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Dokumentenidentifikation DE102004048462B4 12.04.2007
Titel Modellsystem zum Testen von pharmazeutischen Zubereitungen auf Wirksamkeit bei entzündlichen Prozessen im Nervensystem
Anmelder KeyNeurotek AG, 39120 Magdeburg, DE
Erfinder Striggow, Frank, Dr., 39175 Gerwisch, DE;
Mack, Till, Dr., 39104 Magdeburg, DE;
Röhnert, Peter, Dr., 39122 Magdeburg, DE
Vertreter Koepe & Partner, 80538 München
DE-Anmeldedatum 05.10.2004
DE-Aktenzeichen 102004048462
Offenlegungstag 13.04.2006
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 12.04.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.04.2007
IPC-Hauptklasse C12N 5/06(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, DE
IPC-Nebenklasse C12N 5/08(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   G01N 33/15(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   C12Q 1/02(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft Säugerzellen und deren Verwendung als ein Modellsystem zum Testen von pharmazeutischen Zubereitungen und insbesondere von Wirkstoffen in pharmazeutischen Zubereitungen auf Wirksamkeit bei Therapie und Prävention von chronischen und akuten Neuropathien und insbesondere auf ihre neuroprotektive bzw. entzündungsmodulatorische Wirkung. Als funktionales Testsystem mit komplexer Gewebearchitektur dienen organotypische, hippokampale Schnittkulturen vorzugsweise der Ratte, die bei höherem Durchsatz an Testsubstanzen eine ähnlich gute Vorhersagbarkeit über die Wirkung der Substanzen erlauben wie die sehr viel zeit- und kostenaufwendigeren Ganztiermodelle.

Entzündungen bilden eine wesentliche Grundlage des körpereigenen Abwehrverhaltens. Durch Entzündungsprozesse als Teil der Immunantwort versucht der Körper, nach Verletzungen oder Angriffen von außen seine Homöostase wiederherzustellen bzw. beizubehalten. Entzündungen bewirken also eine Verbesserung des Körper-Status im allgemeinen und eine Verbesserung der betroffenen Gewebe im speziellen. Exzessive oder langwierige Entzündungen können aber auch Schäden im betroffenen Gewebe verursachen.

Der Immunstatus des Gehirns ist sehr strikt reguliert und kontrolliert. Im gesunden Zustand wird die Immunantwort und damit entzündliche Prozesse auf ein Minimum reduziert. Im Gegensatz dazu werden im Verlauf von neurodegenerativen Erkrankungen (Neuropathien) wie u.a. Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Multipler Sklerose, Schlaganfällen und Traumata sowie Neoplasien und Infektionen Gliazellen aktiviert. Proinflammatorische Faktoren werden vor Ort synthetisiert, und T-Lymphozyten wandern in das betroffene Hirngebiet ein.

Alle neurodegenerativen Läsionen, besonders wenn sie durch fibrilläre Proteinablagerungen hervorgerufen oder von ihnen begleitet werden, resultieren in nekrotischen Entzündungsreaktionen. Diese umfassen die schon beschriebenen zellulären Veränderungen, u.a. eine Aktivierung der Mikroglia sowie die Freisetzung von proinflammatorischen Faktoren. Schießt diese Entzündungsreaktion über ihr eigentliches Ziel hinaus, lokal die Zelltrümmer der bereits untergegangenen Neurone schnell zu beseitigen, werden statt dessen auch benachbarte, eigentlich gesunde Neurone geschädigt. Die vielfältigen Funktionen von proinflammatorischen Faktoren vorausgesetzt, ist es sehr schwierig, ihre genaue Rolle in spezifischen (patho)physiologischen Situationen genau zu bestimmen. Die veränderte Expression von proinflammatorischen Faktoren kann neurodegenerative Prozesse entweder beschleunigen oder aber ihnen entgegenwirken (Wyss-Coray, T. und Mucke, L.: Inflammation in neurodegenerative disease – a double-edged sword; Neuron. 2002: 35, 419 bis 432). Da entzündliche Prozesse also auch zur Heilung von Schädigungen beitragen, wäre eine selektive Elimination der neurodegenerativen (patho)physiologischen Prozesse ein sehr vielversprechendes therapeutisches Ziel und wäre der bislang angewandten, vollständigen Unterdrückung der Entzündung vermutlich überlegen.

Es wurden bislang im wesentlichen Zellkultur- und Tier-Modelle als Modellsysteme entwickelt, um die komplexen Interaktionen der beteiligten Zelltypen bei Entzündungsreaktionen im Hirngewebe zu analysieren. Im Tiermodell löst die stereotaktische Injektion von bakteriellen Lipopolysacchariden (LPS) aus der äußeren Membran Gram-negativer Bakterien als „pathogen-associated molecular pattern" ins Striatum eine starke Immunantwort aus (eigene Daten, nicht veröffentlicht). Dabei werden im Gewebe verteilte Mikrogliazellen, die im Gehirn die Funktion von Makrophagen wahrnehmen, aktiviert, d.h. zur Phagozytose vorbereitet, und zur Teilung angeregt. Diese Bereitstellung von phagozytotischen Mikroglia ist das wichtigste Kennzeichen der Inflammation im Gehirn. Vermutlich findet auch eine Invasion aus nicht beteiligten Hirnregionen statt. Als Resultat kann man bereits nach wenigen Tagen eine Degeneration des Gewebes inklusive der Neuronen beobachten. Die Dichte der Nervenzellen nimmt stark ab, und das Gewebe vernarbt zunehmend. Vermutlich kommt es auch zu einer Invasion von Immunzellen aus dem Blut durch den Stichkanal, der deutlich als Mittelpunkt der Veränderungen im Gehirngewebe auszumachen ist (eigene Daten; nicht veröffentlicht). Man kann davon ausgehen, dass aktivierte, das heißt phagozytotische Mikroglia für die Beseitigung von degenerierenden Neuronen verantwortlich sind. Es gibt sogar Hinweise, dass sie die Entscheidung über Leben und Tod von überlebensfähigen Neuronen fällen. Darüber hinaus sorgen sie mit der Produktion von einer Vielzahl von pro-inflammatorischen und neurotoxischen Faktoren – darunter Cytokinen, Fettsäuremetaboliten und freien Radikalen, Stickoxyd (NO) und Superoxid – für eine Ausweitung der Inflammation und damit der Degeneration. Der Prozess der Neuroinflammation kann so zu einem Teufelskreis werden, bei dem lokale Inflammation immer auch Neurotoxizität bzw. Neurodegeneration erzeugt, die wiederum die Inflammationsreaktion ausweitet, was wiederum zur Ausbreitung der Neurodegeneration führt. Dabei kann es im Laufe der Erkrankung völlig unerheblich werden, ob am Anfang eine initiale Neurodegeneration oder eine Inflammationsreaktion stand, da sich dieser Kreislauf ohne Intervention von außen immer mehr selbst verstärkt.

Einzelne Faktoren in dieser komplexen Pathogenese können auch in reduktionistischen Zellkultur-Modellen repliziert werden. Dabei werden Co-Kulturen von primären Mikrogliazellen oder mikroglia-artigen Zelllinien mit primären Neuronen angelegt. Eine Aktivierung der Mikroglia kann in diesem Modell durch LPS oder Trimethylzinn erreicht werden (Golde, S., Coles, A., Lindquist, J.A., Compston, A. (2003): Decreased iNOS synthesis mediates dexamethasoneinduced protection of neurons from inflammatory injury in vitro; Eur. J. Neurosci. 18: 2527 bis 2537; Eskes, C., Juillerat-Jeanneret, L., Leuba, G., Honegger, P., Monnet-Tschudi, F. (2003): Involvement of microglia-neuron interactions in the tumor necrosis factor-alpha release, microglial activation, and neurodegeneration induced by trimethyltin; J. Neurosci. Res. 71: 583 bis 590). Als relevanter Ausleseparameter kann nun das Maß an neuronalem Zelltod bzw. die Überlebensrate der Neuronen bestimmt werden. So konnte bereits gezeigt werden, dass u.a. NO als neurotoxischer Faktor Neurodegeneration im Co-Kultur-Modellsystem verursacht, die durch entsprechende Unterdrückung der NO-Produktion aufgehalten werden kann (s.o. Golde et al., 2003).

Ein Vorteil der Zellkultur-Modelle ist also ihre „Einfachheit" und Zugänglichkeit, die eine quantitative Analyse und damit ein Testen von potentiell protektiven Substanzen in relativ kurzer Zeit ermöglicht.

Gravierende Nachteile sind, dass der komplexe Aufbau des Gehirngewebes durch Co-Kulturen nur sehr reduziert abgebildet werden kann. Darüber hinaus werden für diese Co-Kulturen entweder primäre Zellen aus embryonalen Tieren oder Zelllinien verwendet, deren Zustand und Verhalten sich stark von dem adulter Zellen im adulten Gehirn unterscheidet. Diese Modelle bieten also einen guten Durchsatz, aber keine gute Vorhersagequalität, was die Wirksamkeit der getesteten Substanzen im Tiermodell bzw. später im Patienten betrifft.

Die Druckschrift „J. Neuroscience Research 56, Seiten 644–651, 1999" offenbart eine organotypische Gewebekultur aus Hamsterhirnen, wobei die Schnitte ex vivo auf einer porösen Membran in einem Puffer und einem Kulturgas gehalten werden.

Gemäß Dokument EP 1 479 391 werden Mammalia-Herzgewebe-Schnitte ex vivo auf einer Membran mit einer Porengröße von 0,02 &mgr;m bei einem physiologisch annehmbaren pH-Wert in Gegenwart eines Kulturgases in Kultur gehalten.

Aufgabe der Erfindung war daher, ein einfaches, leicht zugängliches und quantitative Analysen in kurzer Zeit ermöglichendes Zellsystem bereitzustellen, das den komplexen Aufbau des Gehirngewebes angemessen abbildet. Eine weitere Aufgabe der Erfindung war, Zellen bereitzustellen, deren Zustand und Verhalten mit dem adulter Zellen im adulten Gehirn vergleichbar ist, so daß an solchen Zellen bei Tests gewonnene Ergebnisse eine zuverlässige Vorhersage der Wirksamkeit der getesteten Substanzen erlauben. Aufgabe der Erfindung war auch, Verwendungen für solche Zellen anzugeben und Verfahren zur Verfügung zu stellen, die sich derartiger Zellen bedienen.

Organotypische Kulturen, die Geweben und Organen eines Säugers entnommen wurden, insbesondere aus Organen oder Geweben des Nervensystems eines Säugers gewonnene Zellen, können ex vivo als organotypische Kulturen bei geeigneten Bedingungen gehalten werden und bei ihrer Kultivierung bleiben die für das Verhalten im Zellverbund wichtigen Nachbarschaftsbeziehungen und die Signaltransduktion zwischen den Zellen beibehalten.

Die vorliegende Erfindung betrifft aus Geweben oder Organen eines Säugers gewonnene, ex vivo auf porösen Membranen mit einer Porengröße ≥ 0,02 &mgr;m bei einem physiologisch annehmbaren pH-Wert in Gegenwart eines Kulturgases in Kultur in einem geeigneten Kulturmedium gehaltene lebende Zellen, bei denen die Nachbarschaftsbeziehungen und die Signaltransduktion zwischen den Zellen beibehalten sind, und die über einen transienten Zeitraum mindestens einer Substanz ausgesetzt wurden, die gewählt ist aus der Gruppe pro-inflammatorische Botenstoffe und Inflammogene. Die erfindungsgemäßen Zellen sind beispielsweise (ohne die Erfindung jedoch hierauf zu beschränken) aus dem Gewebe des Nervensystems eines Säugers gewonnene Zellen, besonders bevorzugt aus dem Hippocampus eines Säugers gewonnene Zellen.

Vorteilhafte Ausführungsformen der beanspruchten lebenden Zellen ergeben sich aus den Unteransprüchen 2 bis 10.

Die Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zur Induktion inflammatorischer Prozesse an ex vivo gehaltenen lebenden Säugerzellen, das die Schritte umfaßt, daß man

  • – Gewebeschnitte auf an sich bekanntem Weg von funktionalem Säuger-Gewebe gewinnt;
  • – die so erhaltenen Gewebeschnitte ex vivo auf porösen Membranen mit einer Porengröße ≥ 0,02 &mgr;m bei einem physiologisch annehmbaren pH-Wert in Gegenwart eines Kulturgases in Kultur in einem geeigneten Kulturmedium in der Weise hält, daß die Nachbarschaftsbeziehungen und die Signaltransduktion zwischen den Zellen beibehalten werden; und
  • – die Zellen der Wirkung mindestens eines pro-inflammatorischen Botenstoffs über einen transienten Zeitraum aussetzt.

Bevorzugte Ausführungsformen dieses Verfahrens sind in den Unteransprüchen 12 und 13 beansprucht.

Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Induktion inflammatorischer Prozesse an ex vivo gehaltenen lebenden Säugerzellen, das die Schritte umfaßt, daß man

  • – Gewebeschnitte auf an sich bekanntem Weg von funktionalem Säuger-Gewebe gewinnt;
  • – die so erhaltenen Gewebeschnitte ex vivo auf porösen Membranen mit einer Porengröße ≥ 0,02 &mgr;m bei einem physiologisch annehmbaren pH-Wert in Gegenwart eines Kulturgases in Kultur in einem geeigneten Kulturmedium in der Weise hält, daß die Nachbarschaftsbeziehungen und die Signaltransduktion zwischen den Zellen beibehalten werden; und
  • – die Zellen der Wirkung mindestens eines Inflammogens über einen transienten Zeitraum aussetzt.

Bevorzugte Ausführungsformen dieses Verfahrens finden sich in den Unteransprüchen 15 und 16.

Bevorzugte Ausführungsformen aller Verfahrensvarianten der vorliegenden Erfindung sind in den Patentansprüchen 17 bis 26 beansprucht.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der lebenden, ex vivo in Kultur gehaltenen und nachfolgend im einzelnen beschriebenen Säugerzellen für medizinische Zwecke.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der lebenden, ex vivo in Kultur gehaltenen und nachfolgend im einzelnen beschriebenen Säugerzellen zur ex vivo-Untersuchung entzündlicher Prozesse, insbesondere zum Testen pharmazeutischer Zubereitungen, weiter bevorzugt zum Testen pharmazeutischer Zubereitungen auf eine neuroprotektive und entzündungsmodulatorische Wirkung.

Weitere bevorzugt Ausführungsformen der vorgenannten Verwendungen sind in den Ansprüchen 31 bis 38 beansprucht.

Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zum Testen der antiinflammatorischen Wirksamkeit einer chemischen Substanz, umfassend die Schritte:

  • – Gewinnen von Gewebeschnitten von funktionalem Säuger-Gewebe, insbesondere von Säuger-Gehirn;
  • – Kultivieren der erhaltenen Gewebeschnitte ex vivo auf porösen Membranen mit einer Porengröße ≥ 0,02 &mgr;m bei einem physiologisch annehmbaren pH-Wert in Gegenwart eines Kulturgases in Kultur in einem geeigneten Kulturmedium in der Weise, daß die Nachbarschaftsbeziehungen und die Signaltransduktion zwischen den Zellen beibehalten werden, unter Erhalt einer lebende Säugerzellen umfassenden Gewebekultur;
  • – Applikation mindestens eines pro-inflammatorischen Botenstoffs auf die Gewebekultur;
  • – Applikation mindestens einer auf ihre antiinflammatorische Wirksamkeit zu testenden chemischen Substanz auf die Gewebekultur;
  • – Applikation mindestens eines Reagenz zum Nachweis einer antiinflammatorischen Wirksamkeit auf die Gewebekultur unter Erzielen einer quantifizierbaren Nachweisreaktion; und
  • – Quantifizieren der Nachweisreaktion anhand des als Ergebnis der Nachweisreaktion erhaltenen Produktes.

Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Testverfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen 40 bis 48.

Der von uns entwickelte Assay verbindet die Vorteile von Zellkultur-Modellen mit der endogenen Komplexität von Gewebekulturen, die als System kommunizierender Zellen die Biologie im geschädigten Organ wesentlich besser wiederspiegeln. Darüber hinaus kann dieses ex vivo-Modellsystem auf eine automatisierte Plattform für organotypische Kulturen (z. B. Telomics RoboticTM) übertragen werden. Dadurch wird eine deutliche Erhöhung des Durchsatz von Testsubstanzen möglich, ohne die Komplexität des Modellsystem bzw. seine Vorhersagequalität einzuschränken. Ein automatisiertes, systematisches Screening von anti-inflammatorischen Substanzen wird dadurch erstmals möglich.

Der Begriff „Säuger", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezeichnet beliebige Säuger bzw. Säugetiere, wie beispielsweise Meerschweinchen, Mäuse, Ratten, Hunde, Katzen oder Affen und bezeichnet in bevorzugten Ausführungsformen Mäuse, Ratten oder Menschen und besonders bevorzugt Menschen. Zellen vom Menschen sind deswegen besonders bevorzugt, weil sie für die denkbaren Verwendungen, wie sie nachfolgend im einzelnen beschrieben werden, die für das vitale Gewebemodell besten Ergebnisse liefern.

Die Säugerzellen sind organotypische Kulturen, die funktionalen Geweben oder Organen eines Säugers entnommen wurden und über mehrere Tage hinweg unter Beibehaltung ihrer Funktionalität ex vivo gehalten werden können. Unter „funktionalen Geweben" wird im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verstanden, daß die komplexen Beziehungen der Zellen untereinander in der organotypischen Gewebekultur beibehalten werden, was sonst nur im Tiermodell realisiert werden kann. Solche Zellen können beliebige Zellen von Geweben oder Organen eines Säugers sein. Erfindungsgemäß bevorzugt sind jedoch aus dem Nervensystem eines Säugers entnommene Zellen und noch mehr bevorzugt Zellen gewählt aus der Gruppe bestehend aus Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS), Zellen aus dem Rückenmark, Zellen vom Hippocampus und Zellen vom zerebralen Cortex. Besonders bevorzugt sind Zellen vom Hippocampus und Zellen vom zerebralen Cortex aufgrund ihrer guten Eignung für die erfindungsgemäßen Zwecke. Derartige Zellen sind gut zugänglich und können auf an sich bekanntem Weg gewonnen werden. Dies kann beispielsweise, ohne die Erfindung hierauf zu beschränken, geschehen durch Anfertigen von Gewebeschnitten auf herkömmlichen Geräten, beispielsweise dem Mcllwain Tissue Chopper. Dabei erhält man Gewebeschnitte einer für die Kultivierung geeigneten Dicke, beispielsweise einer Dicke von 1 bis 1000 &mgr;m, vorzugsweise einer Dicke von 10 bis 800 &mgr;m, weiter bevorzugt einer Dicke von 100 bis 600 &mgr;m, beispielsweise einer Dicke von 350 bis 450 &mgr;m, mit Vorteil einer Dicke von 400 &mgr;m.

Die erhaltenen Gewebeschnitte werden ex vivo gehalten, worunter in der Beschreibung und in den Patentansprüchen verstanden wird, daß die Gewebeschnitte losgelöst vom lebenden Organismus gehalten werden, ohne daß die Zellen an Vitalität und Funktionalität einbüßen.

Bei den lebenden Zellen sind die zellulären Nachbarschaftsbeziehungen und die Signaltransduktion zwischen den Zellen beibehalten, die bevorzugterweise durch neurophysiologische Übertragung von Nervenzell-Impulsen gekennzeichnet ist.

Erfindungsgemäß werden die lebenden Säugerzellen auf porösen Membranen mit einer Porengröße von ≥ 0,02 &mgr;m gehalten. Derartige poröse Membranen sind als solche dem Fachmann für die hier angesprochenen Zwecke bekannt und auch kommerziell erhältlich. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind derartige Membranen durchlässig für ein übliches, auch für das erfindungsgemäß verwendete, Kulturmedium und darüber hinaus weiter bevorzugt auch für Gase, wie beispielsweise für ein im Rahmen der Kultivierung von Zellen verwendetes Kulturgas.

Noch weiter bevorzugt sind Membranen, die auch für Stoffe, selbst oligomere oder polymere Stoffe, durchlässig sind, die im Kulturmedium Verwendung finden. Es entspricht beispielsweise einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, daß die für die Kultivierung der ex vivo gehaltenen Säugerzellen verwendeten Membranen zusätzlich auch durchlässig sind für mindestens einen pro-inflammatorischen Botenstoff und/oder mindestens ein Inflammogen, wie er/es/sie erfindungsgemäß Verwendung findet/finden. Mit Membranen, die für eine oder mehrere der genannten Substanzen durchlässig sind, lassen sich besonders gute Kultur- und Test-Erfolge und auch hohe Durchsätze in den erfindungsgemäßen Verfahren erzielen.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung haben die verwendeten Membranen eine Porengröße im Bereich von 0,02 bis 10 &mgr;m, noch weiter bevorzugt eine Porengröße im Bereich von 0,1 bis 1 &mgr;m und am meisten bevorzugt eine Porengröße im Bereich von 0,2 bis 0,6 &mgr;m, beispielsweise eine Porengröße von 0,2 oder 0,4 &mgr;m.

Erfindungsgemäß werden die ex vivo gehaltenen Säugerzellen in Kultur in einem geeigneten Kulturmedium gehalten. Der Begriff „in Kultur", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Zellen nicht im lebenden Organismus gehalten werden, sondern im wesentlichen vollständig (soweit nicht von anderen, gegebenenfalls gleichartigen Zellen umgeben) von einem künstlichen, im Wesentlichen flüssigen, gegebenenfalls jedoch auch feste, gelöste und/oder gasförmige (auch gasförmig gelöste) Komponenten enthaltenden Medium umgeben sind, das ihnen für bestimmte Funktionen notwendige oder günstige Komponenten kontinuierlich zuführen kann, insbesondere Nährstoffe, Spurenelemente, Vitamine, den pH-Wert einstellende Stoffe, Puffer, bestimmte Zellfunktionen unterstützende, auslösende oder modulierende Stoffe, Antibiotika, und andere Substanzen. Es können ohne Beschränkung dem Fachmann auf diesem technischen Gebiet bekannte Kulturmedien verwendet werden. Es kommen beispielsweise Kulturmedien infrage, die gewählt sind aus Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), F12, Neurobasal Medium, MEM, PRMI (RPMI) 1640, usw.. Besonders bevorzugt, da zum Kultivieren der erfindungsgemäßen Zellen, Halten der erfindungsgemäßen Zellen, Testen der erfindungsgemäßen Zellen oder Anwenden der erfindungsgemäßen Zellen gut bzw. sehr gut geeignet, ist als Kulturmedium DMEM/F12 (volumenbezogene 1 : 1 – Mischung von DMEM und F12). Es kann ein Kulturmedium allein verwendet werden, oder es können auch mehrere Kulturmedien verwendet werden. Dies bezieht sich sowohl auf einen speziellen Schritt des Kultivierens, Haltens, Testens und/oder Anwendens der Zellen als auch auf eine Abfolge mehrerer, parallel oder hintereinander durchgeführter Verfahrensschritte, der/die in einem Kulturmedium oder mehreren Kulturmedien angewendet werden können. Das Kulturmedium kann/die Kulturmedien können an sich bekannte Zusätze enthalten, die einschließen, nicht jedoch beschränkt sind auf Seren (z. B. fetales Rinderserum, Rinderserum, Pferdeserum, B27, N2), Antioxidantien wie Ascorbinsäure, Vitamin E usw..

Erfindungsgemäß werden die ex vivo gehaltenen Säugerzellen in dem Kulturmedium bei einem physiologisch annehmbaren pH-Wert gehalten. Unter dem Begriff „physiologisch annehmbarer pH-Wert" wird in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen ein pH-Wert verstanden, der unter physiologischen Gesichtspunkten für die Zellen erträglich, wenn nicht sogar zuträglich oder förderlich ist, um die Ziele der Erfindung zu erreichen. Insbesondere ist in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung der pH-Wert ein pH-Wert, der demjenigen der zellulären Umgebung entspricht, in der sich die Zellen natürlicherweise aufhalten bzw. in der sie mit Vorteil gehalten werden können. Besonders bevorzugt liegt erfindungsgemäß der physiologisch annehmbare pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 8, noch mehr vorzugsweise im Bereich von 6,9 bis 7,6, weiter bevorzugt im Bereich von 7,3 bis 7,5, beispielsweise bei 7,4.

Erfindungsgemäß werden die Säugerzellen in Gegenwart eines Kulturgases in dem Kulturmedium gehalten. Als Kulturgas kommt jedes Gas infrage, das der Fachmann zum Begasen von ex vivo gehaltenen Säugerzellen in Kulturmedien kennt. Beispiele für Gase, in deren Gegenwart Säugerzellen in Kulturmedien gehalten werden können, sind gewählt aus der Gruppe Luft (wobei unter Luft nicht nur die Luft der Umgebung in ihrer natürlichen Zusammensetzung [im wesentlichen 78,1 Vol.-% Stickstoff, 21,0 Vol.-% Sauerstoff, 0,9 Vol.-% Argon und Mindermengen Kohlendioxid], sondern auch andere, ähnlich zusammengesetzte Gasmischungen, gegebenenfalls auch gereinigte [„Reinluft"] und von unerwünschten Komponenten befreite Luft verstanden wird), Sauerstoff, Stickstoff, Kohlendioxid, an Sauerstoff, Stickstoff oder Kohlendioxid angereicherte Luft usw.. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Kulturgas Reinluft, vorzugsweise Reinluft mit einem erhöhten Gehalt an CO2, weiter bevorzugt Reinluft mit einem Gehalt an CO2 im Bereich von 1 bis 5 Vol.-%, noch weiter bevorzugt Reinluft mit einem Gehalt an CO2 im Bereich von 2 bis 3,5 Vol.-%. Zellen, die in Gegenwart der vorstehend bevorzugt genannten Kulturgase gehalten werden, zeichnen sich erfindungsgemäß durch besondere Vitalität aus und sind damit ausgezeichnete ex vivo haltbare Modellsysteme zum Testen vor Wirkstoffen in pharmazeutischen Zubereitungen auf ihre neuroprotektive und entzündungsmodulatorische Wirkung.

Erfindungsgemäß sind die lebenden, ex vivo gehaltenen Säugerzellen solche Zellen, die über einen transienten Zeitraum mindestens einer Substanz ausgesetzt wurden, die gewählt ist aus der Gruppe pro-inflammatorische Botenstoffe und Inflammogene. Unter pro-inflammatori-schen Botenstoffen werden in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen Stoffe verstanden, die bei Entzündungsreaktionen in unterschiedlichen Geweben zum Zweck der Zell-Kommunikation sekretiert werden. Pro-inflammatorische Botenstoffe sind als solche dem Fachmann des vorliegenden Gebiets in großer Zahl bekannt und können erfindungsgemäß ohne Beschränkung verwendet werden. Der Begriff „Inflammogene" ist im Gegensatz dazu in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen so definiert, dass er Substanzen umfasst, die – wie z. B. Endotoxine – Pathogen-assoziierte Muster enthalten, die vom Muster-Erkennungs-Rezeptoren auf den Zellen des Immunsystems erkannt werden und dadurch eine unverzügliche Antwort auslösen, beispielsweise gegen eingedrungene Mikroorganismen. Inflammogene sind als solche dem Fachmann des vorliegenden Gebiets ebenfalls in großer Zahl bekannt und können erfindungsgemäß ohne Beschränkung verwendet werden. Ein oder mehrere pro-inflammatorische(r) Botenstoff(e) bzw. ein oder mehrere Inflammogen(e) können jeweils allein oder in Gruppen bzw. als mehrere von ihnen verwendet werden, ohne dass dies erfindungsgemäß Beschränkungen unterliegt.

In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wurden die lebenden, in Kultur ex vivo gehaltenen Säugerzellen über einen transienten Zeitraum genau einer Substanz ausgesetzt, die gewählt ist aus der Gruppe pro-inflammatorische Botenstoffe und Inflammogene. Dabei entspricht es noch weiter bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, wenn der/die pro-inflammatorische(n) Botenstoff(e) gewählt ist/sind aus der Gruppe pro-inflammatorische Proteine und Peptide, vorzugsweise aus der Gruppe der Cytokine, weiter bevorzugt aus der Gruppe CSF-Proteine und Interferone, noch mehr bevorzugt aus der Gruppe GM-CSF, G-CSF und M-CSF und IFN&ggr;, und/oder wenn das/die Inflammogen(e) gewählt ist/sind aus der Gruppe der Endotoxine, weiter bevorzugt aus der Gruppe der Lipopolysaccharide (LPS), noch weiter bevorzugt aus der Gruppe der bakteriellen Lipopolysaccharide. Weitere beispielhafte, zur Gruppe der Endotoxine gehörende Inflammogene sind Peptidoglykane, Lipoteichonsäuren, Mannose-reiche Glykane, Flagellin, Pillin, nicht-methylierte Cytosin-Guanin-Dinucleotide, bakterielle DNS, N-Formylmethionin, doppelstängige RNS, Lipoteichinsäure/Glycolipide/Zymosan aus Hefezellen, Phosphorylcholine und andere Lipide aus bakteriellen Membranen.

Der Begriff „transienter Zeitraum", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, soll bedeuten, dass die Zellen dem/den genannten Stoff(en) nicht auf Dauer, sondern nur vorübergehend ausgesetzt wurden. Der Fachmann kann im Einzelfall die Dauer des Kontakts der Zellen mit dem/den genannten Stoff(en) aufgrund einzelner orientierender Versuche ermitteln oder kennt aufgrund seiner Erfahrung die Zeiten, die einem solchen Kontakt zugrundegelegt werden sollten. Der transiente Zeitraum kann in dem Fall, in dem mehrere Stoffe nebeneinander oder nacheinander verwendet werden, für die mehreren Substanzen gleich sein oder kann sich für mehrere Substanzen unterscheiden. Der Zeitraum kann sich auch nach Art der Säugerzelle (z. B. Mausezelle oder humane Zelle) oder nach dem Typ der Zelle (z. B. Zelle des ZNS, Zelle des cerebralen Cortex) unterscheiden. Erfindungsgemäß ist es besonders bevorzugt, dass die Dauer des transienten Zeitraums bei dem mindestens einen pro-inflammatorischen Botenstoff im Bereich von 10 min bis 7 d liegt, vorzugsweise im Bereich von 15 min bis 4d, weiter bevorzugt im Bereich von 30 min bis 2d, und/oder daß die Dauer des transienten Zeitraums bei dem mindestens einen Inflammogen im Bereich von 1d bis 14d liegt, vorzugsweise im Bereich von 1d bis 4d, weiter bevorzugt im Bereich von 2d bis 3d.

Die wie vorstehend beschrieben in Kultur gehaltenen lebenden Säugerzellen gemäß der Erfindung lassen sich in bevorzugten Ausführungsformen für beliebige medizinische Zwecke verwenden. Diese sind nicht beschränkt und werden vom Fachmann anhand seines Fachwissens und der speziellen Eignung der Zellen gewählt. Mit besonderem Vorteil eignen sich die lebenden, in Kultur gehaltenen Säugerzellen entsprechend der obigen detaillierten Beschreibung zur ex vivo-Untersuchung entzündlicher Prozesse, insbesondere zum Testen pharmazeutischer Zubereitungen, weiter bevorzugt zum Testen pharmazeutischer Zubereitungen auf eine neuroprotektive und entzündungsmodulatorische Wirkung.

Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Induktion inflammatorischer Prozesse an ex vivo gehaltenen lebenden Säugerzellen. Dieses Verfahren umfaßt die Schritte, daß man

  • – Gewebeschnitte auf an sich bekanntem Weg von funktionalem Säuger-Gewebe gewinnt;
  • – die so erhaltenen Gewebeschnitte ex vivo auf porösen Membranen mit einer Porengröße ≥ 0,02 &mgr;m bei einem physiologisch annehmbaren pH-Wert in Gegenwart eines Kulturgases in Kultur in einem geeigneten Kulturmedium in der Weise hält, daß die Nachbarschaftsbeziehungen und die Signaltransduktion zwischen den Zellen beibehalten werden; und
  • – die Zellen der Wirkung mindestens eines pro-inflammatorischen Botenstoffs über einen transienten Zeitraum aussetzt.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Induktion inflammatorischer Prozesse an ex vivo gehaltenen lebenden Säugerzellen. Dieses Verfahren umfaßt die Schritte, daß man

  • – Gewebeschnitte auf an sich bekanntem Weg von funktionalem Säuger-Gewebe gewinnt;
  • – die so erhaltenen Gewebeschnitte ex vivo auf porösen Membranen mit einer Porengröße ≥ 0,02 &mgr;m bei einem physiologisch annehmbaren pH-Wert in Gegenwart eines Kulturgases in Kultur in einem geeigneten Kulturmedium in der Weise hält, daß die Nachbarschaftsbeziehungen und die Signaltransduktion zwischen den Zellen beibehalten werden; und
  • – die Zellen der Wirkung mindestens eines Inflammogens über einen transienten Zeitraum aussetzt.

Ein oder mehrere pro-inflammatorische(r) Botenstoff(e) bzw. ein oder mehrere Inflammogen(e) können jeweils allein oder in Gruppen bzw. als mehrere von ihnen in den beiden vorgenannten Verfahren verwendet werden, ohne dass dies erfindungsgemäß Beschränkungen unterliegt.

In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wurden die lebenden, in Kultur ex vivo gehaltenen Säugerzellen über einen transienten Zeitraum genau einer Substanz ausgesetzt, die gewählt ist aus der Gruppe pro-inflammatorische Botenstoffe und Inflammogene. Dabei entspricht es noch weiter bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, wenn in dem einen der vorgenannten Verfahren der/die pro-inflammatorische(n) Botenstoff(e) gewählt ist/sind aus der Gruppe pro-inflammatorische Proteine und Peptide, vorzugsweise aus der Gruppe der Cytokine, weiter bevorzugt aus der Gruppe CSF-Proteine und Interferone, noch mehr bevorzugt aus der Gruppe GM-CSF, G-CSF und M-CSF und IFN&ggr;. In dem anderen der vorgenannten Verfahren ist es besonders bevorzugt, wenn das/die Inflammogen(e) gewählt ist/sind aus der Gruppe der Endotoxine, weiter bevorzugt aus der Gruppe der Lipopolysaccharide (LPS), noch weiter bevorzugt aus der Gruppe der bakteriellen Lipopolysaccharide. Weitere beispielhafte, zur Gruppe der Endotoxine gehörende Inflammogene sind Peptidoglykane, Lipoteichonsäuren, Mannose-reiche Glykane, Flagellin, Pillin, nicht-methylierte Cytosin-Guanin-Dinucleotide, bakterielle DNS, N-Formylmethionin, doppelstängige RNS, Lipoteichinsäure/Glycolipide/Zymosan aus Hefezellen, Phosphorylcholine und andere Lipide aus bakteriellen Membranen.

Der Fachmann kann in den vorgenannten Verfahren die Dauer des transienten Kontakts der Zellen mit dem/den genannten Stoff(en) aufgrund einzelner orientierender Versuche ermitteln oder kennt aufgrund seiner Erfahrung die Zeiten, die einem solchen Kontakt zugrundegelegt werden sollten. Der transiente Zeitraum kann in dem Fall, in dem mehrere Stoffe nebeneinander oder nacheinander verwendet werden, für die mehreren Substanzen gleich sein oder kann sich für mehrere Substanzen unterscheiden. Der Zeitraum kann sich auch nach Art der Säugerzelle (z. B. Mausezelle oder humane Zelle) oder nach dem Typ der Zelle (z. B. Zelle des ZNS, Zelle des cerebralen Cortex) unterscheiden. Erfindungsgemäß ist es besonders bevorzugt, dass in den vorgenannten Verfahren die Dauer des transienten Zeitraums bei dem mindestens einen proinflammatorischen Botenstoff im Bereich von 10 min bis 7d liegt, vorzugsweise im Bereich von 15 min bis 4d, weiter bevorzugt im Bereich von 30 min bis 2d. Im Falle der transienten Einwirkung mindestens eines Inflammogens liegt die Dauer des transienten Zeitraums im Bereich von 1d bis 14d liegt, vorzugsweise im Bereich von 1d bis 4d, weiter bevorzugt im Bereich von 2d bis 3d.

In allen Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, die die Induktion inflammatorischer Prozesse an den erfindungsgemäßen lebenden, ex vivo gehaltenen Säugerzellen betreffen, werden poröse Membranen mit einer Porengröße ≥ 0,02 &mgr;m verwendet. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind derartige Membranen durchlässig für ein übliches, auch für das erfindungsgemäß verwendete, Kulturmedium und darüber hinaus weiter bevorzugt auch für Gase, wie beispielsweise für ein im Rahmen der Kultivierung von Zellen verwendetes Kulturgas.

Noch weiter bevorzugt sind erfindungsgemäß Membranen, die auch für Stoffe, selbst oligomere oder polymere Stoffe, durchlässig sind, die im Kulturmedium Verwendung finden. Es entspricht beispielsweise bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren, daß die für die Kultivierung der ex vivo gehaltenen Säugerzellen verwendeten Membranen zusätzlich auch durchlässig sind für mindestens einen pro-inflammatorischen Botenstoff und/oder mindestens ein Inflammogen, wie er/es/sie erfindungsgemäß Verwendung findet/finden. Mit Membranen, die für eine oder mehrere der genannten Substanzen durchlässig sind, lassen sich besonders gute Kultur- und Test-Erfolge und auch hohe Durchsätze in den erfindungsgemäßen Verfahren erzielen.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung haben die verwendeten Membranen eine Porengröße im Bereich von 0,02 bis 10 &mgr;m, noch weiter bevorzugt eine Porengröße im Bereich von 0,1 bis 1 &mgr;m und am meisten bevorzugt eine Porengröße im Bereich von 0,2 bis 0,6 &mgr;m, beispielsweise eine Porengröße von 0,2 oder 0,4 &mgr;m.

In den oben genannten erfindungsgemäßen Verfahren werden die lebenden, ex vivo gehaltenen Säugerzellen in Kultur in einem geeigneten Kulturmedium gehalten. In dem Kulturmedium sind die lebend ex vivo gehaltenen Säugerzellen im wesentlichen vollständig (soweit nicht von anderen, gegebenenfalls gleichartigen Zellen umgeben) von einem künstlichen, im Wesentlichen flüssigen, gegebenenfalls jedoch auch feste, gelöste und/oder gasförmige (auch gasförmig gelöste) Komponenten enthaltenden Medium umgeben, das ihnen für bestimmte Funktionen notwendige oder günstige Komponenten kontinuierlich zuführen kann, insbesondere Nährstoffe, Spurenelemente, Vitamine, den pH-Wert einstellende Stoffe, Puffer, bestimmte Zellfunktionen unterstützende, auslösende oder modulierende Stoffe, Antibiotika, und andere Substanzen. Es können ohne Beschränkung dem Fachmann auf diesem technischen Gebiet bekannte Kulturmedien verwendet werden. Es kommen beispielsweise Kulturmedien infrage, die gewählt sind aus Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), F12, Neurobasal Medium, MEM, PRMI (RPMI) 1640 usw.. Besonders bevorzugt, da zum Kultivieren der erfindungsgemäßen Zellen, Halten der erfindungsgemäßen Zellen, Testen der erfindungsgemäßen Zellen oder Anwenden der erfindungsgemäßen Zellen gut bzw. sehr gut geeignet, sind als Kulturmedium DMEM/F12 (Mischung im Volumenverhältnis 1 : 1). Es kann ein Kulturmedium allein verwendet werden, oder es können auch mehrere Kulturmedien verwendet werden. Dies bezieht sich sowohl auf einen speziellen Schritt des Kultivierens, Haltens, Testens und/oder Anwendens der Zellen als auch auf eine Abfolge mehrerer, parallel oder hintereinander durchgeführter Verfahrensschritte, der/die in einem Kulturmedium oder mehreren Kulturmedien angewendet werden können. Das Kulturmedium kann/die Kulturmedien können an sich bekannte Zusätze enthalten, die einschließen, nicht jedoch beschränkt sind auf Seren (z. B. fetales Rinderserum, Rinderserum, Pferdeserum, B27, N2), Antioxidantien wie Ascorbinsäure, Vitamin E usw..

In den oben genannten erfindungsgemäßen Verfahren werden die ex vivo gehaltenen Säugerzellen in dem Kulturmedium bei einem physiologisch annehmbaren pH-Wert gehalten, also bei einem pH-Wert, der unter physiologischen Gesichtspunkten für die Zellen erträglich, wenn nicht sogar zuträglich oder förderlich ist, um die Ziele der Erfindung zu erreichen. Insbesondere ist in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung der pH-Wert ein pH-Wert, der demjenigen der zellulären Umgebung entspricht, in der sich die Zellen natürlicherweise aufhalten bzw. in der sie mit Vorteil gehalten werden können. Besonders bevorzugt liegt erfindungsgemäß der physiologisch annehmbare pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 8, noch mehr vorzugsweise im Bereich von 6,9 bis 7,6, weiter bevorzugt im Bereich von 7,3 bis 7,5, beispielsweise bei 7,4.

Erfindungsgemäß werden die Säugerzellen in Gegenwart eines Kulturgases in dem Kulturmedium gehalten. Als Kulturgas kommt jedes Gas infrage, das der Fachmann zum Begasen von ex vivo gehaltenen Säugerzellen in Kulturmedien und/oder die erfindungsgemäßen Verfahrensweisen des Haltens, Kultivierens und Induzierens inflammatorischer Prozesse kennt. Beispiele für Gase, in deren Gegenwart Säugerzellen in Kulturmedien gehalten oder kultiviert werden können und/oder in deren Gegenwart inflammatorische Prozesse initiiert werden können, sind gewählt aus der Gruppe Luft (wobei unter Luft nicht nur die Luft der Umgebung in ihrer natürlichen Zusammensetzung [im wesentlichen 78,1 Vol.-% Stickstoff, 21,0 Vol.-% Sauerstoff, 0,9 Vol.-% Argon und Mindermengen Kohlendioxid], sondern auch andere, ähnlich zusammengesetzte Gasmischungen, gegebenenfalls auch gereinigte [„Reinluft"] und von unerwünschten Komponenten befreite Luft verstanden wird), Sauerstoff, Stickstoff, Kohlendioxid, an Sauerstoff, Stickstoff oder Kohlendioxid angereicherte Luft usw.. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Kulturgas Reinluft, vorzugsweise Reinluft mit einem erhöhten Gehalt an CO2, weiter bevorzugt Reinluft mit einem Gehalt an CO2 im Bereich von 1 bis 5 Vol.-%, noch weiter bevorzugt Reinluft mit einem Gehalt an CO2 im Bereich von 2 bis 3,5 Vol.-%. Zellen, die in Gegenwart der vorstehend bevorzugt genannten Kulturgase gehalten werden, zeichnen sich erfindungsgemäß durch besondere Vitalität aus und sind damit ausgezeichnete ex vivo haltbare Modellsysteme zum Testen vor Wirkstoffen in pharmazeutischen Zubereitungen auf ihre neuroprotektive und entzündungsmodulatorische Wirkung.

Die vorgenannten erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich an beliebigen, aus Geweben oder Organen eines Säugers, vorzugsweise aus Geweben oder Organen aus dem Nervensystem eines Säugers, gewonnenen, ex vivo auf porösen Membranen gehaltenen lebenden Zellen durchführen. Beispiele für solche Zellen sind Zellen beliebiger Säuger bzw. Säugetiere, wie beispielsweise Zellen von Meerschweinchen, Mäuse, Ratten, Hunde, Katzen oder Affen und in bevorzugten Ausführungsformen Zellen von Mäusen, Ratten oder Menschen und besonders bevorzugt Zellen von Menschen. Zellen vom Menschen sind deswegen besonders bevorzugt, weil sie für die denkbaren Verwendungen, wie sie nachfolgend im einzelnen beschrieben werden, die für das vitale Gewebemodell besten Ergebnisse liefern.

In den genannten erfindungsgemäßen Verfahren können die verwendeten Säugerzellen beliebige Zellen von Geweben oder Organen eines Säugers sein. Erfindungsgemäß bevorzugt sind jedoch die verwendeten Zellen aus dem Nervensystem eines Säugers entnommene Zellen und sind noch mehr bevorzugt gewählt aus der Gruppe bestehend aus Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS), Zellen aus dem Rückenmark, Zellen vom Hippocampus und Zellen vom zerebralen Cortex. Besonders bevorzugt sind Zellen vom Hippocampus und Zellen vom zerebralen Cortex aufgrund ihrer guten Eignung für die erfindungsgemäßen Zwecke. Derartige Zellen sind auf den oben beschriebenen Wegen gut zugänglich. Die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Zellen sind bei ihrer Gewinnung Verbünde von Zellen in Form von Gewebeschnitten einer für die Kultivierung geeigneten Dicke, beispielsweise einer Dicke von 1 bis 1000 &mgr;m, vorzugsweise einer Dicke von 10 bis 800 &mgr;m, weiter bevorzugt einer Dicke von 100 bis 600 &mgr;m, beispielsweise einer Dicke von 350 bis 450 &mgr;m, mit Vorteil einer Dicke von 400 &mgr;m.

In den erfindungsgemäßen Verfahren zur Induktion inflammatorischer Prozesse wird in besonders bevorzugten Ausführungsformen als Inflammogen mindestens ein (vorzugsweise baktrielles) Lipopolysaccharid (LPS) in Kombination mit einem oder mehreren pro-inflammatorischen Protein(en) und/oder Peptid(en) verwendet. In diesen verfahrensgemäß verwendeten Kombinationen ist/sind das/die Protein(e) und/oder das/die Peptid(e) weiter bevorzugt gewählt aus der Gruppe der Cytokine, noch weiter bevorzugt aus der Gruppe CSF-Proteine und Interferone, noch mehr bevorzugt aus der Gruppe GM-CSF, G-CSF und M-CSF und IFN&ggr;.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen werden zur Induktion inflammatorischer Prozesse Zellen, Zell-Lysate oder Partikel von Zellen aller Art, speziell Zellen des Immunsystems (z. B. T-Lymphocyten) oder auch Bakterien/Pilze, als Lieferanten pro-inflammatorischer Zytokine in Kombination mit einem Lipopolysaccharid (LPS) oder einem anderen Endotoxin verwendet.

Ergebnis des Einwirkens eines oder mehrerer Stoffe aus der Gruppe Inflammogene und pro-inflammatorische Botenstoffe auf die erfindungsgemäßen lebenden, ex vivo gehaltenen Säugerzellen aus Geweben oder Organen eines Säugers, insbesondere des Säuger-Nervensystems, ist die Manifestation entzündlicher Prozesse, die durch eine maximale Aktivierung der Mikroglia zu Phagocyten gekennzeichnet ist. Für Testzwecke ist angestrebt und damit für den Modellcharakter besonders bevorzugt die Manifestation entzündlicher Prozesse, die degenerative Folgeprozesse bedingen, da die Wirksamkeit neuer Substanzen im Rahmen solcher degenerativer Folgeprozesse inflammatorischer Geschehnisse in solchen Zellen als Modell getestet werden soll.

Im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren zur Induktion inflammatorischer Prozesse ist es ebenfalls eine bevorzugte Verfahrensvariante, die erfindungsgemäßen lebenden, ex vivo gehaltenen Säugerzellen zusammen mit Zellen und/oder Gewebestücken anderen Ursprungs zu kultivieren, besonders bevorzugt gleichzeitig zusammen zu kultivieren. Die Art und der Typ von Zellen und/oder Gewebestücken anderen Ursprungs, die für solche bevorzugten Verfahren geeignet sind, sind erfindungsgemäß nicht beschränkt und können vom Fachmann anhand seines Fachwissens im Rahmen der Ziele der vorliegenden Erfindung ausgewählt werden. Besonders bevorzugt sind die Zellen und/oder Gewebestücke anderen Ursprungs Säugerzellen und/oder Säuger-Gewebestücke anderer Säuger als der oben genannten Säuger, vorzugsweise Humanzellen und/oder Humangewebe-Stücke.

Die erfindungsgemäßen lebenden, ex vivo gehaltenen und aus Geweben und/oder Organen von Säugern, insbesondere von Geweben und/oder Organen des Nervensystems eines Säugers, gewonnenen Säugerzellen können für beliebige, dem Fachmann aufgrund seines Fachwissens denkbare Zwecke verwendet werden. Besonders bevorzugt haben sich im Rahmen der Erfindung medizinische Zwecke als Anwendungsbereich für die Zellen bewährt. Selbst der medizinische Anwendungsbereich ist – für den Fachmann erkennbar – immer noch weit gesteckt und kann den Bereich medizinischer Tests genauso umfassen wie den Bereich der Prävention und/oder Therapie von Erkrankungen am Menschen und am Tier.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen lebenden, ex vivo gehaltenen und aus Geweben und/oder Organen eines Säugers, insbesondere aus Geweben und/oder Organen des Nervensystems von Säugern, gewonnenen Säugerzellen zu ex vivo-Untersuchungen entzündlicher Prozesse, insbesondere zum Testen pharmazeutischer Zubereitungen, weiter bevorzugt zum Testen pharmazeutischer Zubereitungen auf eine neuroprotektive und entzündungsmodulatorische Wirkung, verwendet. Die Zellen sind in diesem Rahmen ein den oben aufgezeigten Erfordernissen optimal entsprechendes Modellsystem und erlauben bei höherem Durchsatz an Testsubstanzen eine ähnlich gute Vorhersagbarkeit über die Wirkung der Substanzen wie die sehr viel zeit- und kostenaufwendigeren Ganztiermodelle.

In weiteren, erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsformen lassen sich die erfindungsgemäßen lebenden, ex vivo gehaltenen und aus Geweben und/oder Organen eines Säugers, insbesondere aus Geweben und/oder Organen des Nervensystems von Säugern gewonnenen Säugerzellen mit exzellenten Voraussage-Ergebnissen in Modell-Untersuchungen chemischer, biologischer und/oder physikalischer Einflüsse auf physiologische oder pathophysiologische Prozesse verwenden. Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Anwendungsbereiche in diesem Rahmen sind die folgenden:

  • – Verwendung in Modell-Untersuchungen chemischer, biologischer und/oder physikalischer Einflüsse auf physiologische oder pathophysiologische Prozesse in Säuger-Gewebe, vorzugsweise im Zentralen Nervensystem (ZNS);
  • – Verwendung zur Target-Identifizierung und Target-Validierung, zur Identifizierung und Validierung von diagnostischen Markern und zur Entwicklung diagnostischer Werkzeuge zur Früherkennung bzw. Akutdiagnose von neurodegenerativen Erkrankungen;
  • – Verwendung zur Aufklärung von physiologischen, vorzugsweise pathophysiologischen Wirkungsmechanismen bei neurodegenerativen Erkrankungen, besonders bevorzugt bei inflammatorischen Erkrankungen, bei Morbus Alzheimer, bei Morbus Parkinson, bei Multipler Sklerose, bei ALS, bei Morbus Hunntigton und bei Wucherungen im ZNS, die mit entzündlichen Prozessen einhergehen;
  • – Verwendung zum Wirkstoff-Screening, zur Wirkstoff-Identifizierung und zur Validierung einschließlich der Verwendung als Toxizitätsassay;
  • – Verwendung zur Entwicklung von präventiv oder therapeutisch wirksamer Substanzen, bevorzugt von Arzneimitteln und ganz besonders bevorzugt zur Entwicklung von Arzneimitteln zur Behandlung von entzündlichen Prozessen im allgemeinen und von Erkrankungen des Nervensystems.

Als besonders vorteilhaft – und damit erfindungsgemäß auch ganz besonders bevorzugt – hat es sich herausgestellt, dass die vorgenannten Verwendungsgebiete ausnahmslos den Einsatz der aus Geweben oder Organen eines Säugers, insbesondere aus Geweben oder Organen des Nervensystems eines Säugers gewonnenen, ex vivo in Kultur gehaltenen Säugerzellen gemäß der obigen detaillierten Beschreibung beim Arbeiten mit automatisierten Geräten erlauben. Somit wird in überraschend einfacher und effektiver Weise ein höherer Durchsatz an Testsubstanzen bei einer ähnlich guten Vorhersagbarkeit über die Wirkung der Substanzen möglich wie bei den sehr viel zeit- und kostenaufwendigeren Ganztiermodellen. Automatische Geräte, die in den oben im einzelnen genannten Anwendungsgebieten verwendet werden, sind dem Fachmann als solche bekannt; sie schließen insbesondere die automatisierte Platform zur Kultivierung organotypischer Kulturen mit der Bezeichnung „Telomics RoboticTM" ein.

Die Erfindung schließt in einer besonderen, da mit unerwarteten Vorteilen gegenüber dem Stand der Technik verbundenen Ausführungsform ein Verfahren zum Testen der antiinflammatorischen Wirksamkeit einer chemischen Substanz ein, das die folgenden Schritte umfasst:

  • – Gewinnen von Gewebeschnitten von funktionalem Säuger-Gewebe, insbesondere vom Säuger-Gehirn;
  • – Kultivieren der erhaltenen Gewebeschnitte ex vivo auf porösen Membranen mit einer Porengröße ≥ 0,02 &mgr;m bei einem physiologisch annehmbaren pH-Wert in Gegenwart eines Kulturgases in Kultur in einem geeigneten Kulturmedium in der Weise, daß die Nachbarschaftsbeziehungen und die Signaltransduktion zwischen den Zellen beibehalten werden, unter Erhalt einer lebende Säugerzellen umfassenden Gewebekultur;
  • – Applikation mindestens eines pro-inflammatorischen Botenstoffs auf die Gewebekultur;
  • – Applikation mindestens einer auf ihre antiinflammatorische Wirksamkeit zu testenden chemischen Substanz auf die Gewebekultur;
  • – Applikation mindestens eines Reagenz zum Nachweis einer antiinflammatorischen Wirksamkeit auf die Gewebekultur unter Erzielen einer quantifizierbaren Nachweisreaktion; und
  • – Quantifizieren der Nachweisreaktion anhand des als Ergebnis der Nachweisreaktion erhaltenen Produktes.

Die in diesem Verfahren durchzuführenden Verfahrensschritte stimmen zum Teil mit den oben bereits im Detail beschriebenen Verfahren überein, nämlich mit den obigen Verfahren zum Induzieren eines inflammatorischen Prozesses an den erfindungsgemäßen, ex vivo in Kultur gehaltenen lebenden Säugerzellen. Daher kann zur Beschreibung dieser Verfahrensschritte und ihrer bevorzugten Ausführungsformen (bevorzugte Durchlässigkeit und Porengröße der für die Kultur verwendeten Membranen, physiologisch annehmbarer pH-Wert des Kulturmediums und dessen bevorzugte Ausführungsformen, präsentes Kulturgas und dessen bevorzugte Ausführungsformen, bevorzugte Säugerzellen, bevorzugte Herkunft der Zellen aus Geweben oder Organen des Nervensystems und deren bevorzugte Ausführungsformen) auf die obige Beschreibung und deren bevorzugte Ausführungsformen Bezug genommen werden.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Testverfahrens ist/sind der/die pro-inflammatorische(n) Botenstoff(e) gewählt aus der Gruppe pro-inflammatorische Proteine und Peptide, vorzugsweise aus der Gruppe der Cytokine, weiter bevorzugt aus der Gruppe CSF-Proteine und Interferone, noch mehr bevorzugt aus der Gruppe GM-CSF, G-CSF und M-CSF und IFN&ggr;. Erfindungsgemäß weiter bevorzugt ist eine Ausführungsform des genannten Testverfahrens, in der man den mindestens einen pro-inflammatorischen Botenstoff für einen transienten Zeitraum auf die Gewebekultur einwirken läßt, vorzugsweise worin die Dauer des transienten Zeitraums bei dem mindestens einen pro-inflammatorischen Botenstoff im Bereich von 10 min bis 7d liegt, weiter bevorzugt im Bereich von 15 min bis 4d, noch mehr bevorzugt im Bereich von 30 min bis 2d.

Gemäß einer weiteren, ebenfalls bevorzugten und entweder zeitlich getrennt von dem obigen Einwirkenlassen des pro-inflammatorischen Botenstoffs oder gemeinsam mit diesem verwirklichten Ausführungsform des Testverfahrens geht man so vor, dass man gleichzeitig mit oder zeitlich getrennt von einer Applikation mindestens eines pro-inflammatorischen Botenstoffs auf die Gewebekultur mindestens ein Inflammogen auf die Gewebekultur aufbringt, vorzugsweise worin man nach einer Applikation mindestens eines proinflammatorischen Botenstoffs auf die Gewebekultur mindestens ein Inflammogen auf die Gewebekultur aufbringt. Dabei ist es weiter bevorzugt, dass das/die Inflammogen(e) gewählt ist/sind aus der Gruppe der Endotoxine, noch mehr bevorzugt aus der Gruppe der Lipopolysaccharide (LPS). Noch weiter bevorzugt wird mindestens ein Inflammogen, vorteilhafterweise mindestens ein Lipopolysaccharid, noch weiter bevorzugt mindestens ein bakterielles Lipopolysaccharid, auf die Gewebekultur aufgebracht. Mit besonderem Vorteil lässt man das wenigstens eine Inflammogen über einen transienten Zeitraum auf die Gewebekultur einwirken. Vorzugsweise liegt die Dauer des transienten Zeitraums bei dem mindestens einen Inflammogen im Bereich von 1d bis 14d, weiter bevorzugt im Bereich von 1d bis 4d, noch mehr bevorzugt im Bereich von 2d bis 3d.

Es entspricht einer erfindungsgemäß erfolgreichen und daher bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, wenn in dem Verfahren zum Testen der antiinflammatorischen Wirksamkeit einer chemischen Substanz als Inflammogen ein (vorzugsweise bakterielles) Lipopolysaccharid (LPS) in Kombination mit einem oder mehreren pro-inflammatorischen Protein(en) und/oder Peptid(en) verwendet wird.

Es entspricht einer weiteren, aufgrund der sich hieraus ergebenden Möglichkeiten besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testverfahrens, dass man als das mindestens eine Reagenz zum Nachweis einer antiinflammatorischen Wirksamkeit auf die Gewebekultur ein physikalische Meßmethoden zulassendes Reagenz aufbringt, vorzugsweise ein optische Nachweismethoden zulassendes Reagenz, weiter bevorzugt ein einer optischen Meßmethode zugängliches Farbreagenz, noch mehr bevorzugt ein einer Fluoreszenz-Messung zugängliches Farbreagenz. Dies ermöglicht einen schnellen und zuverlässigen quantitativen Nachweis der antiinflammatorischen Wirksamkeit, der zudem den weiteren Vorteil aufweist, dass er einer automatisierten Messung zugänglich ist. Dies erlaubt es in überraschender, vorteilhafter Weise, das Testverfahren mit Vorteil auf automatisierten Laboranlagen anzuwenden. So wird bei höherem Durchsatz an Testsubstanzen eine ähnlich gute Vorhersagbarkeit über die Wirkung der Substanzen erlaubt wie bei den sehr viel zeit- und kostenaufwendigeren Ganztiermodellen. Dadurch wird das erfindungsgemäße Testverfahren auch für Screening-Verfahren einer großen Zahl vermutet wirksamer Substanzen zugänglich.

Die Erfindung wird nachfolgend an einem beispielhaften, die Erfindung nicht beschränkenden Verfahrensablauf erläutert, aus dem der Fachmann insbesondere die Vorteile der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung beispielhaft erkennen kann.

Bei organotypischen Kulturen handelt es sich um ca. 400 &mgr;M dicke Schnitte, die aus lebendem Säuger-Gewebe, z. B. Gewebe des Hippocampus als Teil des Cortex, angefertigt und auf porösen Membranen kultiviert werden. Die Massenkultivierung und hervorragende Zugänglichkeit garantieren einen guten Durchsatz von Testsubstanzen.

Gleichzeitig bleiben die Nachbarschaftsbeziehungen und die Signaltransduktion zwischen den verschiedenen Zelltypen des Gehirns auch im Gewebeschnitt erhalten, was durch funktionale Analysen gezeigt werden kann. Es kann also davon ausgegangen werden, dass die Kommunikation der Zellen untereinander in organotypischen Kulturen die Verhältnisse im lebenden Organismus wiederspiegelt oder diese zumindest sehr gut rekapituliert. Dadurch ergibt sich eine exzellente Übertragbarkeit der an diesen Kulturen gewonnen Ergebnisse auf Tiermodelle. Somit ist zu erwarten, das es eine gute Übereinstimmung von wirksamen, neuroprotektiven Substanzen im organotypischen Gewebekulturmodell und im Tiermodell gibt, was durch Validierung von bekannten Entzündungshemmern in unserem Assay bestätigt werden konnte (s. Beispiele und ).

Es ist bereits darauf hingewiesen worden, dass die Mikroglia eine zentrale Rolle bei entzündlichen Prozessen im Gehirn unter physiologischen sowie pathophysiologischen Bedingungen spielt. Nach der Präparation der Gehirngewebeschnitte wird die endogene, d.h. im Gewebe residierende Mikroglia aktiviert.

Nach einer Phase (ca. 5 bis 6 Tage) der Ausheilung und der Abflachung des Gewebes, die auch mit einer Beseitigung der verletzten Neurone einhergeht, kehren die Mikrogliazellen wieder in ihren Ruhezustand zurück, der durch eine verästelte Morphologie gekennzeichnet ist (Czapiga M, Colton CA (1999): Function of microglia in organotypic slice cultures. J. Neurosci. Res. 56:644-651; eigene Beobachtungen). Diese sog. ruhende Mikroglia ist charakteristisch für den Normalzustand eines gesunden, adulten Gehirngewebes. Durch die Zugabe von beispielsweise bakteriellem LPS kommt es nun zu einer (teilweisen) Aktivierung der Mikroglia, die jedoch nicht zu einer Degeneration von Neuronen führt.

Dabei scheint besonders die Expression von MHC-(major histocampatibility complex-) Proteinen mit der Aktivierung der Mikroglia zu einem phagozytotischen, runden Phänotyp, der mit Läsionen im geschädigten Gehirn kolokalisiert, zu korrelieren. Neonatale Mikroglia reagiert in derselben Art und Weise auf die pro-inflammatorischen Cytokine GM-CSF und M-CSF, d.h. durch Veränderung ihrer Morphologie, ihres Phänotyps, und werden darüber hinaus zur Teilung angeregt. GM-CSF stimuliert dabei besonders die Ausbildung eines runden, migratorischen Phänotyps, der darüber hinaus auf die Präsentation von Antigenen vorbereitet ist. Dies kann durch die Expression des „Major Histocampatibility Complex-(MHC-)class II-Antigens" (auch als Ox-6 Marker bekannt) nachgewiesen werden, die durch GM-CSF induziert wird (Schermer C, Humpel C (2002): Granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) activates microglia in rat cortex organotypic brain slices. Neurosci. Lett. 328:180-184; Re F, Belyanskaya SL, Riese RJ, Cipriani B, Fischer FR, Granucci F, Ricciardi-Castagnoli P, Brosnan C, Stern LJ, Strominger JL, Santambrogio L (2002): Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor induces an expression program in neonatal microglia that primes them for antigen presentation. J. Immunol. 169:2264-2273.). Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass intakte Neurone die Induzierbarkeit von MHC class II-Antigen auf den benachbarten Mikrogliazellen unterdrücken können (Neumann H (2001): Control of glial immune function by neurons. Glia 36:191-199.). Möglicherweise wird diese lokale Inhibition durch das Priming der Mikroglia mit GM-CSF aufgehoben, so dass eine pathologische Aktivierung der Mikroglia durch eine nachfolgende oder parallele Inkubation mit 200 &mgr;g/ml LPS innerhalb von 48 h bewirkt werden kann (s. ). Diese Veränderung kann mit dem Antikörper Ox 6 detektiert werden (eigene Daten; nicht gezeigt). Auch Integrine (durch Antikörper Ox 42 detektiert) oder die induzierbare NO Syntase werden häufig als Marker für aktivierte Mikroglia verwendet, ihre Aussagekraft ist jedoch weniger offensichtlich. Eine Expression dieser Marker, die eine Aktivierung der Mikroglia anzeigen und mit der deutlichen Änderung der Morphologie einhergehen, tritt bereits durch die Zugabe der proinflammatorischen Cytokine bzw. des Inflammogens allein auf (z.B. Schermer C, Humpel C (2002): Granulocyte macrophage-colony stimulating factor activates microglia in rat cortex organotypic brain slices. Neurosci. Lett. 328:180-184; eigene Daten). Diese Stufe der Mikroglia-Aktivierung führt jedoch nicht zu einer Schädigung von Zellen bzw. zur Neurodegeneration, weshalb sie in unserem Assay nicht als Ausleseparameter Verwendung findet und zur Testung von potentiell neuroprotektiven Wirkstoffen ungeeignet ist.

Die Aktivierung der Mikroglia zu einem phagozytotischen Phänotyp spiegelt möglicherweise sogar eine „therapeutische" Funktion der Mikroglia wieder, die für die Beseitigung von Pathogenen oder Zelltrümmern essentiell ist. Diese Funktion der Mikroglia sollte daher möglichst beibehalten werden. Eine Überaktivierung der Mikroglia führt jedoch anscheinend auch zur Degeneration des Gewebes und der Neurone, also zu pathologischen Funktionen. Diese pathologischen Funktionen der Mikroglia sollen möglichst kontrolliert bzw. inhibiert werden, ohne die therapeutischen Funktionen zu verlieren. Bislang kann die therapeutische von der pathologischen Aktivierung der Mikroglia noch nicht durch eine Änderung des Markerprofils der Mikroglia unterschieden werden, möglicherweise da diese Zustände bzw. Funktionen überlappen oder in pathologischen Situationen miteinander gekoppelt sind. Daher werden potentielle Wirksubstanzen in einem Assay getestet, in dem die Schädigung bzw. die Degeneration des Gewebes selbst als Maß für die pathologischen Funktionen der Mikroglia verwendet wird (s. 1 und 2). Nur dadurch kann sichergestellt werden, dass wirksame Substanzen tatsächlich spezifisch die pathologischen Funktionen der Mikroglia beeinflussen und dadurch einer Degeneration des Gewebes entgegenwirken. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, dass in diesem Screen gefundene Wirksubstanzen die pathologischen von den therapeutischen Funktionen „entkoppeln", die Mikroglia-Aktivierung also modulieren statt unspezifisch zu unterdrücken.

Wirksubstanzen, die dieses Anforderungsprofil erfüllten, wären hochinteressante Wirkstoffkandidaten, die spezifisch schädliche Inflammationsreaktionen der Mikroglia im Verlauf von neurologischen Konditionen wie Schlaganfall, Morbus Alzheimer u.v.a. unterdrücken könnten. Die Suche nach solchen Wirkstoffen wird häufig in der Literatur als wünschenswert beschrieben, jedoch war ein Modell zum systematischen Screening von solchen Wirkstoffen bislang nicht vorhanden.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert. Die Beispiele betreffen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung, einschließlich der derzeit bekannten besten Ausführungsform der Erfindung, jedoch ist die Erfindung nicht auf die in den Beispielen angegebenen Ausführungsformen beschränkt.

Beispiel 1

Für die Präparation der organotypischen Kulturen aus dem Hippocampus wurden 7 bis 8 Tage alte Sprague-Dowley Ratten verwendet. Aus dem isolierten Hippocampus dieser Tiere wurden ca. 400 &mgr;M dicke Schnitte angefertigt, was etwa 20 Zellschichten entspricht. Jeweils 5 bis 6 Schnitte wurden auf einem Membran-Insert (Millicell; Firma Millipore) mit 0.4 &mgr;m mittlerem Porendurchmesser so platziert, dass sie sich gegenseitig nicht berührten. Die Schnitte konnten bei Austausch des Mediums unterhalb der Membran in 6-Loch Kulturplatten bis zu 3 Wochen kultiviert werden. Der durch die Präparation, besonders an den Schnittflächen, entstandene Zellschaden führte zu einer temporären Aktivierung der residenten Mikroglia in den Schnitten, die nach ca. 5 bis 6 Tagen abklang. Dies ging einher mit der Beseitigung der Zelltrümmer durch die nun phagozytotische Mikroglia. Im Laufe dieser ersten Kultivierungsperiode flachten die Schnitte deutlich ab, was sich an der zunehmenden Transparenz des Schnittes im Durchlicht ablesen ließ. Membranen mit überwiegend transparenten Schnitten zeigten nach einer Woche kaum Schädigung bzw. Neurodegeneration (< 1 %) und konnten somit als Ausgangsmaterial für den Assay eingesetzt werden.

Beispiel 2

Wurde die ruhende Mikroglia in diesen Kulturen durch die pro-inflammatorischen Cytokine GM-CSF oder M-CSF aktiviert, fand eine pathologische (Über-) Aktivierung der Mikroglia durch eine nachfolgende oder parallele Inkubation mit 200 &mgr;g/ml LPS innerhalb von 48 h statt, was auch eine dramatische Degeneration von Neuronen nach sich zog. (s. ). Auch mit dem Cytokin M-CSF (10 &eegr;g/ml) aktivierte Mikroglia reagierte auf LPS (für 48 h) mit gesteigerter Neurotoxizität; die resultierende Degeneration des Gewebes fiel in diesem Fall allerdings geringer aus (s. ). Alle Inkubationen erfolgten in Medium, das 50% Minimal Essential Medium/HEPES, 25% Hank's Balanced Salt Solution und 25% Hitze-inaktiviertes Pferdeserum enthielt.

Die Degeneration des Gewebes wurde durch eine Propidiumiodid-Fluoreszens der Zellen, die den Farbstoff aufgrund ihrer Schädigung nicht mehr durch eine intakte Zellmembran von der Diffusion in den Zellkern und einer Anfärbung der DNA abhalten konnten, sichtbar gemacht. Daher konnte die rote Fluoreszens oberhalb eines Schwellenwertes als Signal für Degeneration von Zellen ausgewertet werden. Das Ausmass der Schädigung pro Schnitt wurde ausgedrückt als Prozent der Gesamtfläche, deren Rotwerte über der Schwelle lagen. Durch diese Quantifizierung des Zellschadens wurde deutlich, dass LPS alleine nicht zur Degeneration führt, wohl aber die Kombination von Cytokin-Priming und LPS (s.).

Beispiel 3

Ein weiteres proinflammatorisches Cytokin, das die Mikroglia aktiviert und die MHC Expression induzieren kann, ist IFN&ggr;. Bei einer Kultivierung von Schnitten mit 30 &eegr;g/ml IFN&ggr; zusammen mit 200 &mgr;g/ml LPS für 48 h konnte eine sehr starke Degeneration des Gewebes induziert werden (Daten nicht gezeigt).

Diese Degeneration von neuronalem Gewebe durch Überaktivierung der Mikroglia ist also singulär auf entzündliche Prozesse und nicht auf eine direkte neurodegenerative Aktivität von LPS oder GM-CSF zurückzuführen. Daher können anti-inflammatorische Wirkstoffe in diesem Assay für eine vollständige Protektion des neuralen Gewebes bewirken, was exemplarisch für Acetylsalicylsäure und Dexamethason gezeigt werden konnte (). Beide Wirkstoffe wurden dabei über 48 h mit LPS und GM-CSF inkubiert. Es wirkten in diesem Assay also sowohl steroidale als auch nicht-steroidale Wirkstoffe. Die Protektionswirkung nahm graduell mit abnehmenden Konzentrationen an Wirkstoff ab, weshalb auch schwächere Wirkstoffe erkannt werden konnten. So konnte z.B. auch eine protektive Wirkung von Ibuprofen nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus konnte eine protektive Wirkung eines Pflanzenextraktes demonstriert werden, die sehr gut mit in vivo Untersuchungen korrelierte. Eine exzellente Übertragbarkeit der Ergebnisse auf die in vivo-Verhältnisse konnte also bereits experimentell untermauert werden. Wirken Substanzen also in diesem neuen Modell der entzündungsvermittelten Neurodegeneration, erscheint eine weitere Testung im Tiermodell sehr erfolgversprechend.

Erläuterung der Figuren

: Durch Entzündung hervorgerufene Degeneration von neuralem Gewebe in organotypischen Kulturen durch die Kombination von Mikrogliaaktivierenden Zytokinen mit dem Endotoxin LPS.

Organotypische Kulturen wurden mit LPS allein oder in Kombination mit den pro-inflammatorischen Zytokinen GM-CSF und M-CSF für 48 h inkubiert. Die Schädigung des Gewebes (Zelltod) wurde durch Propidiumiodid-Anfärbung nachgewiesen (A) und durch eine automatische Bildanalyse quantifiziert (B). Durch einen Western Blot der Kulturen nach der optischen Auswertung konnte mit Hilfe eines neuronalen Markers (class III &bgr;-Tubulin) gezeigt werden, dass die Überaktivierung der Mikroglia innerhalb des Gewebes auch zu einer Neurodegeneration, d. h. zum Absterben der Neurone, führt (C). LPS alleine (oder GM-CSF; nicht gezeigt) führte zu keinem detektierbaren Schaden bzw. keiner nachweisbaren Neurodegeneration.

: Degeneration durch GM-CSF in Kombination mit LPS und Protektion des Gewebes durch zwei unterschiedliche anti-inflammatorische Wirksubstanzen.

Je zwei representative Beispiele von Propidiumiodid-Anfärbungen nach Inkubation der organotypischen Kulturen mit 1 ng/ml GM-CSF und 200 &mgr;g/ml LPS, die gleichzeitig durch die anti-inflammatorische Wirkstoffe Acetylsalicylsäure (A) oder Dexamethason (B) vor dem zu erwartenden Schaden geschützt sind. Durch Quantifizierung der Ergebnisse (C) zeigt sich eine maximale Schädigung der Kulturen durch die Kombination von 1 ng/ml GM-CSF mit 200 &mgr;g/ml LPS. Diese Kombination wurde deshalb auch für die Versuche mit anti-inflammatorischen Substanzen gewählt, die die Degeneration des Gewebes fast vollständig verhindern können. Ähnliche Ergebnisse wurden bei einer Vorinkubation von 10 ng/ml GM-CSF für eine Stunde, gefolgt von einer 48 h Inkubation mit LPS mit bzw. ohne Wirksubstanzen erzielt werden (Daten nicht gezeigt).


Anspruch[de]
Aus Geweben oder Organen eines Säugers gewonnene, ex vivo auf porösen Membranen mit einer Porengröße ≥ 0,02 &mgr;m bei einem physiologisch annehmbaren pH-Wert in Gegenwart eines Kulturgases in Kultur in einem geeigneten Kulturmedium gehaltene lebende Zellen, bei denen die Nachbarschaftsbeziehungen und die Signaltransduktion zwischen den Zellen beibehalten sind, und die über einen transienten Zeitraum mindestens einer Substanz ausgesetzt wurden, die gewählt ist aus der Gruppe pro-inflammatorische Botenstoffe und Inflammogene. Lebende, in Kultur gehaltene Säugerzellen nach Anspruch 1, worin die Zellen über einen transienten Zeitraum einer Substanz ausgesetzt wurden, die gewählt ist aus der Gruppe pro-inflammatorische Botenstoffe und Inflammogene. Lebende, in Kultur gehaltene Säugerzellen nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Membranen durchlässig für das Kulturmedium und das Kulturgas sind, vorzugsweise worin die Membranen eine Porengröße im Bereich von 0,02 bis 10 &mgr;m aufweisen, weiter bevorzugt eine Porengröße im Bereich von 0,1 bis 1 &mgr;m, noch weiter bevorzugt eine Porengröße im Bereich von 0,2 bis 0,6 &mgr;m. Lebende, in Kultur gehaltene Säugerzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der physiologisch annehmbare pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 8 liegt, vorzugsweise im Bereich von 6,9 bis 7,6, weiter bevorzugt im Bereich von 7,3 bis 7,5, insbesondere bei 7,4. Lebende, in Kultur gehaltene Säugerzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Kulturgas Reinluft ist, vorzugsweise Reinluft mit einem erhöhten Gehalt an CO2, weiter bevorzugt Reinluft mit einem Gehalt an CO2 im Bereich von 1 bis 5 Vol.-%, noch weiter bevorzugt Reinluft mit einem Gehalt an CO2 im Bereich von 2 bis 3,5 Vol.-%. Lebende, in Kultur gehaltene Säugerzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, nämlich Rattenzellen, Mäusezellen oder Humanzellen. Lebende, in Kultur gehaltene Säugerzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, nämlich aus dem Nervensystem eines Säugers entnommene Zellen, bevorzugt Zellen gewählt aus der Gruppe bestehend aus Zellen des ZNS, Zellen aus dem Rückenmark, Zellen vom Hippocampus und Zellen vom zerebralen Cortex. Lebende, in Kultur gehaltene Säugerzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin der/die pro-inflammatorische(n) Botenstoff(e) gewählt ist/sind aus der Gruppe pro-inflammatorische Proteine und Peptide, vorzugsweise aus der Gruppe der Cytokine, weiter bevorzugt aus der Gruppe CSF-Proteine und Interferone, noch mehr bevorzugt aus der Gruppe GM-CSF, G-CSF und M-CSF und IFN&ggr;, und/oder worin das/die Inflammogen(e) gewählt ist/sind aus der Gruppe der Endotoxine, vorzugsweise aus der Gruppe der Lipopolysaccharide (LPS), noch mehr bevorzugt aus der Gruppe bakterieller Lipopolysaccharide. Lebende, in Kultur gehaltene Säugerzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Dauer des transienten Zeitraums bei dem mindestens einen proinflammatorischen Botenstoff im Bereich von 10 min bis 7d liegt, vorzugsweise im Bereich von 15 min bis 4d, weiter bevorzugt im Bereich von 30 min bis 2d, und/oder worin die Dauer des transienten Zeitraums bei dem mindestens einen Inflammogen im Bereich von 1d bis 14d liegt, vorzugsweise im Bereich von 1d bis 4d, weiter bevorzugt im Bereich von 2d bis 3d. Lebende, in Kultur gehaltene Säugerzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die Membranen zusätzlich auch durchlässig für den mindestens einen pro-inflammatorischen Botenstoff und/oder das mindestens eine Inflammogen sind. Verfahren zur Induktion inflammatorischer Prozesse an ex vivo gehaltenen lebenden Säugerzellen, umfassend die Schritte, daß man

– Gewebeschnitte auf an sich bekanntem Weg von funktionalem Säuger-Gewebe gewinnt;

– die so erhaltenen Gewebeschnitte ex vivo auf porösen Membranen mit einer Porengröße ≥ 0,02 &mgr;m bei einem physiologisch annehmbaren pH-Wert in Gegenwart eines Kulturgases in Kultur in einem geeigneten Kulturmedium in der Weise hält, daß die Nachbarschaftsbeziehungen und die Signaltransduktion zwischen den Zellen beibehalten werden; und

– die Zellen der Wirkung mindestens eines pro-inflammatorischen Botenstoffs über einen transienten Zeitraum aussetzt.
Verfahren nach Anspruch 11, worin der/die pro-inflammatorische(n) Botenstoff(e) gewählt ist/sind aus der Gruppe pro-inflammatorische Proteine und Peptide, vorzugsweise aus der Gruppe der Cytokine, weiter bevorzugt aus der Gruppe CSF-Proteine und Interferone, noch mehr bevorzugt aus der Gruppe GM-CSF, G-CSF und M-CSF und IFN&ggr;. Verfahren nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, worin die Dauer des transienten Zeitraums bei dem mindestens einen pro-inflammatorischen Botenstoff im Bereich von 10 min bis 7d liegt, vorzugsweise im Bereich von 15 min bis 4d, weiter bevorzugt im Bereich von 30 min bis 2d. Verfahren zur Induktion inflammatorischer Prozesse an ex vivo gehaltenen lebenden Säugerzellen, umfassend die Schritte, daß man

– Gewebeschnitte auf an sich bekanntem Weg von funktionalem Säuger-Gewebe gewinnt;

– die so erhaltenen Gewebeschnitte ex vivo auf porösen Membranen mit einer Porengröße ≥ 0,02 &mgr;m bei einem physiologisch annehmbaren pH-Wert in Gegenwart eines Kulturgases in Kultur in einem geeigneten Kulturmedium in der Weise hält, daß die Nachbarschaftsbeziehungen und die Signaltransduktion zwischen den Zellen beibehalten werden; und

– die Zellen der Wirkung mindestens eines Inflammogens über einen transienten Zeitraum aussetzt.
Verfahren nach Anspruch 14, worin das/die Inflammogen(e) gewählt ist/sind aus der Gruppe der Endotoxine, vorzugsweise aus der Gruppe der Lipopolysaccharide (LPS), weiter bevorzugt aus der Gruppe der bakteriellen Lipopolysaccharide. Verfahren nach Anspruch 14 oder Anspruch 15, worin die Dauer des transienten Zeitraums bei dem mindestens einen Inflammogen im Bereich von 1d bis 14d liegt, vorzugsweise im Bereich von 1d bis 4d, weiter bevorzugt im Bereich von 2d bis 3d. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, worin die Membranen durchlässig für das Kulturmedium und das Kulturgas sind, vorzugsweise worin die Membranen eine Porengröße im Bereich von 0,02 bis 10 &mgr;m aufweisen, weiter bevorzugt eine Porengröße im Bereich von 0,1 bis 1 &mgr;m, noch weiter bevorzugt eine Porengröße im Bereich von 0,2 bis 0,6 &mgr;m. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, worin der physiologisch annehmbare pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 8 liegt, vorzugsweise im Bereich von 6,9 bis 7,6, weiter bevorzugt im Bereich von 7,3 bis 7,5, beispielsweise bei 7,4. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 18, worin das Kulturgas Reinluft ist, vorzugsweise Reinluft mit einem erhöhten Gehalt an CO2, weiter bevorzugt Reinluft mit einem Gehalt an CO2 im Bereich von 1 bis 5 Vol.-%, noch weiter bevorzugt Reinluft mit einem Gehalt an CO2 im Bereich von 2 bis 3,5 Vol.-%. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 19, worin die Zellen Rattenzellen, Mäusezellen oder Humanzellen sind. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 20, worin die Zellen aus dem Nervensystem eines Säugers entnommene Zellen sind, vorzugsweise worin die Zellen gewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Zellen des ZNS, Zellen aus dem Rückenmark, Zellen vom Hippocampus und Zellen vom zerebralen Cortex. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 21, worin die Membranen zusätzlich auch durchlässig für den mindestens einen pro-inflammatorischen Botenstoff und/oder das mindestens eine Inflammogen sind. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 22, worin als Inflammogen mindestens ein Endotoxin, vorzugsweise mindestens ein Lipopolysaccharid (LPS), noch weiter bevorzugt mindestens ein bakterielles Lipopolysaccharid in Kombination mit einem oder mehreren pro-inflammatorischen Protein(en) und/oder Peptid(en) verwendet wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 23 unter der Manifestation von entzündlichen Prozessen in Form einer Aktivierung der Mikroglia zu Phagocyten, vorzugsweise von damit verbundenen entzündlichen Prozessen, die degenerative Folgeprozesse bedingen. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 24, umfassend die gemeinsame, vorzugsweise die gleichzeitige, Kultivierung von Säugerzellen mit Zellen und/oder Gewebestücken anderen Ursprungs. Verfahren nach Anspruch 25, worin die Zellen oder Gewebestücke anderen Ursprungs Säugerzellen und/oder Säuger-Gewebestücke anderer Säuger als der erstgenannten Säuger, vorzugsweise Humanzellen und/oder Humangewebe-Stücke sind. Verwendung von lebenden, ex vivo in Kultur gehaltenen Säugerzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 10 für medizinische Zwecke. Verwendung von lebenden, ex vivo in Kultur gehaltenen Säugerzellen nach Anspruch 27 zur ex vivo-Untersuchung entzündlicher Prozesse. Verwendung von lebenden, ex vivo in Kultur gehaltenen Säugerzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zum Testen pharmazeutischer Zubereitungen. Verwendung von lebenden, ex vivo in Kultur gehaltenen Säugerzellen nach Anspruch 29 zum Testen pharmazeutischer Zubereitungen auf eine neuroprotektive und entzündungsmodulatorische Wirkung. Verwendung von lebenden, ex vivo in Kultur gehaltenen Säugerzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in Modell-Untersuchungen chemischer, biologischer und/oder physikalischer Einflüsse auf physiologische oder pathophysiologische Prozesse. Verwendung nach Anspruch 31 in Modell-Untersuchungen chemischer, biologischer und/oder physikalischer Einflüsse auf physiologische oder pathophysiologische Prozesse in Säuger-Gewebe, vorzugsweise im Zentralen Nervensystem (ZNS). Verwendung nach Anspruch 31 zur Target-Identifizierung und Target-Validierung, zur Identifizierung und Validierung von diagnostischen Markern und zur Entwicklung diagnostischer Werkzeuge zur Früherkennung bzw. Akutdiagnose von neurodegenerativen Erkrankungen. Verwendung nach Anspruch 31 zur Aufklärung von physiologischen, vorzugsweise pathophysiologischen Wirkungsmechanismen bei neurodegenerativen Erkrankungen, besonders bevorzugt bei inflammatorischen Erkrankungen, bei Morbus Alzheimer, bei Morbus Parkinson, bei Multipler Sklerose, bei ALS, bei Morbus Huntington und bei Wucherungen im ZNS, die mit entzündlichen Prozessen einhergehen. Verwendung nach Anspruch 31 zum Wirkstoff-Screening, zur Wirkstoff-Identifizierung und zur Validierung einschließlich der Verwendung als Toxizitätsassay. Verwendung nach Anspruch 31 zur Entwicklung von präventiv oder therapeutisch wirksamer Substanzen, bevorzugt von Arzneimitteln. Verwendung nach Anspruch 36 zur Entwicklung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems. Verwendung nach einem der Ansprüche 27 bis 37 beim Arbeiten mit automatisierten Geräten. Verfahren zum Testen der antiinflammatorischen Wirksamkeit einer chemischen Substanz, umfassend die Schritte:

– Gewinnen von Gewebeschnitten von funktionalem Säuger-Gewebe;

– Kultivieren der erhaltenen Gewebeschnitte ex vivo auf porösen Membranen mit einer Porengröße ≥ 0,02 &mgr;m bei einem physiologisch annehmbaren pH-Wert in Gegenwart eines Kulturgases in Kultur in einem geeigneten Kulturmedium in der Weise, daß die Nachbarschaftsbeziehungen und die Signaltransduktion zwischen den Zellen beibehalten werden, unter Erhalt einer lebende Säugerzellen umfassenden Gewebekultur;

– Applikation mindestens eines pro-inflammatorischen Botenstoffs auf die Gewebekultur;

– Applikation mindestens einer auf ihre antiinflammatorische Wirksamkeit zu testenden chemischen Substanz auf die Gewebekultur;

– Applikation mindestens eines Reagenz zum Nachweis einer antiinflammatorischen Wirksamkeit auf die Gewebekultur unter Erzielen einer quantifizierbaren Nachweisreaktion; und

– Quantifizieren der Nachweisreaktion anhand des als Ergebnis der Nachweisreaktion erhaltenen Produktes.
Testverfahren nach Anspruch 39, umfassend als Reaktionsbedingungen des Kultivierungsschritts eine oder mehrere der in den Ansprüchen 21 bis 26 genannten Bedingungen. Testverfahren nach Anspruch 39 oder Anspruch 40, worin der/die pro-inflammatorische(n) Botenstoff(e) gewählt ist/sind aus der Gruppe pro-inflammatorische Proteine und Peptide, vorzugsweise aus der Gruppe der Cytokine, weiter bevorzugt aus der Gruppe CSF-Proteine und Interferone, noch mehr bevorzugt aus der Gruppe GM-CSF, G-CSF und M-CSF und IFN&ggr;. Testverfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 41, worin man den mindestens einen pro-inflammatorischen Botenstoff für einen transienten Zeitraum auf die Gewebekultur einwirken läßt, vorzugsweise worin die Dauer des transienten Zeitraums bei dem mindestens einen pro-inflammatorischen Botenstoff im Bereich von 10 min bis 7d liegt, weiter bevorzugt im Bereich von 15 min bis 4d, noch mehr bevorzugt im Bereich von 30 min bis 2d. Testverfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 42, worin man gleichzeitig mit oder zeitlich getrennt von einer Applikation mindestens eines proinflammatorischen Botenstoffs auf die Gewebekultur mindestens ein Inflammogen auf die Gewebekultur aufbringt, vorzugsweise worin man nach einer Applikation mindestens eines pro-inflammatorischen Botenstoffs auf die Gewebekultur mindestens ein Inflammogen auf die Gewebekultur aufbringt. Testverfahren nach Anspruch 43, worin das/die Inflammogen(e) gewählt ist/sind aus der Gruppe der Endotoxine, vorzugsweise aus der Gruppe der Lipopolysaccharide (LPS), noch mehr bevorzugt aus der Gruppe der bakteriellen Lipopolysaccharide. Testverfahren nach Anspruch 43 oder Anspruch 44, worin man das wenigstens eine Inflammogen über einen transienten Zeitraum auf die Gewebekultur einwirken läßt, vorzugsweise worin die Dauer des transienten Zeitraums bei dem mindestens einen Inflammogen im Bereich von 1d bis 14d liegt, weiter bevorzugt im Bereich von 1d bis 4d, noch mehr bevorzugt im Bereich von 2d bis 3d. Testverfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 45, worin als Inflammogen mindestens ein Endotoxin, vorzugsweise mindestens ein Lipopolysaccharid (LPS), noch mehr bevorzugt ein bakterielles Lipopolysaccharid, in Kombination mit einem oder mehreren pro-inflammatorischen Protein(en) und/oder Peptid(en) verwendet wird. Testverfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 46, worin das mindestens eine Reagenz zum Nachweis einer antiinflammatorischen Wirksamkeit auf die Gewebekultur ein physikalische Meßmethoden zulassendes Reagenz ist, vorzugsweise ein optische Nachweismethoden zulassendes Reagenz ist, weiter bevorzugt ein einer optischen Meßmethode zugängliches Farbreagenz ist, noch mehr bevorzugt ein einer Fluoreszenz-Messung zugängliches Farbreagenz ist. Testverfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 47 zur Anwendung auf automatisierten Laboranlagen.






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