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Dokumentenidentifikation DE60031091T2 12.04.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001138759
Titel Verfahren zur Produktion einer mehrfach ungesättigte Fettsäure enthaltenden Kultur und eines mehrfach ungesättigte Fettsäure enthaltenden Öles unter Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Labyrinthula
Anmelder National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Tokio/Tokyo, JP
Erfinder Yokochi, Toshihiro, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-0035, JP;
Nakahara, Toro, Ryugasaki-shi, Ibaraki 301-0043, JP;
Yamaoka, Masakazu, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-0042, JP;
Kurane, Ryuichiro, Matsudo-shi, Chiba 270-0034, JP
Vertreter Anwaltskanzlei Gulde Hengelhaupt Ziebig & Schneider, 10179 Berlin
DE-Aktenzeichen 60031091
Vertragsstaaten DE, FR, GB
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 29.12.2000
EP-Aktenzeichen 002504611
EP-Offenlegungsdatum 04.10.2001
EP date of grant 04.10.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.04.2007
IPC-Hauptklasse C12N 1/10(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 1/26(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12P 7/64(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C10G 32/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12R 1/90(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines Mikroorganismus, der zur Gattung Labyrinthula gehört und die Fähigkeit aufweist, langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäuren zu erzeugen, in einem Verfahren zur Herstellung langkettiger, mehrfach ungesättigter Fettsäuren, die vorzugsweise eine Kohlenstoffzahl von 20 oder mehr und zwei oder mehr ungesättigte Bindungen aufweisen (eine mehrfach ungesättigte Fettsäure mit zwei oder mehr ungesättigten Bindungen wird hierin als "PUFA" bezeichnet, und die oben erwähnte mehrfach ungesättigte Fettsäure mit einer Kettenlänge von 20 oder mehr wird als "LCPUFA" bezeichnet). Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf den Mikroorganismus Labyrinthula sp S3-2, Zugangsnummer FERM BP-7090, und eine Kultur dieses Mikroorganismus.

Hintergrund der Erfindung

LCPUFAs wie z.B. Arachidonsäure (AA), Eicosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA) haben wegen ihrer verschiedenen physiologischen Aktivitäten und vor kurzem wegen ihrer Verwendung in funktionellen Nahrungsmitteln und auf dem pharmazeutischen Gebiet die Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Diese LCPUFAs sind jedoch im Allgemeinen in pflanzlichen Ölen überhaupt nicht enthalten, nur DHA und EPA werden in Fischölen wie etwa Sardinen- und Tunfischöl gefunden. Da verschiedene Komponenten von LCPUFAs charakteristische physiologische Funktionen haben, ist die Steuerung ihrer Zusammensetzungen und Inhaltsstoffe für die Anwendung auf verschiedenen Gebieten wichtig. Als Technik für diesen Zweck existiert jedoch nur ein Verfahren, bei dem Enzyme zur Konzentrierung und Reinigung von DHA aus Fischöl verwendet werden, und es gibt kein anderes Umwandlungsmittel zur Steuerung ihrer Zusammensetzung und ihres Gehalts. Unter diesen Umständen besteht die Notwendigkeit, eine Vielfalt von Vorratsquellen von LCPUFA enthaltendem Öl zu entwickeln, die eine charakteristische LCPUFA-Zusammensetzung haben. Eines dieser wichtigen Verfahren ist ein Herstellungsverfahren unter Verwendung von Mikroorganismen. Bis jetzt wird zur Herstellung von &ggr;-Linolensäure, Arachidonsäure und dergleichen, die im Allgemeinen in pflanzlichem Öl nicht vorliegen, ein Verfahren verwendet, das das Kultivieren von Mortierella und das Gewinnen von Öl, das diese PUFAs enthält, aus diesen Schimmelpilzen umfasst. Weiterhin wurden Verfahren entwickelt, bei denen Meeresmikroorganismen wie etwa Thraustochytrium oder Schizochytrium für die Herstellung von DHA verwendet werden, die eine LCPUFA und Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist.

In dem Fall, dass LCPUFA durch einen Mikroorganismus auf diese Weise erzeugt wird, ist ein Kultivierungsverfahren vielversprechend, bei dem Vorstufen-Fettsäuren oder Öle als Kohlenstoffquellen verwendet werden. Da die Verwendung eines Öles oder einer Fettsäure, die eine PUFA-Vorstufe ist, energetisch günstig ist, besteht die Möglichkeit, dass eine höhere Produktionseffizienz erhalten werden kann, als in dem Fall, dass Zucker wie Glucose als anfängliche Rohmaterialien verwendet werden. Durch Umwandlung bekannter pflanzlicher Öle, wie Sojaöl oder Palmöl, in PUFA-enthaltendes Öl kann der Mehrwert dieser Öle weiterhin stark erhöht werden. Es ist auch möglich, die physikalischen Eigenschaften, etwa den Siedepunkt, durch Änderung der Fettsäure-Zusammensetzung zu modifizieren.

Es ist seit langem bekannt, dass einige Mikroorganismen mit Öl als Kohlenstoffquelle kultiviert werden können. Es gibt viele Beispiele solcher Kulturen von Hefe und Bakterien und dergleichen. Der Zweck dieser Kulturen bestand jedoch primär in den Mikroben an sich, d.h., in Kulturen, die auf die Herstellung von Proteinen ausgerichtet sind. Es ist auch bekannt, dass Mortierella-Schimmelpilze befähigt sind, &agr;-Linolensäure, die eine in pflanzlichem Öl gefundene Komponente ist, in Eicosapentaensäure zu überführen.

Bis jetzt wurde jedoch kein Mikroorganismus gefunden, der befähigt ist, Öl oder Fettsäure als Kohlenstoffquelle in LCPUFA zu überführen, die eine Kohlenstoffzahl von 20 oder mehr und zwei oder mehr ungesättigte Bindungen aufweist, wie DHA. Selbst bei dem Herstellungsverfahren unter Verwendung von Mikroorganismen wie Thraustochytrium, die befähigt sind, DHA zu erzeugen, müssen Zucker wie Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet werden. In dem Fall, dass Öl oder Fettsäure als Kohlenstoffquelle verwendet wird – obwohl diese von den Mikroorganismen aufgenommen werden –, erfolgt kaum die Bildung einer ungesättigten Stelle oder eine Verlängerung der Kettenlänge. Obwohl eine Zunahme der gebildeten Mikroben erfolgt, ergibt sich der Nachteil, dass die Menge an erzeugter LCPUFA, darunter DHA, sehr stark verringert ist.

Weiterhin vermehrt sich Labyrinthula der vorliegenden Erfindung grundsätzlich nur an der festen Oberfläche eines Agar-Mediums und muss eine wirtstreue Kultur mit anderen Bakterien oder Hefe als Nahrung für die Subkultur sein. Da noch kein wirksames Verfahren zur Kultivierung gefunden wurde, das zur Herstellung von LCPUFA wie DHA verwendet werden kann, wurde bis jetzt kein Screenen nach einem Stamm mit hoher LCPUFA-Produktivität oder eine Untersuchung von Kulturbedingungen für die LCPUFA-Produktion durchgeführt.

Herkömmlicherweise gibt es weder Mikroorganismen, die sich mit Öl als Kohlenstoffquelle vermehren können, sowie das Öl, das von den Mikroorganismen aufgenommen wird, in LCPUFA, einschließlich DHA, überführen können, noch gibt es ein Verfahren zum Kultivieren eines solchen Mikroorganismus. Somit besteht die Aufgabe der Erfindung darin, Folgendes bereitzustellen: einen Mikroorganismus, der die Fähigkeit hat, pflanzliches Öl und dergleichen, das keine LCPUFA enthält, in Öl, das LCPUFA wie DHA enthält, zu überführen, ein Verfahren zum Kultivieren dieses Mikroorganismus und ein Verfahren zur Herstellung von LCPUFA enthaltendem Öl.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung untersuchten die ökologischen Eigenschaften usw. von Labyrinthula unter marinen Pilzen als einem Mikroorganismus, der LCPUFA wie DHA umfasst, und führten gleichzeitig Untersuchungen über ein Isolierung/Kultivierungsverfahren unter Ausnutzung dieser ökologischen Eigenschaften durch. Als Ergebnis in Bezug auf Labyrinthula, die sich schwierig auf wirksame und stabile Weise vermehren lässt, haben die Erfinder ein effizientes und selektives Isolationsverfahren von Labyrinthula aus einer Vielfalt von Isolierungsquellen, wie z.B. Tang und abgefallene Blättern von Mangroven gefunden, wobei das Verfahren das Anordnen von Probeblättern auf Agarmedium umfasst, auf dem Moraxella-Meeresbakterium verteilt und vermehrt wurde. Die Erfinder haben in Bezug auf dieses Verfahren bereits das Patent JP 2000060539 erhalten. Weiterhin untersuchten die Erfinder zur gleichen Zeit die Verwendung von Öl und dergleichen als Kohlenstoffquelle für ein Verfahren zur effizienten Herstellung von LCPUFA, darunter DHA, und sie untersuchten die Kultur mit Öl und dergleichen von verschiedenen marinen Pilzen, die DHA erzeugen können, darunter Labyrinthula, die aus verschiedenen Isolationsquellen erhalten wurde, zudem untersuchten sie das Screenen und die Kulturbedingungen eines Mikroorganismus, der die Fähigkeit hat, eine solche Kohlenstoffquelle in Öl zu überführen, das LCPUFA wie z.B. DHA enthält, wodurch die vorliegende Erfindung zu Ende gebracht wurde.

Das heißt, ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung eines Mikroorganismus, der zur Gattung Labyrinthula gehört, welcher mit Öl oder Fettsäure als Kohlenstoffquelle kultiviert werden kann und so über die Fähigkeit verfügt, eine langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure zu produzieren.

Labyrinthula sp S3-2 (Zugangsnummer FERM BP-7090) wird als konkretes Beispiel dieses Mikroorganismus bereitgestellt.

Weiterhin ist ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Kultur dieses Mikroorganismus sp S3-2, der zur Gattung Labyrinthula gehört, die durch Kultivieren des obigen Mikroorganismus in einem Medium erhalten werden kann, das Öl oder Fettsäure als Kohlenstoffquelle enthält.

Weiterhin ist ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung von Mikroorganismen, die zur Gattung Labyrinthula gehören, in einem Verfahren zur Herstellung einer langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäure, umfassend die Schritte der Kultivierung des obigen Mikroorganismus in einem Medium, das Öl oder Fettsäure als Kohlenstoffquelle enthält, und die Entnahme der langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäure aus der Kultur.

Weiterhin ist ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung von Mikroorganismen, die zur Gattung Labyrinthula gehören, in einem Verfahren zum Reformieren konventioneller Pflanzenöle durch Umwandlung des Öls in eine langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure durch Kultivieren eines Mikroorganismus der Gattung Labyrinthula mit Öl als Kohlenstoffquelle.

Die oben erwähnte langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure schließt Fettsäuren ein, die eine Kohlenstoffzahl von 20 oder mehr und zwei oder mehr ungesättigte Bindungen aufweisen, z.B. DHA.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung 1. Der bei der vorliegenden Erfindung zu verwendende Mikroorganismus

Der Mikroorganismus, der bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, ist ein isolierter Stamm von Labyrinthula, der durch das nachstehend beschriebene Verfahren gewonnen wurde, und er kann jeder Stamm sein, der sich mit Öl oder Fettsäure als Kohlenstoffquelle vermehrt und die Fähigkeit hat, diese in LCPUFA, darunter DHA, zu überführen.

Zu den Ölen als Kohlenstoffquelle gehören Sojaöl, Palmöl, Olivenöl, Saffloröl und dergleichen, und zu den Fettsäuren gehören gesättigte und ungesättigte Fettsäuren, wie Myristinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolsäure und dergleichen sowie Ester derselben wie z.B. Ethylester.

2. Verfahren zur Isolierung von Labyrinthula

Es ist bekannt, dass Labyrinthula in marinen Umgebungen von den Tropen bis zu den polaren Regionen weit verbreitet ist. Als Isolationsquellen können daher Meerwasser und verschiedene Tang- und Seegrasarten, wie Aalgras, die abgefallenen Blätter von Pflanzen, die an der Küste im Überfluss vorhanden sind, wie Mangrovenwälder, verschiedene benthonische Tiere, Holzstücke, Schlamm, verschiedenartige organische Materialien, die aus dem Meer oder an der Küste gesammelt werden, verwendet werden. In Anbetracht der Verteilungsdichte von Labyrinthula und der Vermehrungsaktivität des isolierten Stamms sind Blattfragmente von Aalgras, abgefallene Mangroven-Blätter von Bruguiera gymnorrhiza und dergleichen, die dem tropischen/subtropischen Meeresbereich entnommen werden, bevorzugte Isolationsquellen. Diese können als Isolationsquellen durch das nachstehend angegebene Verfahren gesammelt werden (siehe JP 2000060539).

i) Herstellung von Agar-Medium

Das Medium, das zur Isolierung und Kultur von Labyrinthula verwendet werden soll, wird wie folgt hergestellt: Ein Medium wird mit 0–10 g Glucose, Hefeextrakt, Pepton und dergleichen als geeigneter Nahrungsquelle und 5–20 g Agar in 1 l natürlichem Meerwasser oder künstlichem Meerwasser hergestellt, mit Dampf sterilisiert, in Petrischalen (Schalen eines Durchmessers von 9 cm werden oft verwendet) gegossen, etwa solche, die bei normalen Mikroorganismus-Kulturversuchen verwendet werden, und dann lässt man das Medium abkühlen und sich verfestigen. Die Konzentration des natürlichen Meerwassers oder des künstlichen Meerwassers kann auf 20–100% der Salzkonzentration von normalem Meerwasser eingestellt werden; zur Kultivieren von Labyrinthula-Mikroorganismen wird jedoch eine Konzentration von 50–90% bevorzugt.

ii) Auftragen von Bakterien auf das Agar-Medium

Um Labyrinthula effizient zu vermehren, wird ein Agarplatten-Medium der oben erwähnten Fähigkeit verwendet, auf das vorher zuerst Bakterien aufgetragen und kultiviert wurden. Die hierin verwendeten Bakterien sind vorzugsweise Meeresbakterien, von denen die Moraxella-Bakterien (z.B. Moraxella sp. LB004, die beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1–3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) am 25. Dezember 2000 mit der erhaltenen Zugangsnummer FERM BP-7412 hinterlegt wurde) repräsentative Meeresbakterien für das effiziente Wachstum von Labyrinthula sind. Wenn die Konzentration an Meerwasser, das zur Herstellung des Agarplatten-Mediums verwendet wird, 50% oder weniger beträgt, können auch Bakterien terrestrischen Ursprungs verwendet werden. Die aufzutragenden Bakterien werden in eine Kulturflüssigkeit eingeimpft, die zuvor mit Glucose (0,1%), Pepton (0,05%), Hefeextrakt (0,25%) in einer 50%igen Konzentration von künstlichem Meerwasser hergestellt wurde, und unter Rühren während einer Zeitspanne von 2 bis 7 Tagen bei einer Kulturtemperatur von 20–30°C kultiviert. Die Kultivierung wird unter Kulturbedingungen durchgeführt, die für die zu verwendenden Bakterien geeignet sind. Jeweils 100 &mgr;l dieser Bakterien-Kulturflüssigkeit werden unter sterilen Bedingungen auf Agarplatten-Medien geimpft, die in einer Petrischale hergestellt wurden. Die Flüssigkeit wird dann mit einem Conradi-Stab oder dergleichen über die Oberfläche des jeweiligen Mediums ausgebreitet oder 1 bis 5 Tage bei einer Kulturtemperatur von 20–30°C oder bei Raumtemperatur statisch kultiviert, um eine Vermehrung der Bakterien auf demselben zu ermöglichen. Diese werden dann zur Isolierung der nachstehenden Labyrinthula-Mikroorganismen verwendet.

Proben von Seegras, abgefallenen Mangrovenblättern oder dergleichen werden zu Bruchstücken von etwa 1 cm × 1 cm geschnitten, und danach wird die Oberfläche derselben mehrere Male mit sterilisiertem Wasser gewaschen. Nachdem die Oberflächen-Bakterien oder Pilzsporen und dergleichen von dem auf der Oberfläche adsorbierten Wasser so weitgehend wie möglich entfernt wurden, wird jedes Bruchstück in den Mittelpunkt des Agarplatten-Mediums gelegt, auf das die oben beschriebenen Moraxella-Bakterien aufgetragen und kultiviert wurden. Dieses Agarplatten-Medium wird dann 2 bis 7 Tage lang bei Raumtemperatur oder einer Kulturtemperatur von 20–30°C inkubiert, und das Vorliegen von Labyrinthula-Mikroorganismen wird mikroskopisch beobachtet. Labyrinthula-Mikroorganismen bestehen aus spindelförmigen Zellen einer Länge von etwa 10 &mgr;m, die zusammen wie Perlen aufgereiht sind oder einen Klumpen bilden, der (die) über dem Agarplatten-Medium ausgebreitet ist (sind), während sie eine gleitende Bewegung aufweisen. Durch diese Bewegung kann ein radiales Ausbreiten der Netzstruktur oder der Pilzhyphe von der Nachbarschaft der Probe her beobachtet werden, und oft innerhalb von 2 bis 5 Tagen reicht diese vom Mittelpunkt der Petrischale, wo die Probe aufgebracht wurde, bis zur Peripherie dieser Petrischale. Zu diesem Zeitpunkt treten verschiedene Bakterien, Schleimpilze, Hefen oder dergleichen, die von Labyrinthula verschieden sind, in der Probe auf, ihre Vermehrung wird aber durch die aufgetragenen Moraxella sp. eingeschränkt. Weiterhin wiederholen Labyrinthula-Mikroorganismen eine aktive Vermehrung innerhalb von Moraxella-Kolonien, die sich in einer Netzstruktur ausbreiten. Zellcluster der Netzstruktur, die nahe bis an den Rand der Petrischale reichen, werden zusammen mit dem Agarmedium (etwa 5 mm × 5 mm) abgeschnitten und wiederum in den Mittelpunkt des Agarplatten-Mediums übertragen, wo Moraxella-Bakterien aufgetragen/kultiviert wurden. Noch einmal wird dieses Agarplatten-Medium 2 bis 7 Tage lang bei Raumtemperatur oder bei 20–30°C inkubiert. Durch dieses Verfahren oder durch Wiederholen dieses Verfahrens wird eine Isolierung von Labyrinthula ermöglicht. Dieser isolierte Mikroorganismus ist jedoch eine wirtstreue Kultur mit Moraxella-Bakterien und dergleichen.

iii) Eigenschaften der wirtstreuen Kultur

Diese wirtstreue Kultur wird leicht in einem Agarplatten-Medium gereinigt, das eine geeignete Menge an Antibiotika wie z.B. Chloramphenicol enthält. Labyrinthula in seiner gereinigten Form hat jedoch eine extreme geringe Reproduktivität auf einem Agarplatten-Medium, zu dem Pferdeserum (1%) gegeben wurde, es kann eine gewisse Vermehrung beobachtet werden, die Beibehaltung des kultivierten Stamms in Form eines reinen Stammes und die Subkultivierung sind schwierig. Wenn man andererseits ein Agarplatten-Medium verwendet, auf das bereits Meeresbakterien wie Moraxella sp. aufgetragen wurden, kann eine äußerst gute Vermehrung und Aktivität der Pilze beibehalten werden.

3. Eigenschaften von Labyrinthula

Labyrinthulen haben die folgenden mykologischen Eigenschaften und können von anderen Mikroorganismen durch mikroskopische Beobachtung ihrer Form und Bewegung leicht unterschieden werden.

Die vegetativen Zellen von Labyrinthula haben eine charakteristische Spindelform, und ihr ektoplasmatisches Netzwerk weist eine gleitende Bewegung auf. Zwei taxonomische Ordnungen höher ist Labyrinthulomycota, die aus den Familien Labyrinthulaceae und Thraustochytriceae bestehen. Es wurde berichtet, dass Labyrinthulaceae eine Gattung Labyrinthula enthält, während Thraustochytriceae 7 Gattungen enthält wie z.B. Thraustochytrium und Schizochytrium (Handbook of Protoctista, David Porter, 1990). Weiterhin sind die vegetativen Zellen von Thraustochytriceae kugelförmig oder eiförmig und lassen sich leicht von der charakteristischen Spindelform von Labyrinthula unterscheiden. Diese Labyrinthulomycota, die zuvor als Pilze klassifiziert wurden, existieren weit verbreitet in marinen Umgebungen und vermehren sich heterotroph und sind als marine Pilze bekannt. Von diesen wurden Thraustochytriceae als Oomycota klassifiziert, während Labyrinthulaceae Myxamycota sind. Diese Labyrinthulomycota haben jedoch im Allgemeinen einen Lebenszyklus, der Zoosporen umfasst, die zwei Geißeln unterschiedlicher Länge und Form aufweisen, und dieselben wurden kürzlich aufgrund der Struktur dieser Zoospore oder genetischer-phylogenetischer Analysen den Heterokontae von Chromophyta zugeordnet.

4. Hinterlegter Stamm

Ein isolierter Stamm, der für die vorliegende Erfindung charakteristisch ist, ist der Labyrinthula sp. S3-2 Stamm, der durch das oben beschriebene Verfahren aus abgefallenen Blättern von Bruguiera gymnorrhiza isoliert wurde, die auf Ishigaki Island gesammelt wurden, und der im National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) am 14. März 2000 hinterlegt wurde und die Zugangsnummer FERM BP-7090 erhielt.

Zu den weiteren isolierten Stämmen zählen Labyrinthula sp 714-2, P11-1, P28-1, P37-1, P38-2 und P47-1.

Weiterhin sind die Mikroorganismen, die zum Reformieren von Öl der vorliegenden Erfindung verwendet werden, nicht auf das oben erwähnte PERM BP-7090 beschränkt, sondern es können beliebige Stämme mit mykologischen Eigenschaften, die im Wesentlichen mit den oben beschriebenen Labyrinthula identisch sind, verwendet werden. LCPUFA enthaltendes Öl kann durch Kultivieren eines solchen Mikroorganismus mit Öl oder einer Fettsäure als Rohmaterial erhalten werden, und nachdem eine Anreicherung von LCPUFA wie z.B. DHA in dieser Struktur ermöglicht wurde, kann Öl aus dieser Kultur gewonnen werden.

5. Ölplattenmedium

Für eine Labyrinthula-Kultur, die Öl oder eine Fettsäure als Rohmaterial aufweist, wird ein Medium der Medium-Zusammensetzung, die zur Isolierung/Kultivierung von Labyrinthula verwendet wurde, hergestellt, durch Dampf sterilisiert, und dann wird eine Fettsäure wie Ölsäure oder Linolsäure oder Öl wie Sojaöl oder Palmöl zu dem Medium in einer Menge von 1 g bis 20 g pro Liter gegeben, und dieselben werden unter Verwendung eines Ultraschallgeräts oder dergleichen im Medium emulgiert und dispergiert. Das Produkt wird dann in Petrischalen gegossen, um ein Agarplatten-Medium zu bilden. Als Fettsäure oder Öl können, abgesehen von den hierin angegebenen Beispielen, eine gesättigte oder ungesättigte Fettsäure wie Stearinsäure, Myristinsäure oder &agr;-Linolensäure oder Ester derselben wie Ethylester und natürliche pflanzliche Öle wie Olivenöl oder Saffloröl oder synthetische Triglyceride wie Triolein verwendet werden. Um das Dispergieren des Öls usw. in dem Medium zu erleichtern, ist es wirksam, zuerst eine geeignete Menge an Tensid, wie Tween-80, zu dem Medium zu geben. Weiterhin können als Stickstoffquellen, die dem Medium zugefügt werden sollen, organische Stickstoffquellen wie Maisquellwasser, Harnstoff, Natriumglutamat und anorganische Stickstoffquellen wie Ammoniumacetat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat anstelle des oben erwähnten Hefeextrakts und Peptons verwendet werden. Als anorganisches Salz kann Kaliumphosphat und dergleichen zweckmäßigerweise eingebracht werden. Weiterhin können anstelle von Glucose Zucker wie Fructose, Saccharose oder dergleichen oder auch Glycerin verwendet werden.

6. Kultivierungsverfahren

Moraxella sp., die bereits in einem bekannten flüssigen Medium kultiviert wurden, welches mit Glucose und Pepton hergestellt wurde, das für Bakterien brauchbar ist, z.B. ein flüssiges Medium, das mit Glucose (0,1%), Pepton (0,05%), Hefeextrakt (0,025%) in künstlichem Meerwasser einer Salzkonzentration von 50% hergestellt wurde, wurden (zuerst) auf ein Öl oder Fettsäure enthaltendes festes Medium aufgetragen und kultiviert, das wie oben hergestellt wurde, oder selbst wenn die Bakterien zum Zeitpunkt der Impfung von Labyrinthula aufgetragen werden, ist der Effekt gleichwertig. Unter Verwendung des Isolierungs-/Kultur-Mediums, auf das Moraxella sp. aufgetragen wurde und in dem sich Labyrinthula ausreichend vermehrt hat, wird eine Netzstruktur der Labyrinthula-Ausbreitung ausgeschnitten (etwa 5 mm × 5 mm) und in den Mittelpunkt des ölhaltigen Mediums gelegt und 3 bis 14 Tage bei einer Kulturtemperatur von 15–30°C inkubiert. Labyrinthula weist zuerst eine Ausbreitung der Netzstruktur oder der Pilzhyphe von dem geimpften Ursprung in der Moraxella-Kolonie auf, jedoch zeigt sich auf der ölhaltigen Platte ein weiteres Eindringen in Agar und eine aktive Vermehrung in demselben. Als Ergebnis nimmt die Transparenz der weißlich emulgierten, ölhaltigen Platte allmählich zu, verbunden mit der Vermehrung von Labyrinthula. Es wird angenommen, dass dies auf die Aufnahme des Öls, das in dem Agar emulgiert und dispergiert ist, in die Zellen von Labyrinthula zurückzuführen ist.

7. Kulturprodukt

Das Agarmedium, in dem die Kultur während der vorgeschriebenen Zeitspanne durchgeführt wurde, setzt sich mit Labyrinthula zu, die sich unter Nutzung des Öls vermehrt haben. Öl, das in dem gesamten Medium dispergiert wurde, wird von den Mikroorganismen aufgenommen und danach in LCPUFA überführt und sammelt sich in den Mikroorganismen an.

Der Ölgehalt und der LCPUFA-Gehalt des Agarplatten-Mediums, die das Produkt dieser Kultur sind, werden durch Ausschneiden von Agar-Fragmenten, auf denen sich Labyrinthula vermehrt hat, bestimmt, und eine Analyse der Fettsäure-Zusammensetzung wurde durch einen Chromatographen mittels gebräuchlicher Verfahren durchgeführt.

8. Gewinnung des Öls

Um Öl, das LCPUFA enthält, aus dieser Kultur zu gewinnen, kann nach dem Zertrümmern der Zellen durch Ultraschall oder eine Dyno-Mühle eine Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel wie z.B. Hexan oder Chloroform oder dergleichen durchgeführt werden.

Der Ölgehalt betrug 1–25 Gew.-% pro 1 g Agar (Nassgewicht), und der LCPUFA-Gehalt des Öls betrug 1–25%. Die Zusammensetzung von LCPUFA umfasst Arachidonsäure (AA, 20:4) und Eicosapentaensäure (EPA, 20:5) mit einer Kohlenstoffzahl von 20 sowie Docosatetraensäure (DTA, 22:4), Docosapentaensäure (DPA, 22:5), Docosahexaensäure (DHA, 22:6) mit einer Kohlenstoffzahl von 22. LCPUFA lag nicht in dem Öl vor, das als Rohmaterial verwendet wurde, und wurde durch Labyrinthula gebildet. Diese Produkte wurden überhaupt nicht gebildet, wenn Moraxella sp. nur ausgestrichen und kultiviert wurde.

Beispiele

Nachstehend wird die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen ausführlicher beschrieben.

Beispiel 1

Unter Verwendung von Labyrinthula sp. S3-2 wurde eine Kultur in einem Agarplatten-Medium durchgeführt, zu dem verschiedene Fettsäuren oder Öle gegeben wurden. Das Agarplatten-Medium wurde hergestellt, indem man 2,0 g Glucose, 1,0 g Polypepton, 0,5 g Hefeextrakt und 15,0 g Agar in 1 l künstlichem Meerwasser einer Konzentration von 50% löste, mit Dampf sterilisierte und nach der Zugabe von 4,5 g Fettsäure wie z.B. Ölsäure, Linolsäure, &agr;-Linolensäure oder Sojaöl jeweils 10 ml in Petrischalen einer Größe von 9 cm aufteilte. Auf das auf diese Weise hergestellte Agarplatten-Medium wurden 100 &mgr;l Kulturflüssigkeit von Moraxella sp., Stamm LB004, aufgetragen, und eine Kultivierung wurde 3 Tage lang bei Raumtemperatur durchgeführt, wodurch das mit Moraxella sp. versehene Medium hergestellt wurde. Die Kulturflüssigkeit von Moraxella sp. war eine solche, die 4 Tage lang in einem Medium kultiviert wurde, das durch Zugabe von 2,0 g Glucose, 1,0 g Polypepton und 0,5 g Hefeextrakt zu 1 l künstlichem Meerwasser einer Konzentration von 50% hergestellt wurde. Der isolierte Labyrinthula-Stamm S3-2 wurde in den Mittelpunkt dieses mit Moraxella-Bakterien beschichteten Mediums gelegt und 11 Tage bei Raumtemperatur kultiviert. Nach der Kultivierung wurde ein Anteil von etwa 2 cm × 2 cm des Agarplatten-Mediums ausgeschnitten und in ein Schraubröhrchen überführt, 3 Stunden bei 105°C getrocknet, wonach das Öl durch normale Verfahren direkt extrahiert oder ein Fettsäuremethylester hergestellt wurde, und dann wurde die Konzentration an LCPUFA bestimmt. Mit anderen Worten: die trockene Kultur wurde in Schraubröhrchen gegeben, 10% Salzsäure in Methanol und Dichlormethan wurden zugegeben, und es wurde 3 Stunden in einem warmen Bad von 60°C erwärmt, und nach der Fettsäure-Methylveresterung der Öl-Komponente in der Zelle wurde diese Komponente mit n-Hexan extrahiert. Unter Verwendung eines Gaschromatographen wurde die gesamte Fettsäure-Zusammensetzung des Fettsäuremethylesters analysiert, und der Gehalt und die Zusammensetzung der LCPUFA-Komponente wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 aufgeführt. Die Ergebnisse für jede LCPUFA-Komponente wurden durch Vergleich mit einer Kontrollsubstanz durch GC/MS-Analyse identifiziert.

Labyrinthula sp. S3-2 vermehrte sich gut auf jeder der Fettsäuren oder Öle, die in den Versuchen verwendet wurden, es erfolgte nicht nur eine Vermehrung auf der Oberfläche des Agarmediums, sondern es wurde auch eine Ausbreitung in dem Agarmedium beobachtet. Zu Beginn der Kultur war das Agarmedium wegen der Fettsäure und des Öls, die im gesamten Medium dispergiert waren, zuerst trübweiß, seine Transparenz nahm aber zu, als sich Labyrinthula vermehrte. Die Vermehrung der Mikroben in dem Medium wurde durch mikroskopische Beobachtung bestätigt, die darauf hinweist, dass Labyrinthula das dispergierte Öl verbrauchte. Die Ergebnisse der Gaschromatographie-Analyse bestätigten, dass die Fettsäure, die nicht in dem dispergierten Öl vorlag, gebildet wurde, und dass LCPUFA derselben zwischen 18,3% und 19,2% der gesamten Fettsäuren erreichte. Die hauptsächliche LCPUFA waren DHA und DPA, wenn verschiedene Typen von Fettsäure verwendet wurden, deren vereinigte Konzentration eine hohe Konzentration von etwa 90% erreichte. In dem Fall, dass Sojaöl verwendet wurde, waren entsprechend DHA und DPA die hauptsächlichen Komponenten, der Anteil an Arachidonsäure nahm aber zu.

  • *AA: 20:4 (n-6), EPA: 20:5 (n-3), DTA: 22:4 (n-6), DPA: 22:5 (n-6), DHA: 22:6 (n-3)

Beispiel 2

Unter Medium-Bedingungen wie im Beispiel 1 unter Verwendung von Sojaöl wurden Kulturen unter der Bedingung dargestellt, dass nur Moraxella sp. aufgetragen wurden (M), der Bedingung, dass Moraxella sp. nicht aufgetragen wurde und nur Labyrinthula geimpft wurde (Laby) und der Bedingung, dass beide verwendet werden (M + Laby), um den Effekt von Moraxella sp. aufzuklären. Nach dem Kultivieren während einer Zeitspanne von 16 Tagen bei Raumtemperatur wurde eine Analyse unter den im Versuch 1 aufgeführten Analyse-Bedingungen durchgeführt.

Sojaöl enthält keine LCPUFA, wie in der Tabelle 2 gezeigt wird; wenn nur Moraxella sp. eingeimpft wurde, wurde keine LCPUFA nachgewiesen. Wenn nur Labyrinthula in Kontakt gebracht wurden, wurde eine DHA einschließende LCPUFA gebildet, wenn jedoch Labyrinthula zusammen mit Moraxella sp. verwendet wurden, wurde eine DHA einschließende C20-22-LCPUFA aus der Ölsäure (18:1) oder Linolsäure (18:2), die in dem Sojaöl enthalten sind, in beträchtlichem Maße gebildet, was darauf hinweist, dass die Umwandlung in LCPUFA tatsächlich gefördert wurde.

Beispiel 3

Verschiedene Stämme von Labyrinthula, die aus abgefallenen Mangrovenblättern isoliert wurden, die an verschiedenen Stellen von Ishigaki-jima Island, Ogasawara Island und Palau Islands gesammelt wurden, wurden 11 Tage in dem Medium kultiviert, das die in Beispiel 1 gezeigte Zusammensetzung aufwies, wobei das verwendete Öl Sojaöl war. Nach der Kultivierung wurde ein Anteil von etwa 2 cm × 2 cm des Agarplatten-Mediums ausgeschnitten, und eine Analyse der LCPUFA in den Mikroben und einschließlich des Öls in dem Medium wurde durchgeführt. Diese Ergebnisse sind in der Tabelle 3 aufgeführt.

  • *AA: 20:4 (n-6), EPA: 20:5 (n-3), DTA: 22:4 (n-6), DPA: 22:5 (n-6), DHA: 22:6 (n-3)

Jeder der isolierten Stämme von Labyrinthula wies eine gute Vermehrung in Sojaöl auf. Ein Wert vom 9,0–14,0% wurde als LCPUFA-Konzentration in der gesamten Fettsäure erhalten, was darauf hinweist, dass die LCPUFAs mit einer Kohlenstoffzahl von 20 bis 22, einschließlich DHA, aus einer Fettsäure mit einer Kohlenstoffzahl von 16 oder 18, die in Sojaöl enthalten ist, in beträchtlichem Maße gebildet wurden.

Beispiel 4

Unter den gleichen Medium-Bedingungen wie im Beispiel 1 wurden Medien mit unterschiedlicher Sojaöl-Konzentration hergestellt, und die Kultivierung des Stamms S3-2 wurde durchgeführt. Unter den Bedingungen von Versuch Nr. 304 bis 306 wurde 1 ml/l Tween-80 als Tensid zugegeben, um das Dispergieren von Sojaöl in dem Medium zu fördern. Unter den Kulturbedingungen von 7 Tagen bei Raumtemperatur und den Bedingungen des Versuchs Nr. 306, der die höchste Konzentration an Sojaöl aufwies, wurde eine Kultur während einer Zeitspanne von 14 Tagen durchgeführt. Die Analyse der Konzentration an Sojaöl, die in dem Medium enthalten ist, und der Menge an LCPUFA, die während der Kultivierung gebildet wurde, wurden aus der Peakfläche des gesamten Fettsäuremethylesters durch Gaschromatographie mit Arachidonsäure (20:0) als innerer Standard bestimmt. Nach der Herstellung des Mediums betrug die Konzentration an Sojaöl 1,1 mg bis 22,8 mg pro 1 g des nassen Agarmediums. Die Ergebnisse der Kultur sind in der Tabelle 4 aufgeführt, und die Zusammensetzung von LCPUFA ist in der Tabelle 5 aufgeführt.

  • * Sojaöl-Konzentration: Konzentration (mg) an Sojaöl, die in 1 g nassem Agarmedium enthalten ist.
  • ** Menge an erzeugtem LCPUFA: Gesamtmenge an LCPUFA, die in 1 g nassem Agarmedium nach der Kultivierung enthalten ist.
  • *** LCPUFA-Gehalt: Gehalt an LCPUFA in Gesamt-Fettsäuren.

Die Menge an LCPUFA, die mit der 7-Tage-Kultur hergestellt wurde, erhöhte sich bei der Zunahme der Sojaöl-Konzentration, sie war aber bei einer Sojaöl-Konzentration von 22,8 mg geringer. Andererseits wurde der höchste Wert des LCPUFA-Gehalts von 21,6% unter der Bedingung der niedrigsten Sojaöl-Konzentration erhalten. Indem man die Kultur während einer Zeitspanne von 14 Tagen mit einer Sojaöl-Konzentration von 22,8 mg durchführte, betrug die erzeugte LCPUFA-Menge 0,76 mg/g-Agar, was in etwa das Doppelte der Menge darstellte, die mit einer 7-Tage-Kultur erhalten wurde und der höchste erhaltene Wert war. Weiterhin zeigte die LCPUFA-Zusammensetzung auch, dass eine Umwandlung in Fettsäuren mit einer längeren Kettenlänge und einem höheren Grad an Nichtsättigung, wie DPA und DHA, mit der Kultivierungszeitspanne zunahm.

Wie oben ausführlich beschrieben, stellt die vorliegende Erfindung ein effizientes Verfahren zum Kultivieren von Labyrinthula bereit, für die bisher kein effektives Kultivierungsverfahren bekannt war. Durch dieses Verfahren kann ein ölhaltiges Produkt, das eine langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure mit einer Kohlenstoffzahl von 20 oder mehr und zwei oder mehr ungesättigten Bindungen wie z.B. Docosahexaensäure umfasst, oder ein Öl, das diese langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure enthält, auf wirksame Weise aus pflanzlichem Öl und Fettsäure usw. hergestellt werden. Weiterhin kann die vorliegende Erfindung als neuartiges Verfahren zum Reformieren von Öl verwendet werden, das pflanzliches Öl und dergleichen in hochwertiges Öl überführt, das langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäuren enthält.


Anspruch[de]
Labyrinthula sp. S3-2 mit der Zugangsnummer FERM BP-7090. Kultur eines Mikroorganismus, der zur Gattung Labyrinthula gehört, die erhalten werden kann durch Kultivieren von Labyrinthula sp. S3-2 nach Anspruch 1 in einem Medium, das Öl oder Fettsäure als Kohlenstoffquelle enthält. Verwendung eines Mikroorganismus, der zur Gattung Labyrinthula gehört, in einem Verfahren zur Herstellung einer langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäure durch Kultivieren des Mikroorganismus in einem Medium, das Öl oder Fettsäure als Kohlenstoffquelle enthält, und Entnehmen der langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäure aus der Kultur. Verwendung nach Anspruch 3, wobei die langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure eine Kohlenstoffzahl von 20 oder mehr und zwei oder mehr ungesättigte Bindungen aufweist. Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, wobei der Mikroorganismus Labyrinthula sp. S3-2 nach Anspruch 1 ist. Verwendung eines Mikroorganismus, der zur Gattung Labyrinthula gehört, in einem Verfahren zum Reformieren von Öl durch dessen Überführung in eine langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure durch Kultivieren des Mikroorganismus mit dem Öl als Kohlenstoffquelle. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure eine Kohlenstoffzahl von 20 oder mehr und zwei oder mehr ungesättigte Bindungen aufweist. Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei der Mikroorganismus Labyrinthula sp. S3-2 nach Anspruch 1 ist.






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