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Dokumentenidentifikation DE60308834T2 15.03.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001482806
Titel UMESTERUNGSREAKTION ZUR HERSTELLUNG VON ESTERN, DIE DEN MILCHPRODUKTGESCHMACK FÖRDERN
Anmelder Fonterra Co-Operative Group Ltd., Auckland, NZ
Erfinder HOLLAND, Ross, PALMERSTON NORTH, NZ;
CROW, Leslie, Vaughan, PALMERSTON NORTH, NZ;
LIU, Quan, Shao, PALMERSTON NORTH, NZ
Vertreter BOEHMERT & BOEHMERT, 28209 Bremen
DE-Aktenzeichen 60308834
Vertragsstaaten AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HU, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, SI, SK, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 20.02.2003
EP-Aktenzeichen 037055563
WO-Anmeldetag 20.02.2003
PCT-Aktenzeichen PCT/NZ03/00029
WO-Veröffentlichungsnummer 2003070010
WO-Veröffentlichungsdatum 28.08.2003
EP-Offenlegungsdatum 08.12.2004
EP date of grant 04.10.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 15.03.2007
IPC-Hauptklasse A23L 1/226(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C11C 3/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C11C 3/10(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A23C 9/12(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A23C 23/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A23C 19/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A23C 13/16(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von geschmacksverbessernden Estern. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft sie insbesondere die Verwendung von Lipasen oder Enzymen aus Milchsäurebakterien bei der Katalyse einer Umesterungsreaktion, um ein Mono-, Di- oder Triglycerid aus einer Milchproduktquelle in gewünschte geschmacksverbessernde Ester umzuwandeln.

Stand der Technik

Verschiedene geschmacksverbessernde Ester sind in Käsesorten vorhanden. Ethylester von Fettsäuren (C2 bis C10) sind besonders reichlich vorhanden. Ethylbutanoat und Ethylhexanoat sind hauptsächlich zum Bewirken von fruchtartigen Geschmacksrichtungen in Rohmilch und Käsen verantwortlich (Bills et al, 1965; McGugan et al, 1975; Horwood et al, 1987; Engels et al, 1997; Friedrich und Acree, 1998). Fruchtartige Geschmacksrichtungen werden im allgemeinen als ein Fehler in Cheddar-Käse betrachtet, werden jedoch von einigen Verbrauchern geschätzt (Urbach, 1995; 1997). Fruchtigkeit ist für einige Käsevariationen vom italienischen Stil, wie Parmesan und Parmigiano Reggiano, kennzeichnend, in denen Ethylester von C2-C10-Fettsäuren in beträchtlichen Gehalten vorhanden sind (Dumont et al, 1974; Meinhart und Schreier, 1986; Barbieri et al, 1994).

Eine Veresterung von freien Fettsäuren und Alkoholen durch die Wirkung von Esterasen wird im allgemeinen als der Mechanismus der Esterbildung in Käsesorten erachtet, wobei Ethanol der Hauptalkohol ist (Bills et al, 1965; Morgan, 1976; Fox et al, 2000). Esterasen aus Milchproduktmilchsäurebakterien (LAB) und Pseudomonads können Ethanol und Fettsäuren verestern, um Ester, wie Ethylbutanoat und Ethylhexanoat zu bilden (Hosono und Elliott, 1974; Hosono et al, 1974; Liu et al, 1998), jedoch sind die Veresterungsaktivitäten in wäßrigen Medien schwach.

Somit ist es bekannt, daß es möglich ist, wenigstens eine Erscheinung des Käsearomas durch die Substitution einer Alkoxygruppe von einem zugegebenen Alkohol für eine Alkoxygruppe von natürlich vorkommenden Glycerylestern in Käsen zu steuern. Für diese Reaktion wurde angenommen, in zwei Stufen stattzufinden (Bills et al, 1965; Morgan, 1976; Fox et al, 2000). Zuerst eine Hydrolyse des natürlich vorkommenden Glycerylesters, um einen Glycerylalkohol und ebenfalls eine Carbonsäure zu bilden. Dann zweitens eine Veresterung der resultierenden Carbonsäure mit einem Alkohol, der eine gewünschte Alkoxygruppe (beispielsweise Ethanol) aufweist. Es wäre vorteilhaft, diese Substitution der Alkoxygruppen mit einer einzelnen Reaktion (der Umesterungsreaktion) anstelle eines Zweistufenreaktionsverfahrens einer Hydrolyse gefolgt von einer anschließenden Veresterung (die Veesterungsreaktion) zu steuern.

In der JP 62-096039 wird ein zweistufiges Verfahren für die Herstellung eines Milchproduktgeschmacks beschrieben. Das Verfahren schließt eine Alkoholfermentation eines Zuckers, wie Glukose, mit Hefe und eine Hydrolyse von Milchfett mit einer Lipase zur gleichen Zeit ein.

Caponio et al beschreiben in „Modification of goat fat triglycerides of immobilised lipase", Fett/Lipid 100 (1998), Nr. 3, 5.74–78, die Umesterung der Lipidfraktion von Gänsemilch unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen, immobilisierten Lipase. Dies resultiert in einer Reduktion der Menge von kurz- und mittelkettigen Fettsäuren (C4-C14) und in einer Zunahme der langkettigen Fettsäuren (C18:1 und C18:2).

In der AU 437571 (FR 2 204360) wird ein Verfahren zum Herstellen eines käseartigen Nahrungsmittels beschrieben. Ein Milchfeststoff wird mit einem Öl oder Fett vermischt, das einer Interveresterung mit einem Buttersäureester eines Alkohols unterzogen worden ist, um die Buttersäureeinheit in das Fett oder Öl zu überführen. Der Milchfeststoff und modifiziertes Fett werden dann einem Käseherstellungsverfahren unterzogen.

Zur Klarheit wird die zweistufige Reaktion in Gleichungen 1 und 2 unten veranschaulicht. Eine Umesterungsreaktion ist in Gleichung 3 gezeigt. wobei:

R1 = H oder CH3(CH2)n(C=O)

R2=(CH2)mH oder andere Alkylgruppen

n eine ganze Zahl größer als oder gleich 2

m eine ganze Zahl ist.

Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, in gewisser Weise in Richtung auf das Ziel des Erreichens eines einstufigen Verfahrens zu gehen oder wenigstens der Öffentlichkeit eine nützliche Wahl anzubieten.

Offenbarung der Erfindung

Demzufolge kann im weitesten Sinne für die Erfindung gesagt werden, aus einem Verfahren zum Herstellen von geschmacksverbessernden Estern zu bestehen, welches umfaßt:

Durchführen einer Umesterungsreaktion zwischen einem Mono-, Di- oder Triglycerid aus einer Milchproduktquelle und einem Alkohol in einem wäßrigen Medium in der Gegenwart einer Esterase, die ein Verhältnis von Umesterungsaktivität zu Veresterungsaktivität mit dem Mono-, Di- oder Triglycerid von wenigstens 25:1 zeigt, um die geschmacksverbessernden Ester zu bilden.

In einer weiteren Ausführungsform kann für die Erfindung gesagt werden, im weitesten Sinne in einem Verfahren zum Herstellen von geschmacksverbessernden Estern zu bestehen, welches umfaßt:

Durchführen einer Umesterungsreaktion zwischen einem Mono- oder Diglycerid aus einer Milchproduktquelle und einem Alkohol in einem wäßrigen Medium in der Gegenwart eines Enzyms, das von Milchsäurebakterium abgeleitet wird, das ein Verhältnis von Umesterungsaktivität zu Veresterungsaktivität mit dem Mono- oder Diglycerid von wenigstens 25:1 zeigt, um die geschmacksverbessernden Ester zu bilden.

In einer weiteren Ausführungsform kann für die Erfindung gesagt werden, im weitesten Sinne in einem Verfahren zum Herstellen von geschmacksverbessernden Estern zu bestehen, welches umfaßt:

Durchführen einer Umesterungsreaktion zwischen einem Mono-, Di- oder Triglycerid aus einer Milchproduktquelle und einem Alkohol in einem wäßrigen Medium in der Gegenwart einer Mischung einer Lipase und eines Enzyms, das aus einem Milchsäurebakterium abgeleitet wird, oder einer Mischung einer Esterase und eines oder mehrerer Enzyme, die aus Milchsäurebakterien abgeleitet werden, wobei die Mischung ein Verhältnis einer Umesterungsaktivität zu Veresterungsaktivität mit dem Mono-, Di- oder Triglycerid von wenigsten 25:1 zeigt, um die geschmacksverbessernden Ester zu bilden.

In einer Ausführungsform ist die Esterase eine Lipase.

In einer Ausführungsform wird das Enzym zu dem Glycerid und dem Alkohol in dem wäßrigen Medium zugegeben.

In einer weiteren Ausführungsform werden die Milchsäurebakterien, von denen das Enzym abgeleitet wird, zu dem Glycerid und dem Alkohol in dem wäßrigen Medium zugegeben, um das Enzym darin zu erzeugen.

Bevorzugt ist das Glycerid aus einer Milchproduktquelle aus Vollmilch, Sahne, Milchfett, Käse, durch Enzym modifiziertem Käse (EMC), Buttermilch, Molke, Molkesahne, fermentierter Milch oder anderem Milchprodukt.

Der Alkohol wird so ausgewählt, daß ein Ester (oder mehrere Ester) mit den gewünschten Geschmackseigenschaften erzeugt wird bzw. werden. In einer Alternative ist der Alkohol Ethanol. In einer weiteren Alternative ist der Alkohol 2-Phenylethanol. Jedoch ist die Erfindung nicht auf diese Alkohole beschränkt und kann einen Bereich von geradkettigen, verzweigkettigen und aromatischen Alkoholen einschließen, einschließlich (jedoch nicht begrenzt auf) solche, die in natürlichen Käsesorten auftreten können.

In einer weiteren Alternative schließt das oben definierte Verfahren einen Fermentationsschritt ein, um den Alkohol zu erzeugen.

Bevorzugt vermitteln Alkohol-erzeugende Mikroorganismen den Fermentationsschritt.

In einer Ausführungsform ist der Alkohol-erzeugende Mikroorganismus Lactobacillus fermentum.

Eine Anzahl von anderen Alkohol-erzeugenden Bakterien kann verwendet werden (einschließlich heterofermentative Lactobacilli und Leuconostokken) und ebenfalls Hefen.

In einer Alternative weisen die Acylgruppen der Mono-, Di- oder Triglyceride jeweils bis zu 10 Kohlenstoffatome auf und ist der Alkohol Ethanol.

Alternativ weisen, wenn das Glycerid ein Diglycerid ist, die Acylgruppen desselben bis zu 6 Kohlenstoffatome auf und ist der Alkohol 2-Phenylethanol.

In einer weiteren Alternative, wenn das Glycerid ein Monoglycerid ist, weisen die Acylgruppen desselben bis zu 8 Kohlenstoffatome auf und ist der Alkohol 2-Phenylethanol.

Bevorzugt ist die Lipase eine 1,3-spezifische Lipase aus Rhizomucor miehei.

Alternativ wird das Enzym aus einem oder mehreren Stämmen der folgenden Gattungen erhalten:

Aus Bakterienkulturen, welche einschließen (jedoch nicht begrenzt sind auf):

Streptococcus

Lactococcus

Lactobacillus

Leuconostoc

Pediococcus

Enterococcus

Propionibbacterium, und

Pseudomonas

In einer Ausführungsform wird das Enzym aus dem Stamm Streptococcus thermophilus ST1 abgeleitet.

Alternativ wird das Enzym aus einem der Stämme Streptococcus thermophilus NCIMB 700821 (erhalten als NCDO 821 und bezeichnet als 821 im folgenden); Lactobacillus fermentum B4017; Lactococcus lactis subsp. cremoris E8 und Lactococcus lactis subsp. lactis ML3 abgeleitet.

In einer weiteren Ausführungsform wird der so hergestellte geschmacksverbessernde Ester als ein Bestandteil zu einem Nahrungsmittelprodukt zugegeben.

Bevorzugt ist das Nahrungsmittelprodukt ein Milchprodukt.

Bevorzugt ist das Milchprodukt ein Käse oder ein Produkt auf Käsebasis.

Die Erfindung kann ebenfalls im weitesten Sinne in einem geschmacksverbessernden Ester bestehen, der durch das hierin definierte Verfahren hergestellt wird.

Die Erfindung kann ebenfalls in einem Nahrungsmittelprodukt bestehen, das den geschmacksverbessernden Ester enthält.

Bevorzugt ist das Nahrungsmittelprodukt ein Milchprodukt.

Bevorzugt ist das Milchprodukt ein Käse oder ein Produkt auf Käsebasis.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1 ist eine Auftragung der Synthese von Ethylbutanoat durch nicht-wachsende Zellen von St. thermophilus ST1 in Phosphatpuffer enthaltend 100 mM Ethanol und 33 mM Tributyrin gegen die Zeit. nur Zellen (42 mg cdw); nur Substrate; 24 mg Zellen (cdw); 48 mg Zellen (cdw). [(cdw), Zelltrockengewicht].

2a, 2b und 2c sind Auftragungen der Synthese von Ethylestern durch nicht-wachsende Zellen von St. thermophilus ST1 in Phosphatpuffer gegen die Zeit. (a) Ethylhexanoat aus 100 mM Ethanol und 35 mM Dihexanoin; (b) Ethyloctanoat aus 500 mM Ethanol und 23 mM Monooctanoin; und (c) Ethyldecanoat aus 500 mM Ethanol und 10 mM Monodecanoin. Ester; Fettsäuren.

3 ist eine Auftragung der Synthese von 2-Phenylethylestern durch nicht-wachsende Zellen von St. thermophilus ST1 in Phosphatpuffer gegen die Zeit. 2-Phenylethylhexanoat aus 17 mM 2-Phenylethanol und 17 mM Dihexanoin; 2-Phenylethyloctanoat aus 17 mM 2-Phenylethanol und 23 mM Monooctanoin.

4 ist eine Auftragung der Synthese von Ethylbutanoat durch 1,3-spezifische Lipase aus Rhizomucor miehei in einem Phosphatpuffer enthaltend entweder 50 mM Ethanol und 66 mM Tributyrin oder enthaltend 50 mM jeweils Ethanol und Butansäure

5 ist eine Auftragung der Synthese von Ethylbutanoat durch 1,3-spezifische Lipase aus Rhizomucor miehei in einem Medium auf Käsebasis enthaltend einen Überschuß an Ethanol, Die Kontrolle weis kein zugegebenes Ethanol auf.

6 ist eine Auftragung der Herstellung von Ethylestern aus Fettsäuren gegen die Zeit, unter Verwendung von Lipase aus Rhizomucor miehei (0,15 %) in Sahne. Ethylester von Fettsäuren C4 bis C8; Ethylester von Fettsäuren C10 bis C18.

7 veranschaulicht die Konzentrationen an Ethylestern von freien Fettsäuren mit zunehmender Kohlenstoffkettenlänge über eine fünfstündige Fermentation, wie es im Beispiel 6 beschrieben ist.

Ausführungsformen der Erfindung

Die Erfindung kann vollständiger durch Verweis auf die folgenden detaillierten Beispiele verstanden werden.

Wenn er hierin verwendet wird, ist der Begriff „Geschmack" beabsichtigt, um Geschmack und/oder Aroma zu bedeuten, wie es im Zusammenhang geeignet ist.

Wenn er hierin verwendet wird, ist der Begriff „Glycerid aus einer Milchproduktquelle" beabsichtigt, um eine Zusammensetzung zu bedeuten, die ein oder mehrere Triglyceride, Diglyceride und Monoglyceride umfaßt, die in Milchfett vorliegen oder daraus erzeugt werden. Dies ist bevorzugt Milchfett von Rinderherkunft, schließt jedoch ebenfalls Milchfett von Schaf- oder Ziegenherkunft ein. Triglyceride sind die vorherrschende Lipidklasse in Milchfett, die etwa 97–98 % des gesamten Milchfettes ausmachen (Christie, 1995). Kleine Mengen an Diglyceriden und Monoglyceriden sind ebenfalls vorhanden, und Gehalte dieser Komponenten können durch die hydrolytische Wirkung von Lipasen erhöht werden. Die Glyceride von Milchfett sind bezüglich ihrer Zusammensetzung sehr unterschiedlich. Der große Bereich an unterschiedlichen Fettsäuren, die in den Glyceridmolekülen verestert sind, vermitteln diese Diversität. Es gibt 10 Hauptfettsäuren im Bereich einer Kettenlänge von vier Kohlenstoffen bis achtzehn Kohlenstoffen. Jedoch sind insgesamt über 400 unterschiedliche Fettsäuren in Rindermilchfett identifiziert worden (Jensen und Clark, 1988).

Beim Berechnen der „Umesterungsaktivität" bedeutet eine Einheit der Umesterungsaktivität die Menge an Enzym, die die Synthese von Tributyrin und Ethanol von 1 nmol an Ethylbutanoat pro Minute katalysiert. Eine Standarduntersuchung zum Bestimmen der Umesterungsaktivität ist in Beispiel 1 dargelegt.

Beim Berechnen der „Veresterungsaktivität" bedeutet eine Einheit der Veresterungsaktivität die Menge an Enzym, die die Synthese von Butansäure und Ethanol von 1 nmol Ethylbutanoat pro 24 Stunden katalysiert. Eine Standarduntersuchung zum Bestimmen der Veresterungsaktivität ist in Beispiel 2 dargelegt.

Beispiel 1: Synthese von Estern durch Streptococcus thermophilus Microorganismen und Wachstumsbedingungen

Streptococcus thermophilus ST1 stammte aus der Kultursammlung des Fonterra Research Centre, Plamerston North, New Zealand. Kulturen wurden bei 37° C in M17-Glukosebrühe (Difco, Frankreich) gezüchtet. Die Kulturen wurden mit 1 % (v/v) Vorkulturen beimpft und statisch für bis zu 36 Stunden inkubiert.

Herstellung von Zellsuspensionen

Sofern nicht anderweitig ausgeführt, wurden Zellen in 300 mL (Kulturen von 24 Stunden) durch Zentrifugation bei 7000 g für 10 Minuten bei 4° C geerntet. Die Zellen wurden in 100 mL (2 ×) 0,1 M Kaliumphosphat (pH 7,0) gewaschen, gefolgt von einer Zentrifugation. Die gewaschenen Zellpellets wurden in 60 mL des gleichen Puffers re-suspendiert und in 10 ml Aliquoten in Universalgefäße abgegeben und bei –20°C vor der Verwendung gelagert.

Estersynthese durch die Umesterungsreaktion

Eine Standarduntersuchung zum Bestimmen der Umesterungsaktivität bestand aus einer 5,0 mL Reaktionsmischung enthaltend 80 mM Kaliumphosphat, pH 7,0, 2,0 mL Zellsuspension, 500 mM Ethanol und 10 bis 35 mM Glycerid. Ein Tributyrinsubstrat wurde wie in Holland & Coolbear (1996) beschrieben hergestellt, und andere Glyceridsubstrate wurden entsprechend hergestellt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,5 mL 5 M Ethanol zu der obigen Reaktionsmischung, vorinkubiert bei 30° C für 5 Minuten, gestartet. Eine 1,0 mL Probe wurde sofort entfernt und in ein Teströhrchen enthaltend Diethylether gegeben und extrahiert. Die verbleibenden Reaktanten wurden bei 30° C für bis zu 60 Minuten inkubiert und Proben in Intervallen genommen und für die unten beschriebene Esteranalyse extrahiert. In einigen Experimenten wurden Substratkonzentrationen gemäß einem bestimmten Experiment, wie es angegeben ist, variiert. Kontrollen ohne Substrate oder ohne Zellen wurden ebenfalls eingeschlossen. Eine Einheit der Enzymaktivität (Umesterung) wurde als die Menge eines Enzyms definiert, die die Synthese von Tributyrin und Ethanol von 1 nmol Ethylbutanoat pro Minute katalysiert, und die spezifische Aktivität als Einheiten pro mg Protein oder Zelltrockengewicht (cdw).

Quantifizierung von Estern durch Gaschromatographie (GC)

Ein mL der Probe, die aus einer Reaktionsmischung oder Brühkultur genommen wurde, wurde zu einem 16 mL Kimax Schraubverschlußteströhrchen enthaltend 2 mL Diethylether und 1 mL inneren Standard (180 mg/L Ethylacetat in Wasser) gegeben. Eine Extraktion wurde durch heftiges Schütteln für etwa 2,5 Minuten durchgeführt, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1260 g für 5 Minuten in einer Zentrifuge (Heraeus Megafuge 1,0). Die obere Lösungsmittelschicht wurde in ein Vial enthaltend kleine Mengen von ofengetrocknetem, wasserfreiem Natriumsulfat überführt und bezüglich der Ester durch Gaschromatographie (GC), wie es unten beschrieben wird, analysiert.

Folgend der Probenextraktion wurden die Ester per GC analysiert. Die Analyse wurde unter Verwendung eines Shimadzu GC-15A Gaschromatographen mit einer Kapillarsäule aus kondensiertem Silica (Flüssigphase, DB-1; Länge, 30 m; innerer Durchmesser, 0,25 mm; Filmdicke, 1,0 &mgr;m) (J&W Scientific, CA, USA) durchgeführt. Der Ofen wurde bei 45° C für 5 Minuten temperaturprogrammiert, gefolgt von einer Anhebung der Temperatur auf 50° C mit 5° C pro Minute, dann auf 270° C mit 20° C pro Minute, und wurde bei 270° C für 8 Minuten gehalten. Eine Splitinjektion wurde in einem Verhältnis vom 5:1 durchgeführt und 3 &mgr;L der Probe wurden injiziert. Die Injektor- und FID (Flammenionisationsdetektor)-Detektortemperaturen waren 250° C bzw. 275° C. Andere Bedingungen waren: Trägergas (He) mit 0,9 mL pro Minute; H2 und Luft mit 0,6 kg pro cm2, Aufgabegas (N2 mit 2 kg pro cm2). Das FID-Ausgangssignal wurde aufgezeichnet und unter Verwendung geeigneter Software (Shimadzu CLASS-VPTM Chromatography Data System Version 4.2 von Shimadzu, MD, USA) bearbeitet. Ester in den Proben wurden identifiziert und durch Vergleich mit Injektionen von bekannten Mengen der reinen Standards quantifiziert.

1 zeigt die zeitabhängige Bildung von Ethylbutanoat aus Ethanol und Tributyrin durch nichtwachsende Zellen von St. thermophilus ST1. Die Anfangsgeschwindigkeit der Synthese war linear für die ersten 30 Minuten. Die Synthesegeschwindigkeit und die Ausbeute erhöhten sich proportional, wenn die Zellbiomasse verdoppelt wurde. Ethylbutanoat wurde in den Kontrollen (lediglich Zellen und lediglich Substrate) nicht detektiert. St. thermophilus ST1 synthetisiert nicht Ethylbutanoat aus Butansäure und Ethanol unter den gezeigten Bedingungen.

St. thermophilus ST1 war nicht in der Lage, Ester aus Ethanol und Triglyceriden mit C6 bis C14, Diglyceriden mit C10 und C14 und Monoglycerid mit C14 (Daten nicht gezeigt) zu synthetisieren. Tributyrin war das einzige Triglycerid, für das der Stamm ST1 aktiv war. Der Stamm ST1 war ebenfalls in der Lage, Ethylester aus Ethanol und Diglycerid mit C6 (Dihexanoin) und Monoglyceriden von C8 (Monooctanoin) und C10 (Monodecanoin) (2a, b, c) zu synthetisieren. Die Geschwindigkeit der Estersynthese und die Ausbeute der Ester waren viel höher als für solche der Fettsäurefreisetzung (2a, b, c). Zusätzlich katalysierte der Stamm ST1 die Synthese von 2-Phenylethylhexanoat und 2-Phenylethyloctanoat aus 2-Phenylethanol und Dihexanoin und Monooctanoin (3), war jedoch nicht aktiv für Tributyrin und Monodecanoin mit 2-Phenylethanol als dem Acylakzeptor (Daten nicht gezeigt).

Beispiel 2: Estersynthese durch Milchsäurebakterien, die in Brühkulturen gezüchtet wurden Kulturen und Wachstum

Kulturen waren aus der Kultursammlung des Fonterra Research Centre, Palmerston North, Neuseeland, und wurden in M17-Glukosebrühe (Difco, Frankreich) bei 30° C gezogen. Lactobacillus fermentum B4017 wurde in MRS-Brühe (Merck, Deutschland) bei 30° C gezüchtet. Die Kulturen wurden in 200 mL geeigneter Brühen ergänzt mit 50 mM Ethanol und 3,3 mM Tributyrin (Endkonzentration) gezüchtet. Kontrollen wurden entweder ohne zugegebene Kultur oder ohne zugegebenen Ethanol oder Tributyrin erhalten. Kulturen wurden wie oben erwähnt für bis zu 36 Stunden inkubiert. Proben wurden in Intervallen zwischen mid-log bis zu späten stationären Phasen genommen und bei –20° C vor der Analyse gelagert. Die Proben wurden für Bestimmungen der Zelltrockengewichte, von Ethylbutanoat und anderen Estern verwendet.

Umesterungsuntersuchungen

Umesterungsaktivitäten für wachsende Bakterienkulturen wurden durch Messen der Ethylbutanoatansammlung in einem Untersuchungssystem ähnlich zu demjenigen, das in Beispiel 1 beschrieben wird, untersucht.

Veresterungsuntersuchungen

Bakterienzellen, die in 400 mL geeigneter Brühe kultiviert wurden, wurden durch Zentrifugation bei 7000 g für 10 Minuten bei 4° C geerntet. Die Zellen wurden durch Resuspendieren von Zellpellets in 30 mL (2 ×) Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH 5,8) gewaschen, gefolgt von einer Zentrifugation bei 7000 g für 10 Minuten bei 4° C. Die gewaschenen Zellen wurden dann resuspendiert in 10 mL des gleichen Puffers, gefolgt von der Zugabe von 5mL jeder der wäßrigen Lösungen von 8 mM Ethanol und 8 mM Butansäure, um eine Endkonzentration von 2 mM jeweils für Ethanol und Butansäure zu ergeben, und eine Endkonzentration von 50 mM Kaliumphosphat in einem Gesamtvolumen von etwa 20 mL Zellsuspension. Die Endsuspension enthaltend Zellen, Ethanol und Butansäure, wurde statisch bei 22° C für 24 Stunden inkubiert und dann bei –20° C für eine nachfolgende Analyse von Ethylbutanoat durch Gasflüssigchromatogrpahie (GLC) gelagert. Beim Berechnen der Veresterungsaktivität war eine Einheit der Veresterungsaktivität die Menge an Enzym, die die Bildung von 1 nmol Ethylbutanoat pro 24 Stunden katalysiert. Spezifische Aktivitäten wurden als Einheiten pro 100 mg Trockengewicht an Zellen (dwc) quantifiziert.

Quantifizierung der Ester

Die Ester wurden durch Gaschromatographie quantifiziert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.

Analyse der Ester durch GC-MS

Ester in Brühekulturen wurden durch Festphasenmikroextraktion (SPME) und Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) analysiert. SPME wurde wie von Liu et al (1998) beschrieben durchgeführt. Der Gaschromatograph (Shimadzu GC-17A) war mit einer 30 m × 0,25 mm (Innendurchmesser) Säule mit kondensiertem Silica-Kapillarcarbowachs (Filmdicke 0,25 &mgr;m; Alltech, IL, USA) ausgerüstet, und die Injektortemperatur war 220° C. Das Trägergas war Helium (Säulendruck, 54 kPa). Die Ofentemperatur wurde wie folgt programmiert: 2 Minuten bei 50° C, 3° C min–1 auf 80° C, 5° C min–1 auf 120° C, 20° C min–1 auf 220° C und 6 Minuten bei 220° C. Die GC-Säule wurde direkt mit der Ionenquelle eines Shimadzu QP-5000 Massenspektrometers (Schnittstellentemperatur 203° C) verbunden. Das MS wurde im Scanning-Modus von 40 bis 350 M/Z bei 2 Scans s–1 betrieben. Die Strukturen wurden durch Spektreninterpretation und Vergleich der Spektren mit Bibliographiedaten zugeordnet.

Eine Anzahl von Milchsäurebakterien wurde bezüglich ihrer Fähigkeit getestet, Ethylbutanoat aus Tributyrin und Ethanol durch Wachstum in Brühen ergänzt mit den zwei Substraten zu synthetisieren. Umesterungsaktivitäten, die erhalten wurden, wurden dann mit den Veresterungsaktivitäten (Synthese der Ester durch Umsetzung freier Säuren mit einem Alkohol) verglichen. Diese Aktivitäten sind in Tabelle 1 dargelegt. Mit sowohl den Veresterungsaktivitäten als auch den Umesterungsaktivitäten gab es einige große Spezies- und Stammunterschiede. Während die Diversität der Umesterungsaktivitäten mit den Veresterungsaktivitäten konsistent ist, ist die erstere Aktivität um das 34–7500-fache höher als die letztere. Stämme von St. thermophilus erzeugten die höchsten Umesterungsaktiväten (bis zum 228-fachen) verglichen mit anderen Milchsäurebakterien, die getestet wurden. Dies ist konsistent mit ihren verhältnismäßig hohen Esteraseaktivitäten. Man beachte, daß die Umesterungsaktivität von Lb. fermentum vergleichbar war mit derjenigen von St. thermophilus. Die Umesterungsaktivitäten der zwei getesteten Lactococcen- Stämme war höher, um bis das 18-fache, als die Aktivitäten der Stämme von Lactobacillus, Leuconostoc und Pediococcus, die getestet wurden.

  • a definiert als nmol min–1 mg–1; cdw, Zelltrockengewicht.
  • b definiert als die Synthese von Ethylbutanoat aus Tributyrin und Ethanol in Brühenkultur.
  • c definiert als die Veresterung von Butansäure und Ethanol zur Bildung von Ethylbutanoat; Daten sind aus Liu et al (1998) abgeleitet.
  • d Verhältnis von Umesterungsaktivität zu Veresterungsaktivität.

Beispiel 3: Synthese von Ethylbutanoat mit Lipase aus Rhizomucor miehei Synthese von Ethylbutanoat in Puffer

Ethylbutanoat wurde in einer 5,0 mL Reaktionsmischung umfassend 80 mM Kaliumphosphat, pH 7,0, 50 mM Ethanol und 33 mM Tributyrin, sofern nicht anderweitig erwähnt, synthetisiert. Das Tributyrinsubstrat wurde wie an anderer Stelle beschrieben (Holland & Coolbear, 1996) hergestellt. Der Reaktion wurde durch Zugabe von 0,1 mL einer geeignet verdünnten Enzymzubereitung (bis zu 1000-fache Verdünnung) zu der obigen Reaktionsmischung, vorinkubiert bei 30° C für 5 Minuten, gestartet. Eine 1,0 mL Probe wurde sofort entfernt und zu einem Teströhrchen enthaltend Diethylether zugegeben und extrahiert (siehe unten). Die verbleibenden Reaktanten wurden bei 30° C für bis zu 40 Minuten inkubiert und Proben in Intervallen genommen und zur Ethylbutanoatanalyse, wie sie unten beschrieben wird, extrahiert.

Synthese von Estern in Medium auf Käsebasis

Ethylbutanoat wurde ebenfalls in einem Medium auf Käsebasis unter Verwendung einer 1,3-spezifischen Lipase aus Rhizomucor miehei (verkauft von Novo Nordisk, Dänemark als „Palatase 20000L") synthetisiert. Dies wurde durchgeführt in einer 9 mL Reaktionsmischung bestehend aus 4 g junger Cheddarkäse-Slurry und 10 mM Ethanol. Eine Slurry wurde unter Verwendung von proteolytischen Enzymen, emulgierenden Salzen (Tri- und Dinatriumzitrat) und Wasser hergestellt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 40 &mgr;l Lipase initiiert und die Mischung bei 30° C für 4 Stunden inkubiert. Eine Kontrolle, die kein zugegebenes Ethanol enthielt, wurde ebenfalls inkubiert.

Extraktion und Analyse von Ethylbutanoat

Ein mL der Probe, der aus einer Reaktionsmischung genommen wurde, wurde sofort zu einem 16-mL Kimax-Schraubkappenteströhrchen enthaltend 2 mL Diethylether und 1 mL inneren Standard (180 mg/L Ethylacetat in Wasser) zugegeben. Eine Extraktion wurde durch heftiges Schütteln für etwa 2,5 Minuten durchgeführt, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1260 × g für 5 Minuten (Heraeus Megaflige 1,0). Die obere Lösungsmittelschicht wurde in ein GLC-Vial enthaltend kleine Mengen an ofengetrocknetem, wasserfreiem Natriumsulfat überführt und bezüglich Ethylbutanoat durch Gasflüssigchromatographie (GLC) analysiert.

4 zeigt, daß Lipase aus Rhizomucor miehei die Synthese von Ethylbutanoat aus Ethanol und Tributyrin katalysierte, sie war linear für die ersten 10 Minuten, jedoch nicht aus Ethanol und Butansäure unter den gleichen Bedingungen. Wiederum gab es keine Bildung von Ethylbutanoat in der Kontrolle, die keine zugegebene Lipase enthielt.

5 zeigt die Herstellung von Ethylbutanoat durch Lipase aus Rhizomucor miehei in einem Medium auf Käsebasis. Es gab eine konsistente Bildung dieses Esters, wenn Ethanol zu dem Medium zugegeben wurde. Im Gegensatz dazu wurde kein Ester detektiert, wenn entweder Ethanol oder Lipase aus Rhizomucor miehei nicht zu dem Medium zugefügt worden war. Zusätzlich zu Ethylbutanoat wurden andere Ester, wie Ethylhexanoat, detektiert, waren jedoch in dem Medium ergänzt mit Ethanol nicht quantifizierbar.

Beispiel 4: Geschmacksverbindungen in Käse

Frischmilch wurde getrennt und rekombiniert, um ein Protein- zu Fettverhältnis von 1:0,82 zu ergeben. Die rekombinierte Mischung wurde in einem kontinuierlichen System pasteurisiert, das die Milch bei 72° C für 15 Sekunden hielt. Die Milch wurde auf 32° C abgekühlt und 375 L in jedem von drei temperaturgesteuerten Käseherstellungsbottichen (Bottiche 3A, 3B und 4) angeordnet.

Eine Kulturmischung aus mesophilen Starterstämmen, 1,8 % des Bottichvolumens, 100 mL Propionibactena-Starterhilfsstoffe (um Käsearoma herzustellen) und 10 mL Hilfsstoffkultur enthaltend Lactobacillus rhamnosus HN001 (wie beschrieben in der WO99/10476) wurde zu jedem der Bottiche zugegeben, außer daß in Bottich 4 die mesophile Starterkultur durch einen Streptococcus-thermophilus-Stamm ersetzt wurde. Weitere 1875 mL einer Kultur (LF2) von Lactobacillus fermentum wurden zu Bottich 4 zugegeben, um Ethanol in situ zu erzeugen. 3 g Hansen-Kid-Lamb-Lipasepulver (80 LFU) wurden in jeden Bottich eingemischt und dann Lab mit einer Geschwindigkeit von 10 mL pro 100 L Milch zugegeben. Die Mischung wurde für 40 Minuten gehalten und dann der Käsebruch mit einem Bruchmesser mit Klingen, die 12 mm voneinander beabstandet waren, geschnitten.

Die Temperatur wurde auf 38° C angehoben und die Molke nach einer Gesamtbehandlungszeit von 130 Minuten, bei der der pH 6,2 war, abgetropft. Wenn 30 % des Bottichvolumens entfernt worden waren, wurde die Molke mit 20 % des Bottichvolumens an Wasser ersetzt. Wenn der Käsebruch pH 5,2 erreicht hatte, wurde er vollständig abgetropft, wobei er für 60 Minuten stehen konnte, und dann gemahlen. Salz (NaCl) wurde mit einer Geschwindigkeit von 17g/kg zugegeben. Zwei 20-kg-Blöcke A und B aus Käse wurden aus jedem Bottich hergestellt. Zum Käsebruch für Block B aus Bottich 3 wurden 118 mL Ethanol gemischt mit 118 mL Wasser zugegeben.

Der Käsebruch wurde gepreßt und dann die Blöcke in porösen Beuteln angeordnet, um zu ermöglichen, daß CO2 entweicht. Die Blöcke wurden bei 20° C für einen Monat gelagert und dann bei 5° C für einen weiteren Monat, bevor er probiert wurde und Proben zur chemischen Analyse entnommen wurden.

Die Ergebnisse der chemischen Analyse sind in der Tabelle unten gezeigt.

Diese Ergebnisse zeigen, daß wenn Ethanol zur Umesterungsreaktion zugegeben wird, dies zu einer Herstellung von Estern, insbesondere Ethylbutanoat, führt. Ethanol, der in situ erzeugt wird, führt ebenfalls zu einer Herstellung von Estern, insbesondere Ethylbutanoat.

Schmecken von fruchtartigem Geschmack in Käse

Käsesorten, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, wurden bezüglich von vier Attributen durch eine Expertengruppe zur sensorischen Einschätzung eingestuft. Die Mitglieder wurden bezüglich des Geschmacks der Käsesorten gefragt und sollten fruchtartige und bittere Noten und Deskriptoren von anderen vorhandenen Geschmacksnoten aufzeichnen. Die Ergebnisse, die in der Tabelle unten gezeigt sind, bestätigen, daß eine Zugabe von Ethanol bei der Erzeugung der fruchtartigen Geschmacksnoten und bei der Maskierung von bitteren Geschmäcken effektiv war. Die erzielten fruchtartigen Geschmäcker korrelierten gut mit den höheren Gehalten an bemerktem Ethylbutanoat.

Beispiel 5: Geschmackskonzentrat aus Fermentation von Sahne

Ethanol wurde zu Sahne zugegeben, die mit Lipase aus Rhizomucor miehei, wie in Beispiel 3 beschrieben, inkubiert wurde.

Die verwendeten Materialien waren: Vollsahne (40 % Fett), Lipase aus Rhizomucor miehei und Ethanol (10M-Lösung). Diese Bestandteile wurden in Schraubverschlußflaschen vereinigt. Jede Flasche enthielt 50 mL Sahne, 40 mL Wasser und 10 mL Ethanol. Eine Flasche wurde als eine Kontrolle zurückgehalten. Lipase aus Rhizomucor miehei (0,15 mL Enzymlösung) wurde zu einer zweiten Flasche – der Testprobe – zugegeben. Die Flaschen, die diese Kombinationen enthielten, wurden in einem Wasserbad bei 30° C gehalten. Proben (5 mL) wurden in Intervallen von 1, 3, 5 und 24 Stunden nach der Enzymzugabe zu der Testflasche entfernt und in einem Gefrierschrank gelagert. Die Proben wurden später unter Verwendung von Standardverfahren zur Analyse von Ethylestergehalt durch Gasflüssigchromatographie (in Beispiel 1 beschrieben) extrahiert.

Die Analyseergebnisse sind in 6 und 7 gezeigt. 6 zeigt, daß die Ethylester der kurzkettigen Fettsäuren (C4 bis C8) sich während des Verlaufs der Reaktion ansammeln. 7 zeigt die Konzentrationen der Ester von kurzkettigen Fettsäuren (C4 bis C8) und von mittelkettigen Estern (C10 bis C12), die sich nach fünf Stunden angesammelt haben.

Beispiel 6: Zugabe von Fruchtgeschmacksnoten zu enzymmodifiziertem Käse

Vierzig Liter Wasser wurden in einem Tank bei 43° C gehalten. Dinatriumphosphat (1,2 kg gelöst in 5 L heißem Wasser) und 30 kg geriebener junger Cheddar-Käsebruch wurden zugegeben. Nach zwanzig Minuten Rühren wurden 120 g Protease gelöst in 5 L Wasser bei 43° C zugegeben. Die Mischung wurde für weitere fünf Minuten gerührt, nach welcher Zeit weitere 20 kg an geriebenem Käsebruch über eine Dauer von zehn Minuten zugegeben wurden. Die Temperatur der gerührten Reaktionsmischung wurde bei 43° C für vier Stunden gehalten und die Mischung bei pH 5,6 durch Zugabe von 4M NaOH, zugegeben in Aliquoten von 100 mL, gesteuert. Das Enzym wurde dann durch Erwärmen der Mischung auf 93° C und Halten bei dieser Temperatur für 15 Minuten inaktiviert. Nach dem Abkühlen wurde die Mischung bei 32° C und einem pH von 5,4–5,6 gehalten. Die Mischung wurde dann mit 4 L einer Kultur aus Enterococcus faecalis, Stamm EF2, und 2 L einer Kultur aus Lb plantarum beimpft, um ein ausgeglichenes reifes Käsearoma bereitzustellen.

Die Mischung wurde bei 32° C gehalten und der pH im Bereich von 5,4–5,6 für 45 Stunden gesteuert. Proben wurden aus der Mischung (Probe T4) zur chemischen Analyse entnommen. Als nächstes wurden 440 mL von 100 % Ethanol und 75 mL einer Lipase aus Rhizomucor miehei zu der Mischung zugegeben. Nach 5 Stunden wurde eine weitere Probe (T5) genommen. Am nächsten Tag wurde nach 20stündiger Reaktion Probe 16 genommen. Ein fruchtiger und käseartiger Geruch war in dieser Mischung offensichtlich. Die Mischung wurde dann weiter verarbeitet, um kommerzielle Erfordernisse zu erfüllen.

Ergebnisse der chemischen Analyse, die in Tabelle 4 gezeigt sind, bestätigen, die Bildung von flüchtigen Estern in der Reaktionsmischung folgend der Zugabe von Lipase und Ethanol.

Beispiel 7: Estersynthese aus Schafmilch

Eine Lösung aus 90 mL Schafmilch und 10 mL von 10 M Ethanol wurde auf 37° C erwärmt. Palatase 20000 L (0,03 %) wurde zugegeben und die Mischung für 5 Stunden inkubiert. Proben (10 ml) wurden mit 1 mL 2,5 M H2SO4 angesäuert und bei –20° C vor der Analyse der Ester gelagert. Ester wurden durch Gaschromatographie (GC) in einer Modifikation des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens bestimmt. Ein mL einer aufgetauten, angesäuerten Probe wurde zu einem 16 mL Kimax Schraubkappenteströhrchen enthaltend 5 mL Diethylether zugegeben. Eine Extraktion wurde durch heftiges Schütteln für etwa 2,5 Minuten durchgeführt, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1260 g für 5 Minuten in einer Zentrifuge (Heraeus Megafuge 1,0). Ein mL der Lösungsmittelschicht wurde dann in ein 16 mL Kimaxröhrchen enthaltend 1 mL internen Standard (180 mg/L Ethylacetat in Wasser) überführt. Das gesamte Lösungsmittelextrakt enthaltend internen Standard wurde dann durch eine 500 mg Aminopropylfestphasenextraktionspatrone (SPE) geführt, um Triglyceride zu entfernen. Esterverbindungen, die glatt durchgelangten, wurden dann in einem GC-Vial enthaltend eine kleine Menge an ofengetrocknetem, wasserfreiem Natriumsulfat gesammelt. Diese Probe wurde bezüglich der Ester durch GC wie unten beschrieben analysiert.

Folgend der Probenextraktion wurden die Ester durch GC analysiert. Die Analyse wurde durchgeführt unter Verwendung eines Shimadzu GC-15A Gaschromatographen mit einer Kapillarsäule aus kondensiertem Silica (Flüssigphase, DB-1; Länge, 30 m; innerer Durchmesser, 0,25 mm; Filmdicke, 1,0 &mgr;m) (J&W Scientific, CA, USA). Der Ofen wurde temperaturprogrammiert bei 45° C für 5 Minuten, gefolgt von einer Anhebung der Temperatur auf 50° C mit 5° C min–1, dann auf 270° C mit 20° C min–1 und bei 270° C für 8 Minuten gehalten. Eine Splitinjektion wurde mit einem Verhältnis von 5:1 durchgeführt und 3&mgr;L der Probe injiziert. Die Injektor- und FID-Detektortemperaturen (Flammenionisationsdetektor) waren 250° C bzw. 275° C. Andere Bedingungen waren: Trägergas (He) mit 0,9 mL pro min–1; H2 und Luft mit 0,6 kg pro cm2; Aufgabegas (N2 mit 2 kg pro cm2). Das FID-Ausgabesignal wurde aufgezeichnet und unter Verwendung geeigneter Software (Shimadzu CLASS-VPTM Chromatography Data System Version 4.2 von Shimadzu, MD, USA) verarbeitet. Ester in den Proben wurden identifiziert und durch Vergleich mit Injektionen von bekannten Mengen der reinen Standards quantifiziert.

Die Mengen der Ethylester, die in dieser Reaktion gebildet werden, sind unten in Tabelle 5 dargelegt.

Beispiel 8: Estersynthese aus Ziegenmilch

Eine Lösung von 90 mL Ziegenmilch und 10 mL von 10 M Ethanol wurde auf 37° C erwärmt. Palatase 20000 L (0,03 %) wurde zugegeben und die Mischung für 7 Stunden inkubiert. Proben (10 mL) wurden mit 1 mL 0,5 M H2SO4 angesäuert und bei –20° C vor der Analyse der Ester gelagert. Die Ester wurden durch Gaschromatographie (GC), wie es in Beispiel 7 beschrieben ist, bestimmt.

Die Mengen der Ethylester, die in dieser Reaktion gebildet werden, sind unten in Tabelle 6 dargelegt.

Beispiel 9: Estersynthese aus Sahne

25 Kilogramm Sahne (40 % Fett) [bitte % Milchfett spezifizieren] wurden mit 0,075 kg Palatase 20000 L, 2,31 kg Ethanol (99,8 % Nahrungsmittelqualität aus Molkefermentation) und 22,63 kg Wasser in einem gerührten Tank mit zirkulierender Pumpe und Heizung gemischt. Nachdem das Enzym zugegeben war, wurde die Mischung gerührt und für 48 Stunden bei 37° C gepumpt. Der pH am Ende von drei Stunden war 5,5. Der pH am Ende von 48 Stunden war 4,6. Die Reaktion kann an dieser Stufe wärmebehandelt werden, um einen stabilen Aromabestandteil herzustellen. In diesem Beispiel wurden jedoch 50 kg an geriebenem Cheddarkäse zu dem aromatisierten Esterbestandteil zugegeben und diese Mischung bei 85° C für 15 Minuten erwärmt. Die Hauptmasse des Esters/Sahne/Käse wurde in 20 L Kunststoffeimer gegeben. Das Mischen des Esters und der Sahne mit dem Käse stoppte eine Phasenseparation. Der Wärmeschritt inaktivierte die Palatase und machte das Produkt aseptisch.

Eine zweite Charge an Aromabestandteil wurde aus Sahne wie oben umrissen hergestellt, jedoch wurde sie hergestellt aus einer Anfangsmischung von 70 kg Sahne, mit Palatase 20000 L, Ethanol (99,8 % Nahrungsmittelqualität aus Molkefermentation) und Wasser, zugegeben im gleichen Verhältnis wie oben beschrieben für die erste Charge. 60 kg des resultierenden Produkts wurden mit 60 kg Cheddarkäse vermischt und auf 85° C für 15 Minuten wärmebehandelt, um die Palatase zu inaktivieren und das Produkt aseptisch zu machen.

Die Esteranalyse des resultierenden Produkts aus der zweiten Charge ist unten in Tabelle 7 dargelegt.

Beispiel 10: Aromaevaluierung a) Weiße Sauce

Eine Probe des aromatisierten Esterbestandteils, die gemäß der zweiten Charge in Beispiel 9 hergestellt wurde, wurde mit 1 % in einer weißen Saucenformulierung eingemischt. Die weiße Sauce wurde aus Mischen und Erwärmen von 125 g Saucenpulver (5 g Salz, 120 g Standardweizenmehl und 500 g Sahnepulver) hergestellt und mit 450 g Wasser vermischt.

Der resultierende Geschmack wurde durch die sensorische Expertengruppe (siehe Beispiel 4) bestimmt, um von fruchtigem, süßem (Ananasstück) Geschmack mit seifigen Noten zu sein.

b) Cheddarkäse

Eine Cheddarzubereitung wurde wie folgt hergestellt. 0,5 % eines aromatisierten Esterbestandteils, der gemäß der zweiten Charge in Beispiel 9 hergestellt wurde, wurde mit 58,8 % Cheddarkäse, 1,75 % Trinatriumcitrat und 39,4 % Wasser vermischt, wobei die Prozentanteile auf einer Gewicht/Gewicht-Basis sind.

Das resultierende Produkt wies einen ausgeglichenen, fruchtartigen Geschmack auf, der spät durchkam.

c) Käse von Parmesanstil

Eine Käsemischung mit Parmesanstil wurde wie folgt hergestellt: 0,5 % eines aromatisierten Esterbestandteils, der gemäß der zweiten Charge in Beispiel 9 hergestellt wurde, wurde mit 56,2 % Parmesankäse, 1,75 % Trinatriumcitrat und 42 % Wasser gemischt.

Dies wurde durch die Expertengruppe beschrieben, um einen angenehm süßen, fruchtartigen Geschmack zu ergeben, der einen guten Ausgleich zu den pikanten Geschmacksnoten für Käse mit Parmesanstil bereitstellte.

d) Goudakäse

Eine Goudakäsezubereitung wurde hergestellt durch Mischen von 0,5 % aromatisierten Esterbestandteilen, hergestellt wie für die zweite Charge in Beispiel 9 beschrieben, mit 63,7 % Goudakäse, 1,75 % Trinatriumcitrat und 34,5 % Wasser.

Dieser wurde durch die Expertengruppe als mit einem fruchtigen Geschmack mit keinem chemischen Nachgeschmack beschrieben.

e) Fonduekäse

Ein Fonduerezept wurde hergestellt unter Verwendung von 14 % Cheddarkäse, 23 % Sahne, 47 % Milch, 9 % Butter, 4 % Mehl, 1 % anderen Aromastoffen und 2 % des aromatisierten Esterbestandteils, der gemäß dem Verfahren hergestellt wurde, wie es in Beispiel 6 beschrieben wird.

Die Expertengruppe bemerkte, daß die resultierende Fonduezubereitung verbesserten pikanten/fruchtartigen und käseartigen Geschmack aufwies.

LITERATURHINWEISE

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Anspruch[de]
Verfahren zum Herstellen von geschmacksverbessernden Estern, welches umfaßt:

Durchführen einer Umesterungsreaktion zwischen einem Mono-, Di- oder Triglycerid aus einer Milchproduktquelle und einem Alkohol in einem wäßrigen Medium in der Gegenwart einer Esterase, die ein Verhältnis von Umesterungsaktivität zu Veresterungsaktivität mit dem Mono-, Di- oder Triglycerid von wenigstens 25:1 zeigt, um die geschmacksverbessernden Ester zu bilden.
Verfahren zum Herstellen von geschmacksverbessernden Estern, welches umfaßt:

Durchführen einer Umesterungsreaktion zwischen einem Mono- oder Diglycerid aus einer Milchproduktquelle und einem Alkohol in einem wäßrigen Medium in der Gegenwart eines Enzyms, das von Milchsäurebakterium abgeleitet wird, das ein Verhältnis von Umesterungsaktivität zu Veresterungsaktivität mit dem Mono- oder Diglycerid von wenigstens 25:1 zeigt, um die geschmacksverbessernden Ester zu bilden.
Verfahren zum Herstellen von geschmacksverbessernden Estern, welches umfaßt:

Durchführen einer Umesterungsreaktion zwischen einem Mono-, Di- oder Triglycerid aus einer Milchproduktquelle und einem Alkohol in einem wäßrigen Medium in der Gegenwart einer Mischung einer Lipase und eines Enzyms, das aus einem Milchsäurebakterien abgeleitet wird, oder einer Mischung einer Esterase und eines oder mehrerer Enzyme, die aus Milchsäurebakterien abgeleitet werden, wobei die Mischung ein Verhältnis einer Umesterungsaktivität zu Veresterungsaktivität mit dem Mono-, Di- oder Triglycerid von wenigstens 25:1 zeigt, um die geschmacksverbessernden Ester zu bilden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 3, wobei die Esterase eine Lipase ist. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Enzym zu dem Glycerid und dem Alkohol in dem wäßrigen Medium zugegeben wird. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Milchsäurebakterien, von denen das Enzym abgeleitet wird, zu dem Glycerid und dem Alkohol in dem wäßrigen Medium zugegeben wird, um das Enzym darin zu erzeugen. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Glycerid aus einer Milchproduktquelle aus Vollmilch, Sahne, Milchfett, Käse, durch Enzym modifiziertem Käse (EMC), Buttermilch, Molke, Molkesahne, fermentierter Milch oder anderem Milchprodukt ist. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Alkohol Ethanol ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Alkohol 2-Phenylethanol ist. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, welches einen Fermentationsschritt einschließt, um den Alkohol zu erzeugen. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei Alkohol-erzeugende Mikroorganismen vorhanden sind, um den Fermentationsschritt zu vermitteln. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Alkohol-erzeugende Mikroorganismus Lactobacillus fermentum ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und 10 bis 12, wobei die Mono-, Di- oder Triglyceride jeweils Acylgruppen mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen aufweisen und der Alkohol Ethanol ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und 9 bis 12, wobei das Glycerid ein Diglycerid mit Acylgruppen mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen ist und der Alkohol 2-Phenylethanol ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und 9 bis 12, wobei das Glycerid ein Monoglycerid mit Acylgruppen mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen ist und der Alkohol 2-Phenylethanol ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 15, wobei die Lipase eine 1,3-spezifische Lipase aus Rhizomucor miehei ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 15, wobei das Enzym aus Bakterienkulturen von einem oder mehreren Stämmen der folgenden Gattungen abgeleitet wird, die einschließen:

Streptococcus,

Lactococcus,

Lactobacillus;

Leuconostoc,

Pediococcus,

Enterococcus,

Propionibacterium, und

Pseudomonas.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Enzym aus dem Stamm Streptococcus thermophilus ST1 abgeleitet wird. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Enzym aus einem der Stämme Streptococcus thermophilus NCIMB 700821; Lactobacillus fermentum B4017; Lactococcus lactis subsp. cremoris E8 und Lactococcus lactis subsp. lactis ML3 abgeleitet wird. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der so hergestellte geschmacksverbessernde Ester als ein Bestandteil zu einem Lebensmittel zugegeben wird. Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Lebensmittel ein Milchprodukt ist. Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Milchprodukt ein Käse oder ein Produkt auf Käsebasis ist.






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