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Dokumentenidentifikation DE102005048555A1 12.04.2007
Titel Verfahren zur Justierung einer Lichtquelle in einem Mikroskop
Anmelder Carl Zeiss Jena GmbH, 07745 Jena, DE
Erfinder Thirase, Jan, Dr., 37085 Göttingen, DE;
Venus, Brüne, Dr., 37085 Göttingen, DE
DE-Anmeldedatum 06.10.2005
DE-Aktenzeichen 102005048555
Offenlegungstag 12.04.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.04.2007
IPC-Hauptklasse G02B 21/06(2006.01)A, F, I, 20051006, B, H, DE
IPC-Nebenklasse G02B 21/00(2006.01)A, L, I, 20051006, B, H, DE   
Zusammenfassung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, mit dem die in den Beleuchtungsstrahlengang eines Mikroskops einzukoppelnde Beleuchtungsstrahlung exakt kontrolliert und/oder justiert werden kann.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Justierung einer Lichtquelle in einem Mikroskop wird anstelle des Objektivs eine abbildende optische Reflexionseinheit (6) an das Mikroskop angekoppelt, um das Licht der Lichtquelle so auf einen Detektor (9) abzubilden, dass eine Kontrolle der Fokusposition und/oder der Lage und/oder eine Justierung der Lichtquelle hinsichtlich der Fokusposition und/oder der Lage erfolgen kann.
Die vorgeschlagene Lösung zur Kontrolle und Justierung eines in den Beleuchtungsstrahlengang eines Mikroskops einzukoppelnden Laserstrahls ist zwar insbesondere für die Ausnutzung der TIRF-Effekte vorgesehen, kann aber prinzipiell auch für andere Lösungen verwendet werden, bei denen die Parallelität von Beleuchtungsstrahlen kontrolliert und/oder justiert werden soll.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine einfache und schnelle Lösung zur Justierung der Beleuchtung eines Mikroskops zur Verfügung gestellt, bei dem eine Gefährdung des Bedienpersonals durch austretendes Beleuchtungslicht vermieden wird.

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren mit dem die, in den Beleuchtungsstrahlengang eines Mikroskops einzukoppelnde Laserstrahlung exakt kontrolliert und/oder justiert werden kann.

So wird beispielsweise bei der TIRF-Mikroskopie (Total Internat Reflection Fluorescence) eine hohe axiale Auflösung erreicht, indem Beleuchtungsstrahlung so in ein hochaperturiges Objektiv eingestrahlt wird, dass an der Probenoberfläche innere Totalreflexion auftritt. Die eingestrahlte Leistung wird nur als evaneszentes Feld ins optisch dünnere Probenmedium eingebracht. Grenzflächennahe Moleküle werden dadurch zur Fluoreszenz angeregt. Die Apertur des verwendeten Objektivs muss dazu größer sein als der Brechungsindex der zu untersuchenden Probe. Da biologische Proben typischerweise einen Brechungsindex von 1,33 bis 1,38 haben, werden in der Praxis Objektive mit numerischen Aperturen größer als 1,4 verwendet. Die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes ist dabei von der Apertur des verwendeten Objektivs abhängig und ist desto kleiner je größer dessen Apertur ist.

Die Totalreflexion des extrem kleinen Lichtpunktes des anregenden Lichts an definierten Grenzflächen erlaubt die Beobachtung einzelner Moleküle, was früher nur mit einem Elektronenmikroskop möglich war. Es lassen sich somit kontrastreiche Bilder der markierten Moleküle, der Zellmembrane oder Zellwände in Echtzeit erzeugen. Der Forscher kann dynamische Abläufe beobachten, wie beispielsweise die Bewegungen der Moleküle in der Zellmembrane, den Austausch von Molekülen zwischen Membrane und Flüssigkeit oder die Bewegung der Zellorganellen. Mit TIRF-Systemen werden damit völlig neue Dimensionen der Lichtmikroskopie erschlossen.

Wichtige Bedingung zur Erzielung von TIRF-Effekten ist die Parallelität der polarisierten Laserstrahlung am Ort der Probe. Dies kann dadurch erreicht werden, dass man eine Taille des Laserstrahls mit Hilfe einer Justiervorrichtung in die Eintrittspupille des Objektivs schiebt.

Bisher war es üblich den Laserstrahl im Fernfeld zu betrachten und die Justiereinrichtung so einzustellen, dass der Durchmesser des Laserstrahls dort minimal wird, was äquivalent zu einer parallelen Bündelausbreitung am Ort des Objektes ist. Dafür wird im Labor gerne die Decke des Labors genommen. Will man jedoch erforderliche Sicherheitsbestimmungen für den Gebrauch von Lasern einhalten, ist eine solche Methode nicht zulässig.

Neben der Parallelität der Laserstrahlung am Ort der Probe ist die Einstellung des Winkels unter dem die Laserstrahlung auf die Probe trifft von entscheidender Bedeutung. Von diesem Winkel, der mit der Lager des Fokuses in der Austrittspupille korrespondiert, ist abhängig, ob Totalreflextion auftritt und wie groß die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes ist. Von der Justiervorrichtung wird die Lager des Fokuses in der Austrittspupille auf die Kamera abgebildet. Mit Hilfe der Justiervorrichtung ist es somit möglich diese Lage zu bestimmen und damit auch auf die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes zu schließen.

Nach dem Stand der Technik sind aber auch Lösungen bekannt mit denen die Eigenschaften von Laserstrahlungen vor dem Auftreffen auf eine Probe exakt bestimmt und korrigiert werden können.

In der DE 198 22 924 C2 wird ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Messung der Verteilung der Energiefelddichte eines gepulsten Laserstrahls beschrieben. Dazu wird ein Messstrahl zu unterschiedlichen Zeitpunkten ausgeblendet und örtlich voneinander getrennt auf einem CCD-Chip abgebildet. Die gemessenen Energiedichten im Bearbeitungsfokus des Laserstrahls können miteinander verglichen und bei Bedarf korrigiert werden. Die beschriebene Lösung ist insbesondere für die Prozessüberwachung bei der Laserbearbeitung von Werkstücken vorgesehen.

Eine Lösung zur Bestimmung der Intensitätsverteilung beim Auftreffen eines Laserstrahls auf eine Oberfläche ist Inhalt der DE 102 08 781 A1. Dazu werden die Intensitätsverteilungen in mehreren Ebenen des Laserstrahls erfasst, rechnergestützt als digitale Bilddaten angeordnet und aus diesen durch Interpolation die Intensitätsverteilung auf der Oberfläche berechnet. Es können Intensitätsverteilungen sowohl für nicht ebene als auch für nicht senkrecht zur Strahlachse liegende Oberflächen bestimmt werden. Auch diese Lösung ist insbesondere für die Prozessüberwachung bei der Laserbearbeitung von Werkstücken geeignet und sowohl für kontinuierliche als auch für gepulste Laserquellen anwendbar.

In der DE 102 17 098 A1 wird eine Auflicht-Beleuchtungseinrichtung für ein Mikroskop, insbesondere ein TIRF-Mikroskop beschrieben. Hierbei wird besonderes Augenmerk auf das Erreichen einer hohen Polarisation der Laserstrahlung gelegt. Eine hohe Polarisation der Laserstrahlung ist neben dem exakten Einstrahlwinkel ein wichtiges Kriterium zur Erreichung eines hohen Wirkungsgrades. Der Einstrahlwinkel entspricht dabei im wesentlichen dem Grenzwinkel der Totalreflexion an der Probe. Die Beleuchtungseinrichtung erlaubt eine Veränderung des Einstrahlwinkels, wodurch eine optimale Einkopplung der Anregungsstrahlung gewährleistet werden kann.

Ein Mikroskop bei dem mindestens ein Beleuchtungsstrahl bezüglich der optischen Achse radial verschoben werden kann wird in der DE 101 43 481 A1 beschrieben. Je weiter der Beleuchtungsstrahl in radialer Richtung von der optischen Achse entfernt durch das Objektiv fällt, desto größer wird der Reflexionswinkel des Beleuchtungsstrahles an der Grenzfläche zwischen Objektträger und Objekt. Um die mikroskopische Beobachtung des Objektes nicht zu beeinträchtigen, wird der reflektierte Anteil des Beleuchtungsstrahles absorbiert. Eine gezielte Justierung der Anordnung wird dadurch ermöglicht, dass das an der Grenzfläche reflektierte Licht auf einen Detektor geleitet und entsprechend ausgewertet wird.

Auch bei der fluoreszenzbasierten optischen Objektuntersuchungseinrichtung, insbesondere für die TIRF-Mikroskopie gemäß DE 102 58 945 A1 wird das von der Grenzfläche reflektierte Licht einer Lichtfallenanordnung zugeführt. Durch diese definierte Strahlfallenanordnung wird störendes Streulicht vermieden und damit die Detektion sehr schwacher Fluoreszenzsignale ermöglicht; zum einen durch Vermeidung störender Hintergrundfluoreszenz und zum anderen durch Verbesserung des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses am Detektor.

Bei dem in der US 6,819,484 A beschriebenen TIRF-Mikroskop wird das von der Grenzfläche reflektierte Licht einer Lichtfallenanordnung zugeführt, die in einer besonderen Ausführung außerhalb des Mikroskops angeordnet ist. Durch synchrone Bewegung der das Beleuchtungslicht ein- und auskoppelnden optischen Elemente wird auch bei veränderten Einstrahlwinkeln gewährleistet, dass das gesamte, an der Grenzfläche reflektierte Licht der Lichtfallenanordnung zugeführt wird.

Eine weitere Einrichtung zur Einkopplung von Licht in ein Mikroskop wird in der DE 102 29 935 A1 beschrieben. Hierbei wird ein an den meisten Mikroskopen standardmäßig vorhandener und an sich zur Aufnahme von speziellen Einrichtungen zur Kontrastierung (z. B. DIC-Schieber) vorgesehener Zugang zur Einkopplung des Lichtes einer zweiten Lichtquelle, z. B. eines Lasers genutzt, ohne dass weitere Veränderungen am Beleuchtungsstrahlengang vorgenommen werden müssen. Durch die vorgesehene Möglichkeit den eingekoppelten Lichtstrahl gegen die optische Achse zu neigen, lässt sich in besonders einfacher Weise der Lichtstrahl auf den Randbereich der Austrittspupille eines hochaperturigen Objektiv richten und so das TIRF-Verfahren realisieren.

Auch bei dem in der JP 2003-215 462 A beschriebenen Mikroskop wird eine Lösung vorgeschlagen, bei der kein für die Abbildung notwendiges optisches Element entfernt werden braucht. Statt dessen wird zur Justierung der Beleuchtung des Mikroskops ein Spiegel in den Strahlengang vor das Objekt geschwenkt, der das Beleuchtungslicht über die zur Abbildung notwendigen optischen Bauelemente und eine zusätzlich in den Strahlengang, vor den Detektor eingebrachte Bertrand-Linse auf den Detektor abbildet. Der entstehende Lichtfleck wird zur Justierung des Mikroskops entsprechend ausgewertet.

Für die Anwendung zur Justierung zu TIRF sind die genannten Lösungen zu aufwendig. Wichtige Bedingung für den TIRF-Effekt ist, dass die Laserstrahlung am Ort der Probe parallel ist. Dies wird dadurch erreicht, dass man eine Taille des Laserstrahls mit einer Justiervorrichtung in die Eintrittspupille des Objektivs schiebt.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Justierverfahren für die Laserquelle an einem Mikroskop zu entwickeln, mit dem ein in den Beleuchtungsstrahlengang einzukoppelnder Laserstrahl auf einfache Weise hinsichtlich seiner Parallelität und/oder seiner Lage kontrolliert und/oder justiert werden kann.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Justierung der Laserquelle eines Mikroskops wird anstelle des Objektivs eine abbildende optische Reflexionseinheit an das Mikroskop angekoppelt, um das Licht der Laserquelle so auf einen Detektor abzubilden, dass eine Kontrolle der Fokusposition und/oder eine Justierung der Laserlichtquelle erfolgen kann.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Weiterbildungen und Ausgestaltungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.

Die vorgeschlagene technische Lösung zur Kontrolle und Justierung eines in den Beleuchtungsstrahlengang eines Mikroskops einzukoppelnder Laserstrahls ist zwar insbesondere für die Ausnutzung der TIRF-Effekte vorgesehen, kann aber prinzipiell auch für andere Lösungen verwendet werden, bei denen die Parallelität von Beleuchtungsstrahlen kontrolliert und/oder justiert werden sollen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher beschrieben. Dazu zeigt

1: den prinzipiellen Strahlverlauf in einem Mikroskop während der Justierung.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Justierung der TIRF-Beleuchtung eines Mikroskops wird anstelle des Objektivs eine abbildende optische Reflexionseinheit an das Mikroskop angekoppelt, um das Licht der als TIRF-Beleuchtung dienenden Laserlichtquelle so auf einen Detektor abzubilden, dass eine Kontrolle der Fokusposition und/oder eine Justierung der Laserlichtquelle erfolgen kann. Dabei ist die abbildende optische Reflexionseinheit so bemessen, dass das Licht der als TIRF-Beleuchtung dienenden Laserlichtquelle genau dann auf den Detektor fokussiert wird, wenn die Laserlichtquelle auf die Austrittspupille des Objektivs fokussiert ist. In einer ersten Ausgestaltung kann hierbei als Reflexionseinheit ein sammelnder Spiegel ohne weiteren optischen Elemente verwendet werden.

Dazu zeigt 1 den prinzipiellen Strahlverlauf in einem Mikroskop während der Justierung. Ausgehend von der Laserlichtquelle 1 wird das als TIRF-Beleuchtung dienende Laserlicht 2 über einen halbdurchlässigen Spiegel 3 in die Austrittspupille 4 des zur TIRF-Mikroskopie verwendeten Objektives fokussiert. An der optischen Anlagefläche 5, an der ansonsten das zur TIRF-Mikroskopie verwendete Objektiv angeordnet ist, wird zur Justierung der Laserlichtquelle 1 eine abbildende optische Reflexionseinheit 6 positioniert.

Diese abbildende optische Reflexionseinheit 6 besteht dabei aus einer Linse 7 und einem Reflexionselement 8, das eine ebene oder eine gekrümmte Fläche aufweisen kann. Statt der Linse 7 kann auch ein Linsensystem verwenden werden. Außerdem ist es möglich das Reflexionslement 8 als spiegelnde Fläche auf der Linse 7 bzw. der Linsenanordnung auszuführen.

Von der abbildenden optischen Reflexionseinheit 6 wird das Laserlicht 2 über einen halbdurchlässigen Spiegel 3 auf den Detektor 9 fokussiert. Eine exakte Fokussierung des Laserlichtes 2 auf den Detektor 9 erfolgt genau dann, wenn die Laserlichtquelle 1 in die Austrittspupille 4 fokussiert ist. Als Detektor 9 wird hierbei im einfachsten Fall eine Kamera verwendet, die in den meisten Mikroskopen ohnehin vorhanden ist.

Durch Auswertung des Abbildes des auf den Detektor 9 fokussierten Laserlichtes 2 kann die Fokussierung der Laserlichtquelle 1 kontrolliert und/oder über Stellmechanismen justiert werden.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung wird zur Erleichterung der Auswertung von der abbildenden optischen Reflexionseinheit 6 ein vergrößertes Abbild der Laserlichtquelle 1 auf den Detektor 9 abgebildet wird.

Um den Detektor vor der hohen Intensität der Laserstrahlung, die nur während der Justierung der TIRF-Beleuchtung auf den Detektor trifft zu schützen, verfügt die abbildende optische Reflexionseinheit über ein zusätzliches Filter, welches vorzugsweise als Neutralfilter ausgebildet ist.

In einer weiteren zweckmäßigen Ausgestaltung wird die abbildende optische Reflexionseinheit und das Objektiv auf einem Objektiv-Revolver angeordnet. Dies hat den Vorteil, dass die Reflexionseinheit für den Justierung bzw. Kontrolle der TIRF-Beleuchtung schnell in den Strahlengang eingebracht werden kann und sofort die dafür erforderliche definierte Lage bezüglich der Austrittspupille des für die TIRF-Mikroskopie verwendeten Objektives aufweist. Da die Reflexionseinheit nur auf ein Objektiv abgestimmt werden kann, ist es auch möglich mehre Reflexionseinheiten für verschieden zur TIRF-Mikroskopie verwendbare Objektive auf dem Objektiv-Revolver anzuordnen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine einfache und schnelle Lösung zur Justierung der TIRF-Beleuchtung eines Mikroskops zur Verfügung gestellt. Eine Gefährdung des Bedienpersonals vor der hohen Intensität des Laserlichtes wird dadurch vermieden, dass kein Austritt von Laserstrahlung in den Raum möglich ist. Somit ist es für jeden Bediener möglich, die Fokussierung der TIRF-Beleuchtung zu kontrollieren bzw. entsprechend nach zu justieren.

Mit dem vorgeschlagenen Verfahren wird eine einfache und schnelle Justierung der Laserquelle, insbesondere zur TIRF-Beleuchtung bei hoher Sicherheit und Reproduzierbarkeit, unter Einhaltung der Laserschutzbedingungen ohne großen Aufwand gewährleistst.


Anspruch[de]
Verfahren zur Justierung einer Lichtquelle in einem Mikroskop, bei dem anstelle des Objektives eine abbildende optische Reflexionseinheit (6) an das Mikroskop angekoppelt wird, um das Licht der Lichtquelle so auf einen Detektor (9) abzubilden, dass eine Kontrolle der Fokusposition und/oder der Lage und/oder eine Justierung der Lichtquelle hinsichtlich der Fokusposition und/oder der Lage erfolgen kann. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die abbildende optische Reflexionseinheit (6) so bemessen ist, dass das Licht der Lichtquelle genau dann auf den Detektor (9) fokussiert wird, wenn die Lichtquelle auf die Austrittspupille (4) des Objektives fokussiert ist. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 und 2, bei dem als abbildende optische Reflexionseinheit (6) ein sammelnder Spiegel verwendet wird. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 und 2, bei dem als abbildende optische Reflexionseinheit (6) eine Linse bzw. Linsenanordnung (7) mit einem Reflexionselement (8) verwendet wird. Verfahren nach mindestens einem der vorgenannten Ansprüche, bei dem das Reflexionslement (8) eine ebene oder gekrümmte Fläche aufweisen kann. Verfahren nach mindestens einem der vorgenannten Ansprüche, bei dem das Reflexionslement (8) als eine spiegelnde Fläche auf der Linse bzw. Linsenanordnung (7) ausgeführt sein kann. Verfahren nach mindestens einem der vorgenannten Ansprüche, bei dem von der abbildenden optischen Reflexionseinheit (6) ein vergrößertes Abbild der Lichtquelle auf den Detektor (9) abgebildet wird. Verfahren nach mindestens einem der vorgenannten Ansprüche, bei dem das Licht der Lichtquelle über ein in der abbildenden optischen Reflexionseinheit (6) vorhandenes zusätzliches Filter abgeschwächt wird. Verfahren nach mindestens einem der vorgenannten Ansprüche, bei dem die abbildende optische Reflexionseinheit (6) und das Objektiv auf einem Objektiv-Revolver angeordnet sind. Verfahren nach mindestens einem der vorgenannten Ansprüche, bei dem mehre abbildende optische Reflexionseinheiten (6) und Objektive auf dem Objektiv-Revolver angeordnet sein können. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Lichtquelle eine Laserichtquelle (1) zur TIRF-Beleuchtung ist.






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