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Dokumentenidentifikation DE102005048187A1 12.04.2007
Titel Einrichtung und Verfahren zur Bestimmung von parazellulären und transzellulären Pemeabilitäten von Zellkulturen
Anmelder Technische Universität Dresden, 01069 Dresden, DE
Erfinder Schnittler, Hans-Joachim, 01445 Radebeul, DE;
Koch, Edmund, 01309 Dresden, DE;
Seebach, Jochen, 01099 Dresden, DE
Vertreter Hempel, H., Dipl.-Phys., Pat.-Anw., 01159 Dresden
DE-Anmeldedatum 02.10.2005
DE-Aktenzeichen 102005048187
Offenlegungstag 12.04.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.04.2007
IPC-Hauptklasse C12M 1/34(2006.01)A, F, I, 20051002, B, H, DE
Zusammenfassung Die Erfindung betrifft eine Einrichtung und ein Verfahren zur Bestimmung von parazellulären und transzellulären Permeabilitäten von Zellkulturen.
Die Aufgabe besteht darin, dass die transzellulären Permeabilitäten und die parazellulären Permeabilitäten von Zellen mittels Marker schnell, präzise und kostengünstig ermittelt werden können. Es soll insbesondere auch ein Nachweis von geringen Konzentrationen der Marker bei einer Markierungsrate von 1% gewährleistet werden.
Das Verfahren ist durch folgende Schritte gekennzeichnet:
- Vorgabe des Eingangsvolumens VE und der Eingangskonzentration KE in einer Filtereinrichtung,
- Konstanthaltung des Eingangsvolumens VE und eines Eingangsdrucks mittels eines Füllstandsmessers,
- Messen des transendothelialen elektrischen Widerstandes TER mittels eines Impedanzspektrometers,
- Messung von durch den Zellrasen hindurchtretenden Substanzen (einer Ausgangskonzentration KA) mittels eines Fluoreszenzphotometers,
- Speichern der gemessenen Größen KE, KA, TER, VE, VA im Speicher des Computersystems,
- Berechnung der Permeabilitäten Pp, Pt als Funktionen der Messwerte der Größen KE, KA, TER, VE, VA mit Pp, Pt = f (KE, KA, TER, VE, VA),
- Darstellung der Permeabilitäten Pp, Pt in Kurvenform,
- Vergleich der Permeabilitäts-Kurven und
- Anwendung eines Massenbilanzierungsprogrammes.

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft eine Einrichtung und ein Verfahren zur Bestimmung von parazellulären und transzellulären Permeabilitäten von Zellkulturen.

Das Gesamtphänomen des Durchtritts von Substanzen durch flächenmäßig zusammenhängende Zellen hindurch wird durch Permeabilitäten definiert. Prinzipiell können zwei Formen von Permeabilitätsänderungen unterschieden werden. Einmal der transzelluläre Transport von Substanzen oder Wasser durch eine Zelle hindurch mit Hilfe einer zellulären Maschinerie oder der parazelluläre Tranport zwischen angrenzenden Zellen hindurch.

Endothelzellen bilden als Grenzschicht zwischen intra- und extravasalem Raum eine semipermeable Barriere, die zudem unterschiedlichen physikalischen Einflüssen – Schubspannung, Blutdruck, Dehnung – ausgesetzt ist und sowohl den Austausch von im Blut gelösten Substanzen als auch die Passage korpuskulärer Elemente (Zellen) kontrolliert. Diese prinzipiellen Verhältnisse treffen ebenso für andere Grenzflächen bildende Zellschichten, zu denen z.B. Epithelien der Lunge, des Magens, des Darms, der Niere und Mesothelien von Hohlräumen und Lymphendothelien gehören, zu.

Als Grenzflächen können Epithelzellen und Endothelzellen Ziel unterschiedlicher Stimuli werden, die auf verschiedenen Signalwegen unterschiedlichen Wegen zu einer Permeabilitäts-Zunahme führen. Solche Störungen kommen im Rahmen zahlreicher Erkrankungen vor, wie z.B. bei akuten und chronischen Entzündungsaktionen, Autoimmunerkrankungen u.a. Die Aufklärung der Mechanismen ist von generellem Interesse um die Pathogenese und gegebenenfalls als Basis zur Konzeptionierung therapeutischer Ansätze zu verstehen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Einrichtung und ein Verfahren zur Bestimmung von parazellulären und transzellulären Permeabilitäten von Zellkulturen (engl. paracellular-transcellular permeability analyses system) anzugeben, die derart geeignet ausgebildet sind, dass die transzelluläre (transzytotische) Permeabilität und die parazelluläre Permeabilität von Zellen mittels Marker (engl. tracer) schnell, präzise und kostengünstig ermittelt werden können. Es soll insbesondere auch ein Nachweis von geringen Konzentrationen der Marker bei einer Markierungsrate von 1% gewährleistet werden.

Die Aufgabe wird durch die Merkmale der Patentanspruchs 1 und 22 gelöst.

Der Einrichtung zur Bestimmung von parazellulären und transzellulären Permeabilitäten von Zellkulturen, insbesondere zur Messung von Permeabilitätsparametern von Zellkulturen gemäß Patentanspruch 1 sind folgende apparative Einrichtungs-Komponenten innerhalb eines offenen Flüssigkeitskreislaufes zugeordnet:

  • – mindestens eine Filtereinrichtung, wobei vorher auf einer Filtermembran die zu untersuchenden Zellen kultiviert und als eine rasenartige Zellkultur in eine Filtereinrichtung zur Analyse von Tranzytoprozessen eingesetzt werden. Dadurch entstehen zwei Kompartimente, ein oberes und ein unteres Kompartiment, in der Filtereinrichtung. Der Zellrasen wird mit einem hydrostatischen Druck beansprucht, der über eine Flüssigkeitssäule aufgebaut wird. Die Flüssigkeit enthält mindestens einen fluoreszierenden Marker mit einer Eingangskonzentration KE und einem Eingangsvolumen VE. Mit Hilfe eines ersten Drucksensors wird die Konstanthaltung der Flüssigkeitssäule über ein Regelsystem durchgeführt.
  • – mindestens ein Fluoreszenzphotometer zur Erfassung mindestens eines durch die Zellkultur hindurch tretenden fluoreszierenden Markers,
  • – mindestens ein Füllstandsmesser mit einem zweiten Drucksensor zur Messung der durch den Zellrasen hindurch getretenen Volumenmenge VA,
  • – mindestens eine Pumpe zur Aufrechterhaltung des Flüssigkeitskreislaufes, die mit der Filtereinrichtung in Verbindung steht, wobei die Filtereinrichtung, das Fluoreszenzphotometer, der Füllstandsmesser und die Pumpe sich im Flüssigkeitskreislauf befinden sowie
  • – ein Impedanzspektrometer zur Messung des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER der Zellkultur und
  • – ein Computersystem zur Messsteuerung und Auswertung sowie zur Anzeige verschiedener Parameter, aus denen die parazellulären Permeabilitäten Pp und die transzellulären Permeabilitäten Pt als Funktionen der Größen KE, KA, TER, VE, VA berechnet werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von parazellulären Permeabilitäten Pp und transzellulären Permeabilitäten Pt von Zellkulturen gemäß Patentanspruch 22 mittels der vorgenannten Einrichtung ist durch folgende Schritte gekennzeichnet,

  • – Vorgabe des Eingangsvolumens VE und der Eingangskonzentration KE in einer Filtereinrichtung,
  • – Konstanthaltung des Eingangsvolumens VE und eines Eingangsdrucks mittels eines Füllstandsmessers,
  • – Messen des transendothelialen elektrischen Widerstandes TER mittels eines Impedanzspektrometers,
  • – Messung von durch den Zellrasen hindurchtretenden Substanzen (einer Ausgangskonzentration KA) mittels eines Fluoreszenzphotometers,
  • – Speichern der gemessenen Größen KE, KA, TER, VE, VA im Speicher des Computersystems,
  • – Berechnung der Permeabilitäten Pp, Pt als Funktionen der Messwerte der Größen KE, KA, TER, VE, VA mit Pp, Pt = f(KE, KA, TER VE, VA)
  • – Darstellung der Permeabilitäten Pp, Pt in Kurvenform,
  • – Vergleich der Permeabilitäts-Kurven und
  • – Anwendung eines Massenbilanzierungsprogrammes.

Dabei werden im Wesentlichen zeitgleiche Mehrfachmessungen an die Marker enthaltenden Flüssigkeiten sowohl bei mehreren unterschiedlichen Wellenlängen als auch in mehreren Durchflussküvetten, durch die Flüssigkeiten mit der zu messenden Konzentration der Marker fließen, durchgeführt und dabei störendes Streulicht minimiert.

Mit der Einrichtung wird Messzeit eingespart, die Genauigkeit der Bestimmung der Permeabilitäten erhöht und die Parameter können quantitativ miteinander verglichen werden.

Weiterbildungen und weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind in weiteren Unteransprüchen angegeben.

Die Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen mittels mehrerer Zeichnungen näher erläutert.

Es zeigen:

1 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Einrichtung zur Bestimmung der parazellulären Permeabilität und der transzellulären Permeabilität einer Zellkultur über die zeitgleiche Messung verschiedener Parameter,

2 eine schematische Darstellung einer Zellkultur und von zugehörigen Diffusions-Vorgängen,

3 ein Fluoreszenzphotometer als Detektionseinheit in einer perspektivischen Darstellung mit einer Durchflussküvette sowie einer Anregungsanordnung und einer Detektionsanordnung,

4 ein Fluoreszenzphotometer in einer perspektivischen Darstellung mit einer Drehhalterungseinrichtung für mehrere Detektionseinheiten in zentralsymmetrischer Anordnung,

5 ein Fluoreszenzphotometer in einer schematischen Darstellung mit einer Verschiebehalterungseinrichtung und mehreren stationären Durchflussküvetten für eine Detektionseinheit,

6 eine Darstellung einer Transmissions-Wellenlängen-Kurve von Anregungsfilter und Detektionsfilter für eine Probe FITC-Dextran als Marker,

7 eine Darstellung einer Fluoreszenzintensität(Detektorstromsignal)-Zeit-Kurve mit Eichkurve in Abhängigkeit von Konzentrationen des FITC-Dextrans, und

8 eine Darstellung eines Diagramms der relativen Fluoreszenz zur Konzentration von FITC-Dextran.

In 1 ist eine erfindungsgemäße Einrichtung 1 zur Bestimmung der parazellulären Permeabilität und der transzellulären Permeabilität einer rasenartigen Zellkultur 16 mit mindestens einem Marker 23 dargestellt, der folgende apparative Einrichtungs-Komponenten innerhalb eines offenen Flüssigkeitskreislaufes 6 mit einer Flüssigkeit 25 zugeordnet sind:

  • – mindestens eine der Zellkultur 16 enthaltende Filtereinrichtung 2 zur Analyse von Transzytoseprozessen in der Zellkultur 16 mittels jeweils einer Eingangskonzentration KE und eines Eingangsvolumens VE mindestens eines fluoreszierenden, der Flüssigkeit 25 beigefügten Markers 23 in einer, die Zellkultur 16 mit einem hydrostatischen Druck belastenden Flüssigkeitssäule 17 sowie mit einem ersten Drucksensor 27 zur Regelung der Höhe der Flüssigkeitssäule 17,
  • – ein Fluoreszenzphotometer 3 zur Erfassung einer jeweiligen Ausgangskonzentration KA des durch die Zellkultur 16 diffundierenden Markers 23,
  • – mindestens ein Füllstandsmesser 4 mit einem zweiten Drucksensor 26 zur Regelung der Höhe einer zweiten Flüssigkeitssäule 31 und zur Bestimmung eines Ausgangsvolumens VA der Flüssigkeit 25 mit dem darin befindlichen Marker 23,
  • – eine Pumpe 5 zur Aufrechterhaltung des Flüssigkeitskreislaufes 6, die mit der Filtereinrichtung 2 in Verbindung steht, wobei die Filtereinrichtung 2, das Fluoreszenzphotometer 3, der Füllstandsmesser 4 und die Pumpe 5 sich im Flüssigkeitskreislauf 6 befinden, sowie
  • – ein Impedanzspektrometer 7 zur Messung des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER der Zellkultur 16 und
  • – ein Computersystem 9 mit programmtechnischen Mitteln zur Messsteuerung und Auswertung sowie zur Anzeige der Permeabilitäten Pp, Pt als Funktionen von KE, KA, TER, VE, VA.

Das Impedanzspektrometer 7 ist an die Filtereinrichtung 2 über elektrische Verbindungsleitungen 8, 32 angeschlossen, wobei die Filtereinrichtung 2 eine Transwellfiltereinrichtung darstellen kann.

Das Computersystem 9 steht über erste Leitungen 10 mit dem Impedanzspektrometer 7, über zweite Leitungen 11 mit dem Fluoreszenzphotometer 3, über dritte Leitungen 12 mit dem Füllstandsmesser 4 einschließlich des zweiten Drucksensors 26 und über vierte Zeitungen 13 mit der Pumpe 5 in elektrischer und signaltechnischer Verbindung, wobei die Pumpe 5 eine Rollerpumpe darstellen kann.

Das Computersystem 9 kann derart ausgebildet sein, dass es selbst eine Steuer-/Regeleinrichtung darstellt oder in eine solche als Hauptbestandteil integriert ist.

Die Transwellfiltereinrichtung 2 weist im Wesentlichen ein oberes Kompartiment 20 und ein unteres Kompartiment 21 auf, wobei sich zwischen beiden Kompartimenten 20, 21 eine nach unten poröse kleinvolumige Kammer 14 mit einem darin einsetzbaren Filterinsert 15 befindet, in dem die Zellkultur 16 in Form einer Schicht aus zusammenhängenden Zellen vorhanden ist.

In 2 ist in einer schematischen Darstellung die auf dem Filterinsert 15 aufgebrachte Zellkultur 16 – Zellrasen – perspektivisch vergrößert gezeigt, wobei die parazellulären Diffusions-Vorgänge 29 und die transzellulären (tranzytotischen) Diffusions-Vorgänge 30 durch Pfeile richtungsbezogen angegeben sind.

In der nach oben freien Kammer 14 lastet auf der Zellkultur 16, wie in 1 gezeigt ist, die erste Flüssigkeitssäule 17 von vorzugsweise exakt 10 cm, wobei als Flüssigkeit 25 Kulturmedium eingebracht ist. Die Kammer 14 steht zur ersten Flüssigkeitssäule 17 gerichtet mit einer dem oberen Kompartiment 20 zugeordneten Ringelektrode 18 sowie von der ersten Flüssigkeitssäule 17 abgewendet mit einer dem unteren Kompartiment 21 zugeordneten Elektrodenplatte 19 zur Messung des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER in Verbindung, der mit Hilfe des Impedanzspektrometers 7 ermittelt wird. Die Ringelektrode 18 ist über eine erste Verbindungsleittang 8 an das Impedanzspektrometer 7 angeschlossen. Die Elektrodenplatte 19 steht über eine zweite Verbindungsleitung 32 mit dem Impedanzspektrometer 7 in Verbindung.

Die Kammer 14 ist in das obere Kompartiment 20 einsetzbar und steht über das untere Kompartiment 21 mit dem Flüssigkeitskreislauf 6 in Verbindung. Das von den Elektroden 18, 19 aufgebaute elektrische Feld greift durch den porösen Teil der Kammer 14 und den zugehörigen Bereich des Flüssigkeitskreislaufs 6 hindurch. Die Flüssigkeit wird zwischen dem Filterinsert 15 und der Elektrodenplatte 19 quer zur Flüssigkeitssäule 17 mittels der Pumpe 5 bewegt.

Das obere Kompartiment 20 besitzt im Bereich der ersten Flüssigkeitssäule 17 mindestens eine Zuführungsleitung 22 zur gesteuerten Zugabe des mit der Flüssigkeit 25 gemischten Markers 23 aus einem Vorratsbehälter heraus, wobei die Flüssigkeit 25 der Flüssigkeitssäule 17 über die Zellkultur 16 und das Filterinsert 15 der Flüssigkeit 25 des Kreislaufs 6 zuführbar ist. Die Flüssigkeit 25 kann vorzugsweise Wasser sein.

Der ersten Flüssigkeitssäule 17 ist im Bereich zur Kammer 14 der erste Drucksensor 27 zugeordnet, der über eine fünfte Leitung 28 mit dem Computersystem 9 in Verbindung steht und mit dem die erste Flüssigkeitssäule 17 ständig höhenmäßig signaltechnisch überprüft wird.

In 3 ist ein miniaturisiertes Fluoreszenzphotometer 3 zur Erfassung der Konzentration KA des durch die dimensionierungsminimierte Zellenkultur 16 hindurchgelangten fluoreszierenden Marker 23 gezeigt.

Dafür ist in der 3 das Fluoreszenzphotometer 3 in einer einfachen schematischen Form mit einer Durchflussküvette 34 auf einer Haltevorrichtung 35 gezeigt.

Das Fluoreszenzphotometer 3 kann als Detektionseinheit im Wesentlichen folgende Bauelemente/Baugruppen aufweisen:

  • – eine Energieversorgungseinheit 36, an die
  • – eine Lichtquelle 37, z.B. eine Leucht- oder Laserdiode angeschlossen ist,
  • – eine erste Optik 38, der
  • – ein Anregungsfilter 39 nachgeordnet ist, die allesamt eine Anregungsanordnung 40 bilden,
  • – eine auf der Haltevorrichtung 35 angeordnete Durchflussküvette 34 mit einem Küvettenzufluss 41 und einem Küvettenabfluss 42, wobei sich in der Durchflussküvette 34 die zugeführte Flüssigkeit 25 mit mindestens einem vorgesehenen Marker 23 befindet,
  • – eine zweite Optik 44,
  • – einen Detektionsfilter 45,
  • – eine dritte Optik 46 sowie
  • – einen Detektor 47,
  • – eine Auswerteeinrichtung 48, die in das Computersystem 9 integriert ist, wobei die zweite Optik 44, das Detektionsfilter 45, die dritte Optik 46 und der Detektor 47 mit Auswerteeinerichtung 48 eine Detektoranordnung 43 bilden.

Anschlusskabel 49, 50 – als Versorgungs- und Signalempfangsleitungen – für den Anschluss der Laserdiode 37 und für den Anschluss der Auswerteeinrichtung 48 vervollständigen das Flureszenzphotometer 3.

Der Küvettenzufluss 41, die Durchflussküvette 34 und der Küvettenabfluss 42 sind ein Teil des Flüssigkeitskreislaufes 6.

Das Fluoreszenzphotometer 3 und die Haltevorrichtung 35 mit den wahlweise darauf befestigten Durchflussküvetten können relativ zueinander bewegbar angeordnet sein.

Dem in 1 gezeigten Füllstandsmesser 4 ist eine Volumenmesskapillare 24 mit einer zweiten Flüssigkeitssäule 31 zugeordnet, wobei der Volumenmesskapillare 24 ein Abfluss 33 zugeordnet ist, der ventilmäßig betätigbar ist.

Die Volumenmesskapillare 24 dient der Quantifizierung des durch die Zellkultur 16 hindurchtretenden Flüssigkeitsvolumens VA. Die Volumenquantifizierung von VA erfolgt über den zweiten Drucksensor 26, der mit der Volumenmesskapillare 24 gekoppelt ist. Das abfließende Volumen VA wird als Messgröße über die Leitung 12 an das Computersystem 9 übermittelt.

Vorzugsweise können Mehrfachvorgänge in mehreren parallel angeordneten und aufeinander abgestimmten Flüssigkeitskreisläufen durch eine entsprechende Anzahl der apparativen Einrichtungs-Komponenten durchgeführt werden. Z.B. können

  • – die Transwellfiltereinrichtung 2 mehrfach, vorzugsweise sechsfach,
  • – das Fluoreszenzphotometer 3 für mehrfache, vorzugsweise sechs Detektionseinheiten,
  • – der Füllstandsmesser 4 mehrfach, insbesondere sechsfach und
  • – die Pumpe 5 in Form einer Mehrkanal-Rollerpumpe für mehrfache, vorzugsweise sechs Flüssigkeitskreislauf-Kanäle
ausgebildet sein,

während das Impedanzspektrometer 7 und das Computersystem 9 aus Gründen des vorhandenen Empfangs über mehrere signalelektrische Ein- und Ausgangs-Kanäle in einfacher Ausbildung vorgesehen sind.

In der 4 ist ein zweites Fluoreszenzphotometer 51 in einer perspektivischen Darstellung mit einer Haltevorrichtung 351 für mehrere Durchflussküvetten 341, 342, 343, 344 (vier von sechs möglichen) in zentralsymmetrischer Anordnung gezeigt, wobei zur Haltevorrichtung 351 ein Boden 52 zur Halterung der Durchflussküvetten 341, 342, 343, 344 sowie zugehörige Trennwände 531, 532, 533, 534, 535, 536 gehören. Die drei Detektionseinheiten 56, 57, 58, jeweils bestehend aus einer Anregungsanordnung 401, 402, 403 und einer Detektionsanordnung 931, 432, 433, sind einer schematisch dargestellten Drehhalterungseinrichtung 54 zugeordnet, die mit einem die Drehrichtung umschaltbaren Antriebssystem (nicht eingezeichnet) verbunden ist, das vom Computersystem 9 aus gesteuert werden kann. Die Haltevorrichtung 351 ist z.B. um die Drehhalterungseinrichtung 54 drehbar gelagert angeordnet.

Mittels der Trennwände 531, 532; 532, 533; 533, 534; 534, 535; 535, 536; 536, 531 und der jeweils dazwischen befindlichen Durchflüssküvette 341, 342, 343, 344 usw. entsteht jeweils ein Messsektor 55, wobei in 4 sechs Messsektoren 55 einem Winkel von 60° zugeordnet und drei Detektionseinheiten 56, 57, 58 vorgesehen sind.

Das Fluoreszenzphotometer 3 kann auch, wie in 5 gezeigt ist, mit einer Halterungsvorrichtung 352 für die Durchflussküvetten 341, 342, 343 angeordnet sein, wobei die Durchflussküvetten 341, 342, 343 ortsfest gehaltert und in Reihe nebeneinander ausgerichtet sein können. Das Fluoreszenzphotometer 3 kann dabei linear und parallel zur Reihen-Anordnung der Durchflussküvetten 341, 342, 343 verschiebbar angeordnet und die Halterungsvorrichtung 352 fest platziert sein. Auf einem in Pfeilrichtung 61 bewegbaren Verschiebetisch 62 ist die Anregungsanordnung und die Detektionsanordnung fest platziert. In einem vorgegebenen Strahlengang 63 befinden sich die Laserdiode 37, die erste Optik 38, der Anregungsfilter 39, die zweite Optik 44, der Detektionsfilter 45, die dritte Optik 46 und der Detektor 47, der über das Anschlusskabel 50 mit der Auswerteeinrichtung 48 verbunden ist, sowie ein semipermeabler Spiegel 64, der sich zwischen dem Anregungsfilter 39 und der zweiten Optik 46 befindet, und die rückstrahlende, zu erfassende Fluoreszenz in der Durchflussküvette 342 zur dritten Optik 46 und dem Detektor 47 gerichtet umlenkt.

Zusätzlich können in beiden Fluoreszenzphotometern 3 und 51 Blenden in die Strahlengänge eingefügt, die Ablenk-Winkel optimal eingestellt sowie Durchflussküvetten schwarz eingefärbt zur wesentlichen Verringerung des Streulichts bzw. zur Verbesserung des wellenlängenabhängigen Fluoreszenzsignal/Rausch-Verhältnisses eingesetzt sein.

Als zweckmäßig erweisen sich Küvetten aus Quarzglas, mit denen das Signal-Rausch-Verhältnis wesentlich gesteigert werden kann.

Auf dem Verschiebetisch 62 können auch mehrere parallel zueinander angebrachte Detektionseinheiten angebracht sein.

Die Fluoreszenzsignale bezogen auf den jeweiligen Marker 23 in der Flüssigkeit 25 werden folgendermaßen dargestellt:

In 6 ist eine Darstellung der Transmissions-Wellenlängen-Kurve des Anregungsfilters 39 und des Detektionsfilters 45 aus 3 oder 5 für eine Probe des Markers FITC-Dextran 23 bei einer Küvettenlänge von 10 mm und einer Konzentration von 100 &mgr;g/ml (rechte Größenachse) gezeigt. Dabei sind die Transmissionen des Anregungsfilters 39 und des Detektionsfilters 45 angegeben. Für eine Strahlung unter größerem Einfallswinkel als 90° verschiebt sich die Transmission des Detektionsfilters 45 zu kürzeren Wellenlängen, so dass dann auch Anregungslicht das Detektionsfilter 45 passieren kann. Das FITC-Fluoreszenzspektrum wird aus dem Absorptionsspektrum durch Spiegelung mit dem bekannten Emissionsmaximum von 517 nm berechnet. Zum Vergleich ist das Spektrum der eingesetzten Laserdiode 37 aufgetragen. Die Anregungswellenlänge 59 liegt etwa bei 470 nm, die fluoreszierende Beobachtungswellenlänge 50 hat ihr Maximum bei etwa 520 nm.

In 7 ist eine Darstellung der Fluoreszenzintensität-Zeit-Kurve (Eichkurve) in Form einer Detektorsignal-Zeitreihe in Abhängigkeit von der Konzentration des FITC-Dextrans gezeigt, wobei die Fluoreszenzintensität als Signal jeweils im Detektor 47 in Ampere für eine Verdünnungsreihe von FITC-Dextran gemessen wird. Die Konzentration von FITC-Dextran wird ausgehend von einer Stammlösung mit einer Konzentration von 100 mg/ml zunächst um einen Faktor 1000 auf 100 &mgr;g/ml verdünnt. Danach ist eine Verdünnungsreihe erstellt, bei der die Konzentration jeweils um einen Faktor 10 bis auf 0,1 ng/ml reduziert wird.

Auch die verwendete Zellkulturlösung – Promocell – ergibt bereits ein geringes Fluoreszenzsignal. Ab einer Konzentration von 0,41 &mgr;g/ml ist eine deutliche Zunahme der Fluoreszenzintensität zu erkennen. Nach Erreichen der höchsten Konzentration von 100 &mgr;g/ml ist die Durchflussküvette mit der Flüssigkeit 25 gespült und erneut die Fluoreszenz gemessen worden. Der Vorgang wird solange wiederholt, bis kein weiterer Abfall der Detektorsignale mehr zu beobachten ist. Zwischen den einzelnen Messungen wird die Durchflussküvette 34 aus dem Strahlengang entfernt, was am Einbruch der Detektorsignale erkennbar ist.

In 8 ist ein Diagramm der relativen Fluoreszenz zur Konzentration von FITC-Dextran 23 dargestellt. Die aus den der 7 zugrunde liegenden Messungen ermittelten Fluoreszenzströme sind auf das Maximum normiert und gegen die Konzentration aufgetragen. Neben dem relativen Detektorstrom ist zum Vergleich das mit dem CytoFluor II 23 für die gleichen Lösungen bestimmte Fluoreszenzsignal aufgetragen. Zum leichteren Vergleich ist das Signal auch auf das Maximum normiert. Durch Abzug des auch mit reiner Nährlösung vorhandenen Rauschsignals können auch noch Konzentrationen im Bereich von 0,01 &mgr;g/ml erkannt werden.

Die Kombination von mehreren bei unterschiedlichen Wellenlängen arbeitenden Fluoreszenzdetektionseinheiten 56, 57, 58 im Fluoreszenzphotomer 51 ermöglicht nahezu simultane Messungen mehrerer Fluoreszenzmarker 23.

In dem Verfahren zur Bestimmung von Permeabilitäten von Zellkulturen 22 werden folgende Schritte unter Verwendung der erfindungsgemäßen Einrichtung 1 durchgeführt:

  • – Messen des Eingangsvolumens VE und der Eingangskonzentration KE mittels der Filtereinrichtung 2,
  • – Messen des Ausgangsvolumens VA mittels des Füllstandsmessers 4,
  • – Messen des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER mittels des Impedanzspektrometers 7,
  • – Messung der Ausgangskonzentration KA mittels des Fluoreszenzphotometers 3 oder 51,
  • – Speichern der gemessenen Größen KE, KA, TER, VE, VA im Speicher des Computersystems 9,
  • – Berechnung der Permeabilitäten Pp, Pt als Funktionen der Messwerte der Größen KE, KA, TER, VE, VA mit Pp, Pt = f(KE, KA, TER, VE, VA),
  • – Darstellung der Permeabilitäten Pp, Pt in Kurvenform und
  • – Vergleich der Permeabilitäts-Kurven.

Im Folgenden wird die Funktionsweise der erfindungsgemäßen Einrichtung 1 zur Bestimmung der Permeabilitäten Pp, Pt unter Bezugnahme auf die 2 und 1 erläutert.

Die schichtartige Zellkultur 16 wird je nach Bedarf auf Filterinserts 15 von 6,5 mm, 12 mm oder 24 mm oder anderer Durchmesser kultiviert und in die kleinvolumige Kammer 14 eingesetzt. Die Zellen der Zellkultur 16 werden somit während des Messvorgangs einem hydrostatischen Druck von 10 cm Flüssigkeits(Wasser)säule 17 ausgesetzt. Der Druck entspricht dem physiologischen, postkapillaren, hydrostatischen Druck in vivo und führt zu einem Abdichten der Zellkultur 16.

Über die beiden Elektroden 18, 19 wird der elektrische transendotheliale Widerstand (TER – TransEndothelial Resistance) mit Hilfe des Impedanzspektrometers 7, das ein bekanntes Solartron 1260 – Gerät darstellen kann, gemessen. Die zwischen den Kompartimenten 20, 21 strömende Flüssigkeit 25 wird mit Hilfe der Pumpe 5 ständig in dem Flüssigkeitskreislauf b, der bedingt durch die beiden offenen Flüssigkeitssäulen 17, 31 halboffen ist, gepumpt. In den Flüssigkeitskreislauf 6 ist das Fluoreszenzphotometer 3 eingebunden und dazu in Reihe die Volumenmesskapillare 24 mit der zweiten Flüssigkeitssäule 31 des Füllstandsmessers 4 angeordnet.

Das Fluoreszenzphotometer 3, wie in den 3, 4 und 5 gezeigt ist, erfasst mindestens einen durch die Zellkultur 16 diffundierenden und durch die Durchflussküvette 34 fließenden, fluoreszierenden Marker 23, z.B. ein FITC-Albumin oder ein TRITC-Dextran, die der Zellkultur 16 über das obere Kompartiment 20 unter Messung des zugeführten Volumens VE gesteuert zugeführt werden. Die zuführbaren Marker 23 können sich im Molekulargewicht oder in der Qualität voneinander unterscheiden.

Mit der die zweite Flüssigkeitssäule 31 enthaltenden Volumenmesskapillare 24 kann das durch die Zellkultur 16 diffundierte Flüssigkeitsvolumen VA mit dem Marker 23 über den zweiten Drucksensor 26 gemessen und überwacht werden.

Als Vergleichswerte für die Permeabilitäten Pp, Pt bezogen auf die den Marker 23 enthaltende Flüssigkeit im Bereich der Zellkultur 16 kann die Permeabilität Pw der verwendeten Flüssigkeit 25, insbesondere des Wassers in einem vorher oder nachfolgenden Messvorgang ermittelt werden.

Die Erfindung ermöglicht es, dass insbesondere mit einer mehrkanaligen Einrichtung mehrere in Molekulargewicht und Qualität verschiedene Marker 23 weitgehend zeitgleich angeboten und detektiert werden können.

Die aus den apparativen Einrichtungs-Komponenten 3, 4, 7 gemäß einem Messprogramm bereitgestellten Messwerte der Größen KE, KA, TER, VE, VA werden in einen Speicher des Computersystems 9 eingebracht, dort gespeichert und nach Lesung mittels programmtechnischer Mittel zu Werten der zutreffenden Permeabilitäten Pp, Pt zumindest als Funktionen der Messwerte KE, KA, TER, VE, VA mit Pp, Pt = f(KE, KA, TER, VE, VA) berechnet, in Kurvenform dargestellt und zur Erstellung von Schlussfolgerungen miteinander verglichen.

Mit den drei weitgehend zeitgleich aufgenommenen Messparametern – dem elektrischen transendothelialen Widerstand TER, den Konzentrationen KE, KA der Marker 23 und der Volumen VE, VA – können unter Berücksichtigung der biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften der Marker 23 und einem in den programmtechnischen Mitteln vorhandenen Massenbilanzierungsprogramm nicht nur zwischen transzellulärer Permeabilität Pt und parazellulärer Permeabilität Pp unterschieden, sondern vorteilhafterweise auch Transportkinetiken präzise erstellt werden.

Veränderungen, wie z.B. Verstoffwechselung und Spaltung der Marker 23 während des Messvorgangs können durch Proteinfällung oder mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie – HPLC – bestimmt werden. Für die Proteinfällung werden Standardverfahren eingesetzt. Das abgespaltene TRITC oder das abgespaltene FITC sind nicht fällbar und können dann im Überstand nach Abzentrifugieren des gefällten Proteins und einem pH-Abgleich in zuverlässiger Weise gemessen werden.

Aus der Kenntnis und Anzeige des Unterschiedes zumindest der beiden genannten Permeabilitäten Pt, Pp in Diagrammen können Schlussfolgerungen über Transportweg und deren Störungen in der Zellkultur 16 abgeleitet werden.

1
Einrichtung
2
Filtereinrichtung
3
Fluoreszenzphotometer
4
Füllstandsmesser
5
Pumpe
6
Flüssigkeitskreislauf
7
Impedanzspektrometer
8
Erste Verbindungsleitung
9
Computersystem
10
Erste Leitungen
11
Zweite Leitungen
12
Dritte Leitungen
13
Vierte Leitungen
14
Kammer
15
Filterinsert
16
Zellkultur
17
Erste Flüssigkeitssäule
18
Ringelektrode
19
Elektrodenplatte
20
Oberes Kompartiment
21
Unteres Kompartiment
22
Zuführungsleitung
23
Marker
24
Volumenkapillare
25
Flüssigkeit
26
Erster Drucksensor
27
Zweiter Drucksensor
28
Fünfte Leitung
29
Erste Diffusions-Vorgänge
30
Zweite Diffusions-Vorgänge
31
Zweite Flüssigkeitssäule
32
Zweite Verbindungsleitung
33
Abfluss
34
Durchflussküvette
35
Haltevorrichtung
351
Drehvorrichtung
36
Energieversorgungseinheit
37
Lichtquelle
38
erste Optik
39
Anregungsfilter
40
Anregungsanordnung
401
Anregungsanordnung
402
Anregungsanordnung
403
Anregungsanordnung
41
Küvettenzufluss
42
Küvettenabfluss
43
Detektoranordnung
431
Detektoranordnung
432
Detektoranordnung
433
Detektoranordnung
44
zweite Optik
45
Detektionsfilter
46
dritte Optik
47
Detektor
48
Auswerteeinrichtung
49
Anschlusskabel
50
Anschlusskabel
51
Fluoreszenzphotometer-Mehrfachanordnung
52
Boden
531
Trennwand
532
Trennwand
533
Trennwand
534
Trennwand
535
Trennwand
536
Trennwand
54
Drehhalterungseinrichtung
55
Messsektor
56
Detektionseinheit
57
Detektionseinheit
58
Detektionseinheit
59
Anregungswellenlänge
66
Beobachtungswellenlänge
61
Pfeilrichtung
62
Verschiebetisch
63
Strahlengang
64
Semigermeabler Spiegel
VE
Eingangsvolumen
VA
Ausgangsvolumen
TER
transendothelialer elektrischer Widerstand
KE
Eingangskonzentration des Markers
KA
Ausgangskonzentration des Markers
Pp
parazelluläre Permeabilität
Pt
transzelluläre Permeabilität


Anspruch[de]
Einrichtung zur Bestimmung von parazellulären und transzellulären Permeabilitäten von Zellkulturen,

dadurch gekennzeichnet, dass ihr folgende apparative Einrichtungs-Komponenten innerhalb eines offenen Flüssigkeitskreislaufes (6) zugeordnet sind:

– mindestens eine die Zellkultur (16) enthaltende Filtereinrichtung (2) zur Analyse von Transzytoseprozessen in der Zellkultur (16) mittels einer Messung der jeweiligen Eingangskonzentration KE und des Eingangsvolumens VE mindestens eines fluoreszierenden Markers (23) in einer, die Zellkultur (16) mit hydrostatischem Druck belastenden Flüssigkeitssäule (17) sowie mit einem ersten Drucksensor (27) zur Regelung der Flüssigkeitssäule (17),

– mindestens ein Fluoreszenzphotometer (3) zur Erfassung einer jeweiligen Ausgangskonzentration KA des durch die Zellkultur (16) der Filtereinrichtung (2) diffundierenden Markers (23),

– mindestens ein Füllstandsmesser (4) mit einem zweiten Drucksensor (26) zur Messung von durch die Zellkultur (16) hindurch tretenden Flüssigkeitsmenge mittels einer zweiten Flüssigkeitssäule (31) und zur Bestimmung eines Ausgangsvolumens VA der Flüssigkeit (25) mit dem darin befindlichen Marker (23),

– mindestens eine Pumpe (5) zur Aufrechterhaltung des Flüssigkeitskreislaufes (6), die mit der Filtereinrichtung (2) in Verbindung steht, wobei die Filtereinrichtung (2), das Fluoreszenzphotometer (3), der Füllstandsmesser (4) und die Pumpe (5) sich im Flüssigkeitskreislauf (6) befinden sowie

– ein Impedanzspektrometer (7) zur Messung des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER der Zellkultur (16) und

– ein Computersystem (9) zur Messsteuerung und Auswertung sowie zur Anzeige der Permeabilitäten Pp, Pt als Funktionen der Größen KE, KA, TER, VE, VA mittels einer programmtechnischen Massenbilanzierung.
Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Filtereinrichtung (2) eine Transwellfiltereinrichtung darstellt und im Wesentlichen ein oberes Kompartiment (20) und ein unteres Kompartiment (21) aufweist, wobei sich zwischen beiden Kompartimenten (20, 21) eine nach unten poröse kleinvolumige Kammer (14) mit einem darin einsetzbaren Filterinsert (15) befindet, in dem zumindest die Zellkultur (16) in Form einer Schicht aus zusammenhängenden Zellen vorhanden ist. Einrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass in der nach oben freien Kammer (14) auf der Zellkultur (16) eine erste Flüssigkeitssäule (17) von vorzugsweise 10 cm lastet, wobei die Kammer (14) zur ersten Flüssigkeitssäule (17) gerichtet mit einer dem oberen Kompartiment (20) zugeordneten Ringelektrode (18) sowie von der ersten Flüssigkeitssäule (17) abgewendet mit einer dem unteren Kompartiment (21) zugeordneten Elektrodenplatte (19) zur Messung des transendothelialen Widerstandes TER mit Hilfe des Impedanzspektrometers (7) in Verbindung steht und die Kammer (14) in das obere Kompartiment (20) einsetzbar ist und mit dem unteren Kompartiment (21) über den Flüssigkeitskreislauf (6) in Verbindung steht. Einrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das obere Kompartiment (20) im Bereich der ersten Flüssigkeitssäule (17) mindestens eine Zuführungsleitung (22) zur gesteuerten Zugabe des Markers (23) besitzt, der gemischt mit Wasser auf der Zellkultur (16) lastet und oberhalb der Zellkultur (16) und des Filterinserts (15) der Flüssigkeit (25) des Kreislaufs (6) zuführbar ist. Einrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Drucksensor (27) über eine fünfte Leitung (28) mit dem Computersystem (9) in Verbindung steht, der die erste Flüssigkeitssäule (17) ständig höhenmäßig und signaltechnisch überprüft. Einrichtung nach Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet,

dass das Fluoreszenzphotometer (3) als Detektionseinheit folgende Bauelemente/Baugruppen aufweist:

– eine Energieversorgungseinheit (36), an die

– eine Lichtquelle (37) angeschlossen ist,

– eine erste Optik (38), der

– ein Anregungsfilter (39) nachgeordnet ist, die allesamt eine Anregungsanordnung (40) bilden,

– eine auf der Haltevorrichtung (35) angeordnete Durchflussküvette (34) mit einem Küvettenzufluss (41) und einem Küvettenabfluss (42), wobei sich in der Durchflussküvette (34) die Flüssigkeit (25) mit einem vorgesehenen Marker (23) befindet,

– eine zweite Optik (44),

– ein Detektionsfilter (45),

– eine dritte Optik (46) sowie

– ein Detektor (47),

– eine Auswerteeinrichtung (48), die in das Computersystem (9) integriert ist, wobei die zweite Optik (44), das Detektionsfilter (45), die dritte Optik (46) und der Detektor (47) mit Auswerteeinerichtung (48) eine Detektoranordnung (43) darstellen.
Einrichtung nach Anspruch b, dadurch gekennzeichnet, dass Anschlusskabel (49, 50) – Versorgungs- und Signalempfangsleitungen – für den Anschluss der Lichtquelle (37) und für den Anschluss der Auswerteeinrichtung (48) das Flureszenzphotometer (3) vervollständigen. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluoreszenzphotometer (51) mit mehreren Detektionseinheiten (56, 57, 58) und einer Haltevorrichtung (351) für mehrere Durchflussküvetten (341, 342, 343, 344) in zentralsymmetrischer Anordnung versehen ist, wobei zur Haltevorrichtung (351) ein Boden (52) zur Halterung der Durchflussküvetten (341, 342, 343, 344) sowie zugehörige Trennwände (531, 532, 533, 534, 535, 536) gehören, wobei die drei Detektionseinheiten (56, 57, 58), jeweils bestehend aus einer Anregungsanordnung und Detektionsanordnung, einer Drehhalterungseinrichtung (54) zugeordnet sind, die mit einem die Drehrichtung umschaltbaren Antriebssystem verbunden ist, das vom Computersystem (9) aus steuerbar ist. Einrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass durch Trennwände (531, 532) und eine dazwischen befindliche Durchflüssküvette (351) zu einem Messsektor (55) gehören. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Flureszenzphotometer (3) mit einer Halterungsvorrichtung (352) für die Durchflussküvetten (341, 342, 343) in Verbindung steht, wobei die Durchflussküvetten (341, 342, 343) ortsfest gehaltert und in Reihe nebeneinander ausgerichtet sind und das Fluoreszenzphotometer (3) relativ linear und parallel zur Reihen-Anordnung der Durchflussküvetten (341, 342, 343) verschiebbar angeordnet und zur Halterungsvorrichtung (352) angeordnet ist. Einrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass in einem vorgegebenen Strahlengang (63) sich die Lichtquelle (37), die erste Optik (38), das Anregungsfilter (39), die zweite Optik (44), das Detektionsfilter (45), die dritte Optik (46) und der Detektor (47), der über das Anschlusskabel (50) mit der Auswerteeinrichtung (48) verbunden ist, sowie ein semipermeabler Spiegel (64), der sich zwischen dem Anregungsfilter (39) und der zweiten Optik (46) befindet und der die rückstrahlende, zu erfassende Fluoreszenz in der Durchflussküvette (342) zur dritten Optik (46) und dem Detektor (47) gerichtet umlenkt, befinden. Einrichtung nach Anspruch 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass in den Fluoreszenzphotometern (3, 51) Blenden in die Strahlengänge eingefügt sind, die Ablenk-Winkel optimal eingestellt sowie Durchflussküvetten schwarz eingefärbt zur wesentlichen Verringerung des Streulichts bzw, zur Verbesserung des wellenlängenabhängigen Fluoreszenzsignal/Rausch-Verhältnisses eingesetzt sind. Einrichtung nach Anspruch 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Durchflussküvetten aus Quarzglas sind, mit denen ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis erreichbar ist. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dem Füllstandsmesser (4) eine Volumenmesskapillare (24) mit einer zweiten Flüssigkeitssäule (31) zugeordnet ist, wobei die Volumenmesskapillare (24) mit einem Abfluss (33) verbunden ist, der ventilmäßig betätigbar ist, wobei das abfließende Volumen VA als Messgröße an das Computersystem (9) übermittelt wird. Einrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Volumenmesskapillare (24) der Quantifizierung des durch die Zellkultur (16) hindurch diffundierenden Flüssigkeitsvolumens VA dient. Einrichtung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Volumenquantifizierung über den zweiten Drucksensor (26) erfolgt, der mit der Volumenmesskapillare (24) gekoppelt ist. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Impedanzspektrometer (7) an die Transwellfiltereinrichtung (2) über elektrische Verbindungsleitungen (8, 32) angeschlossen ist. Einrichtung nach Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Computersystem (9) über erste Leitungen (10) mit dem Impedanzspektrometer (7), über zweite Leitungen (11) mit dem Fluoreszenzphotometer (3), über dritte Zeitungen (12) mit dem Füllstandsmesser (4) einschließlich des zweiten Drucksensors (26) und über vierte Leitungen (13) mit einer Pumpe (5) in elektrischer und signaltechnischer Verbindung steht. Einrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Computersystem (9) derart ausgebildet ist, dass es selbst eine Steuer-/Regeleinrichtung darstellt oder in eine solche als Hauptbestandteil integriert ist. Einrichtung nach Ansprüchen 1 bis 19,

dadurch gekennzeichnet,

dass Mehrfachvorgänge in parallelen Flüssigkeitskreisläufen (6) durch eine entsprechende Anzahl der apparativen Einrichtungs-Komponenten durchgeführt werden, wobei

– die Filtereinrichtung (2) mehrfach,

– das Fluoreszenzphotometer (3, 51) für mehrere Detektionseinheiten (56, 57, 58),

– der Füllstandsmesser (4) mehrfach,

– die jeweils in einzelne Flüssigkeitskreisläufe (6) integriert sind, und

während die Pumpe (5) als Mehrkanal-Rollerpumpe für mehrfache Messkammern ausgebildet ist, wobei jede Messkammer einem der Flüssigkeitskreisläufe (6) zugeordnet ist und das Impedanzspektrometer (7) und das Computersystem (9) in einfacher Ausbildung vorgesehen sind.
Einrichtung nach einem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die vorgesehenen, durch die Zellkultur (16) diffundierenden fluoreszierenden Marker (23) ein FITC-Albumin oder ein TRITC-Dextran sind, wobei sich die zuführbaren Marker (23) im Molekulargewicht oder in der Qualität voneinander unterscheiden. Verfahren zur Bestimmung von parazellulären und transzellulären Permeabilitäten von Zellkulturen mittels einer Einrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 21, durch folgende Schritte gekennzeichnet,

– Messen des Eingangsvolumens VE der Flüssigkeit (25) einschließlich des Markers (23) und dessen Eingangskonzentration KE mittels einer Filtereinrichtung (2),

– Messen des Ausgangsvolumens VA der Flüssigkeit (25) einschließlich des Markers (23) mittels eines Füllstandsmessers (4),

– Messen des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER mittels eines Impedanzspektrometers (7),

– Messung der Ausgangskonzentration KA des vorgegebenen Markers 23 mittels eines Fluoreszenzphotometers (3, 51),

– Speichern der gemessenen Größen KE, KA, TER, VE, VA im Speicher des Computersystems (9),

– Berechnung der Permeabilitäten Pp, Pt als Funktionen der Messwerte der Größen KE, KA, TER, VE, VA mit Pp, Pt = f(KE, KA, TER, VE, VA).

– Darstellung der Permeabilitäten Pp, Pt in Kurvenform und

– Vergleich der Permeabilitäts-Kurven.
Verfahren nach Anspruch 22,

dadurch gekennzeichnet,

dass folgende Schritte durchgeführt werden:

– die Zellkultur (16) wird je nach Bedarf auf Filterinserts (15) von 6,5 mm, 12 mm oder 24 mm oder anderer Durchmesser kultiviert und in die kleinvolumige Kammer (14) eingesetzt,

– danach wird durch die beiden Elektroden (18, 19) der transendotheliale Widerstand TER mit dem Impedanzspektrometer (7) gemessen,

– die im unteren Kompartiment (21) strömende Flüssigkeit (25) wird mit Hilfe der Pumpe (5) ständig in dem Flüssigkeitskreislauf (6), der bedingt durch die beiden offenen Flüssigkeitssäulen (17, 31) halboffen ist, gepumpt und

– in den Flüssigkeitskreislauf (6) ist das Fluoreszenzphotometer (3) eingebunden und dazu in Reihe die Volumenmesskapillare (24) mit der zweiten Flüssigkeitssäule (31) des Füllstandsmessers (4) angeordnet.
Verfahren nach Anspruch 22 und 23, dadurch gekennzeichnet, dass mit der die zweiten Flüssigkeitssäule (31) enthaltende Volumenmesskapillare (24) das durch die Zellkultur (16) diffundierte, mindestens einen Marker (23) enthaltende Flüssigkeitsvolumen VA über den zweiten Drucksensor (26) gemessen und überwacht wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass als Vergleichswerte für die Permeabilitäten Pp, Pt im Bereich der Zellkultur (16) die Permeabilität Pw des als Flüssigkeit (25) verwendeten Wassers ermittelt wird. Verfahren nach Anspruch 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass mit der mehrkanaligen Einrichtung mehrere in Molekulargewicht und Qualität verschiedene Marker (23) weitgehend zeitgleich angeboten und im unteren Kompartiment (21) detektiert werden. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen der Zellkultur (16) während des Messvorgangs in der Filtereinrichtung (2) einem hydrostatischen Druck von 10 cm Flüssigkeitssäule (17) ausgesetzt werden. Verfahren nach Ansprüchen 22 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass mit den drei weitgehend zeitgleich aufgenommenen Messgrößen – des Widerstandes TER, der Konzentrationen KE, KA des Markers (23) und der Volumen VE, VA – unter Berücksichtigung der biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften des Markers (23) und einem in den programmtechnischen Mitteln vorhandenen Massenbilanzierungsprogramm sowohl die tranzytotische Permeabilität Pt und parazelluläre Permeabilität Pp als auch Transportkinetiken erstellt werden. Verfahren nach Anspruch 22 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass Veränderungen, wie z.B. Verstoffwechselung und Spaltung, der Marker (23) während des Messvorgangs durch Proteinfällung oder mittels HPLC bestimmt werden, wobei für die Proteinfällung bekannte Verfahren eingesetzt werden und wobei das abgespaltene TRITC oder das abgespaltene FITC nicht gefällt werden und dann im Überstand nach Abzentrifugieren des gefällten Proteins und einem pH-Abgleich gemessen werden. Verfahren nach Anspruch 22 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die gemessenen Größen KE, KA, TER, VE, VA mittels eines Gesamtprogramms im Computersystem (9) aufgenommen, gespeichert, ausgewertet und angezeigt werden, wobei die Werte aus den einzelnen Messgrößen KE, KA, TER, VE, VA gemäß eines Auswerteprogramms zu zugehörigen Permeabilitätsdiagrammen ausgewertet werden.






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