| Dokumentenidentifikation |
DE102005046753A1 12.04.2007 |
| Titel |
Mikroskopierverfahren und Mikroskop |
| Anmelder |
Carl Zeiss Jena GmbH, 07745 Jena, DE |
| Erfinder |
Wolleschensky, Ralf, Dipl.-Phys., 99510 Apolda, DE;
Kempe, Michael, Dr., 07751 Jena, DE |
| Vertreter |
GEYER, FEHNERS & PARTNER (G.b.R.), 80687 München |
| DE-Anmeldedatum |
29.09.2005 |
| DE-Aktenzeichen |
102005046753 |
| Offenlegungstag |
12.04.2007 |
| Veröffentlichungstag im Patentblatt |
12.04.2007 |
| IPC-Hauptklasse |
G02B 21/00(2006.01)A, F, I, 20050929, B, H, DE
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| Zusammenfassung |
Es wird bereitgestellt ein Mikroskopierverfahren zum Erzeugen eines Bildes eines in einer vorbestimmten Tiefe einer zu untersuchenden Probe liegenden Bildfeldes, mit mehreren Beleuchtungsschriften, in den jeweils ein Teil des Bildfeldes mit einem fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündel beleuchtet wird, das aufgrund einer Wechselwirkung mit der Probe die Erzeugung von Probenstrahlung bewirkt, Detektionsschritten, in denen die erzeugte Probenstrahlung detektiert wird, und einem Auswerteschritt, in dem auf Basis der detektierten Probenstrahlung das Bild erzeugt wird, wobei während jeden Beleuchtungsschritts ein erster und ein zweiter Detektionsschritt durchgeführt werden, wobei im ersten Detektionsschritt im Fokus sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung und im zweiten Detektionsschritt ein geringerer Anteil der im Fokus erzeugten Probenstrahlung als im ersten Detektionsschritt sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung detektiert wird und wobei im Auswerteschritt die im zweiten Detektionsschritt detektierte Probenstrahlung genutzt wird, um bei der im ersten Detektionsschritt detektierten Probenstrahlung den außerfokalen Anteil zu verringern.
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| Beschreibung[de] |
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Die Erfindung betrifft ein Mikroskopierverfahren zum Erzeugen eines
Bildes eines in einer vorbestimmten Tiefe einer zu untersuchenden Probe liegenden
Bildfeldes, mit mehreren Beleuchtungsschritten, in denen jeweils ein Teil des Bildfeldes
mit einem fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündel beleuchtet wird, das aufgrund
einer Wechselwirkung mit der Probe die Erzeugung von Probenstrahlung bewirkt, Detektionsschritten,
in denen die erzeugte Probenstrahlung detektiert wird, und einem Auswerteschritt,
in dem auf Basis der detektierten Probenstrahlung das Bild erzeugt wird. Ferner
betrifft die Erfindung ein Mikroskop zum Erzeugen eines Bildes eines in einer vorbestimmten
Tiefe einer zu untersuchenden Probe liegenden Bildfeldes, mit einem Beleuchtungsmodul,
das in mehreren Beleuchtungsschritten das Bildfeld beleuchtet, wobei in jedem Beleuchtungsschritt
jeweils ein Teil des Bildfeldes mit einem fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündel
beleuchtet wird, das aufgrund einer Wechselwirkung mit der Probe die Erzeugung von
Probenstrahlung bewirkt, einem Detektionsmodul, das erzeugte Probenstrahlung detektiert,
und einem Auswertemodul, das auf der Basis der detektierten Probenstrahlung das
Bild erzeugt.
Um die gewünschte konfokale Tiefendiskriminierung zu erreichen,
damit das Bild des in einer vorbestimmten Tiefe der zu untersuchenden Probe liegenden
Bildfeldes erzeugt werden kann, wird bei der Laser-Scanning-Mikroskopie eine Blende
eingesetzt, die unerwünschtes Probenlicht abschattet.
Es ist ferner bekannt, daß zur Erzielung von konfokaler Tiefendiskriminierung
im Weitfeld bzw. bei partieller Beleuchtung des Bildfeldes (z. B. einer Linienbeleuchtung)
eine Strukturierung bzw. Intensitätsmodulation) der Beleuchtung eingesetzt
werden kann. Durch eine Phasenverschiebung der strukturierten Beleuchtung kann dann
ein tiefendiskriminierter optischer Schnitt berechnet und so das gewünschte
Bild des Objekts erzeugt werden. Wie beispielsweise in M.A.A. Neil et al. „Method
of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope"
Optics Letters 22(24) 1997, 1905–1907 beschrieben ist, kann dies mit drei
Phasenbildern bei 0°, 120° und 240° erreicht werden.
Zur Strukturierung der Beleuchtung werden entweder Gitter im Beleuchtungsstrahlengang,
die Interferenz von kohärenten Teilstrahlen oder der Einsatz von diffraktiven
optischen Elementen vorgeschlagen. Nachteilig ist die dadurch bedingte Inflexibilität
und der erhöhte Aufwand, da bei einem Wechsel des Objektivs des Lasermikroskops
im allgemeinen auch ein Wechsel der Strukturierung erforderlich ist. Dazu muß
dann in der Regel ein anderes Gitter vorgesehen werden, die Interferenz der kohärenten
Teilstrahlen geändert werden oder ein anderes diffraktives optisches Element
eingesetzt werden.
Ausgehend hiervon ist es Aufgabe der Erfindung, ein Mikroskopierverfahren
und ein Mikroskop der eingangs genannten Art derart weiterzubilden, daß die
Erzeugung tiefendiskriminierter optischer Schnitte einfach möglich ist, ohne
physikalische Blenden zum Abschatten außerfokaler Probenstrahlung vorsehen
zu müssen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe bei einem Mikroskopierverfahren
der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß während jedem Beleuchtungsschritt
ein erster und ein zweiter Detektionsschritt durchgeführt werden, wobei im
ersten Detektionsschritt im Fokus sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung
und im zweiten Detektionsschritt ein geringerer Anteil der im Fokus erzeugten Probenstrahlung
als im ersten Detektionsschritt sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung
detektiert wird, und daß im Auswerteschritt die im zweiten Detektionsschritt
detektierte Probenstrahlung genutzt wird, um bei der im ersten Detektionsschritt
detektierten Probenstrahlung den außerfokalen Anteil zu verringern.
Es wird somit die aufgrund der Fokussierung vorliegende räumliche
Begrenztheit der Beleuchtung innerhalb des Bildfeldes dazu genutzt, im ersten und
zweiten Detektionsschritt bei im wesentlichen gleicher Probenstrahlung, die außerhalb
des Fokus erzeugt wird, unterschiedliche Anteile der im Fokus erzeugten Probenstrahlung
zu detektieren. Dies wird dann im Auswerteschritt vorteilhaft dazu genutzt, den
außerfokalen Anteil der im ersten Detektionsschritt detektierten Probenstrahlung
zu reduzieren.
Somit kann mit geringem Aufwand ein tiefendiskriminierter Schnitt
erzeugt werden, ohne eine physikalische Blende zum Abschatten der außerfokalen
Probenstrahlung vorsehen zu müssen.
Da ein Vorsehen einer physikalischen Blende nicht notwendig ist und
da aufgrund der Fokussierung eine räumliche Begrenztheit der Beleuchtung gegeben
ist, gewinnt man detektionsseitig einen räumlichen Freiheitsgrad. Wenn das
Beleuchtungsstrahlenbündel z. B. punktförmig fokussiert wird, kann man
die detektierte Probenstrahlung spektral aufspalten und mittels z. B. einem Liniendetektor
spektral aufgelöst detektieren. Der zusätzliche Freiheitsgrad (bzw. die
zusätzliche räumliche Koordinate) kann somit dazu genutzt werden, in den
Detektionsschritten spektral zu detektieren und gleichzeitig die gewünschte
tiefendiskriminierte Erzeugung des Bildes des Bildfeldes zu realisieren.
Da keine die außerfokale Probenstrahlung abschattende Blende
notwendig ist, kann eine größere Detektionseffizienz erreicht werden,
da sehr viel mehr Probenlicht (im Vergleich zu einem Verfahren mit Pinhole-Blende)
detektiert und für die Auswertung genutzt werden kann.
Insbesondere kann im zweiten Detektionsschritt keinerlei der im Fokus
erzeugten Probenstrahlung und somit nur außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung
detektiert werden. Der Anteil der im Fokus erzeugten Probenstrahlung, der im zweiten
Detektionsschritt detektiert wird, beträgt somit null.
Die beiden Detektionsschritte können während zumindest einem
Beleuchtungsschritt gleichzeitig durchgeführt werden. Damit läßt
sich die Meßzeit möglichst gering halten.
Alternativ ist es auch möglich, daß beide Detektionsschritte
während zumindest einem Beleuchtungsschritt zeitlich nacheinander durchgeführt
werden. In diesem Fall kann man für beide Beleuchtungsschritte einen einzeigen
Detektor einsetzten.
Insbesondere wird im ersten Detektionsschritt die aus einem ersten
Abschnitt der Probenoberfläche und im zweiten Detektionsschritt die aus einem
zweiten Abschnitt der Probenfläche austretende Probenstrahlung detektiert,
wobei beide Abschnitte aneinander grenzen oder der zweite Abschnitt den ersten Abschnitt
nur teilweise überdeckt. Die beiden Abschnitte können unmittelbar aneinandergrenzen
(sich berühren) oder aber auch voneinander beabstandet sein. Ferner kann man
im ersten Detektionsschritt der Fokusbereich im Bildfeld auf einen Detektor abbilden,
während im zweiten Detektionsschritt eine benachbarte Fläche im Bildfeld
detektiert wird.
Im Auswerteschritt kann das im zweiten Detektionsschritt detektierte
Signal vom im ersten Detektionsschritt detektierten Signal subtrahiert werden. Natürlich
kann dabei eine relative Gewichtung der beiden Signale zueinander berücksichtigt
werden.
Insbesondere können die Beleuchtungsschritte, die Detektionsschritte
und der Auswerteschritt für mehrere Bildfelder in unterschiedlichen vorbestimmten
Tiefen der Probe durchgeführt werden, um somit mehrere tiefendiskriminierte
Schnittbilder der Probe erzeugen zu können.
Daraus können dann mit bekannten Verfahren auch dreidimensionale
Probenbilder erzeugt werden.
Bei dem Verfahren kann das Beleuchtungsstrahlenbündel (bevorzugt
beugungsbegrenzt) punkt- oder linienförmig fokussiert werden.
Die Aufgabe wird ferner bei einem Mikroskop der eingangs genannten
Art dadurch gelöst, daß während jedem Beleuchtungsschritt das Detektionsmodul
einen ersten und einen zweiten Detektionsschritt durchführt, wobei im ersten
Detektionsschritt im Fokus sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung
und im zweiten Detektionsschritt ein geringerer Anteil der im Fokus erzeugten Probenstrahlung
als im ersten Detektionsschritt sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung
detektiert wird, und daß das Auswertemodul die im zweiten Detektionsschritt
detektierte Probenstrahlung nutzt, um bei der im ersten Detektionschritt detektierten
Probenstrahlung den außerfokalen Anteil zu verringern.
Durch diese Art der Detektion kann auf eine physikalische Blende zum
Abschatten der außerfokalen Probenstrahlung verzichtet werden, da die durch
die räumliche Begrenztheit des im Bildfeld fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündels
vorliegende örtliche Modulation der Beleuchtung mittels den beiden Detektionsschritten
ausgenutzt wird, um unterschiedliche Anteile der im Fokus erzeugten Probenstrahlung
zu detektieren. Insbesondere kann im zweiten Detektionsschritt nur außerhalb
des Fokus erzeugte Probenstrahlung detektiert werden. Der Anteil der im Fokus erzeugten
Probenstrahlung, der im zweiten Detektionsschritt detektiert wird, beträgt
dann null.
Ferner kann man in den beiden Detektionsschritten die Probenstrahlung
spektral aufgelöst detektieren. Dabei wird ausgenutzt, daß keine physikalische
Blende zur Abschattung des außerfokalen Anteils der Probenstrahlung notwendig
ist und daß durch die räumliche Begrenztheit des fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündels
detektionsseitig ein weiterer Freiheitsgrad vorliegt. So kann bei einem punktförmig
fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündel die Probenstrahlung spektral aufgespalten
und mittels einem Liniendetektor spektral detektiert werden. Die spektrale Aufspaltung
erfolgt in Richtung der Erstreckungsrichtung des Liniendetektors. Natürlich
kann als Liniendetektor z. B. auch nur eine Zeile oder eine Spalte eines ortsauflösenden
Flächendetektors eingesetzt werden. Wenn das Beleuchtungsstrahlenbündel
linienförmig fokussiert wird, wird ein Flächendetektor eingesetzt, wobei
hier die spektrale Aufspaltung bevorzugt quer zur Erstreckungsrichtung des linienförmigen
Fokus erfolgt. Die spektrale Aufspaltung kann mit jedem geeigneten Optikelement
(mit geeigneter Dispersion) durchgeführt werden, z. B. mittels einem Prisma
oder einem Beugungsgitter. Das Detektionsmodul kann somit eine Optik zur spektralen
Aufspaltung der Probenstrahlung sowie zumindest einen die spektral aufgespaltene
Probenstrahlung spektral aufgelöst detektierenden Detektor aufweisen.
Das Detektionsmodul kann zwei Detektoren umfassen, wodurch eine gleichzeitige
Durchführung der beiden Detektionsschritte über beide Detektoren möglich
ist. Alternativ kann das Detektionsmodul auch einen einzigen Detektor aufweisen,
so daß beide Dektionsschritte zeitlich nacheinander durchgeführt werden.
Im ersten Detektionsschritt kann die aus einem ersten Abschnitt der
Probenoberfläche und im zweiten Detektionsschritt die aus einem zweiten Abschnitt
der Probenoberfläche austretende Probenstrahlung detektiert werden, wobei die
beiden Abschnitte der Probenoberfläche aneinandergrenzen (direkt oder voneinander
beabstandet sein) oder der zweite Abschnitt den ersten Abschnitt nur teilweise überdeckt.
Ferner kann das Detektionsmodul derart ausgebildet sein, daß
der Fokusbereich im Bildfeld im ersten Detektionsschritt auf einen Detektor abgebildet
wird und im zweiten Detektionsschritt eine zum Fokusbereich benachbarte Fläche
des Bildfeldes auf einen Detektor des Detektionsmoduls abgebildet wird.
Das Auswertemodul kann das im zweiten Detektionsschritt detektierte
Signal vom im ersten Detektionsschritt detektieren Signal subtrahieren, wobei eine
Gewichtung der beiden Signale zueinander möglich ist. Damit wird in einfacher
Art und Weise der außerfokale Anteil im detektierten Signal des ersten Detektionsschrittes
reduziert.
Das Beleuchtungsmodul kann ein Scannermodul aufweisen, das das Beleuchtungsstrahlenbündel
so ablenkt, daß das gesamte Bildfeld beleuchtet wird.
Ferner kann das Beleuchtungsmodul das Beleuchtungsstrahlenbündel
als punkt- oder linienförmig fokussiertes Beleuchtungsstrahlenbündel auf
das Bildfeld richten.
Die Erfindung wird nachfolgend beispielshalber anhand der beigefügten
Zeichnungen noch näher erläutert. Es zeigen:
1 eine schematische Ansicht des erfindungsgemäßen
Mikroskops;
2 eine vergrößerte Darstellung des Detektionsmoduls
von 1;
3 eine Querschnittsansicht der zu untersuchenden Probe;
4 eine Draufsicht auf die Detektoren von
2;
5 eine Abwandlung der Detektoren von 4;
6 eine alternative Ausführungsform des Dektionsmoduls
von 1, und
7 und 8 eine weitere alternative
Ausführungsform des Detektionsmoduls von 1.
Bei der in 1 gezeigten Ausführungsform
ist das Mikroskop als Laser-Scanning-Mikroskop ausgebildet, das ein Lichtquellenmodul
1, ein Scanmodul 2, ein Objektiv 3, ein Aufnahmemodul
4 sowie ein Auswertemodul 5 umfaßt.
Das Lichtquellemodul 1, das einen Laser 8 und eine
Strahlformoptik 9 aufweist, erzeugt einen Laserstrahl LS1, der über
einen zwischen dem Lichtquellemodul 1 und dem Scanmodul 2 geschalteten
Strahlteiler 6 zum Scanmodul 2 gelenkt wird, das den Strahl LS1
so über die Probe 7 ablenkt, das ein Bildfeld innerhalb der Probe
vollständig beleuchtet wird. Der Laserstrahl LS1 wird dabei mittels des Objektivs
3 in die Probe 7 fokussiert, und zwar in die Tiefe des Bildfeldes,
von dem ein Bild erzeugt werden soll (optischer Schnitt).
Bei der hier beschriebenen Ausführungsbeispiel wird der Laserstrahl
LS1 punkförmig (bevorzugt beugungsbegrenzt) fokussiert, so daß das Scanmodul
2 den Laserstrahl LS1 in zwei unabhängige Richtungen voneinander ablenkt,
um somit das gesamte Bildfeld innerhalb der Probe 7 mit dem fokussierten
Laserstrahl LS1 überstreichen zu können.
Aufgrund der Wechselwirkung des Laserstrahls LS1 mit der Probe wird
Probenstrahlung LS2 erzeugt, die über das Objektiv 3 auf das Scanmodul
2 trifft, das die von der Probe 7 kommende Probenstrahlung LS2
descannt, so daß die Probenstrahlung LS2 hinter dem Scanmodul 2 als
ruhendes Strahlenbündel LS2 vorliegt. Der Strahlteiler 6 ist so ausgebildet,
daß er die Probenstrahlung LS2 transmittiert, so daß diese auf das Detektionsmodul
4 trifft.
Die erzeugte Probenstrahlung kann z. B. Fluoreszenzlicht, Lumineszenzlicht,
reflektiertes, transmittiertes und/oder gestreutes Licht sein.
Wie in 2 schematisch dargestellt ist,
umfaßt das Detektionsmodul 4 eine Detektionsoptik 11 sowie
einen ersten und zweiten Detektor D1, D2, deren Signale dem Auswertemodul
5 zugeführt werden. Auf den Detektor D1 wird der Fokusbereich des
Bildfeldes (also der Bereich, in dem der Laserstrahl LS1 fokussiert) abgebildet,
während auf den Detektor D2 ein dazu benachbarter Bereich abgebildet wird.
Dies wird in Verbindung mit 3 noch näher
erläutert. 3 zeigt einen Querschnitt durch die
zu untersuchende Probe 7, wobei die Strahltaille 12 des Beleuchtungsstrahlenbündels
LS1 dargestellt ist. Zwischen den gestrichelt eingezeichneten waagrechten Linien
L1 und L2 liegt der darzustellende Tiefenbereich (Bildfeld) der Probe
7. In diesem Bereich ist der Laserstrahl LS1 fokussiert. Dies erkennt man
daran, daß die Strahltaille 12 in diesem Bereich den geringsten Durchmesser
aufweist.
Durch die Abbildung des Fokusbereiches auf den Detektor D1 gelangt
auf den Detektor die im schräg schraffierten Bereich B1 erzeugte Probenstrahlung.
Man erkennt, daß neben der gewünschten konfokalen Probenstrahlung aus
dem Abschnitt des Bereichs B1 zwischen den gestrichelten Linien L1 und L2 noch die
außerfokale Probenstrahlung gelangt, die oberhalb und unterhalb der Linie L1
und L2 im Bereich B1 erzeugt wird.
Auf den Detektor D2 gelangt die in dem waagrecht schraffierten Bereich
B2 erzeugte Probenstrahlung. Da mit dem Detektor D2 nur ein Bereich neben dem Fokusbereich
detektiert wird, trifft auf den Detektor D2 nur die Probenstrahlung, die außerhalb
des fokalen Bereiches (zwischen L1 und L2) vom Strahl LS1 innerhalb des Bereiches
B2 erzeugt wird. Bei dem hier beschriebenen Beispiel sieht der Detektor D2 somit
nur außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung LS2.
In 4 ist zur Verdeutlichung die detektorseitige
Beleuchtungsverteilung im Fokus dargestellt. Der fokussierte Laserstrahl LS1 wird
nur auf den Detektor D1 abgebildet (Kreis F1), so daß der Detektor D2 keine
konfokalen Signale aufnimmt.
Wenn man annimmt, daß die beiden Detektoren D1 und D2 ungefähr
die gleiche Fläche und Empfindlichkeit haben, kann man für das konfokale
Signal Sc und das nicht konfokale Signal Snc folgendes angeben:
Sc = S1 – n·S2 und
Snc = S1 + n·S2 – Sc = 2·n·S2
wobei S1 und S2 die Signale der Detektoren D1 und D2 sind. Die Konstante n kann
man empirisch z. B. aus der Minimierung des Untergrundsignals während der Messung
bestimmen. Typische Werte für n betragen 1 bis 1, 3.
Es hat sich gezeigt, daß insbesondere bei dicken Proben die genaue
Lage und die Schärfe der Trennlinie zwischen beiden Detektoren mit Bezug zum
beugungsbegrenzten Fokusspot aus dem Fokalbereich nicht wesentlich ist.
Es ist im allgemeinen zweckmäßig, die Detektoren so anzuordnen,
daß die Grenze zwischen beiden Detektoren D1 und D2 ca. 1 bis 2 Airy-Unit-Radien
vom Zentrum der Spotverteilung aus dem Fokus auf dem Detektor D1 entfernt liegt.
Die Airy-Unit wird objektseitig als 1 AU = 1,22 &lgr;/NA definiert, wobei &lgr;
die Vakuumwellenlänge des Beleuchtungsstrahlenbündels LS1 und NA die numerische
Apertur des Objektivs 3 ist. Auch eine Beabstandung der beiden Bereiche
B1 und B2, wie dies in 3 zur vereinfachten graphischen
Darstellung dargestellt ist, von beispielsweise kleiner 1AU zwischen beiden Detektoren
D1 und D2 (beispielsweise durch einen Steg) stellt kein Problem dar.
In 5 sind die Detektoren D1 und D2 für
den Fall dargestellt, daß nicht eine punktförmige Fokussierung vorliegt,
sondern eine linienförmige Fokussierung. In gleicher Weise wird der linienförmige
Fokus (Ellipse F2) dann auf den Detektor D1 abgebildet, wie in 5
dargestellt ist. Natürlich ist dann das Scanmodul 2 entsprechend angepaßt,
so daß unter Umständen (wenn die Linie so lang ist, daß sie das gesamte
Bildfeld in Linienrichtung abdeckt) nur eine Ablenkung quer zur Erstreckungsrichtung
des linienförmigen Fokus notwendig ist.
Für die Steuerung des Mikroskops und die Durchführung der
beschriebenen Schritte weist das Mikroskop eine Steuereinheit 10 auf.
Natürlich ist man nicht auf eine punkt- oder linienförmige
Fokussierung beschränkt. Wesentlich ist, daß die Fokussierung zumindest
in einer Richtung im Bildfeld eine örtliche Begrenzung aufweist, wobei diese
Begrenzung bevorzugt möglichst scharf ist. Die Steilheit der Begrenzung sollte
bevorzugt zumindest einer Raumfrequenz bei der halben Grenzfrequenz des Objektivs
3 entsprechen.
In 6 ist eine alternative Ausbildung
des Detektionsmoduls 4 gezeigt. Hier weist das Detektionsmodul
4 einen Strahlteiler 13 auf, der beispielsweise je die Hälfte
des einfallenden Probenlichtes LS2 reflektiert und transmittiert und somit in zwei
Detektionsarme aufspaltet. Bei dem nach rechts laufenden Detektionsarm in
6 ist sowohl der fokale Anteil LS2c als auch der außerfokale
Anteil LS2nc eingezeichnet, wobei in dem nach oben laufenden Detektionsarm zur Vereinfachung
nur noch der konfokale Anteil LS2c dargestellt ist. Aufgrund der örtlichen
Anordnung der Detektoren D1, D2 in den Detektionsarmen trifft auf den Detektor D2
nur der außerfokale Anteil LS2nc, während auf den Detektor D1 der fokale
Anteil LS2c trifft.
In 7 und 8
ist eine Ausführungsform des Detektionsmodul 4 gezeigt, bei der nur
ein einziger Detektor D1 vorgesehen ist. Zwischen der Detektionsoptik
10 und dem Detektor D1 ist eine drehbare Glasplatte
14 angeordnet, die je nach Drehstellung dafür sorgt, daß entweder
der fokale Anteil LS2c oder der außerfokale Anteil LS2nc auf die aktive Fläche
des Detektors 1 trifft.
Wenn das Beleuchtungsstrahlenbündel bzw. der fokussierte Laserstrahl
LS1 punktförmig fokussiert wird, wie in Verbindung mit 1
beschrieben wurde, können die Liniendetektoren von 5
zur spektral aufgelösten Detektion genutzt werden. Dazu muß die detektierte
Probenstrahlung nur spektral in Richtung der Erstreckungsrichtung des Liniendetektors
aufgespalten werden, bevor sie auf die Liniendetektoren D1, D2 trifft.
Entsprechendes gilt, wenn der Laserstrahl LS1 linienförmig fokussiert
wird. Dann ist mindestens ein ortsauflösender flächiger Detektor notwendig,
wobei z. B. in Spaltenrichtung ortsaufgelöst der Linienfokus und in Zeilenrichtung
der in diese Richtung spektral aufgelöste Linienfokus spektral aufgelöst
detektiert wird.
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| Anspruch[de] |
Mikroskopierverfahren zum Erzeugen eines Bildes eines in einer vorbestimmten
Tiefe einer zu untersuchenden Probe liegenden Bildfeldes, mit
mehreren Beleuchtungsschritten, in den jeweils ein Teil des Bildfeldes mit einem
fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündel beleuchtet wird, das aufgrund einer
Wechselwirkung mit der Probe die Erzeugung von Probenstrahlung bewirkt,
Detektionsschritten, in denen die erzeugte Probenstrahlung detektiert wird, und
einem Auswerteschritt, in dem auf Basis der detektierten Probenstrahlung das Bild
erzeugt wird,
dadurch gekennzeichnet, daß während jedem Beleuchtungsschritt ein
erster und ein zweiter Detektionsschritt durchgeführt werden,
wobei im ersten Detektionsschritt im Fokus sowie außerhalb des Fokus erzeugte
Probenstrahlung und
im zweiten Detektionsschritt ein geringerer Anteil der im Fokus erzeugten Probenstrahlung
als im ersten Detektionsschritt sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung
detektiert wird,
und daß im Auswerteschritt die im zweiten Detektionsschritt detektierte Probenstrahlung
genutzt wird, um bei der im ersten Detektionsschritt detektierten Probenstrahlung
den außerfokalen Anteil zu verringern.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die beiden Detektionsschritte während
zumindest einem Beleuchtungsschritt gleichzeitig durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die beiden Detektionsschritte während
zumindest einem Beleuchtungsschritt zeitlich nacheinander durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem im ersten Detektionsschritt
die aus einem ersten Abschnitt der Probenoberfläche auftretende Probenstrahlung
und im zweiten Detektionsschritt die aus einem zweiten Abschnitt der Probenoberfläche
austretende Probenstrahlung detektiert wird, wobei beide Abschnitte aneinandergrenzen
oder der zweite Abschnitt den ersten Abschnitt nur teilweise überdeckt.
Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem im Auswerteschritt
das im zweiten Detektionsschritt detektierte Signal vom im ersten Detektionsschritt
detektierte Signal subtrahiert wird.
Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem die Beleuchtungsschritte,
die beiden Detektionsschritte und der Auswerteschritt für mehrere Bildfelder
in unterschiedlichen vorbestimmten Tiefen der Probe durchgeführt werden, um
mehrere tiefendiskriminierte Schnittbilder der Probe zu erzeugen.
Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem das Beleuchtungsstrahlenbündel
punkt- oder linienförmig fokussiert wird.
Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem in den beiden
Detektionsschritten die Probenstrahlung spektral aufgelöst detektiert wird.
Mikroskop zum Erzeugen eines Bildes eines in einer vorbestimmten Tiefe
einer zu untersuchenden Probe liegenden Bildfeldes, mit
einem Beleuchtungsmodul, das in mehreren Beleuchtungsschritten das Bildfeld beleuchtet,
wobei in jedem Beleuchtungsschritt jeweils ein Teil des Bildfeldes mit einem fokussierten
Beleuchtungsstrahlenbündel beleuchtet wird, das aufgrund einer Wechselwirkung
mit der Probe die Erzeugung von Probenstrahlung bewirkt,
einem Detektionsmodul, das erzeugte Probenstrahlung detektiert, und
einem Auswertemodul, das auf Basis der detektierten Probenstrahlung das Bild erzeugt,
dadurch gekennzeichnet, daß während jedem Beleuchtungsschritt das Detektionsmodul
einen ersten und einen zweiten Detektionsschritt durchführt,
wobei im ersten Detektionsschritt im Fokus sowie außerhalb des Fokus erzeugte
Probenstrahlung und
im zweiten Detektionsschritt ein geringerer Anteil der im Fokus erzeugten Probenstrahlung
als im ersten Detektionsschritt sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung
detektiert wird, und
daß das Auswertemodul die im zweiten Detektionsschritt detektierte Probenstrahlung
nutzt, um bei der im ersten Detektionsschritt detektierten Probenstrahlung den außerfokalen
Anteil zu verringen.
Mikroskop nach Anspruch 9, bei dem das Detektionsmodul zwei Detektoren
umfaßt, so daß eine gleichzeitige Durchführung der beiden Detektionsschritte
möglich ist.
Mikroskop nach Anspruch 9, bei dem das Detektionsmodul für die
beiden Detektionsschritte einen einzigen Detektor aufweist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 11, bei dem im ersten
Detektionsschritt die aus einem ersten Abschnitt der Probenoberfläche und im
zweiten Detektionsschritt die aus einem zweiten Abschnitt der Probenoberfläche
austretende Probenstrahlung detektiert wird, wobei die beiden Abschnitte der Probenoberfläche
aneinandergrenzen oder der zweite Abschnitt den ersten Abschnitt nur teilweise überdeckt.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 12, bei dem das Auswertemodul
das im zweiten Detektionsschritt detektierte Signal vom im ersten Detektionsschritt
detektierten Signal subtrahiert.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 13, bei dem das Beleuchtungsmodul
ein Scannermodul aufweist, das das Beleuchtungsstrahlenbündel über das
Bildfeld lenkt.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 14, bei dem das Beleuchtungsmodul
das Bildfeld mit einem punkt- oder linienförmig fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündel
beleuchtet.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 15, bei dem in den beiden
Detektionsschritten die Probenstrahlung spektral aufgelöst detektiert wird.
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Patent Zeichnungen (PDF)
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