als Träger (Vektoren) zur Herstellung oder Präsentation von Fremdpeptiden. Insbesondere betrifft die Erfindung die genetische Manipulation von viraler Nukleinsäure durch Einbau von Fremdnukleinsäuresequenzen, welche in dem Viruspartikel (Virion) als Peptide exprimiert werden. In dieser Beschreibung bezeichnet die Bezeichnung "fremd", wie sie für ein Peptid oder für die Nukleinsäure, die dafür codiert, angewendet wird, Peptide oder Nukleinsäuren, welche für den als Vektor verwendeten Pflanzenvirus nicht nativ sind. Solche Sequenzen können alternativ als exogene oder heterologe Sequenzen beschrieben werden. Die Bezeichnung "Peptid" umfasst kleine Peptide und Polypeptide.

Unsere Patentanmeldung WO 92/18618 beschreibt die Verwendung von Pflanzenviren als Vektorsysteme zur Expression von Fremdnukleotidsequenzen, d.h. Nukleotidsequenzen (RNA oder DNA), welche nicht in Pflanzenviren vorliegen, wie sie in der Natur vorkommen, und welche folglich für Peptide codieren, die üblicherweise nicht in einem beliebigen, natürlich vorkommenden Pflanzenvirus vorkommen. Die hierin beschriebene Erfindung umfasst zusammengesetzte Partikel eines Pflanzenvirus, der ein Fremdpeptid enthält. Die Pflanzenviren der Erfindung enthalten daher modifizierte Formen der nativen Viren und werden vereinfachend als modifizierte Viren bezeichnet.

Die Fremdpeptide, welche gemäß unserer früheren Anmeldung WO 92/18618 in Pflanzenviren eingebaut werden können, können von äußerst unterschiedlichen Arten sein und sind lediglich der Einschränkung unterworfen, dass die Beschaffenheit und Größe des Fremdpeptids und die Stelle, an welcher es in oder auf dem Viruspartikel lokalisiert ist, nicht die Fähigkeit des modifizierten Virus beeinträchtigen, sich unter Kultivierung in vitro oder in vivo zusammenzufügen. Allgemein können modifizierte Viren aus beliebigen biologisch geeigneten Peptiden (üblicherweise Polypeptiden) gebildet werden, deren Funktion eine bestimmte Konformation für dessen Aktivität erfordert. Dies kann durch Assoziation des Peptids mit einem größeren Molekül erreicht werden, z.B. zur Verbesserung von dessen Stabilität oder Art der Präsentation in einem bestimmten biologischen System. Beispiele solcher Peptide sind Peptidhormone; Enzyme; Wachstumsfaktoren; Antigene, die von tierischen Einzellern, Viren, Bakterien, Pilzen oder Tieren abstammen; Antikörper einschließlich anti-idiotypischer Antikörper; Immunoregulatoren und Cytokine, z.B. Interferone und Interleukine; Rezeptoren; Adhesine; und Teile von Vorläufern einer beliebigen der zuvor genannten Petpidarten. Die Peptide enthalten bevorzugt mehr als 5 Aminosäuren.

Unter der großen Auswahl biologisch aktiver Peptidsequenzen, die auf Pflanzenvirusvektoren gemäß unserer früheren Erfindung präsentiert werden, wird den Antigenpeptiden, welche die Grundlage von Impfstoffen bilden, insbesondere Virusimpfstoffe vom Tier (einschließlich Mensch), besondere Bedeutung beigemessen. Es sollte beachtet werden, dass im Rahmen unserer früheren Erfindung Impfstoffe prophylaktische (d.h. Krankheitsprävention) oder therapeutische (d.h. Krankheitsbehandlung) Anwendungen aufweisen. Für Impfstoffanwendungen stellt unsere frühere Erfindung ein besonders reizvolles Epitopenpräsentationssystem dar. Bei Verwendung solcher Anwendungen wird die antigene Peptidkomponente geeigneterweise so auf dem Viruspartikel positioniert, dass sie leicht durch das Immunsystem erkannt werden kann, z.B. durch Positionierung auf einem exponierten Teil des Hüllproteins des Virus. Wie es auch für Letzteres zutrifft, umfasst unsere frühere Erfindung daher zusammengesetzte Partikel eines modifizierten Pflanzenvirus, der ein Antigen enthält, das von einem Pathogen abstammt, z.B. einem Tiervirus, welches in einer exponierten Position auf der Oberfläche des Hüllproteins des Pflanzenvirus eingebaut ist. Diese Erfindung umfasst auch die Verwendung solcher zusammengesetzter modifizierter Pflanzenviruspartikel als immunogene Komponente eines Impfstoffs. Solche zusammengesetzten modifizierten Pflanzenviruspartikel, die Antigenpeptide präsentieren, können auch als Antigen-Präsentationskomponente eines immunodiagnostischen Assays zum Nachweis von z.B. Pathogenen und Krankheiten vom Tier (einschließlich Mensch) angewendet werden.

Das in unserer früheren Anmeldung beschriebene System ist im Hinblick auf die Größe des Fremdpeptids, welches in das virale Hüllprotein insertiert werden kann, äußerst vielseitig. Daher sind Peptide, die bis zu 38 oder mehr Aminosäuren enthalten, im Verlauf unserer fortdauernden Forschung erfolgreich insertiert worden. Die so hergestellten modifizierten Viren, die nichtnatürliche Strukturen darstellen, weisen jedoch gegenüber dem nichtmodifizierten Virus (Wildtyp) einen Wettbewerbsnachteil auf, wenn sie sich in Pflanzen vermehren. Folglich haben wir in einigen modifizierten Viren eine Tendenz beobachtet, dass das Fremdpeptid während der Fortpflanzung mit anschließender Verminderung der Ausbeute an modifiziertem Virus verlorengeht.

Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Ursachen für dieses Problem identifiziert worden und die zu dessen Vermeidung notwendigen Schritte sind bestimmt worden.

Erstens sollte das zur Modifizierung der Pflanzenvirusnukleinsäure verwendete Verfahren durch Einführen einer Nukleotidsequenz, die für ein Fremdpeptid codiert, das Vorliegen direkter Sequenzwiederholungen, die an das Insert angrenzen, vermeiden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein Konstrukt, das eine direkte Sequenzwiederholung enthält, ein solches Konstrukt, in welchem eine identische Oligonukleotidsequenz auf beiden Seiten des insertierten Nukleotids vorliegt. Solche Konstrukte können genetisch instabil sein, da Rekombination zwischen den Sequenzwiederholungen auftreten kann, was zum Verlust der für das Fremdpeptid codierenden Sequenz und zur Rückbildung zur Wildtypsequenz führt. Zweitens kann dem sich ergebenden modifizierten Virushüllprotein dort eine Aminosäuresequenz, welche zur Virusreplikation, Einkapselung und Verbreitung in der Pflanze von Bedeutung ist, fehlen, wo die Fremdoligonukleotidsequenz in das Pflanzenvirusgenom als Ersatz für einen Teil der bestehenden Sequenz insertiert wird. Dieser Defekt kann leicht bestimmt und vermieden werden. Drittens sollte die heterologe Sequenz nicht an einer weniger optimalen Stelle insertiert werden.

Die vorliegende Erfindung umfasst zusammengesetzte Partikel eines Pflanzenvirus, der ein Fremdpeptid enthält, wobei die entsprechende Fremdnukleinsäure, die an das Insert angrenzt, frei von direkten Sequenzwiederholungen und zusätzlich zu der bestehenden Nukleinsäure in das Pflanzenvirusgenom insertiert worden ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Pflanzenvirus Kuherbsen-Mosaik-Virus (CPMV) und das Fremdinsert wird so hergestellt, dass es dem Prolin 23 (Pro23)-Rest in der &bgr;B-&bgr;C-Schleife des kleinen Capsidproteins (VP23) unmittelbar vorangeht.

Die Erfindung kann durch Identifizieren desjenigen Teils des Virusgenoms, welcher für einen exponierten Abschnitt eines Hüllproteins codiert, auf einen beliebigen Pflanzenvirus angewendet werden. Innerhalb dieses Teils des Genoms werden zwei unterschiedliche Restriktionsenzymstellen ausgewählt, und die Nukleinsäure wird unter Verwendung der geeigneten Restriktionsenzyme gespalten. Paare von komplementären Oligonukleotiden, die für das Fremdpeptid codieren, welches wünschenswerterweise in das Virushüllprotein zu insertieren ist, werden synthetisiert. Die Oligonukleotide sind so terminiert, dass die Enden mit den Restriktionsenzym-Schnittstellen kompatibel sind, wodurch die Insertion in die gespaltene Virusnukleinsäure ermöglicht wird. Dieser Vorgang führt zur Einführung einer Nukleotidsequenz, die für ein Fremdpeptid codiert, während das Vorliegen von direkten Sequenzwiederholungen, die an das Insert angrenzen, vermieden wird. Bevorzugt werden komplementäre Oligonukleotide synthetisiert, wobei die Sequenz, die für die heterologen Aminosäuren codiert, an Pflanzenvirusspezifische Sequenzen angrenzt, sodass die Fremdnukleinsäure zusätzlich zu der viralen Nukleinsäure insertiert wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die dreidimensionale Struktur eines Pflanzenvirus zur Identifizierung von Abschnitten eines Hüllproteins untersucht, welche auf der Virusoberfläche besonders exponiert sind und welche daher potenzielle optimale Stellen zur Insertion darstellen. In einer weiteren Ausführungsform wird die Aminosäuresequenz der exponierten Abschnitte eines Hüllproteins auf Aminosäuren hin untersucht, welche &agr;-helikale Strukturen brechen, da diese potenziell optimale Stellen zur Insertion darstellen. Beispiele geeigneter Aminosäuren sind Prolin und Hydroxyprolin, wobei beide, wann immer sie in einer Polypeptidkette auftreten, die &agr;-Helix unterbrechen und eine starre Schleife oder Krümmung in der Struktur erzeugen.

Zur Veranschaulichung dieses Systems wurde der Pflanzenvirus Kuherbsen-Mosaik-Comovirus (CPMV) ausgewählt. Die dreidimensionale Struktur von CPMV ist mit atomarer Auflösung aufgelöst worden, welche ohne Zerstörung der Partikelstruktur die Identifizierung von zur Modifizierung geeigneten Stellen ermöglicht hat.

CPMV ist ein zweiteiliger RNA-Virus und es ist zur Manipulation des Genoms eines beliebigen RNA-Virus zur Expression von Fremdpeptiden notwendig, cDNA-Klone der RNA zu verwenden. Volllängen-cDNA-Klone von beiden CPMV-RNA-Molekülen, welche zur Insertion von Oligonukleotidsequenzen, die für ein Fremdpeptid codieren, manipuliert werden können, sind erhältlich. cDNA-Klone des Genoms aus Pflanzen-RNA-Viren können zur Erzeugung von in vitro-Transkripten verwendet werden, die bei Beimpfung auf Pflanzen infektiös sind. Das Infektionsvermögen der Transkripte ist jedoch wesentlich geringer als dasjenige natürlicher Virion-RNAs, wahrscheinlich als Folge des Vorliegens nicht-viraler Reste an den Enden der Transkripte. Schwierigkeiten können auch während der Beimpfung durch Behandeln der Transkripte mit zersetzenden Mitteln verursacht werden. Aus diesem Grund werden die Transkripte üblicherweise dadurch stabilisiert, dass sie an ihren 5'-Enden mit einer CAP versehen werden, dies ist jedoch ein ineffizientes, kostspieliges und zeitintensives Verfahren.

In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung sind cDNA-Klone von CPMV-RNAs M und B konstruiert worden, wobei der cDNA-Klon der M RNA eine insertierte Oligonukleotidsequenz enthält, die für ein Fremdpeptid codiert, enthaltend die 35S-Promotorsequenz des Blumenkohlmosaik-Virus (CaMV), die mit den 5'-Enden der viralen cDNAs verknüpft ist, die infektiöse Transkripte in der Pflanze erzeugen. Diese Methode überwindet einige der Probleme, auf die man bei der Verwendung von Transkripten stößt, die in vitro erzeugt wurden, und sie ist für alle Pflanzen-RNA-Viren anwendbar.

Um die breite Anwendbarkeit dieser Erfindung zu veranschaulichen, werden Antigenpeptide aus vier unterschiedlichen Tierviren, einem bakteriellen Pathogen von Tieren und einem Säugerpeptidhormon verwendet. Zwei der Viren gehören der Picornavirusgruppe der Tierviren-Maul- und Klauenseuchen-Virus (FMDV) und humaner Rhinovirus (HRV) an. In dieser Gruppe gibt es verschiedene bedeutende Pathogene, insbesondere FMDV, Poliomyelitis (Polio) und Hepatitis A. Der dritte ausgewählte Virus ist Human Immune Deficiency Virus (HIV), welcher keine Ähnlichkeit mit einem bekannten Pflanzenvirus aufweist, und für welchen gegenwärtig keine erfolgreichen Impfstoffe verfügbar sind. Das bakterielle Pathogen ist Staphylococcus aureus, ein Mittel, welches für verschiedene Tierkrankheiten einschließlich Mastitis bei Kühen, verantwortlich ist. Das Peptid ist Gonadotrophin-Releasing-Hormon vom Schwein.

Die Erfindung wird nunmehr unter Bezugnahme auf die folgenden begleitenden Zeichnungen beschrieben:

1 veranschaulicht die Region von CPMV M RNA, welche für die Aminoterminalen 40 Aminosäuren von VP23 codiert. Die Ziffern unter der Nukleotidsequenz beziehen sich auf die M RNA-Sequenz und die Position der einzelnen Nhe1-Stelle wird angezeigt. Die Aminosäuren, die an der Bildung der &bgr;B- und &bgr;C-Stränge von VP23 beteiligt sind, sind über der Aminosäuresequenz des Proteins angezeigt, welches unter Verwendung des üblichen Ein-Buchstaben-Codes gezeigt ist.

2 veranschaulicht (A) die Oligonukleotidsequenz, die bei der Konstruktion von pFMDV verwendet wird, zusammen mit der Aminosäuresequenz, die durch den oberen (positiven) Strang codiert wird, welcher den Aminosäureresten 136–160 aus VP1 des FMDV-Serotyps O1 entspricht, und (B) die Struktur von VP23 nach Insertion der FMDV-spezifischen Oligonukleotide. Die durch den Pfeil angezeigte Region zeigt die Größe des insertierten FMDV-Epitops an. Die Nhe1-Stelle, die während der Klonierung nicht wieder hergestellt wird, ist durch xNhe1 angezeigt. Die diagnostische BglII-Stelle, die in der insertierten Sequenz vorliegt, ist auch angezeigt.

3 veranschaulicht die Wirkung der Insertion der FMDV-spezifischen Oligonukleotide, die für Aminosäurereste 136–160 von VP1 von FMDV-Serotyp O1 codieren, auf die Struktur von VP23 in pMT7-FMDV-I an. Die Aminosäuren, die an der Bildung der &bgr;B- und &bgr;C-Stränge von VP23 beteiligt sind, sind über der Aminosäuresequenz des Proteins angezeigt, welches unter Verwendung des üblichen Ein-Buchstaben-Codes gezeigt ist.

4 veranschaulicht die Konstruktion eines "Substitutions"-Vektors durch ortsspezifische Mutagenese. Der Stern zeigt den T-Rest an, der durch ortsspezifische Mutagenese in ein C umgewandelt wird, wodurch eine neue AatII-Stelle erzeugt wird.

5 veranschaulicht (A) die Nukleotidsequenz der bei der Konstruktion von pMT7-HIV verwendeten Oligonukleotide zusammen mit der Aminosäuresequenz, die durch den oberen (positiven) Strang codiert wird, welche den Aminosäureresten 735–752 von gp41 von HIV1 entspricht, und (B) die Struktur von VP23 nach Insertion der HIV-spezifischen Oligonukleotide.

Die durch den Pfeil gekennzeichnete Region zeigt die Größe des insertierten HIV-Epitops an. Die diagnostische Pvu1-Stelle, die in der insertierten Sequenz vorliegt, ist auch angezeigt.

6 veranschaulicht (A) die Nukleotidsequenz der bei der Konstruktion von pMT7-HRV verwendeten Oligonukleotide zusammen mit der Aminosäuresequenz, die durch den oberen (positiven) Strang codiert wird, welcher den Aminosäureresten 85–99 von VP1 von HRV-14 entspricht, und (B) die Sequenz von VP23 nach Insertion der HRV-spezifischen Oligonukleotide. Die durch den Pfeil gekennzeichnete Region zeigt die Größe des insertierten HRV-Epitops an. Die diagnostische Cla1-Stelle, die in der insertierten Sequenz vorliegt, ist auch angezeigt.

7 veranschaulicht die Wirkung der Insertion der FMDV-spezifischen Oligonukleotide (fettgedruckt dargestellt), die für Aminosäurereste 141–160 aus VP1 von FMDV-Serotyp O1 codieren, auf die Sequenz von VP23 in pMT7-FMDV-II.

8: Oligonukleotidsequenz, die zur Konstruktion von pMT7-FMDV-V, pMT7-HRV-II und pMT7-HIV-III verwendet wird. Alle verwendeten Oligonukleotide terminierten in den am oberen Ende des Schaubilds fett gezeigten Sequenzen. Die variablen, zur Konstruktion von pMT7-FMDV-V (FMDV-V), pMT7-HRV-II (HRV-II) und pMT7-HIV-III (HIV-III) verwendeten Abschnitte sind unten gezeigt. Die Aminosäuresequenzen, die durch die Plus-Sense-Oligonukleotide codiert sind, sind über der Nukleotidsequenz angezeigt und entsprechen wie folgt: FMDV-V, den Aminosäuren 141–160 aus VP1 von FMDV-Serotyp O1; den HRV-II-Aminosäuren 85–98 aus VP1 von HRV-14; den HIV-III, Aminosäuren 731–752 aus gp41 von HIV-I.

9: Neutralisierung von HIV-1 IIIB durch Seren aus einzelnen C57/BL6-Mäusen, denen zwei subkutane Injektionen der CPMV-HIV-1-Chimären verabreicht wurden, die Aminosäuren 731–752 von gp41 auf dessen Oberfläche exprimieren (nicht gefüllte Balken). Die Mäuse wurden nach 14 Tagen zur Ader gelassen. Der mittlere Serum-Neutralisierungstiter einer parallelen Mäusegruppe, die mit dem Wildtyp CPMV geimpft wurde, ist auch gezeigt (ausgefüllte Balken). Alle Immunogene wurden in einem Alaunhilfsmittel formuliert.

Modifizierung von CPMV

Verfahren zum Manipulieren des Genoms des Virus zur Bildung von Insertionen in das Hüllprotein von CMPV sind in WO 92/18618 beschrieben. Ein Volllängen-cDNA-Klon von CPMV M RNA in dem Transkriptionsvektor pPMI (pPMM2902) sowie ein Volllängen-cDNA-Klon von CPMV B RNA (pBT7-123) ist erhältlich. Ein Gemisch von Transkripten aus pPMM2902 und pBT7-123 führt nach Elektroporieren in Kuherbsen-Protoplasten zu einer vollständigen Virusinfektion.

Wir haben die &bgr;B-&bgr;C-Schleife in VP23 zur Insertion von Fremdpeptid ausgewählt. Diese Schleife ist deutlich auf der Oberfläche des Viruspartikels exponiert und Modellerstellung mittels Computer hat gezeigt, dass sogar große Schleifen, die an dieser Stelle insertiert sind, die Wechselwirkung zwischen benachbarten Untereinheiten, die für die Capsidstruktur und -stabilität verantwortlich sind, wahrscheinlich nicht beeinträchtigen. Diese Schleife weist eine einzelne Nhe1-Stelle an Position 2708 der M RNA-spezifischen Sequenz auf, an welcher Fremdsequenzen insertiert werden können (siehe 1).

Die Hauptantigenstellen des Picornavirus der Maul- und Klauenseuchenkrankheit (FMDV) und des humanen Rhinovirus (HRV) sowie des Lentiretrovirus des Human Immune Deficiency Virus (HIV) wurden zur Veranschaulichung der Verwendung von modifizierten Pflanzenviren bei der Herstellung von Impfstoffen für Tierviren verwendet.

Das Entwerfen und die Konstruktion von pFMDV, eines Volllängen-cDNA-Klons von CPMV M RNA, die ein DNA-Insert enthält, welches für ein Segment des FMDV-Schleifenproteins codiert, ist in WO 92/18618 beschrieben. Eine Oligonukleotidsequenz, die für Aminosäurereste 136–160 aus VP1 von FMDV-Serotyp O1, Stamm BFS 1860 codiert, wurde in die einzelne Nhe1-Stelle von pPMM2902 zusätzlich zu der vorhandenen Nukleinsäure insertiert. Der verwendete Vorgang führte zur Erzeugung einer direkten Wiederholungssequenz, die an das Insert angrenzt (siehe 2B). Die Eigenschaften von pFMDV-Transkripten sind in WO 92/18618 beschrieben. Infektion von Kuherbsen-Protoplasten mit einem Gemisch aus pFMDV und pBT7-123-Transkripten führt zur Vermehrung und zur Zusammenfügung modifizierter Viruspartikel.

Zur Herstellung modifizierter Pflanzenviren im Großmaßstab ist es jedoch notwendig, ein Konstrukt herzustellen, welches direkt auf ganze Pflanzen geimpft werden kann und welches wie in dem Protoplastensystem Viruspartikel repliziert und sich zu Viruspartikeln zusammenfügt. Daher wurde pPMM2902 so modifiziert, dass RNA-Synthese durch einen effizienteren Promotor gesteuert wird und dass das modifizierte Plasmid unter Bedingungen transkribiert wird, die zu Transkripten mit einer "Cap"-Struktur an deren 5'-Enden führen. Die Schritte bei der Modifizierung von pPMM2902 zur Herstellung von pMT7-601 sind ausführlich in WO 92/18618 beschrieben. Es wurde nachgewiesen, dass ein Gemisch von pMT7-601- und pBT7-123-Transkripten, die eine Cap aufwiesen, für unversehrte Kuherbsen-Pflanzen infektiös war.

Das Entwerfen und die Konstruktion von pMT7-FMDV-I, ausgehend von pMT7-601 und pFMDV, sind in WO 92/18618 beschrieben. Eine Oligonukleotidsequenz, die für Aminosäurereste 136–160 aus VP1 vom FMDV-Serotyp O1 codiert, wurde in die einzelne Nhe1-Stelle von pMT7-601 zusätzlich zu der vorliegenden Nukleinsäure insertiert. Der verwendete Vorgang führte zur Erzeugung einer direkten Wiederholungssequenz, die an das Insert angrenzt (siehe 3). Die Eigenschaften von pMT7-FMDV-I-Transkripten sind ausführlich in Usha et al. [Virology (1993) 197, 366–374] beschrieben.

Pflanzen, die mit einem Gemisch aus pMT7-FMDV-I- und pBT7-123-Transkripten beimpft wurden, entwickelten auf ihren beimpften Blättern Läsionen, die kleiner als diejenigen waren, die auf den Blättern von Pflanzen beobachtet wurden, die mit Wildtyp-Transkripten beimpft wurden. Immunosorbent-Elektronenmikroskopie auf Blatthomogenisaten aus beimpften Blättern von pMT7-FMDV-I-infizierten Pflanzen bestätigten das Vorliegen von CPMV-artigen Viruspartikeln. Es lag jedoch kein Nachweis systemischer Verbreitung der chimären Viruspartikel auf unbeimpfte Blätter vor.

Wir haben daher die Nachkommenschaft einer pMT7-FMDV-I-Infektion durch reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion-(RT-PCR)-Analyse von aus Blättern extrahierter RNA untersucht, die mit pMT7-FMDV-I beimpft wurden. Die Analyse ergab das Vorliegen von zwei Produkten, wobei das größere Podukt dem erwarteten Produkt von etwa 580 bp entsprach, und ein kleineres Produkt von 500 bp. Das letztere Produkte wanderte mit dem Produkt, welches aus RNA synthetisiert wurde, die aus einer mit Wildtyp-CPMV infizierten Pflanze extrahiert wurde, mit. Bei Klonierung der PCR-Produkte in Bacteriophagen M13 und Bestimmung der Sequenz um die Insertionsstelle herum konnten zwei Klassen von Klonen nachgewiesen werden: diejenigen, welche die gesamte FMDV-spezifische Sequenz (die Mehrheit) beibehielten, und diejenigen, welche eine Sequenz enthielten, die genau dem Wildtyp-CPMV entsprach (die Minderheit). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Rückbildung zur Wildtyp-Sequenz in den mit dem Transkript beimpften Blättern durch einen offensichtlichen Ein-Schritt-Vorgang stattfindet.

Wenn RNA, die aus einem mit pMT7-FMDV-I-Transkript beimpften Blatt extrahiert wurde, auf nicht infizierte Kuherbsen passagiert wurde, entwickelten die. Pflanzen Symptome auf deren beimpften Blättern, welche aus einem Gemisch von kleinen Läsionen bestanden, die für eine pMT7-FMDV-I-Infektion und größere Wildtyp-CPMV-Läsionen charakteristisch sind. Zusätzlich entwickelten die oberen Blätter mosaikartige Symptome, die für eine Wildtyp-CPMV-Infektion charakteristisch sind. RT-PCR-Analyse von aus den beimpften Blättern solcher Pflanzen extrahierter RNA ergaben wiederum zwei Produkte, in diesem Fall entsprach das überwiegende Produkt jedoch demjenigen, das aus Wildtyp-M RNA stammte. Analyse von Klonen, die aus dem überwiegenden Gemisch von PCR-Produkten stammten, ergaben wieder dieselben zwei Sequenzklassen, die zuvor nachgewiesen wurden. In diesem Fall stellte die Mehrheit der Klone jedoch die Wildtyp-Sequenz dar. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass nicht nur pMT7-FMDV-I dazu neigt, die gesamte FMDV-spezifische Sequenz in einem Ein-Schritt-Vorgang zu verlieren, möglicherweise als Folge des Vorliegens direkter Wiederholungen, die an das Insert angrenzen, sondern auch, dass der Wildtyp-Virus der Nachkommenschaft einen wesentlichen Vorteil gegenüber dem chimären Virus aufweist.

Zur Vermeidung der Erzeugung direkter Wiederholungssequenzen, die an das Insert angrenzen, wurde eine zweite Restriktionsenzymschnittstelle in der Nukleotidsequenz der Region des CPMV-Genoms, das für VP23 codiert, erzeugt. Ein einzelner stiller Basenaustausch (U gegen C) an Position 2740 der M RNA erzeugt eine einzelne AatII-Stelle bei Aminosäure Valin 27 (Position 2735 der Nukleotidsequenz). Dies wurde durch ortsspezifische Mutagenese von M13-JR-1 unter Verwendung von in WO 92/18618 beschriebenen Verfahren erreicht (siehe 4). Die Erzeugung der AatII-Stelle ermöglicht es, dass die Nukleotidsequenz, die für die sechs Aminosäuren aus der nativen &bgr;B-&bgr;C-Schleife in CPMV codiert, durch Verdau mit NheI und AatII entfernt wird. Die Sequenz kann anschließend durch eine beliebige Sequenz mit NheI- und AatII-kompatiblen Enden ersetzt werden.

Konstruktion von pMT7-FMDV-II, pMT7-HIV und pMT7-HRV

Drei unterschiedliche Sequenzen wurden entworfen, die durch die Sequenz zwischen den NheI- und AatII-Stellen der mutierten M RNA-Sequenz auszutauschen sind. In allen drei Fällen codierten die Fremdsequenzen, die durch die Wildtyp-Sequenzen ausgetauscht wurden, für sechs Aminosäuren. Die erste in VP23 zu substituierende Sequenz bestand aus Oligonukleotiden, die für die Reste 735–752 aus dem Transmembranglykoprotein gp41 des Human Immuno Deficiency Virus (HIV-1) codieren. Diese Sequenz wurde ausgewählt, da ein synthetisches Peptid für diese Region in Enzymgekoppelten Immunabsorptionsassays (ELISA) durch Antiseren aus seropositiven AIDS-Patienten erkannt wird und in der Lage ist, Antikörper zu erzeugen, welche eine Reihe von HIV-Isolaten neutralisieren. Die zweite Sequenz besteht aus der Nukleotidsequenz, die für Reste 85–99 aus VP1 des humanen Rhinovirus 14 (HRV-14) codiert. In beiden Fällen wurden die Oligonukleotide zur Erleichterung des Durchmusterns so entworfen, dass sie Restriktionsenzymstellen enthalten. Die Sequenzen der Oligonukleotide und die Wirkung der Substitutionen auf die Aminosäuresequenz von VP23 sind in 5 und 6 gezeigt. Die zur Konstruktion von pMT7-HIV und pMT7-HRV verwendeten Verfahren sind in WO 92/18618 beschrieben.

Die dritte Sequenz bestand aus Nukleotiden, die für Reste 141–160 aus VP1 vom FMDV-Serotyp O1 codieren. Die Wirkung der Substitution auf die Aminosäuresequenz von VP23 ist in 7 gezeigt. Das zur Konstruktion von pMT7-FMDV-II verwendete Verfahren ist in Usha et al. (1993) beschrieben.

Die Eigenschaften der pMT7-HIV- und pMT7-FMDV-II-Transkripte sind jeweils in WO 92/18618 und Usha et al. (1993) beschrieben. Wenn die pMT7-HIV-Transkripte mit pBT7-123-Transkripten gemischt werden, können sie in Kuherbsen-Protoplasten replizieren und das sich ergebende modifizierte Hüllprotein kann sich zu chimären Viruspartikeln zusammenfügen. Auf ähnliche Art und Weise können pMT7-FMDV-II-Transkripte in Kuherbsen-Protoplasten replizieren, jedoch reichert sich die RNA der Nachkommenschaft in einer beträchtlich geringeren Menge an als diejenige aus pMT7-FMDV-I oder aus pMT7-601, welche die Wildtyp-VP23-Sequenz enthält. In Protoplasten, die mit pMT7-FMDV-II infiziert waren, konnten keine Viruspartikel nachgewiesen werden. Die Fähigkeit von Transkripten, die von pMT7-FMDV-II abstammen, sich in ganzen Kuherbsen-Pflanzen zu vervielfachen, wurde auch von Usha et al. (1993) untersucht. Auf beimpften Pflanzen konnte keine Entwicklung von Symptomen nachgewiesen werden und RNA der Nachkommenschaft konnte weder auf den beimpften noch auf den oberen Blättern nachgewiesen werden.

Das verminderte Infektionsvermögen von pMT7-FMDV-II kann auf die sich ergebenden chimären Viruspartikel zurückgeführt werden, die keine Aminosäuresequenz aufweisen, welche im Wildtyp-Virus und im chimärem Virus, der bei pMT7-FMDV-I-Infektionen produziert wird, vorliegt und welche zur Virusreplikation und -verbreitung in der Pflanze wichtig ist.

Beispiel 1 Konstruktion von pMT7-FMDV-V, pMT7-HRV-II und pMT7-HIV-III

Der Phänotyp von pMT7-FMDV-I mit der geringen Läsion und dessen kompetitiver Nachteil im Vergleich zu Wildtyp-CPMV legt nahe, dass die heterologe Sequenz an einer weniger optimalen Stelle insertiert worden ist. Ausführliche Untersuchung der 3D-Struktur von CPMV ergab, dass Prolin 23 (Pro23), welches im Zentrum der &bgr;B-&bgr;C-Schleife des S-Proteins liegt, auf der Virusoberfläche besonders exponiert ist und die potenziell optimale Stelle für eine beliebige Insertion darstellt. Um von dieser Tatsache Gebrauch zu machen und zur Verhinderung der Einführung von wiederholten Sequenzen, welche die Rückbildung erleichtern können, wurden Paare von komplementären Oligonukleotiden synthetisiert, wobei die Sequenz, die für die heterologen Aminosäuren codiert, an Sequenzen angrenzt, die in Wildtyp-CPMV vorliegen, sodass das Insert Pro23 unmittelbar vorangeht. Die Oligonukleotide sind so terminiert, dass ihre Enden mit NheI und AatII kompatibel sind, wodurch möglich wird, dass sie zwischen den NheI- und AatII-Stellen entweder von pMT7-FMDV-II (Usha et al. (1993)) oder dessen Derivat pMT7-FMDV-II AatII anstelle des ursprünglichen FMDV-spezifischen Inserts insertiert werden. Eine solche Vorgehensweise stellt nicht nur sicher, dass die heterologen Sequenzen an der optimalen Stelle insertiert werden und dass die Inserts nicht an direkte Wiederholungen angrenzen, sie stellt jedoch auch sicher, dass keine CPMV-spezifischen Sequenzen deletiert werden, welches eine Tatsache darstellt, von der man glaubt, dass sie eine wesentliche Rolle beim Zusammenfügen der Viruspartikel spielt (Usha et al. (1993)). Die auf diese Art und Weise insertierten Sequenzen bestanden aus Resten 141–160 von VP1 vom FMDV-Serotyp O1(eine etwas kürzere Version des Epitops pMT7-FMDV-1), Resten 85–98 von VP1 von HRV-14, welches die immunodominante Stelle bilden, NIm-IA [Sherry et al., J. Virology (1986) 57, 246–257] und einem Epitop, welches Reste 731–752 von gp41 von HIV, das sogenannte "Kennedy-Epitop", umfasst [Kennedy et al., Science, (1986) 231, 1556–1559]. Die in den Konstruktionen verwendete Oligonukleotidsequenz ist in 8 gezeigt. Die sich ergebenden Konstrukte wurden jeweils als pMT7-FMDV-V, pMT7-HRV-II und pMT7-HIV-III bezeichnet.

Die Konstruktion und Eigenschaften der Plasmide pBT7-123, pMT7-FMDV-I und pMT7-FMDV-II sind zuvor beschrieben worden (Usha et al., 1993). Diese Konstrukte und deren Derivate wurden im Escherichia coli-Stamm JM83 vermehrt. Oligonukleotide wurden auf einem Pharmacia Gene Assembler Plus-Synthesiser synthetisiert. Sequenzanalyse wurde durch "Dideoxy"-Verfahren unter Verwendung entweder von E.coli DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) oder SequenaseTM Version 2.0 durchgeführt.

Zur Konstruktion von pMT7-FMDV-V wurde pMT7-FMDV-II vollständig mit NheI (welches an Position 2708 der M RNA-Sequenz spaltet) und teilweise mit AatII, welches einmal innerhalb der M RNA-Sequenz (Position 2735), und einmal in dem vom pUC-stammenden Abschnitt des Plasmids (Position 2617 auf der pUC19-Karte) schneidet. Ein Paar komplementärer Oligonukleotide, die für Reste 141–159 aus VP1 vom FMDV-Serotyp O1 codieren, die an Sequenzen angrenzen, die für Reste 18–22 und 23–26 des CPMV VP23-Proteins codieren (8), wurden phosphoryliert, aneinander gelagert und in NheI/AatII-verdautem pMT7-FMDV-II ligiert. Rekombinante mit der gewünschten Struktur wurden durch Restriktionsenzym-Kartierung und Sequenzanalyse identifiziert.

Zur Konstruktion von pMT7-HRV-II und pMT7-HIV-III wurde pMT7-FMDV-II zunächst teilweise mit AatII und linearen Volllängen-Molekülen, die nach der Agarosegelelektrophorese gewonnen wurden, teilweise verdaut. Das linearisierte Plasmid wurde mit E.coli DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) zur Entfernung der 3'-Überhänge, die von AatII zurückgelassen wurden, behandelt, rezirkularisiert und wieder in den E.coli-Stamm JM83 transformiert. Eine Rekombinante, die mit pMT7-FMDV-AatII bezeichnet wurde, in welcher die AatII-Stelle in dem pUC-Abschnitt des Plasmids zerstört worden war, welche jedoch die AatII-Stelle in dem mRNA-spezifischen Abschnitt beibehielt, wurde durch Restriktionsenzymanalyse identifiziert. Komplementäre Oligonukleotide, die für Reste 85–98 aus VP1 von HRV-14 oder Reste 731–752 von gp41 von HIV-I codieren, welche an die geeigneten CPMV-spezifischen Sequenzen angrenzten, wurden phosphoryliert, aneinander gelagert und in NheII/AatII-verdautes pMT7-FMDV-AatII ligiert, was pMT7-HRV-II bzw. pMT7-HIV-III ergab.

Beispiel 2 Fähigkeit von pMT7-FMDV-V, pMT7-HRV-II und pMT7-HIV-III zur Replikation in ganzen Kuherbsen-Pflanzen

Wenn RNA aus den chimären Plasmiden transkribiert wurde, mit Transkripten aus pBT7-123 gemischt und auf Kuherbsen-Pflanzen geimpft wurde, entwickelten die beimpften Blätter in jedem Fall chlorotische Läsionen, die für eine Wildtyp-CPMV-Infektion typisch ist. RNA-Hybridisierungsanalyse ergab das Vorliegen von M RNA-spezifischen Sequenzen innerhalb dieser Blätter. In allen drei Fällen konnte die Infektion mechanisch auf weitere gesunde Kuherbsen-Pflanzen übertragen werden. Im Fall von pMT7-HRV-II und pMT7-HIV-III verbreitete sich die Infektion auf die oberen Blätter der meisten der infizierten Pflanzen, wodurch sich ein typisches systemisches Mosaik ergab. Die durch pMT7-FMDV-V ausgelöste Infektion stand weiterhin ausschließlich mit den beimpften Blättern in Zusammenhang, wobei keine systemischen Symptome beobachtet wurden und keine Virus-spezifische RNA in den oberen Blättern der Pflanzen nachgewiesen wurde.

Bei Extraktion der Gesamt-RNA aus Blättern, die mit pMT7-FMDV-V-Transkripten beimpft und mittels RT-PCR analysiert wurden, wurde nur eine einzelne Bande beobachtet, die größenmäßig dem Produkt entsprach, welches aus der das Insert beibehaltenden RNA stammte. Sogar nach drei aufeinanderfolgenden Passagen wurde ein ähnliches Ergebnis erhalten. Zur Bestätigung, dass das Insert beibehalten worden war, wurden die Produkte, die aus Proben stammten, die den Pflanzen nach anfänglicher Beimpfung und nach drei aufeinanderfolgenden Passagen entnommen wurden, in Bacteriophage M13 kloniert, und die Nukleotidsequenz einer repräsentativen Anzahl an Klonen wurde bestimmt. Alle Klone enthielten in beiden Fällen die Sequenz, die viraler RNA entspricht, welche die insertierte unversehrte Sequenz beibehielten. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die Rückbildung von pMT7-FMDV-V RNA nicht mit einer nachweisbaren Häufigkeit auftrat. Analyse von RNA, die aus gereinigten pMT7-HRV-II- und pMT7-HIV-III-Partikeln extrahiert wurde (siehe unten), unterstützte die Schlussfolgerung, dass neue Konstrukte genetisch stabil sind, wobei nach 10 aufeinanderfolgenden Passagen kein Anzeichen einer Rückbildung nachgewiesen wurde.

Viruspartikel konnten unter Verwendung des standardmäßigen CPMV-Reinigungsprotokolls [van Kammen und de Jager, (1978), Cowpea mosaic virus. CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses, 197] aus Blattgewebe, welches entweder mit pMT7-HRV-II oder pMT7-HIV-III infiziert wurde, hergestellt werden, wobei die erhaltenen Ausbeuten (1,2–1,5 mg Virus pro Gramm frischem Gewebe) denjenigen ähnlich waren, die mit Wildtyp-CPMV erhalten wurden. Im Gegensatz dazu konnten unter Verwendung des Standardverfahrens oder einer Reihe von Varianten davon keine Partikel erhalten werden, die von MT7-FMDV-V abstammten. Dieser Fehlschlag lag nicht an der Abwesenheit von Partikeln innerhalb des infizierten Gewebes, da eine große Anzahl solcher Partikel durch Immunoabsorptionselektronen-Mikroskopie (ISEM) von Gewebehomogenat unter Verwendung von Gittern, die mit Anti-CPMV-Serum beschichtet waren, beobachtet werden konnten.

Beispiel 3 Immunologische Eigenschaften chimärer Viruspartikel die aus pMT7-HRV-II und pMT7-HIV-III stammen

Zur Bestätigung, dass gereinigte pMT7-HRV-II-Partikel die antigenen Eigenschaften der insertierten Sequenz besitzen, wurden Proben der gereinigten Virionen Western Blot-Analyse unter Verwendung eines polyklonalen Antiserums, welches gegen HRV-14 gerichtet ist, unterworfen. Ein Produkt, das größenmäßig dem modifizierten VP23-Protein entsprach, konnte nachgewiesen werden, wodurch die Antigenizität der insertierten Sequenz bestätigt wurde. Wenn Proben von Wildtyp-CPMV auf dieselbe Art und Weise analysiert wurden, konnte keine Reaktion mit dem Antiserum beobachtet werden.

Bei Untersuchung einer Probe des denaturierten Virus durch Elektrophorese auf einem SDS-Polyacrylamidgel konnten nur drei Banden beobachtet werden. Das größte Polypeptid (L) entspricht dem großen (VP37) viralen Hüllprotein und wanderte mit dem L-Polypeptid aus Wildtyp-CPMV mit. Die mittlere Bande (SS) entspricht dem kleinen (VP23) viralen Hüllprotein, welches das HIV-1-spezifische Epitop beherbergt. Die am schnellsten wandernde Bande (S') stellt die C-terminalen 192 Aminosäuren des VP23-Proteins dar. Sequenzanalyse der Enden zeigte durch proteolytische Spaltung zwischen den C-terminalen Aminosäureresten des Inserts, dass sie aus dem VP23-Protein stammte. Daher enthält SS, nicht jedoch S', das Insert und reagiert, wie vorhergesagt, im Western-Blot mit gp41-spezifischem Antikörper. Das vorhergesagte N-terminale Spaltprodukt besteht nur aus 43 Resten und konnte nicht auf dem verwendeten Gelsystem aufgelöst werden. Beide Elemente von S blieben mit dem Virion verbunden. Da eine bestimmte Menge an S'-Protein stets in Zubereitungen von CPMV-HIV unabhängig davon vorlag, wie schnell der Virus gereinigt wurde, ist es möglich, dass diese Spaltung in Pflanzen auftritt.

Diese zur Überwindung der Nachteile von pMT7-FMDV-I entwickelte Vorgehensweise hat sich als erfolgreich erwiesen, da alle drei der neuen Chimären (pMT7-FMDV-V, pMT7-HRV-II und pMT7-HIV-III) Wildtyp-Symptome auf den beimpften Blättern ergaben und kein Anzeichen von Rückbildung zeigten. Darüber hinaus entwickelten sich zwei der Chimäre wie Wildtyp-CPMV und konnten leicht gereinigt werden. Die Tatsache, dass pMT7-FMDV-V auf beimpften Blättern Wildtyp-Läsionen ergab, sich jedoch nicht systemisch verbreiten konnte, legt nahe, dass diese chimären Viruspartikel für Zell-zu-Zell-Bewegung vollständig kompetent, jedoch für Langstrecken-Transport unzureichend sind. Diese Erscheinung kann mit der Beobachtung zusammenhängen, dass Partikel aus pMT7-FMDV-V scheinbar zu intrazellulären kristallinen Anordnungen aggregieren, was die Reinigung problematisch macht. Diese Eigenschaften sind nicht die Folge der Länge der heterologen Sequenz, da pMT7-FMDV-V ein Insertzwischenprodukt enthält, das in seiner Größe (19 Reste) zwischen denjenigen, die in pMT7-HRV-II (14 Reste) und pMT7-HIV-III (22 Reste) enthalten sind, liegt.

Beispiel 4 Verwendung chimärer pMT7-HRV-II-Viruspartikel zur Erzeugung von Antikörpern gegen HRV

Partikel von pMT7-HRV-II und Wildtyp-CPMV wurden wie in Beispiel 2 beschrieben gereinigt, in Kaninchen injiziert, die Antiseren wurden gesammelt und als Sonden für Western Blots von denaturierten HRV-14-Viruspartikeln verwendet. Eine einzelne Bande, die VP1 von HRV-14 entsprach, konnte sogar bei einer Verdünnung des Serums von 1:16000 unter Verwendung des Antiserums detektiert werden, welches gegen pMT7-HRV-II-Viruspartikel gerichtet war. Keine Reaktion konnte bei den anderen HRV-14-Hüllproteinen (VP2 und VP3) beobachtet werden. Bei Verwendung von gegen Wildtyp-CPMV gerichtetem Serum als Sonden für Blots konnte keine Reaktion mit einem beliebigen HRV-14-Protein nachgewiesen werden. Die Fähigkeit von pMT7-HRV-II-Virionen zur Erzeugung von Antikörpern, welche VP1 von HRV-14 erkennen, zeigt, dass Epitope, die auf der Oberfläche von CPMV-Partikeln präsentiert werden, immunogen sind.

Beispiel 5 Verwendung chimärer pMT7-HIV-III-Viruspartikel zur Erzeugung von neutralisierenden Antikörpern gegen HIV

Transkripte, die aus pMT7-HIV-III stammten, wurden mit Transkripten gemischt, die aus Plasmid pBT7-123 stammten und auf die Blätter von 10 Tage alten Kuherbsen-Pflanzen geimpft. Um große Ausbeuten von rekombinanten Viruspartikeln zu erhalten, wurden Proben von Blattgewebe, welche für eine CPMV-Infektion charakteristische Symptome zeigten, in 100 mM Natriumphosphat mit einem pH-Wert von 7,0 homogenisiert, kurz zentrifugiert und der Überstand wurde zur Beimpfung gesunder Kuherbsen-Pflanzen verwendet. Die Pflanzen wurden 2–3 Wochen nach der Beimpfung geerntet und chimäre Viruspartikel wurden wie in Beispiel 2 beschrieben gereinigt. Der gereinigte chimäre Virus, welcher als CPMV-HIV-I bezeichnet wurde, wurde bei 4 °C in 10 mM Natriumphosphat mit einem pH-Wert von 7,0 in Gegenwart von 0,05 % (w/v) Natriumazid gelagert. Die Qualität der Zubereitung wurde durch Elektronenmikroskopie und durch Elektrophorese von Abschnitten von denaturiertem Virus auf 15 % Polyacrylamid/SDS/reduzierenden Gelen kontrolliert. Die Proteine wurden durch Anfärben des Gels mit Coomassiebrilliantblau R250 sichtbar gemacht. Vor der Injektion in Mäuse wurde die Viruszubereitung gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung dialysiert und die Proteinkonzentration wurde mittels Bio-RadTM-Assay bestimmt.

Erwachsene C57/BL6-Mäuse wurden im Alter von 8 Wochen immunisiert. Virus (CPMV-HIV-I oder CPMV) wurde mit Aluminiumhydroxid-Adjuvans in einem Verhältnis von 1:5 unter Rühren für 30 min bei Raumtemperatur gemischt. Mäuse (6 pro Gruppe) wurden subkutan am hinteren Nacken an 5 Stellen mit einer Gesamtmenge von 100 &mgr;l Virus-Adjuvans-Gemisch, das 100 &mgr;g Virus enthielt, immunisiert. In den erforderlichen Zeitabständen wurde den Tieren aus dem Schwanz Blut entnommen und Serum wurde bei –20 °C gelagert. Alle Seren wurden bei 56 °C für 30 min erwärmt, bevor sie auf neutralisierende Antikörper hin untersucht wurden.

Mäusen wurden am Tag 0 und 35 zwei Injektionen von CPMV-HIV-I oder Wildtyp-CPMV verabreicht und 14 Tage später wurde Blut aus dem Schwanz entnommen. Einzelne neutralisierende Titer für HIV-1 IIIB wurden anschließend wie folgt bestimmt. Verdünnungen von wärmebehandeltem Serum wurden mit etwa 2000 Synzytium-bildenden Einheiten (sfu) pro ml Virus für 1 h bei 37 °C inkubiert. Semikonfluente Monoschichten von C8166-Zellen (5 × 104 Zellen/Vertiefung) wurden in Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen hergestellt, welche mit Poly-L-Lysin vorbehandelt worden waren. Medium wurde entfernt und die Zellen erreichten 50 &mgr;l Impfstoff. Diese wurden für 1 h bei 37 °C inkubiert, bevor frisches Medium hinzugefügt wurde. Die Inkubation wurde für 3 Tage bei 37 °C fortgeführt und Synzytia wurden anschließend mittels eines Mikroskops gezählt und die prozentuale Hemmung wurde für jede Vertiefung berechnet.

9 zeigt, dass neutralisierende Antikörper in Mäusen hergestellt wurden, die mit CPMV-HIV-I mit einem 50 % neutralisierenden Titer von etwa 1/1000 in 83 % der Mäuse immunisiert wurden. Antiserum, welches 1/100 verdünnt wurde, ergab einen mittleren Neutralisierungstiter von 97 %, wobei 100 % Mäuse reagierten. Die Reaktion war äußerst gleichmäßig. 9 zeigt auch, dass eine Kontrollgruppe, der parallel Wildtyp-CPMV injiziert wurde, auch eine neutralisierende Reaktion gegenüber HIV-I ergab. Der Neutralisierungstiter war etwa 10 mal geringer als mit CPMV-HIV-I mit einem 50 % Neutralisierungstiter für etwa 1/100. Dies war offensichtlich eine de novo-Antikörperreaktion, da sogar bei einer Verdünnung von 1/10 keine wesentliche Neutralisierung mit Serum aus nicht-immunisierten „Litter Mate"-Mäusen vorlag.

Die Stabilität der neutralisierenden Antikörper-Reaktion auf die CPMV-HIV-Chimären wurde durch Blutentnahme der Mäuse, die wiederum nach 48 Tagen nach der zweiten Injektion stattfand, untersucht. Diese Antiseren wiesen bei einer Verdünnung von 1/10 keinen signifikanten Neutralisierungstiter auf, was darauf hindeutet, dass die Konzentration an neutralisierendem Antikörper um mehr als das 100-fache abgenommen hat. Die neutralisierende Aktivität, die durch Wildtyp-CPMV stimuliert wurde, war jetzt ebenso nicht mehr nachweisbar.

Denselben Mäusen wurde wie zuvor 3 Monate nach der zweiten Injektion eine dritte Injektion von CPMV-HIV-I verabreicht, und 14 Tage später wurden sie zur Ader gelassen. Der mittlere Neutralisierungstiter betrug bei einer 1/1000-Verdünnung 54 %, wobei alle Mäuse nun eine Reaktion zeigten. Bei dieser Verdünnung lag keine Neutralisierung mit Serum aus Mäusen vor, die mit Wildtyp-CPMV verstärkt wurde. Daher bestand lediglich ein geringer allgemeiner Anstieg an neutralisierender Aktivität. Die Stabilität der neutralisierenden Antikörperreaktion auf CPMV-HIV-I wurde mit Antiserum überprüft, welches nach 56 Tagen erhalten wurde. Die Titer waren gesunken, die Antiseren aus allen Mäusen ergaben jedoch immer noch bei einer Verdünnung von 1/10 eine signifikante Neutralisierung mit einem mittleren Wert von 58 %. Die Neutralisierung durch Antiseren aus Kontrollen, die mit Wildtyp-CPMV beimpft wurden, waren kaum signifikant.

Neutralisierung des homologen HIV-I-Stamms IIIB durch Antiserum, welches nach der dritten Injektion erhalten wurde, wurde mit der Neutralisierung von HIV-I-Stämmen RF und SF2 verglichen. Bei einer Verdünnung, bei welcher Stamm IIIB um 92 % neutralisiert wurde, wurde RF um 78 % und SF um 66 % neutralisiert. Antiseren, die gegen Wildtyp-CPMV gerichtet waren, neutralisierten ebenso alle drei Stämme, aber im Verhälntis zu Stamm IIIB neutralisierten diese Antiseren RF und SF2 weniger stark als Antiseren, die gegen CPMV-HIV-I gerichtet waren.

Es wurde bestätigt, dass die neutralisierenden Antikörper in dem Antiserum, welche gegen den Wildtyp-CPMV gerichtet waren, alle für CMPV-Epitope spezifisch waren, wobei kein Antikörper durch Adsorption von Antiseren mit gereinigtem Wildtyp-CPMV gegen das HIV-I-gp41-Peptid gerichtet war. Drei aufeinanderfolgende Adsorptionen mit CPMV verminderten den HIV-1-neutralisierenden Titer des Anti-CPMV-HIV-I-Serums nicht signifikant, jedoch verminderten sie den Neutralisierungstiter des Anti-CPMV-Serums um das 5-fache. Daher kommen wir zum Schluss, dass die Mehrheit der neutralisierenden Antikörper, die gegen die CPMV-HIV-Chimären gerichtet waren, gegen HIV-spezifische Epitope gerichtet waren, dass jedoch CPMV-Antikörper stimuliert, die mit neutralisierenden Epitopen von HIV-I kreuzreagieren.

Beispiel 6 Konstruktion von cDNA-Klonen von CPMV RNA M und B welche direkt zur Beimpfung von Pflanzen verwendet werden können

cDNA-Klone von RNAs M und B von CPMV wurden in pUC18 so konstruiert, dass die 5'-Enden der viralen RNAs direkt an die transkriptionelle Startstelle des CaMV 35S-Promotors angrenzen. Zusätzlich kann der RNA B-Klon (pCP1) durch Restriktionsenzymverdau an einer einzelnen MluI-Stelle genau am 3'-Ende der viralen Sequenz linearisiert werden und der RNA M-Klon (pCP2) kann auf ähnliche Art und Weise mit Eco RI behandelt werden. Daher können nach Verdau mit diesen Enzymen run-off-Transkripte erzeugt werden, welche entweder an deren 5'- oder 3'-Enden keine nicht-viralen Sequenzen enthalten.

Die Klone wurden wie in Dessens et al [Journal of General Virology (1993) 74, 889–892] beschrieben, konstruiert. Der CaMV 35S-Promotor wurde zwischen den HindIII- und PstI-Stellen von pUC18 kloniert, wobei während dieses Vorgangs die HindIII-Stelle verloren ging. Diese Promotorsequenz grenzt an SstII- und Stul-Restriktionsstellen an, wobei die Letztere zur Exponierung der transkriptionellen Startstelle den Verdau der stumpfen Enden ermöglicht. cDNAs wurden für RNAs M und B erzeugt, und die 5'-Hälften davon wurden unabhängig durch Verdau mit SstI bzw. BamHI und Ligation in einen StuI-/SstI- oder StuI-/BamHI-geschnittenen CaMV 35S-Vektor kloniert. Die 3'-Hälften der RNAs wurden unter Verwendung von zuvor konstruierten cDNA-Klonen (pMT7-601 und pBT7-123) in diese Konstrukte kloniert, welche so konstruiert worden sind, dass die 3'-Enden durch Restriktionsenzymverdau genau exponiert werden konnten. RNA M wurde auf einem PstI-/EcoRI-Fragment und RNA B auf einem BglII-/EcoRI-Fragment kloniert.

Der CaMV 35S-Promotor verwendet DNA-abhängige RNA-Polymerasen aus Wirtspflanze und ist äußerst aktiv. Daher kann eine Infektion in dem Pflanzenwirt einfach durch Abreiben der Oberfläche der Primärblätter in Gegenwart eines Gemisches aus linearisiertem pCP1 und pCP2 erzeugt werden. Die Wirtspolymerase steuert die Transkription von viraler RNA des CaMV 35S-Promotors in vivo und in Zellen, in welchen sowohl pCP1 als auch pCP2 transkribiert sind, wird eine Infektion erzeugt, die derjenigen ähnlich ist, die mit Wildtyp-CPMV erhalten wurde. Daher ist ein in vitro-RNA-Transkriptionsschritt nicht mehr erforderlich. Dies stellt einen wesentlichen Vorteil gegenüber dem bisherigen Verfahren zur Beimpfung von Pflanzen sowohl im Hinblick auf einfache Nutzung als auch geringe Kosten dar.

Um die Herstellung von zusammengesetzten Partikeln von CPMV zu ermöglichen, die ein Fremdpeptid enthalten, welches in der &bgr;B-&bgr;C-Schleife des kleinen Capsid-Proteins unmittelbar vor dem Pro23-Rest insertiert worden ist, und wobei die entsprechende Fremdnukleinsäure frei von direkten Sequenzwiederholungen ist, die an das Insert angrenzen und zusätzlich zu der vorhandenen Nukleinsäure in das CPMV-Genom insertiert worden ist, wurde cDNA-Klon pCP2, wie zuvor in dieser Beschreibung für pMT7 beschrieben, mutiert, um eine einzelne AatII-Stelle an Position 2735 der RNA M-Sequenz zu erzeugen. Diese wurde als pCP2-AatII bezeichnet.

Oligonukleotidsequenzen, die für verschiedene Fremdpeptide codieren (siehe Tabelle 1), wurden durch die Sequenz zwischen den NheI- und AatII-Stellen von pCP2-AatII, wie in Beispiel 1 beschrieben, ersetzt. Die pCP2-AatII-Varianten und pCP-1 wurden linearisiert und auf die Pimärblätter von Kuherbsen-Pflanzen geimpft. In allen Fällen entwickelten sich Infektionen, und stabile chimäre Viruspartikel, die geeignetes Fremdpeptid exprimieren, wurden aus Pflanzen gewonnen.


Anspruch[de]
Zusammengesetzte Partikel eines Pflanzenvirus, der ein Fremdpeptidinsert zusätzlich an einer nicht-terminalen Stelle in dem Hüllprotein des Virus enthält, wobei die Stelle des Inserts in dem Hüllprotein einer Stelle in dem Pflanzenvirusgenom entspricht, sodass die Nukleotidsequenz, die an das Insert angrenzt, frei von direkten Sequenzwiederholungen ist, und wobei das Hüllprotein des Virus eine &bgr;-Fassstruktur aufweist und die Insertionsstelle des Fremdpeptids in einer Schleife vorliegt, die die &bgr;-Faltblätter des Pflanzenvirus verbindet. Viruspartikel nach Anspruch 1, wobei das Fremdpeptid ein biologisch funktionelles Peptid ist, wobei dessen biologische Anwendung die Präsentation des Peptids in Assoziation mit einem größeren Molekül oder Partikel erfordert oder dadurch verstärkt wird. Viruspartikel nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Peptid ein Antigen, bevorzugt ein virales Antigen, stärker bevorzugt ein virales Antigen vom Tier (einschließlich Mensch) ist. Viruspartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Fremdpeptid in eine exponierte Oberfläche des Hüllproteins des Pflanzenvirus eingebracht ist. Viruspartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Pflanzenvirus ein RNA-Virus ist. Viruspartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Pflanzenvirus ein Comovirus, bevorzugt ein Kuherbsen-Mosaikvirus (cowpea mosaic virus) (CPMV) ist. Viruspartikel nach Anspruch 6, wobei das Fremdpeptid in die &bgr;B-&bgr;C-Schleife des Pflanzenvirus insertiert ist. Viruspartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Fremdpeptid ein Antigen vom Tier, welches vom Maul- und Klauenseuchenvirus (FMDV), Human Immune Deficiency Virus (HIV), humanen Rhinovirus (HRV) oder caninen Parvovirus abstammt; ein Krankheitserreger-Antigen vom Tier, welches von Staphylococcus aureus abstammt; oder ein Antigen, welches von einem Peptidhormon, bevorzugt Gonadotropin-Releasing-Hormon, abstammt, ist. Impfstoff zum Schutz gegen Krankheitserreger vom Mensch oder Tier, welcher zusammengesetzte Pflanzenviruspartikel nach einem der Ansprüche 3 bis 8 als immunogenen Bestandteil davon umfasst. Verfahren zur Herstellung von Pflanzenviruspartikeln nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Verfahren umfasst: Einbringen einer Nukleotidsequenz, die für ein Fremdpeptid codiert, zur Modifizierung der Pflanzenvirusnukleinsäure, welche für das Hüllprotein codiert, auf eine solche Art und Weise, dass die Erzeugung von direkten Sequenzwiederholungen, die an die eingeführte Sequenz angrenzen, vermieden wird; Infizieren von Pflanzen, Pflanzengewebe, Pflanzenzellen oder Protoplasten mit der modifizierten Virusnukleinsäure; und Ernten von zusammengesetzten Partikeln des modifizierten Virus. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die eingeführte Nukleotidsequenz in denjenigen Teil der Pflanzenvirusnukleinsäure insertiert wird, welche für einen exponierten Teil des Hüllproteins codiert. Verfahren nach Anspruch 10, welches bei einem RNA-Pflanzenvirus angewendet wird, wobei das Verfahren umfasst: Einführen einer DNA-Sequenz, die für das Fremdpeptid codiert, in eine cDNA, die der RNA des Pflanzenvirus entspricht, welche für einen exponierten Teil des Hüllproteins des Pflanzenvirus codiert, Herstellen eines RNA-Transkripts aus der auf diese Weise modifizierten cDNA; Impfen von Pflanzen, Pflanzengewebe, Pflanzenzellen oder Protoplasten mit der auf diese Weise modifizierten cDNA oder einem RNA-Transkript davon, gegebenenfalls zusammen mit einer anderen beliebigen DNA oder RNA, die für die Vermehrung und den Zusammenbau der gesamten Viruspartikel in dem Pflanzenmaterial erforderlich ist; und Ernten der zusammengesetzten Partikel des modifizierten Virus. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die modifizierte cDNA durch Einführen der DNA, die für das Fremdpeptid codiert, in ein DNA-Fragment, welches aus der viralen Pflanzen-cDNA herausgeschnitten wird, hergestellt wird, und Rekombinieren des modifizierten Fragmentes, sodass die virale Pflanzen-cDNA in modifizierter Form wieder hergestellt wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei die Fremdnukleotidsequenz durch Auswählen von zwei unterschiedlichen Restriktionsenzymstellen in der viralen Pflanzennukleinsäure insertiert wird; Schneiden der viralen Pflanzennukleinsäure unter Verwendung der entsprechenden Restriktionsenzyme; und Insertieren eines Paares von komplementären Oligonukleotiden, welche für das Fremdpeptid codieren und welche so terminiert sind, dass die Enden mit den Restriktionsenzym-Schnittstellen kompatibel sind, in die herausgeschnittene virale Nukleinsäure. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Sequenz, die für das Fremdpeptid codiert, in den komplementären Oligonukleotiden an Pflanzenvirusspezifische Sequenzen angrenzt, sodass die Fremdnukleotidsequenz zusätzlich zu der viralen Pflanzennukleinsäure insertiert wird. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei der erzeugte modifizierte Virus oder die daraus extrahierte RNA zur Erzeugung von weiteren Ausbeuten von modifiziertem Virus in Pflanzen passagiert wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei die cDNA eine Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotorsequenz enthält, die an das 5'-Ende des Konstruktes gekoppelt ist. Fragment der cDNA des CPMV-Hüllproteins, welches eine DNA-Sequenz enthält, die für ein Fremdpeptid codiert, zusätzlich an einer nicht-terminalen Stelle, die einer exponierten Oberfläche des Hüllproteins entspricht, wobei die DNA-Sequenz an einer Stelle (i) neben einer Sequenz, welche für einen Prolin- oder Hydroxyprolinrest codiert, in einer Schleife vorliegt, die &bgr;-Faltblätter des CPMV-Hüllproteins verbindet, und (ii) frei von direkten Sequenzwiederholungen ist, die an das Insert angrenzen. Fragment nach Anspruch 18, wobei das Fragment ein SstI-Fragment ist. Vektor, der ein Fragment nach Anspruch 18 oder Anspruch 19 enthält. Vektor, der eine Volllängen-cDNA von CPMV M RNA umfasst, die ein DNA-Insert enthält, das für ein Fremdpeptid codiert, zusätzlich an einer Stelle, die einer exponierten Oberfläche des Hüllproteins des CPMV entspricht, wobei das Fremdpeptid neben einem Prolin- oder Hydroxyprolinrest in einer Schleife vorliegt, die &bgr;-Faltblätter des Hüllproteins verbindet, und wobei der Vektor frei von direkten Sequenzwiederholungen ist, die an das DNA-Insert angrenzen. RNA-Transkript eines Fragmentes oder eines Vektors nach einem der Ansprüche 18 bis 20, bevorzugt ein RNA-Transkript, das eine CAP aufweist.






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