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Dokumentenidentifikation DE69636013T2 12.04.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0000840895
Titel VERFAHREN ZUM ERLANGEN VON REZEPTOR-FREIGABELIGAND (RELAND)-KOMPLEXEN UND TESTANSÄTZE
Anmelder Serex Inc., Maywood, N.J., US
Erfinder FITZPATRICK, Judith, Tenafly, NJ 07670, US;
LENDA, Regina, Wesley Hills, NY 10977, US
Vertreter Andrae Flach Haug, 83022 Rosenheim
DE-Aktenzeichen 69636013
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 19.06.1996
EP-Aktenzeichen 969233337
WO-Anmeldetag 19.06.1996
PCT-Aktenzeichen PCT/US96/10566
WO-Veröffentlichungsnummer 1997001097
WO-Veröffentlichungsdatum 09.01.1997
EP-Offenlegungsdatum 13.05.1998
EP date of grant 05.04.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.04.2007
IPC-Hauptklasse G01N 33/535(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse G01N 33/536(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   G01N 33/58(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   G01N 33/72(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   G01N 33/94(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Gewinnung stabiler Komplexe aus einem Rezeptor und einem Freisetzungsliganden (der hier als „Reland" bezeichnet wird, wie weiter unten definiert werden wird) sowie Verfahren zu ihrer Verwendung. Sie betrifft Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens eines Analyten in einer Probe. Im Einzelnen betrifft sie homogene Flüssigphasen- und heterogene Flüssigphasen/Festphasen-Freisetzungsassays, die hochspezifisch und empfindlich sind. Die erfindungsgemäßen Verfahren erhöhen deutlich die Empfindlichkeit, die Spezifität und den dynamischen Bereich von Assays für Analyten, und sie verringern die Dauer und die Komplexität derartiger Assays.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Immunoassays nützen die spezifischen Bindungsfähigkeiten von Antikörpern oder Antigenen für den Nachweis des Vorliegens von Zielmolekülen in einer Probe aus. Das allgemeine Prinzip ist zwar auf einen weiten Bereich von Problemen anwendbar, aber das kommerzielle Interesse hat sich vor allem auf medizinische diagnostische Anwendungen für eine große Vielzahl von Analyten in biologischen Flüssigkeiten, wie Blut, Speichel und Urin, konzentriert.

Es gibt bereits verschiedene Typen von Immunoassays, die für unterschiedliche Anwendungen nützlich sind. Bei jedem dieser Assaytypen muss auf irgendeine Weise unterschieden werden, ob die Bindungsstellen eines Antikörpers besetzt oder frei sind. Typischerweise erfolgt das mit Hilfe einer Markierung, wie eines Atoms, Moleküls, Enzyms oder Teilchens, das dauerhaft entweder am Antikörper oder am Analyten oder an einem Analogen des Analyten befestigt ist.

Die Empfindlichkeit und die Spezifität sind Schlüsselparameter eines Immunoassays. Die Spezifität bezieht sich in erster Linie auf die Bindungsstelle des Antikörpers für das Antigen, die von der Auswahl von Genabschnitten des variablen Bereichs abhängt und unabhängig von der Assaykonfiguration ist. Die Empfindlichkeit bezieht sich in erster Linie auf die Affinität des Antikörpers für seinen Liganden und auf die inhärente Nachweisbarkeit der Markierung. Zum Beispiel können Radioisotopen, die für den Radioimmunoassay eingesetzt werden, in beträchtlich niedrigeren Konzentrationen nachgewiesen werden als fluoreszierende Moleküle. Enzymmarkierungen sind in Konzentrationen nachweisbar, die denjenigen der fluoreszierenden Markierungen ähnlich sind. Wenn Substrate, die fluoreszierende oder chemilumineszierende Produkte bilden, zusammen mit Enzymmarkierungen eingesetzt werden, ist die Empfindlichkeit der resultierenden Immunoassays mit der von solchen, die Radioisotopenmarkierungen einsetzen, vergleichbar oder noch höher.

Bis heute sind Immunoassays für Diagnostika zwei grundsätzlichen Kategorien zuzurechen: Sandwich-Immunoassays, die das Vorliegen eines Analyten indirekt messen, indem sie ihn zwischen zwei Antikörpern „fangen", und kompetitive Immunoassays, bei denen der Analyt mit einem markierten Liganden um die Bindung an den Antikörper konkurriert. Diese Assaytechniken haben jedoch Nachteile. Der Sandwich-Immunoassay erfordert es, dass der Analyt groß genug ist, die Bindung an zwei Antikörper zu ermöglichen, und er ist somit besser für größere Analyten, wie Proteine, geeignet. Kompetitive Assays, bei denen ein Analyt und ein Ligand vergleichbare Bindungsaffinitäten für den Antikörper besitzen, hängen in erster Linie vom Massenwirkungsgesetz ab, und deshalb fehlt es ihnen an Empfindlichkeit, oder der dynamische Bereich ist klein, oder es ist beides der Fall. Wenn sich die Affinitäten des Analyten und des Liganden für den Antikörper beträchtlich unterscheiden, wird der Assay zu empfindlich gegenüber Matrixeffekten, da die mit niedrigerer Affinität erfolgende Bindungswechselwirkung stärker durch Variablen wie die Temperatur, den pH, die Salzkonzentration und das Vorliegen denaturierender Agenzien (z.B. im Urin) beeinflusst wird.

Viele herkömmliche Assaytechniken werden insofern als kompetitiv angesehen, als der Analyt und die markierte Komponente vergleichbare Affinitäten für die Antikörperbindungsstelle aufweisen. Ein Beispiel für ein derartiges kompetitives Verfahren findet sich im US-Patent Nr. 3 817 837 an Rubenstein und Ullman, das eine Technik beschreibt, bei der ein Analyt und ein Enzym:Ligand-Konjugat um Bindungsstellen eines Antikörpers konkurrieren. Da die Bindung des Antikörpers an das Enzym:Ligand-Konjugat dessen Enzymaktivität verändert, kann die vorliegende Konzentration des Analyten über die Messung der Geschwindigkeit, mit der eine solche Mischung das Substrat in das Produkt überführt, bestimmt werden.

Eine Abwandlung der kompetitiven Assays ist der dissoziative Assay, der einen vorgeformten Komplex aus Antikörper und Ligand mit einer hohen Dissoziationskonstante einsetzt, und bei dem es nach der Dissoziation des Liganden vom Antikörper zur Konkurrenz kommt. Für diesen Typ von Assays wurde nicht berichtet, dass er irgendwelche signifikanten Vorteile gegenüber herkömmlichen kompetitiven Assays hat. Die derzeitigen dissoziativen Assays, wie bestimmte Fluoreszenzpolarisationsassays, stellen keinen stabilen, vorgeformten Immunkomplex bereit, sondern bei ihnen muss der Ligand mehrere Minuten vor dem Analyten zum Antikörper zugesetzt werden, was eine erhöhte Komplexität zur Folge hat.

Immunoassays können ferner als homogen oder heterogen charakterisiert werden. Bei einem heterogenen Verfahren ist die Markierung sowohl im gebundenen als auch im ungebundenen Zustand nachweisbar. Um ein aussagekräftiges Assayergebnis zu erhalten, ist die physikalische Trennung des gebundenen vom nicht gebundenen Antikörper erforderlich. Eine übliche Strategie zur Erzielung dieser Trennung umfasst die Bindung der Markierung an eine feste Phase, die vor dem Nachweisschritt physikalisch von der flüssigen Phase abgetrennt werden kann. Ein typischer heterogener Assay ist der CotiTraq®-ELISA-Kit von Serex Inc., Maywood, New Jersey, für den Nachweis von Cotinin im Urin.

Bei einem homogenen Verfahren unterscheidet sich die nachweisbare Eigenschaft der Markierung von Haus aus in Abhängigkeit davon, ob sie an den Antikörper gebunden ist oder nicht. Im gebundenen Zustand hat die Markierung eine größere oder eine geringere Signalintensität. Üblicherweise führt die Bindung des Antikörpers an den markierten Liganden zu einer Abnahme der Signalintensität, z.B. wenn die Markierung ein Enzym ist. Zu typischen Produkten in dieser Kategorie gehören die EMIT®-Reihe der Enzymimmunoassays von Syva Company, Palo Alto, Kalifornien, und die TDX-Reihe der Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays von Abbot Diagnostics, Chicago, Illinois.

Zwei weitere Charakteristika von Immunoassays sind besonders bemerkenswert. Diese sind die minimale Konzentration des Analyten, die nachgewiesen werden kann, und der dynamische Bereich des Nachweises. Der dynamische Bereich ist der Bereich der Analytenkonzentrationen, innerhalb dessen sich das Signal einer Markierung von Null bis zum Maximum ändert. Die Reihenfolge, in der die Probe, der Antikörper und eine markierte Komponente zusammengegeben werden, kann beide dieser Schlüsselparameter signifikant beeinflussen, indem sie das Ausmaß der Bindung der markierten Komponente beeinflusst, was wiederum den Nachweis der Markierung beeinflusst.

Bei bestimmten bekannten Assayverfahren werden der Antikörper und der Analyt vor der Zugabe der markierten Komponente zusammengegeben. Bei anderen werden der Analyt und die markierte Komponente vor der Zugabe des Antikörpers zusammengegeben. Jeder dieser Fälle erfordert die Bereitstellung zweier getrennter Reagenzien, die zusammengegeben werden, wobei die Probe den Analyten enthält. Die Abhängigkeit von zwei derartigen getrennten Reagenzien kann unbequem sein und zu einer umständlicheren, komplexeren Methode führen. Weiterhin kann, da eine genaue Volumenbestimmung eines jeden Reagens kritisch für eine gute Testdurchführung ist, die Notwendigkeit zweier Dosierschritte zu Fehlern führen, die zu verzerrten Ergebnissen führen können.

Ein Verfahren zur Verbesserung der Assaygenauigkeit und damit zur Erhöhung der Assayempfindlichkeit besteht darin, einen vorgemischten Komplex aus dem Antikörper und der markierten Komponente bereitzustellen. Das ist jedoch problematisch, weil man allgemein findet, dass die Bindungsreaktion unter den meisten Testbedingungen praktisch irreversibel ist. Somit kommt es, wenn ein Komplex aus dem vorgeformten markierten Analyten und dem Antikörper mit einer Lösung, die den Analyten enthält, vereinigt wird, innerhalb eines vernünftigen Zeitrahmens (Minuten) nicht zu einer nennenswerten Verdrängung der gebundenen Markierung.

WO 93/03367 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines Analyten in einer Probe mittels eines Rezeptor-Liganden-Komplexes.

Hinds et al. (1984) Chin. Chem. 30, 1174–1178, betrifft einen Enzymimmunoassay zur Bestimmung von Theophyllin im Serum.

GB 2 078 370 A betrifft ein Verfahren zur Durchführung eines Bindungsassays. EP 0 077 896 A betrifft Theophyllinderivate, Antikörper gegen Theophyllin und ihren Einsatz in Immunoassays.

WO 95/16026 betrifft Reagenzien und Verfahren zum Nachweis von Methotrexat.

US 4 434 236 betrifft einen Immunoassay.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es werden Verfahren zur Gewinnung von Rezeptor:Reland-Komplexen durch die Erfindung bereitgestellt. Der Begriff „Reland" ist ein geprägtes Wort, das Freisetzungsligand bedeutet. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass ein gemäß dieser Erfindung ausgewählter Reland dazu gebracht werden kann, einen Komplex mit einem Rezeptor zu bilden und dem Rezeptor:Reland-Komplex Eigenschaften zu verleihen, die nach dem Stand der Technik bisher nicht beschrieben wurden. Die erhaltenen Komplexe sind stabil, d.h. praktisch irreversibel, in Abwesenheit des Analyten, aber überraschenderweise sind sie, wenn sie mit dem Analyten in Kontakt gebracht werden, praktisch vollständig instabil, was zur schnellen Freisetzung des Relanden führt. Die Freisetzung des Relanden aus dem stabilen Rezeptor:Reland-Komplex in Gegenwart des Analyten ist der zentrale Punkt der Erfindung. Der Reland kann in monomerer oder multimerer Form vorliegen, wie im Folgenden vollständiger beschrieben werden wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Methodik, die den erhaltenen stabilen Komplex aus dem Relanden und einem Rezeptor für einen Analyten einsetzt, wobei der Rezeptor:Reland-Komplex imstande ist, den Relanden in Gegenwart eines Analyten freizusetzen. Der Reland, geeignet markiert, kann nachgewiesen werden, wodurch er auf positive Weise das Vorliegen des Analyten in einer Testprobe anzeigt, wenn das Verfahren in einem diagnostischen Assayformat eingesetzt wird. Es werden Verfahren für das Design, die Herstellung, den Einsatz und die Stabilisierung derartiger Komplexe bereitgestellt. Die Methodik ist sowohl auf homogene Assays als auch auf heterogene Assays für Analyten, die einen breiten Bereich an Typen und Größen umfassen, anwendbar. Die erfindungsgemäßen Assays überwinden die Nachteile und Unzulänglichkeiten der diagnostischen Assays nach dem Stande der Technik, indem sie zum Beispiel das Vorliegen eines Analyten in kürzerer Zeit, mit höherer Empfindlichkeit und mit einem größeren dynamischen Bereich, als es bisher mit einem einzigen Assaydesign möglich war, nachweisen.

Die Erfindung ist auch sowohl für Reagenzien für diagnostische In-vivo-Assays als auch für therapeutische Behandlungsvenfahren einsetzbar. Zum Beispiel stellt die vorliegende Erfindung in einem breiten Aspekt Verfahren zur Gewinnung von Komplexen bereit, die für neuartige Verfahren zur Erreichung einer spezifischen Stelle im Körper und zur Reaktion mit dieser sind. Das Verfahren umfasst das Zuführen eines Rezeptor:Reland-Komplexes zu einer Stelle im Körper und das Nachweisen der Bindung des Rezeptors an die Stelle nach der Freisetzung des Relanden aus dem Komplex. In diesem Falle wird der Nachweis durch die Inkorporation einer „Markierung" oder eines Nachweissystems, und zwar eines vollständigen oder eines Teils, in den Rezeptor oder das therapeutische Mittel erleichtert.

Wir stellen Kits, die den vorgeformten Rezeptor:Reland-Komplex oder jedes Mittel einzeln umfassen, für den Einsatz in den heterogenen und homogenen Assayverfahren, die hier gelehrt werden, oder in den diagnostischen oder therapeutischen In-vivo-Behandlungsverfahren bereit. Der Rezeptor:Reland-Komplex kann vor dem Inkontaktbringen der Probe mit dem Komplex gebildet werden, indem der Rezeptor für einen geeigneten Zeitraum mit dem Relanden inkubiert wird.

Ein essentieller Aspekt der Erfindung ist die Wahl des Relanden zur Bildung von Komplexen, die Eigenschaften haben, die sich beträchtlich von den Eigenschaften der Ligand:Rezeptor-Komplexe unterscheiden, die in den kompetitiven oder dissoziativen Assays nach dem Stande der Technik beschrieben werden. Da die Bildung eines geeigneten Rezeptor:Reland-Komplexes von den Charakteristika des Relanden abhängt, erscheint es an dieser Stelle passend, einige dieser Charakteristika vorzustellen. Weitere und spezifischere Details werden weiter unten präsentiert werden.

Der Reland ist bezüglich seiner Struktur mit dem Analyten verwandt, und in monomerer Form zeigt er weniger als 1% Kreuzreaktivität hinsichtlich der Bindung an den Rezeptor, ein Effekt, der inkonsistent mit der Fähigkeit zur Bildung eines stabilen Komplexes erscheint. In direktem Kontrast zu den Assays und Komplexen nach dem Stande der Technik konkurriert der Reland bezüglich der Bindung an den Rezeptor nicht nachweisbar mit dem Analyten. Bei der Herstellung des Komplexes haben wir gefunden, dass der monomere Reland mit dem Rezeptor nur bei hohen konzentrationen des Relanden assoziiert (niedrigere Konzentrationen können eingesetzt werden, wenn der Reland als ein Multimer präsentiert wird), und er tut es mit einer langsamen Kinetik und nur in Abwesenheit des Analyten. Der Reland beeinflusst nicht nachweisbar die praktisch vollständige Bindung des Analyten an den Rezeptor, und er bindet auch nicht in Gegenwart des Analyten an den Rezeptor. Die Assoziationskonstante des monomeren Relanden mit dem Rezeptor liegt unter oder bei ungefähr 105 M–1, vorzugsweise bei 103 bis 105 M–1 und am bevorzugtesten in der Gegend um 104 M–1. Wenn er mit dem Rezeptor als Multimer komplexiert vorliegt, wie zum Beispiel, wenn der Reland ein Dimer, Trimer oder höheres -mer ist, oder wenn er mit einem Träger, wie einem Peptid, konjugiert ist (immer noch ein Multimer, wie es hier verwendet wird), wird die Assoziationskonstante dramatisch erhöht. Es wird nicht bevorzugt, ein Gesamtmolekulargewicht für den Relanden von 5 000 Dalton zu überschreiten, wenn die optimale Freisetzbarkeit ein Ziel ist, aber der Grund dafür besteht darin, dass größere Molekülgrößen dazu neigen, die Bildung irreversibler Komplexe mit dem Rezeptor zu begünstigen, und dass sie eine höhere Kreuzreaktivität mit dem Analyten begünstigen. Wenn jedoch der Komplex zum Zeitpunkt, oder nahe dem Zeitpunkt, der Durchführung des Assays gebildet wird, so dass die Irreversibilität des Komplexes kein Faktor ist, führen die Multimere mit höherem Molekulargewicht, wie sie mit BSZ, BCT, G6PH und anderen erhalten werden, zu auf geeignete Weise freisetzbaren Komplexen, vorausgesetzt, dass die Parameter bezüglich der Kreuzreaktivität akzeptabel sind.

Bei einem stark bevorzugten Aspekt der Erfindung liegt das Molekulargewicht des Relanden bei unter 5000 Dalton, und bevorzugter bei unter 2000 Dalton. Das Molekulargewicht des Relanden für Zwecke der Erfindung schließt das Epitop ein, das die Bindung an den Rezeptor steuert, sowie beliebige Linker, Markierungen oder Hilfsstrukturen des Relanden. Durch das Bereitstellen eines Verfahrens zur Gewinnung eines Relanden geringer Größe hilft die vorliegende Erfindung sicherzustellen, dass eine irreversible Komplexbildung zwischen dem Relanden und dem Rezeptor vermieden wird. Das ist besonders wichtig, da es die Bereitstellung eines vorgeformten Komplexes in einen Kit limitieren würde. Der Komplex wirkt, wenn er an Ort und Stelle oder unmittelbar vor der Verwendung hergestellt wird, trotzdem auf geeignete Weise als ein Freisetzungskomplex.

Theoretisch könnte man beim Design des Komplexes wählen, entweder den Relanden oder die Bindungsstelle des Rezeptors zu modifizieren. In der Praxis ist es aber viel praktischer, den Relanden zu modifizieren. Es steht eine große Vielzahl von Rezeptoren für den Einsatz in der Erfindung bereit, wie weiter unten beschrieben werden wird.

Die erfindungsgemäßen diagnostischen Verfahren, die die angegebenen Komplexe einsetzen, stellen eine überraschend höhere Empfindlichkeit, Spezifität, Genauigkeit und einen überraschend größeren Nachweisbereich bereit, als es herkömmlichen Assoziationsassays oder kompetitiven Dissoziationsassays, wie sie z.B. bei Freytag im US-Patent Nr. 4 551 426 beschrieben wurden, tun.

Analyten können beliebte Antigene oder Zielmoleküle, wie sie hier beschrieben werden, sein, einschließlich von therapeutischen Arzneimitteln und deren Metaboliten, verbotenen Drogen und deren Metaboliten, Steroiden, Peptidhormonen, Hormonen, z.B. Insulin, viralen Antigenen, bakteriellen Antigenen, Serumproteinen, Antikörpern, Toxinen, Pestiziden, Produkten in der Umwelt, Krebsantigenen, genetischen Markern oder jedem beliebigen interessierenden Antigen, wenn der Nachweis des Vorliegens (oder des Fehlens) des Analyten mit einem schnellen, spezifischen und empfindlichen Assay gewünscht ist.

DEFINITIONEN

  • Analyt – interessierendes Molekül in einem Assay oder an einer Stelle des Körpers; auch das Ziel des Rezeptors.
  • Reland – ein Wort, das aus dem Begriff „Release Ligand" geprägt wurde, der die Freisetzungseigenschaften des Liganden im komplexierten Zustand beschrieb; ein Molekül, das fähig ist, an einen Rezeptor zu binden, und das die folgenden Eigenschaften aufweist:

  • – der Reland kann monomer vorliegen, oder er kann in multimerer Form, wie als Dimer, Trimer, 4-, 5-, 6-mer oder in Form eines höheren -mer des monomeren Moleküls vorliegen; „multimer" schließt auch Konjugate des Relanden mit einem Träger, wie Peptiden, Zuckern, Polymeren und dergleichen, ein;
  • – die Dissoziationskonstante des Relanden und des Rezeptors ist derart, dass es in Abwesenheit des Analyten für den Rezeptor nicht zu einer nennenswerten Freisetzung des Relanden kommt;
  • – die Dissoziationskonstante des Reland-Rezeptor-Komplexes ist extrem niedrig, so dass die Analyten-induzierte Freisetzung des Relanden nicht von der Dissoziationsgeschwindigkeit des stabilen Komplexes abhängig ist oder mit dieser in Beziehung steht;
  • – der Reland ist strukturell mit dem Analyten in monomerer Form verwandt, zeigt aber weniger als 1% Kreuzreaktivität mit dem Rezeptor und, bevorzugter, zeigt keine nachweisbare Kreuzreaktivität mit dem Analyten oder konkurriert nicht nachweisbar mit diesem bezüglich der Bindung an den Rezeptor;
  • – die Freisetzung des Relanden aus dem Rezeptor:Reland-Komplex wird durch den Analyten induziert;
  • – der Reland assoziiert mit dem Rezeptor in Abwesenheit des Analyten mit langsamer Kinetik;
  • – bei der vorherigen Bildung des Komplexes kommt es nicht zu einer nennenswerten Bindung des monomeren Relanden an den Rezeptor, bis die Konzentration des Relanden bei ungefähr 10–5 M liegt, vorzugsweise bei 10–3 bis 10–4 M oder wenigstens Konzentrationen, z.B. 10–5 oder darunter (10–6 bis 10–8 oder höher), wenn der Reland in Form von Multimeren vorliegt. Die Rezeptorkonzentrationen liegen gewöhnlich im Bereich von 10–6 bis 10–1 M, aber es können Werte außerhalb dieses Bereiches eingesetzt werden;
  • – der monomere (oder multimere) Reland bindet an den Rezeptor mit beträchtlich niedrigerer Affinität, als der Analyt an den Rezeptor bindet, aber der Rezeptor:Reland-Komplex hat eine Dissoziationskonstante, die derjenigen des Rezeptor:Analyt-Komplexes ähnlich ist.

  • Rezeptor – ein spezifischer Bindungspartner das Analyten; und ein Molekül, das imstande ist, spezifisch den Analyten oder Relanden zu binden, wie es hier beschrieben ist. In jedem Falle wird ein stabiler Komplex gebildet, aber die Assoziationskonstante des Analyten ist größer als diejenige des Relanden. Ein bevorzugter Rezeptor ist ein Antikörper, aber andere spezifische Bindungspartner, wie sie hier im folgenden beschrieben werden, stellt man sich auch für den Einsatz in dieser Erfindung vor.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 Molekülformeln. Fig. A, Nicotin; B, Cotinin; C, N-Isopropyl-4-carboxylnorcotinin und D, N-Propyl-4-carboxylnorcotinin

2 Freisetzungsassay im ELISA-Format für Cotinin zeigt die Freisetzung aus immobilisiertem cis-Hydroxycotinin-G-6-PDH (Sterne); N-Isopropylnorcotinin-G-6-PDH (Pluszeichen); N-Propylnorcotinin-G-6-PDH (offene Quadrate)

3 Vergleich der Dosis-Wirkungskurven eines homogenen Assays im Emit-Format nach dem Stande der Technik (Pluszeichen) für Cotinin und eines erfindungsgemäßen Freisetzungsassays für Cotinin (Quadrate)

4 Dosis-Wirkungskurve für den erfindungsgemäßen homogenen Freisetzungsassay für Cotinin

5 Monoklonaler Antikörper gegen glykiertes Hämoglobin bindet an nicht glykiertes Hämoglobin und glykiertes Hämoglobin (HbGlc) in einem herkömmlichen ELISA-Assay.

6 Vergleich der Fähigkeit von nicht glykiertem Hämoglobin (HbAo) und glykiertem Hämoglobin (HbGlc) zur Freisetzung von Relanden von einem monoklonalen Antikörper gegen glykiertes Hämoglobin

7 Vergleich des herkömmlichen Assays mit dem Freisetzungsassayformat bezüglich der Fähigkeit eines monoklonalen Antikörpers gegen glykiertes Hämoglobin, zwischen glykiertem (HbGlc) und nicht glykiertem Hämoglobin (HbAo) zu unterscheiden

8 (8A, 8B, 8C) Kinetik der Bindung des monoklonalen Anti-Theophyllin-Antikörpers an einen Biotin-konjugierten Theophyllin-Liganden (Carboxypropyldimethylxanthin-Biotin) und an Theophyllin-Reland-Biotin (Theobromin-1-acetat-Biotin)

9 Freisetzungskinetik für Ligand-Biotin, 9A, Carboxypropyldimethylxanthin-Biotin und für Reland-Biotin, 9B, (Theobromin-1-acetat-Biotin)

10 Kreuzreaktivität von Theobromin und Therobromin-1-acetat in einem kompetitiven ELISA für Theophyllin

11 Konzentrationsabhängigkeit der Bildung des Komplexes Theophyllin-Reland (Theobromin-1-acetat-Biotin)-Rezeptor (Quadrate) im Vergleich zu derjenigen der Bildung des Komplexes Theophyllin-Ligand (Carboxypropyldimethylxanthin)-Rezeptor (Rauten)

12 Untersuchung der Fähigkeit von Pyridinolin-Reland-Kanditaten (d.h. Pyridin-Analogen) im ELISA-Format, an Anti-Pyridinolin-Antikörper zu binden

13 ELISA-Format. Freisetzung von biotinyliertem Pyridoxal (Pyridinolin-Reland) vom Anti-Pyridinolin-Antikörper durch Pyridinolin

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der auf In-vitro-Diagnostika angewandten vorliegenden Erfindung werden ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines Analyten in einer Probe mittels der angegebenen Rezeptor:Reland-Komplexe sowie Kits dafür bereitgestellt. Eine Testprobe kann jede beliebige Flüssigkeit sein, die im Verdacht steht, den Analyten, auf den abgezielt wird, zu enthalten, zum Beispiel Milch, Wasser, Urin, Blut, Serum, Speichel, Körperabsonderung etc. sowie Flüssigkeiten, die aus interessierenden festen Materialien stammen, wie Böden, Nahrungsmitteln, Chemikalien, Körpergewebe und dergleichen. Das erfindungsgemäße Verfahren des Freisetzungsassays umfasst das Inkontaktbringen einer Testprobe mit einem Rezeptor:Reland-Komplex und, wenn der Analyt vorhanden ist, den Nachweis der Freisetzung des Relanden (oder des freigesetzten Rezeptors) aus dem Komplex oder, in geeigneten Fällen, den Nachweis der Bindung des Rezeptors an den Analyten.

Es wird angenommen, dass es zur Freisetzungsreaktion kommt, wenn der Analyt mit dem Rezeptor:Reland-Komplex in Kontakt kommt, wodurch ein vermuteter trimolekularer Komplex gebildet wird. Das Vorliegen des Analyten mit einer Assoziationskonstante mit dem Rezeptor von über oder gleich 108 M–1 (z.B. 109 etc.) induziert eine Veränderung im Rezeptor:Reland-Komplex, die die Dissoziationskonstante des Komplexes verändert, was die Freisetzung des Relanden ermöglicht. Diese Wechselwirkung des Analyten mit dem Rezeptor kann an der Bindungsstelle des Relanden oder an einer allosterischen Bindungsstelle erfolgen. Nach der Freisetzung des Relanden wird der Komplex aus dem Analyten und dem Rezeptor durch die Gegenwart des freien Relanden nicht nachweisbar beeinflusst. Es kann entweder der Reland oder der Rezeptor nach der Freisetzung aus seinem Ausgangskomplex nachgewiesen werden, um das Vorliegen des Analyten in der Probe zu erfassen. Das erfindungsgemäße Assayverfahren kann entweder in homogenen oder in heterogenen Formaten durchgeführt werden. Spezifische Details für jedes Format werden weiter unten angegeben.

Ein erfindungsgemäßer Freisetzungsassay erlaubt die Präparation eines Komplexes, bei dem die Bindungsstelle oder die Bindungsstellen auf dem Rezeptor und dem Relanden in ungefähr gleicher Konzentration vorhanden ist bzw. sind, d.h. eine quantitative Komplexbildung, auch wenn das nicht essentiell ist. Das Vorliegen der beiden Elemente in gleicher Konzentration erhöht die Empfindlichkeit, da, wenn der Rezeptor im Überschuss vorliegt, er den Analyten binden kann, ohne den Relanden aus dem Komplex freizusetzen.

Zur Erzielung eines Rezeptor:Reland-Komplexes, bei dem die Bindungsstellen eines jeden Elements im wesentlichen in gleicher Menge vorhanden sind, werden der Rezeptor und der Reland vor der Exposition gegen die Probe wenigstens eine Stunde inkubiert, auch wenn kürzere Inkubationszeiten möglich sind, wenn eines der Reagenzien im Vergleich zum anderen in großem Überschuss vorliegt. Vorzugsweise ist die Inkubationszeit länger als ungefähr 12 Stunden. Eine lange Inkubationszeit ermöglicht die Bildung der stabilsten Komplexe während wiederholter Freisetzungs- und Bindungsreaktionen, wenn ein Element, entweder der Rezeptor oder der Reland, im Überschuss vorliegt. Nachdem diese mit niedriger Affinität erfolgende Bindungsreaktion ihr Gleichgewicht erreicht hat, wird der Rezeptor:Reland-Komplex, der nach der langfristigen Inkubation nun stabil vorliegt, aus dem überschüssigem Reagens (entweder Reland oder Rezeptor) isoliert. Die Isolierung des Komplexes kann über eine Ausfällung, eine Größenausschlusschromatographie, eine Dichtegradientenzentrifugation, eine Mikrofiltration oder eine andere Technik zur Abtrennung von Komplexen von ihren Komponenten erreicht werden. Alternativ können, zur Vermeidung des Trennschrittes, der Rezeptor und der Reland in gleichen Konzentrationen hinsichtlich der Bindungsstelle oder bei einem leichten Überschuss (ungefähr 1- bis 2-fach) des Relanden gemischt und für eine Zeit inkubiert werden, die von der Konzentration des Relanden abhängt, um eine im wesentlichen quantitative Bindung in Form stabiler Komplexe zu ermöglichen. Zum Beispiel (8C) war bei Relandenkonzentrationen von 0,25 &mgr;g/ml eine Inkubation von einer Woche oder länger erforderlich. Die Bildung des Reagens:Reland-Komplexes wird weiter unten ausführlicher diskutiert. Zur Vermeidung der Kosten für die Bereitstellung einer Markierung des Relanden in hoher Konzentration und der anschließenden Trennung der gebundenen von der freien Form kann der Reland zu einer multimeren Form polymerisiert werden. In einer derartigen Form läuft die Bindung bei stöchiometrischen Mengen von Rezeptor und Reland vollständig ab.

Die erfindungsgemäßen Verfahren basieren auf der Entdeckung, dass die Freisetzung des Relanden aus einem Komplex aus Rezeptor und Reland in Gegenwart des Analyten durch den Analyten induziert wird. Der freigesetzte Reland reassoziiert nicht mit dem Rezeptor, und deshalb konkurriert er nicht mit dem Analyten um Bindungsstellen auf dem Rezeptor. Es wird angenommen, dass es zu diesem Ergebnis zumindest teilweise dadurch kommt, dass die Assoziationskonstante der Bindung des Relanden an den Rezeptor für den monomeren Relanden bei ungefähr 105, und vorzugsweise bei 104 bis 103, liegt.

Die Freisetzung des Relanden aus dem Rezeptor:Reland-Komplex in Gegenwart des Analyten wird hier als die Freisetzungsreaktion bezeichnet. Es ist wichtig festzuhalten, dass die Freisetzung praktisch vollständig erfolgt (d.h. praktisch der gesamte Reland freigesetzt wird), und zwar innerhalb von Sekunden bis Minuten, nachdem der Analyt mit dem Komplex in Kontakt gekommen ist. Der freie Reland reassoziiert innerhalb des Zeitrahmens der Analyse, des Tests oder des Verfahrens nicht mit dem Rezeptor. Es wurde zwar postuliert, dass die logische Folge der Freisetzung des Relanden ist, dass sich der freie Rezeptor mit dem Analyten unter Bildung eines stabilen Komplexes vereinigt, aber für die Erfindung ist es nicht erforderlich, dass es dazu kommt. Die Menge des freigesetzten Relanden ist direkt proportional zur Menge des Analyten, der auf den Reland:Rezeptor-Komplex trifft, und somit ist ein Maß für die Menge an freigesetztem Relanden ein Maß für die Menge an vorhandenem Analyten.

Ohne sich auf eine bestimmte Hypothese hinsichtlich des Mechanismus der Freisetzungsreaktion festlegen zu wollen, wird auf der Basis der schnellen Kinetik der Freisetzungsreaktion trotz der Stabilität des Rezeptor:Reland-Komplexes und der resultierenden fehlenden Abhängigkeit der Relandenfreisetzung von der Dissoziationsgeschwindigkeit des Rezeptor:Reland-Komplexes angenommen, dass ein trimolekularer Komplex zwischen dem Rezeptor, dem Analyten und dem Relanden gebildet wird, wenn der Analyt vorhanden ist. Aufgrund der hohen Affinität des Analyten für den Rezeptor und der relativen Instabilität des trimolekularen Komplexes wird der Reland freigesetzt, was es dem Analyten ermöglicht, einen Komplex mit dem Rezeptor zu bilden. Da der Reland nicht nachweisbar mit dem Analyten um die Bindung an den Rezeptor konkurriert, wird der Komplex aus dem Analyten und dem Rezeptor nicht erkennbar durch die Gegenwart des Relanden beeinflusst. Diese Hypothese ist auch mit der Existenz einer doppelten Bindungsstelle am Rezeptor konsistent.

Die Assoziationskonstante der Bindung des Rezeptors an den monomeren Relanden wird nicht mehr als ungefähr 1%, und bevorzugter nicht mehr als ungefähr 0,2%, der Assoziationskonstante der Bindung des Rezeptors an den Analyten betragen. Das kann qualitativ als relative Bindung, z.B. anhand der apparenten Aktivität in einem Assay, beobachtet werden.

Da die Freisetzungsreaktion auf einer hochaffinen Assoziation zwischen dem Rezeptor und dem Analyten beruht, ist sie empfindlich und spezifisch. Das heißt, der Rezeptor bindet niedrige Konzentrationen des Analyten. Die Abhängigkeit der Freisetzungsreaktion von der Bindung mit differenzieller Affinität erhöht die Spezifität noch mehr. Der Rezeptor wird nicht dissoziieren und kreuzreagierende Analoge des Analyten binden, es sei denn, die Bindungskonstante ist viel höher als die Bindungskonstante zwischen Rezeptor und Reland.

Einer der wichtigen Vorteile der Beziehung zwischen Analyt und Reland gemäß der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass das für die Induktion der Freisetzungsreaktion wirksame Verhältnis von Analyt zu Reland bei unter 100:1 liegt, vorzugsweise bei unter 10:1 und bevorzugter bei ungefähr 1:1. Tatsächlich bewirkt ein Verhältnis von 1:2 eine praktisch vollständige und stöchiometrische Freisetzung. Dieses Charakteristikum der erfindungsgemäßen Assays unterscheidet sich beträchtlich von den Dissoziationsverfahren nach dem Stande der Technik, bei denen das Verhältnis des Analyten, das benötigt wird, um ein Analoges des Analyten (das mit dem Analyten kreuzreagiert) freizusetzen, erheblich größer als 100:1 ist, da es vom Kd-Wert des Rezeptorliganden abhängt.

Es ist wichtig zu betonen, dass ein wirksamer Anteil des Rezeptor:Reland-Komplexes in Gegenwart des Analyten freigesetzt werden muss, und nur sehr wenig in Abwesenheit des Analyten freigesetzt werden darf, wenn nicht das Hintergrundrauschen im System ein beträchtlicher Faktor werden soll. Wenn zum Beispiel lediglich 1% des Rezeptor:Reland-Komplexes freigesetzt würden, würden 99% des Systems unbeeinflusst bleiben. Wenn die Standardabweichung der Messung bei 1% läge (entsprechend 99 ± 1%), was für Immunoassaysysteme einen ausgezeichneten Variationskoeffzienten bedeutet, dann würde die Wirkung einer 1%igen Freisetzung 1% ± 1% sein, und dieses Ergebnis hätte keinerlei Signifikanz. Der vorliegende Assay stellt eine signifikante Dissoziation des Rezeptor:Reland-Komplexes sicher, d.h. eine Freisetzung oberhalb der Nulllinie.

Die stöchiometrische Freisetzung des Relanden bietet auch die Möglichkeit, die Analyten über einen weiten Konzentrationsbereich nachweisen zu können. In kompetitiven Systemen nach dem Stande der Technik erfordert es das Design des Assays, dass begrenzte Mengen des Liganden eingesetzt werden, wenn geringe Menge des Analyten in einer Probe nachgewiesen werden sollen. Eine derartige Konfiguration würde durch eine große Menge des Analyten jedoch überschwemmt werden. Umgekehrt werden, wenn hohe Mengen an Analyt erwartet werden, größere Mengen des Analogen des Analyten benötigt. Unter diesen Bedingungen wäre die Ausgangsdissoziation ungefähr gleich der Dissoziation in Gegenwart einer kleinen Menge des Analyten, oder sie würde diese sogar noch übersteigen. Dementsprechend überwindet die vorliegende Erfindung diese Mängel des Standes der Technik, indem der vorgeformte Rezeptor:Reland-Komplex bereitgestellt wird, der in Abwesenheit des Analyten stabil ist und trotzdem in Gegenwart des Analyten potenziell quantitativ freigesetzt werden kann.

Die Menge des freigesetzten Relanden kann, auch wenn sie potenziell quantitativ ist, durch das System beeinflusst werden. Zum Beispiel werden in einem heterogenen System, wenn ein Festphasenkomplex aus einem Meerrettichperoxidase-markierten Antikörper gegen Cotinin als Rezeptor und Isopropylnorcotinin als Reland, der an ein Trägerprotein (z.B. Glucose-6-phosphatdehydrogenase) geknüpft ist, um die Bindung an die feste Phase zu erleichtern, mit einer Probe umgesetzt wird, 5–10% des gesamten Antikörpers durch den Analyten freigesetzt. Der genaue Prozentsatz ist schwer zu bestimmen, da man weiß, dass die Aktivität eines Enzyms auf einer festen Phase geringer ist als die des Enzyms in flüssiger Phase. In einem homogenen Freisetzungsassay mit den gleichen Reagenzien induziert die Cotinin enthaltende Probe eine 100%ige Umkehrung der Enzymhemmung, was eine 100%ige Freisetzung anzeigt. Das zeigt an, dass die geringere Freisetzung, die man in dem Festphasensystem sieht, eine Funktion des Systems, und nicht eine des Reland:Antikörper-Komplexes, ist.

Weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung dürften Fachleuten auf diesem Gebiet leicht erkennbar sein. Die Freisetzungsreaktion erfolgt nahezu sofort, im Allgemeinen in weniger als 5 Minuten bis zum Endpunkt. Die Diffusion der Reagenzien ist in der Zeit, die für den Assay benötigt wird, ein limitierender Faktor. Somit können die Zeiten verkürzt werden, indem die Konzentration der Reagenzien erhöht wird. Am vorteilhaftesten ist, dass die Freisetzungsreaktion kein hochempfindliches Nachweissystem erfordert. Das bedeutet, dass die vorliegende Erfindung einfache Assays bereitstellt, unter Einsatz von Verbindungen, die bei geringer Empfindlichkeit nachweisbar sind, wie Cofaktoren, Farbstoffe und dergleichen, anstelle der hochempfindlichen Fluorophore, und somit machen sie den Einsatz komplizierter – und teurer – Nachweisapparaturen überflüssig, wie sie in kompetitiven Dissoziationsassays nach dem Stand der Technik benötigt werden.

DER REZEPTOR:RELAND-KOMPLEX

Ein leistungsfähiger Freisetzungsassay erfordert den Einsatz eines stabilen Rezeptor:Reland-Komplexes. Dieser Komplex bildet sich langsamer als herkömmliche Komplexe, zum Beispiel Rezeptor:Analyt- oder Antikörper:Antigen-Komplexe etc. (8A, 8B, 8C). Dieser Komplex wird in einem wässrigen flüssigen Medium durch die Inkubation des Relanden und des Rezeptors für einen Zeitraum, der von der Konzentration der Reagenzien abhängig ist, hergestellt. Bei höheren molaren Konzentrationen sind kürzere Zeiten erforderlich. Die Freisetzung des Komplexes erfolgt während des Beginns der Bildung des Rezeptor:Reland-Komplexes leicht. Nach einer geeigneten Inkubationszeit, üblicherweise von über einer Stunde, und häufiger von über 123 Stunden, wird der Rezeptor:Reland-Komplex jedoch stabil. Üblicherweise sind Temperaturen von 4°C bis 40°C geeignet, wobei 4°C bis Raumtemperatur vorgezogen werden.

Die Stabilität des Komplexes ist zum Teil eine Funktion des Designs des Relanden und der Inkubationszeit des Relanden und des Rezeptors. Die geeignete Inkubationszeit kann für jede Kombination aus Rezeptor und Reland leicht bestimmt werden. Im Allgemeinen sollten der Rezeptor und der Reland vor der Exposition gegen den Analyten jedoch wenigstens eine Stunde, und vorzugsweise länger als 12 Stunden, inkubiert werden.

Unter geeigneten Bedingungen, zum Beispiel in Gegenwart von Salzen, wie Natriumchlorid, oder von stabilisierenden Mitteln, wie Proteinen oder Glucose, oder von beiden, bleibt der stabile Rezeptor:Reland-Komplex über einen langen Zeitraum freisetzbar – Tage, Wochen oder länger. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein stabiler Rezeptor:Reland-Komplex in Lösung vorliegen, oder er kann getrocknet sein. Ein Komplex, der in Gegenwart von 5% Natriumchlorid gebildet wurde, könnte 6 Tage, nachdem der Rezeptor:Reland-Komplex hergestellt wurde, verwendet werden. Es können auch Proteine, Zucker oder andere bekannte Stabilisatoren zur Stabilisierung eines trockenen Rezeptor:Reland-Komplexes verwendet werden.

Ohne sich bei der vorliegenden Erfindung auf irgendeine bestimmte Theorie oder Hypothese festlegen zu wollen wird angenommen, dass die Bildung eines stabilen Rezeptor:Reland-Komplexes ein Modell einer molekularen Akkomodation zwischen dem Relanden und dem Rezeptor unterstützt. Das Gleichgewicht dieser Bindung begünstigt eine Konfiguration des Komplexes, die ihn stabilisiert, was bedeutet, dass die effektive Affinität des Komplexes beim reifen Komplex höher sein kann, und wahrscheinlich sein muss, als beim Ausgangskomplex. Das spiegelt sich in einer sehr niedrigen Dissoziationsgeschwindigkeit des Komplexes wider.

Gemäß der Erfindung ist der Reland vorzugsweise mit einem Nachweissystem oder einem Teil eines solchen markiert. Alternativ kann die Markierung in den Rezeptor inkorporiert sein. Man stellt sich auch vor, dass bei der Erfindung ein Teil des Markierungssystems auf dem Relanden bereitgestellt wird und der Rest des Markierungssystems in der Testumgebung. Die zwei Teile vereinigen sich nach der Freisetzung des markierten Relanden unter Bildung des Indikatornachweissystems. Zum Beispiel kann der Reland mit FAD markiert sein, das derjenige Teil der Glucoseoxidase ist, der dem Enzym Aktivität verleiht. Wenn der FAD-Reland im Komplex mit dem Rezeptor vorliegt, ist das FAD für die Glucoseoxidase (die „Apoglucoseoxidase" oder ApoGO genannt wird, wenn FAD fehlt) nicht leicht zugänglich. Wenn der FAD-Reland durch den Kontakt mit einem geeigneten Analyten freigesetzt wird, wird das FAD leicht in die im Testsystem bereitgestellte Apoglucoseoxidase inkorporiert, aktiviert diese und wird als Maß für vorliegende Menge des Analyten nachgewiesen.

REZEPTOREN

Ein Element des Rezeptor:Reland-Komplexes ist ein Rezeptor mit einer oder mehreren Bindungsstelle(n), die imstande ist bzw. sind, spezifisch an den Analyten zu binden, wobei die Assoziationskonstante der Bindung hoch ist. Vorzugsweise liegt die Assoziationskonstante bei über 108 M–1, und bevorzugter bei über 1010 M–1. Der Rezeptor ist auch imstande, an einen monomeren Relanden mit einer Assoziationskonstante der Bindung zu binden, die im Vergleich zu derjenigen für die Bindung des Rezeptors an den Analyten relativ niedrig ist. Zu geeigneten Rezeptoren für den Einsatz in erfindungsgemäßen Freisetzungsassays gehören Antikörper oder ein Fragment des Antikörpers, das Bindungsstellen für den Analyten und den Relanden aufweist, oder beliebige andere Moleküle oder Makromoleküle, die imstande sind, spezifisch an sowohl einen Relanden als auch einen Analyten zu binden und einen stabilen Komplex mit diesen zu bilden. Es werden Antikörper und Zelloberflächenrezeptoren bevorzugt, wobei Antikörper stärker bevorzugt werden. Am stärksten bevorzugt werden Antikörper, die gegen ein spezifisches Epitop gerichtet sind, d.h. eine Droge oder ein kleines Peptid, die bzw. das an ein immunogenes Molekül, wie ein Protein, eine Polyaminosäure (z.B. Polylysin), Agarose oder andere polymere Derivate, gekoppelt ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Rezeptor so erzeugt oder ausgewählt, dass er für das charakteristischste Epitop auf dem Analyten spezifisch ist.

Bei einer spezifischen Ausführungsform, siehe unten, bei der der Rezeptor ein Antikörper ist, wird der Antikörper hinsichtlich seiner Spezifität für ein charakteristisches Epitop auf dem Analyten, z.B. die Glykierungsstelle auf glykiertem Hämoglobin, oder eine charakteristische Sequenz eines Proteins oder Polypeptids ausgewählt.

Es können verschiedene in diesem Fachgebiet bekannte Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern gegen interessierende Analyten eingesetzt werden. Zu derartigen Antikörpern gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, polyklonale, monoklonale, schimärische und einzelkettige Antikörper, Fab-Fragmente und eine Fab-Expressionsbibliothek. Zur Erzeugung der Antikörper können verschiedene Wirtstiere durch die Injektion des jeweiligen Analyten oder des an einen immunogenen Träger konjugierten Analyten immunisiert werden, wobei zu den Tieren Kaninchen, Mäuse, Ratten etc. gehören, ohne dass sie jedoch auf diese beschränkt sind. Es können verschiedene Adjuvanzien eingesetzt werden, um die Immunantwort in Abhängigkeit von der Wirtsspezies zu erhöhen, einschließlich von, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, Freunds (komplettem oder inkomplettem) Adjuvans, Mineralgelen wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktiven Substanzen wie Lysolecithin, Pluronsäurepolyolen, Polyanionen, Polypeptiden, Ölemulsionen, dem Hämocyanin der Schlüssellochnapfschnecke, Dinitrophenol sowie potenziell nützlichen humanen Adjuvanzien, wie BCG (Bacillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.

Monoklonale Antikörper gegen Analyten können mittels jeder beliebigen Technik hergestellt werden, die die Erzeugung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur oder in vivo ermöglicht. Zu diesen Techniken gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, die Hybridomtechnik, die ursprünglich von Köhler und Milstein beschrieben wurde (Nature, 1975, 256:495–497), die neuere Technik unter Verwendung humaner B-Zell-Hybridome (Kosbor et al., 1983, Immunology Today, 4: 72) und die EBV-Hydridomtechnik (Cola et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., S. 77–96). Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können monoklonale Antikörper, die spezifisch für Analyten sind, in keimfreien Ratten unter Einsatz einer neueren Technologie erzeugt werden (PCT/US90/02545). Gemäß der Erfindung können menschliche Antikörper verwendet werden, und sie können über menschliche Hybridome (Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., 80: 2026–2030) oder über das Transformieren menschlicher B-Zellen mit dem EBV-Virus in vitro (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77–96) erhalten werden. Tatsächlich können gemäß der Erfindung Techniken verwendet werden, die für die Erzeugung „schimärischer Antikörper" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851–6855, Neuberger et al., 1984, Nature, 312: 604–608, Takeda et al., 1985, Nature, 312:452–454) über das Spleißen der Gene eines Maus-Antikörpermoleküls geeigneter Antigenspezifität mit den Genen eines menschlichen Antikörpermoleküls geeigneter biologischer Aktivität entwickelt wurden. Derartige Antikörper sind im Umfang dieser Erfindung enthalten.

Gemäß der Erfindung können Techniken, die für die Erzeugung einzelkettiger Antikörper beschrieben wurden (US-Patent 4 946 778), an die Erzeugung analytenspezifischer einzelkettiger Antikörper adaptiert werden. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung setzt die für die Konstruktion von Fab-Expressionsbibliotheken beschriebenen Techniken ein (Huse et al., 1989, Science, 246: 1275–1281), um eine schnelle und einfache Identifizierung monoklonaler Fab-Fragmente mit der gewünschten Spezifität für Analyten zu ermöglichen.

Antikörperfragmente, die für Analyten spezifische Stellen enthalten, können mittels bekannter Techniken erzeugt werden. Zum Beispiel gehören zu solchen Fragmenten, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, die F(ab')2-Fragmente, die über den Pepsinverdau des Antikörpermoleküls erzeugt werden können, und die Fab-Fragmente, die über das Reduzieren der Disulfidbrücken der F(ab')2-Fragmente erzeugt werden können.

Alternativ können für einen interessierenden Analyten spezifische polyklonale oder monoklonale Antikörper von kommerziellen Quellen bezogen werden.

Rezeptoren für die Bindung des Analyten können zum Beispiel über eine Affinitätschromatographie gereinigt werden. Ein monoklonaler Antikörper kann auch über eine Protein-A- oder Anti-Ig-Chromatographie gereinigt werden. Techniken zur Reinigung polyklonaler und monoklonaler Antikörper sind in diesem Gebiet gut bekannt. Eine heterogene Rezeptorpräparation, wie ein polyklonaler Antikörper, kann auch mit einer niedrigen Konzentration (z.B. 1% der Rezeptorkonzentration) des Relanden vorbehandelt werden, um möglicherweise vorhandene Rezeptoren zu entfernen, die imstande sind, den Relanden mit hoher Affinität zu binden.

RELAND

Der Begriff „Reland", wie er hier verwendet wird, schließt, um die Eigenschaften, die unter „Definitionen" dargelegt werden, weiter zu erläutern, Moleküle mit begrenzter Kreuzreaktivität mit Analyten hinsichtlich der Bindung an den Rezeptor ein. Der Begriff „Reland" wird hier austauschbar mit „Freisetzungsligand" verwendet, da Reland ein Begriff ist, der von den Miterfindern der vorliegenden Erfindung geprägt wurde und sich auf einen Freisetzungsliganden beziehen soll. Der Freisetzungsligand oder Reland bindet an den Rezeptor mit einer niedrigen Assoziationskonstante, und er beeinflusst die Stabilität eines Analyt:Rezeptor-Komplexes nicht. Somit steht ein Reland strukturell in Beziehung zu seinem zugehörigen Analyten, so dass er eine spezifische Bindungswechselwirkung ermöglicht, aber er weist auch genügend Strukturunterschiede auf, die die Affinität erniedrigen und die Bildung irreversibel gebundener Komplexe ausschließen. Demgemäß kann ein Reland ein Analoges des Analyten sein, einschließlich eines Epitops des Analyten, eines Derivats des Analyten, eines modifizierten Analyten oder eines Isomers des Analyten. Vorzugsweise unterscheidet sich der Reland in seiner Struktur bezüglich einer Stelle am Epitop oder in der Nähe des Epitops vom Analyten. Zu diesen Unterschieden können chemische Modifikationen, sterische Veränderungen, Veränderungen der Konfiormation oder ionische Veränderungen gehören. Vorzugsweise werden ionische Gruppen durch neutrale, polare Gruppen ersetzt, da ionische Wechselwirkungen besonders stark sind und die Freisetzung stören können.

Moleküle, die hergestellt werden, um den Analyten strukturell nachzuahmen, sind auch Analoge für einen Einsatz als Reland. Solche Strukturnachahmungen können, müssen aber nicht, von der gleichen chemischen Art sein wie der Analyt, solange das Epitop chemisch ähnlich ist. So kann zum Beispiel, wie in spezifischen Beispielen weiter unten gezeigt wird, ein Peptid ein Analoges eines Proteins sein. Sobald ein Analyt/Rezeptor-Paar für die Untersuchung ausgewählt worden ist, werden potenzielle Relanden aus Analogen des Analyten ausgewählt. Analoge des Analyten können ausgewählt werden, indem Strukturen identifiziert werden, die dem Analyten ähnlich sind, einige ausgewählt werden, bei denen unterschiedliche Teile des Moleküls modifiziert wurden, wie es hier gelehrt wird, und die Kreuzreaktivität derartiger Strukturen in einem kompetitiven Assay für Analyten wie zuvor beschrieben überprüft wird. Die Modifikationen können in bestimmten Fällen lediglich einfache Veränderungen oder Substitutionen der Struktur sein, wie eine Einschritt-Dissoziation oder Substitution einer einzelnen Aminosäure in einer Polypeptidkette. Aus diesen monomeren Verbindungen mit einer Kreuzreaktivität von unter 1%, vorzugsweise unter 0,1% und am bevorzugtesten keiner Kreuzreaktivität bei 10–6 M, werden verschiedene ausgewählt, um ihre Fähigkeit, stabil an den Rezeptor zu binden, zu untersuchen. Ein bevorzugtes Verfahren zur Prüfung auf eine stabile Bindung besteht darin, die potenziellen Relanden mit Biotin zu konjugieren, den Rezeptor auf einer ELISA-Platte zu immobilisieren und die Fähigkeit des Reland-Biotins zur Bindung an den Rezeptor mittels eines Meerrettichperoxidase-Konjugats mit Avidin zu testen. Von denjenigen, die eine stabile Bindung zeigen, werden mehrere ausgewählt, um zu bestimmen, welcher freigesetzt wird und über die Zeit stabil ist.

Wenn keine Analogen kommerziell erhältlich sind, können Derivate hergestellt werden, indem modifizierende Gruppen an den Analyten angefügt oder von ihm entfernt werden. Derivate können auch natürliche Stoffwechselprodukte des Analyten sein. Ein durchschnittlicher Fachmann wird mit den hier präsentierten Informationen ohne weiteres wissen, wie er Derivate von Analyten für den Einsatz in der Erfindung herstellen oder identifizieren kann. Veränderungen der molekularen Struktur des Analyten werden die Bindungsaffinität des Rezeptors für den Relanden verändern, oder großräumige Gruppen können die langfristige Fähigkeit zur Freisetzung des Relanden verstärken.

Zu modifizierten Analyten gehören die, die mit einer räumlich störenden Gruppe konjugiert wurden. Die Anfügung großräumiger Gruppen, wie aliphatischer, aromatischer oder cyclischer Moleküle oder von Zuckern oder von ionischen Gruppen, oder, vorzugsweise, der Ersatz ionischer Gruppen an einem Analyten oder an einem Peptid durch nichtionische Gruppen kann aufgrund einer sterischen Wechselwirkung und/oder einer Wechselwirkung der Ladung zu einer erniedrigten Bindungsaffinität für den Rezeptor führen. Alternativ kann die Konjugation mit einer großräumigen Gruppe eine Veränderung im Epitop des Relanden verursachen, die die Bindungsaffinität für den Rezeptor erniedrigt. Chemische Modifikationen organischer Moleküle sind in diesem Gebiet gut bekannt und können zur Modifizierung des Relanden eingesetzt werden. Zum Beispiel kann ein Analyt, das Cotinin, durch die Gegenwart von Alkylgruppen mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, und am bevorzugtesten N-Isopropyl- oder N-Propylgruppen, zur Bereitstellung eines bevorzugten Relanden in einem Assay für Cotinin modifiziert werden (1).

Isomere von Analyten sind Moleküle mit der gleichen Zusammensetzung, aber einer anderen Konfiguration. Typischerweise haben Isomere unterschiedliche Konfigurationen an einem bestimmten Kohlenstoffzentrum, z.B. cis gegenüber trans, D gegenüber L. Zu Isomeren gehören Diastereomere, die an einem chiralen Zentrum oder an mehreren chiralen Zentren entgegengesetzte Konfigurationen aufweisen, und sie schließen Enantiomere von Analyten ein. Da biologische Bindungswechselwirkungen von der Konfiguration sowie von der Konformation und Zusammensetzung abhängen, kann die Verwendung eines Isomers als Reland zu einer viel geringeren Bindungsaffinität für Rezeptoren führen. Im Allgemeinen reicht eine erniedrigte Affinität eines Isomers allein nicht aus, um einen Relanden zu erzeugen, aber ein Isomer kann die Wirkung anderer Veränderungen verstärken.

Wenn der Analyt ein Protein ist, kann der Reland hergestellt werden, indem Peptidanaloge des Epitops synthetisiert werden, für das der Rezeptor spezifisch ist. Gentechnologische Verfahren unter Einsatz von Techniken einer ortsgerichteten Mutagenese oder anderer Mutagenisierungstechniken zur Veränderung der Aminosäuresequenz des Proteins können ebenfalls eingesetzt werden. Diese Techniken sind Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt (siehe z.B. Zoller und Smith, 1984, DNA 3: 479–488, Oliphant et al., 1986, Gene 44: 177, Hutchinson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 710). Techniken, die die Polymerasekettenreaktion (PCR) einsetzen, werden für die ortsgerichtete Mutagenese bevorzugt (siehe Higuchi, 1989, „Using PCT to Engineer DNA", in PCR Technology : Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, Hrsg., Stockton Press, Kapitel 6, S. 61–70). Vorzugsweise wird ein derartiges rekombinant exprimiertes Protein fragmentiert, z.B. über den Verdau mit einer Peptidase, um Relandenfragmente mit einem Molekulargewicht von, am bevorzugtesten, weniger als ungefähr 5000 Dalton zu erhalten. Besonders bevorzugt ist, dass der Reland für ein Protein ein Peptid mit einem Molekulargewicht von unter 2000 ist, das synthetisch hergestellt wird.

Der Reland kann auch eine Verknüpfungsgruppe umfassen. Eine Verknüpfungsgruppe kann eingesetzt werden, um eine Markierung mit dem Relanden zu konjugieren, zum Beispiel ein bifunktionelles Vernetzungsmittel, um die Anbringung einer Markierung an Relanden zu erleichtern, wenn die funktionellen Gruppen des Relanden und der Markierung keine direkte Anbringung erlauben. Ein Beispiel für eine Verknüpfungsgruppe ist Aminocapronsäure. Es können auch großräumige Verknüpfungsgruppen eingesetzt werden, um die Bindung des Relanden an den Rezeptor sterisch zu hindern. Ein Beispiel für eine großräumige Verknüpfungsgruppe ist p-Aminobenzoesäure. Sowohl Verknüpfungsgruppen als auch Markierungen können die Assoziations- und/oder Dissoziationskonstante erniedrigen oder erhöhen. Deshalb erfordert die Auswahl eines Relanden die Bewertung des gesamten Relanden einschließlich der Verknüpfungsgruppe und der Markierung.

Relanden können bezüglich ihrer Eignung für einen Einsatz in einem Freisetzungsassay untersucht werden. Zu Assays für eine Untersuchung der Relanden gehören kompetitive Assays, Assays auf eine Bindungsverstärkung, direkte Assays und Freisetzungsassays unter Einsatz von Mikrotiterplatten sowie der Freisetzungsassay, den man sich hier vorstellt, selbst. Der Endpunkt derartiger Assays besteht darin, zu zeigen, dass der Reland einen stabilen Komplex mit dem Rezeptor bilden kann, dass der Reland einen Komplex aus dem Analyten und dem Rezeptor nicht nachweisbar beeinflusst, dass der Analyt die Freisetzung des Relanden aus einem stabilen Komplex des Analyten und des Rezeptors induziert, dass der Reland die Freisetzung eines stabilen Komplexes aus Reland und Rezeptor nicht signifikant induziert und dass der Reland mit dem Analyten nicht signifikant, und vorzugsweise nicht nachweisbar, bezüglich der Bindung an den Rezeptor konkurriert. Diese Eigenschaften eines Relanden können quantitativ gezeigt werden, indem die prozentuale Freisetzung, die Affinitätskonstanten und dergleichen quantitativ gemessen werden, oder qualitativ, indem die nachweisbare Freisetzung und die relativen Bindungsaktivitäten gemessen werden.

Kompetitive Assays, die für die Beurteilung potenzieller Relanden nützlich sind, können im ELISA-Format durchgeführt werden, aber es kann eine kompetitive Assaytechnik eingesetzt werden. Zum Beispiel ist ein Reland bezüglich der Hemmung der Bindung des Rezeptors an den Analyten auf einer Festphase viel weniger wirksam als ein Analyt. Ein Molekül, das im Vergleich zum Analyten ein schlechter kompetitiver Hemmer ist, kann eine gute Wahl hinsichtlich einer Verwendung als Reland sein.

Für eine niedrige Konzentration eines geeigneten Relanden kann es tatsächlich so aussehen, dass sie in einem kompetitiven Assay die Bindung des Rezeptors an den Analyten verstärkt. So zeigt in einem Assay vom kompetitiven Typ ein erhöhtes absolutes Signal in Gegenwart einer niedrigen Konzentration des Relandenkandidaten an, dass der Kandidat ein geeigneter Reland sein könnte (siehe 10).

Wenn ein direkter Assay zur Beurteilung eines potenziellen Relanden eingesetzt wird, wird die Bindung des Rezeptors an den Relanden mit der Bindung des Rezeptors an den Analyten verglichen. Ein ELISA-Format ist für diesen Assaytyp gut geeignet, aber es können auch andere Formate eingesetzt werden. Ein monomerer Reland wird nicht mehr als ungefähr 1%, und vorzugsweise weniger als ungefähr 0,2%, der Bindungsaktivität des Analyten zeigen. Typischerweise wird in einem ELISA-Test die Bindungsaktivität durch den Titer repräsentiert, d.h. die Verdünnung oder Konzentration des Rezeptors mit einer bestimmten Bindungsaktivität. Alternativ können die spezifischen Aktivitäten bei der gleichen Rezeptorkonzentration verglichen werden.

Das Mikrotiterplattenverfahren zur Beurteilung eines Relanden nützt die Fähigkeit multimerer Relandenstrukturen aus, eine erhöhte Assoziationskonstante zu zeigen. Wenn die Mikrotiterplatte mit einem potenziellen Relandenkandidat beschichtet wird, der mit einem Protein konjugiert ist, gibt man den komplementären markierten Antikörper zu und lässt einen Komplex bilden. Wenn der Reland geeignet ist, wird es zur Freisetzung des markierten Antikörpers aus dem Komplex kommen, und er kann, nachdem eine Probe, die den Analyten enthielt, zugegeben wurde, im Überstand der Probe nachgewiesen werden. Ein Mikrotiterplattenformat wird für das Screening auf potenzielle Relanden eingesetzt, da die Technik sehr einfach ist. Um schnell und einfach auf potenzielle Relanden zu screenen, werden zunächst Mikrotiterplatten mit Albumin in einer Konzentration von 2 &mgr;g/ml beschichtet. Die verschiedenen Relandenkandidaten, die -COOH- oder -NH2-Gruppen tragen, werden zusammen mit Carbodiimid zu den Wells gegeben, und man lässt sie über Nacht mit dem Albumin in Wechselwirkung treten. Nach dem Waschen kann die mit dem Relanden beschichtete Platte getestet werden, zuerst, um ihre Fähigkeit zur Bindung des Antikörpers zu bestimmen, und dann zur Bestimmung ihrer Fähigkeit zur Freisetzung. In diesem Format ist es möglich, Dutzende von Relandenkandidaten schnell und einfach an einem Tag oder so zu screenen.

FREISETZUNGSASSAY-FORMAT

Der Freisetzungsassay der einen Rezeptor, einen Relanden und ein Mittel zum Nachweis des freigesetzten Relanden oder Rezeptors (falls es gewünscht wird, den freigesetzten Rezeptor nachzuweisen) umfasst, stellt ein schnelles, einfaches und kostengünstiges Verfahren zum Nachweis von Analyten bereit.

Analyten können diejenigen sein, die hier zuvor allgemein beschrieben wurden. Spezifische Ausführungsformen sind auf Theophyllin, glykiertes Hämoglobin, Stoffwechselprodukte des Nicotins, wie Cotinin, und C- und N-terminate Peptidmarker des Knochen- und Collagenturnovers, wie Telopeptide und Pyridinoline, die besonders für die Kontrolle der Osteoporose geeignet sind, gerichtet.

Das erfindungsgemäße Assayverfahren ist insofern ein direkter Assay, als er beim Nachweis der Dissoziation eines Rezeptor:Relanden-Komplexes ein positives Ergebnis liefert. Das heißt, das Vorliegen eines Analyten für den Rezeptor führt zur Freisetzung der markierten Komponente als positives Ereignis anstelle keines Ereignisses oder eines negativen Ereignisses, wie bei Assays nach dem Stande der Technik. Eine positive Korrelation ist vorteilhaft, da es psychologisch befriedigend ist, dass die Gegenwart eines Signals oder die Zunahme einer Signalintensität die Gegenwart eines Analyten in einer Probe anzeigt. Ergebnisse, die mit Assayverfahren erhalten werden, bei denen der Nachweis eines Signals abnimmt, wenn der Analyt vorhanden ist, sind anfällig für Fehlinterpretationen. Es ist erwünscht, einen Assay, wie denjenigen der vorliegenden Erfindung, einzusetzen, bei dem nur ein positives Ergebnis ein Signal erzeugt. Die erfindungsgemäßen Assays sind gleichermaßen sowohl für den Einsatz in einem Laboratorium durch technisches Personal als auch außerhalb eines Laboratoriums durch sowohl technisches als auch nicht-technisches Personal geeignet.

Bei einem heterogenen Freisetzungsassay ist vorzugsweise der Reland markiert, so dass die Relandenmarkierung nach der Freisetzung in Gegenwart des Analyten von Reaktionsprodukten abgetrennt und die Markierung nachgewiesen wird. In einem homogenen Freisetzungsassay kann, auch wenn es bevorzugt wird, dass der Reland markiert ist, unter bestimmten Bedingungen auch der Rezeptor markiert sein. Zum Beispiel kann auf dem Rezeptor eine Fluoreszenzmarkierung eingesetzt werden, und in diesem Falle kann der Reland einen Quencher der Fluoreszenz enthalten. Beim Rezeptor:Reland-Komplex ist das Fluoreszenzsignal somit gequencht, und es ist keine Fluoreszenz nachweisbar, bis es in Gegenwart des Analyten zur Freisetzung des Relanden kommt. Zu geeigneten Markierungen gehören Enzyme, Enzymhemmer, Fluorophore, Cofaktoren Chromophore, kolloidales Gold, Farbstoffe und chemilumineszierende Mittel sowie radioaktive Markierungen, die alle in diesem Gebiet gut bekannt sind. Das spezifische Verfahren zum Nachweis der Dissoziation eines Rezeptor:Reland-Komplexes hängt zum Teil davon ab, ob der Assay homogen oder heterogen ist.

Sobald ein geeigneter Rezeptor, ein geeigneter Reland und ein geeignetes Nachweisverfahren ausgewählt worden sind, sollte das Assaysystem für den Einsatz mit einer bestimmten Probenmatrix optimiert werden. Eine Urinprobe hat andere inhärente Eigenschaften als eine Probe in einem wässrigen Puffer. Das gleiche gilt für Proben aus Speichel, Blut, Plasma oder Serum oder für eine beliebige Körperflüssigkeit. Der Assay kann durch das Variieren der Reagenzienkonzentration, der Pufferzusammensetzung, der Freisetzungszeit, der Nachweiszeit, der Nulllinienkontrollen und anderer Variablen optimiert werden. Diese Variablen sind in diesem Gebiet gut bekannt, und ihre Justierungen zur Erzielung einer optimalen Spezifität und Empfindlichkeit des Assays mit einer bestimmten Assaymatrix werden für Fachleute auf diesem Gebiet leicht verständlich sein.

HOMOGENE FREISETZUNGSASSAYS

Der Freisetzungsassay kann in einer homogenen flüssigen Phase durchgeführt werden. Ein derartiger Assay wird bevorzugt, da er in einem einzigen Reaktionsgefäß durchgeführt werden kann und deshalb für den Einsatz mit automatischen Analysegeräten oder auf einer Membran und somit für eine On-Site-Testung gut geeignet ist.

Ein Rezeptor:Reland-Komplex in einem homogenen Freisetzungsassay umfasst ein geeignetes Markierungssystem als Nachweismittel, wobei die Markierungsaktivität vor der Freisetzung des Relanden vorzugsweise nicht nennenswert nachweisbar ist. Diese fehlende Nachweisbarkeit ist generell eine Konsequenz der Eigenschaften der Markierung und des Komplexes, die sich in Form einer Modulation der Aktivität des Nachweissystems, wie einer Abschwächung, Hemmung oder Aktivierung, manifestieren. Die Intensität des von der Markierung ausgehenden Signals wird bei der Bildung oder Dissoziation des Komplexes erhöht oder erniedrigt. Die Markierungen können zum Beispiel eine fluoreszierende Markierung, eine chemilumineszierende Markierung oder eine Enzymmarkierung einschließen, die am Relanden befestigt ist, sowie einen am Rezeptor befestigten geeigneten Quencher. Der Rezeptor kann selbst ein Quencher sein. Das Signal wird gequencht, und es wird kein Signal beobachtet. Nach der Dissoziation des Rezeptor:Reland-Komplexes und der Freisetzung des Rezeptors und des Relanden in Gegenwart des Analyten werden die Wirkungen der Modulation jedoch umgekehrt, und die Markierung wird nachweisbar sein. Es sind andere, von einer unmittelbaren Nachbarschaft abhängige Signalabschwächungsmittel, wie bei der Fluoreszenzpolarisation, in diesem Gebiet bekannt, und sie können für den Einsatz in einem Freisetzungsassay adaptiert werden. Alternativ kann der Reland mit einer Markierung in Form eines Cofaktors, eines Farbstoffs oder eines Enzymhemmers oder eines anderen Markierungstyps markiert werden, die nach der Freisetzung nachgewiesen wird, wie zum Beispiel die hier zuvor beschriebene FAD-Komponente der Glucoseoxidase. Es sollte ferner klar sein, dass sich die Markierung auf dem Rezeptor und der Quencher auf dem Relanden befinden kann.

HETEROGENE FREISETZUNGSASSAYS

Bei einer anderen Ausführungsform wird ein heterogener Festphasen/Flüssigphasen-Freisetzungsassay bereitgestellt. Bei einem derartigen Assay ist der Rezeptor irreversibel an einen Festphasenträger adsorbiert. So, wie der Begriff „irreversibel adsorbiert" hier verwendet wird, schließt er eine kovalente, eine nicht kovalente und eine ionische Assoziation ein. Zu Festphasenträgern gehören Plastikmaterialien, Polymerkügelchen, Glaskügelchen, Glas, Silicagel und die Wells einer Kunststoffmikrotiterplatte sowie Membranen wie Nylon und Nitrocellulosemembranen. Der Freisetzungsassay ist jedoch nicht auf eine bestimmte Wahl eines Festphasenträgers beschränkt, und es kann jeder in diesem Gebiet bekannte Festphasenträger verwendet werden.

Der Reland ist markiert, und es bildet sich ein stabiler Komplex, der das markierte Element und den Rezeptor auf dem Festphasenelement enthält. Sobald sich ein stabiler Rezeptor:Reland-Komplex gebildet hat, kann er der Probe ausgesetzt werden. Wenn der interessierende Analyt in der Probe vorhanden ist, läuft die Freisetzungsreaktion ab, und das Signal der Markierung wird in der flüssigen Phase nachgewiesen. Das Ausmaß der Freisetzung, und somit die Signalintensität in der flüssigen Phase, korreliert positiv mit der Menge des Analyten in der Probe. Die tatsächliche Konzentration kann mit Hilfe von Standardkurven erhalten werden, die gemäß Techniken, die Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt sind, erhalten oder hergestellt werden. Die Signalintensität der festen Phase nimmt umgekehrt proportional zur Menge des Analyten in der Probe ab.

Es können viele Markierungen in dem heterogenen Freisetzungsassay eingesetzt werden. Markierungen, wie Cofaktoren (z.B. FAD), Inhibitoren, Chromophore, Fluorophore, chemilumineszierende Agenzien, Radioisotope, chelatbildende Komplexe, Farbstoffe und kolloidales Gold, sekundäre Markierungen (z.B. Biotin oder ein Hapten) und dergleichen können in der flüssigen Phase nach der Freisetzungsreaktion als erhöhte enzymatische Aktivität, optische Dichte, Fluoreszenz, Lumineszenz, Radioaktivität, Farbe (für Farbstoffe), über den Nachweis der sekundären Markierung (z.B. mittels Avidin oder Streptavidin zum Nachweis von Biotin oder eines für ein Hapten spezifischen Antikörpers zum Nachweis des Haptens) und der Trübung (für kolloidales Gold) nachgewiesen werden. Wenn das Signal der Markierung, das im Rezeptor:Reland-Komplex gebunden bleibt, nicht nachgewiesen werden kann, kann der Assay ohne den Trennschritt durchgeführt werden, zum Beispiel in nur einem Reaktionsgefäß.

Bei einer bestimmten Ausführungsform, die für Anwendungen außerhalb von Laboratorien bevorzugt wird, wird die Gegenwart eines Analyten durch das Erscheinen einer Form, d.h. eines Buchstaben, in einem Reaktionsfeld auf einem festen Träger angezeigt. Dabei wird ein Reaktionsfeld, das eine Indikatorzone und eine Kontrollzone aufweist, auf einem Festphasenträger präpariert. Die Indikatorzone umfasst den immobifisierten Rezeptor, wie er vom heterogenen Assayformat bereitgestellt wird. Ein Rezeptor:Reland-Komplex in der Indikatorzone reagiert empfindlich bezüglich der Freisetzungsreaktion. Die Kontrollzone umfasst einen anderen Rezeptor:Ligand- oder Rezeptor:Reland-Komplex in der Kontrollzone, der nicht empfindlich bezüglich der spezifischen Freisetzungsreaktion ist, der aber eine unspezifische Freisetzung anzeigen kann, wenn die Bedingungen derart sind, dass sie eine unspezifische Freisetzung verursachen.

In der Praxis führt das Inkontaktbringen einer Probe, die den interessierenden Analyten enthält, mit dem Reaktionsfeld zu einer nachweisbaren Freisetzungsreaktion in der Indikatorzone und zu keiner Reaktion in der Kontrollzone. Die Freisetzungsreaktion wird als Bildung einer Zone, die einen Kontrast zur Indikatorzone bildet, nachgewiesen. Um das zu erreichen wird die Markierung sowohl für den Freisetzungskomplex als auch den Kontrollkomplex so gewählt, dass sie einen Kontrast zum festen Träger bildet.

Wenn sich keine Kontrastzone ausbildet, ist die Probe negativ. Ein „Verblassen" sowohl der Indikatorzone als auch der Kontrollzone, d.h. eine Freisetzung der Markierung aus beiden Komplexen, zeigt eine falsch positive Reaktion, ungeeignete Reaktionsbedingungen oder eine mögliche Verfälschung der Probe an. Auf diese Weise stellt die Kontrollzone eine Kontrolle für akkurate Assayergebnisse bereit. Bei einer alternativen Ausführungsform ist die Reaktionszone, auf der ein blauer Rezeptor:Reland-Komplex immobilisiert wurde, gelb. Die Freisetzung des Relanden (blaue Farbe), der ursprünglich die gelbe Farbe verdeckte, verursacht eine Farbänderung von Blau (negativ) nach Grün (schwach positiv) bis Gelb (stark positiv).

Vorzugsweise werden unterschiedliche Buchstaben oder Symbole als Indikator eingesetzt, in Abhängigkeit vom interessierenden Analyten. Zum Beispiel kann die Indikatorzone, die für einen Kokaingebrauch spezifisch ist, die Form des Buchstaben „K" haben; eine Indikatorzone für einen Marihuanagebrauch kann wie der Buchstabe „M" geformt sein (oder wie „T" für Tetrahydrocannabinol), und eine Zone, die einen Nicotingebrauch anzeigt, kann wie der Buchstabe „N" geformt sein.

Es ist klar, dass andere Kombinationen von Rezeptor und Reland genau so gut als Kontrollkomplexe fungieren können. Man stellt sich ferner vor, dass ein einziger Festphasenträger mehr als ein Nachweisfeld enthalten kann, da jedes Nachweisfeld spezifisch für einen bestimmten Analyten und unempfindlich für beliebige andere Analyten, z.B. Tetrahydrocannabinol, Benzoylecgonin und Cotinin, ist, und zwar in nur einem Format.

Zu geeigneten Markierungen für den Einsatz in diesem Assay gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, Farbstoffe, kolloidales Gold und dergleichen. Auch kann jeder beliebige Festphasenträger in dieser Ausführungsform eingesetzt werden, aber Kunststoff und Membranen, wie Nitrocellulose oder Nylon, werden bevorzugt. Außerdem kann der feste Träger, zum Beispiel eine Membran, eine Reihe von Linien aus dem markierten Reland:Rezeptor-Komplex aufweisen, die im Barcode-Format angeordnet sind, wobei jede Linie/jeder Strich für einen anderen Analyten spezifisch ist. Wenn ein derartiges Teil zum Beispiel in einen Testliganden getaucht wird, beispielsweise Milch, Speichel, Urin, Blut, eine Umweltprobe oder dergleichen, führt die Gegenwart des Analyten, der spezifisch für einen Strich ist, zum Verlust des markierten Relanden aus diesem Strich, was zu einer Veränderung führt, die mit dem Barcode-Leser gelesen werden kann.

Bei einer anderen Ausführungsform ist FAD mit dem Relanden konjugiert. Der Streifen ist eine Membran, die einen FAD-Reland:Rezeptor-Komplex, Apoglucoseoxidase, Glucose, Meerrettichperoxidase (HRP) und ein Chromogen, Tetramethylbenzidin (TMB), umfasst. Zusammen betrachtet bilden FAD, ApoGO, Glucose und HRP das Werkzeug zum Nachweis der Freisetzung. Das Inkontaktbringen der Probe, die den Analyten enthält, mit der Membran führt zur Freisetzung des Reland-FAD, das dann für die Aktivierung der ApoGO frei ist, die Glucose unter Bildung von H2O2 oxidiert, das dann durch das TMB unter Bildung einer blaugefärbten oxidierten Form von TMB reduziert wird. Dieses System kann auf die Weise hergestellt werden, die zur Herstellung von Streifen zur Messung der Blutglucose eingesetzt wird.

Bei noch einer weiteren Ausführungsform ist der Rezeptor: Reland/FAD-Komplex an der Basis oder der „Birne" einer thermometerförmigen Membran immobilisiert. Der Streifen oberhalb der Basis enthält immobilisierte ApoGO und Peroxidase. Die Freisetzung des FAD/Reland durch den Analyten führt dazu, dass der FAD/Reland die ApoGO-imprägnierte Strecke entlang wandert und an die ApoGO bindet. Die ApoGO wird nun in das aktive Enzym überführt, das dann die farberzeugende Reaktion einleitet, die im vorhergehenden Abschnitt beschrieben wurde. Der Abschnitt der Streifenfänge oder die Höhe der Säule, der bzw. die proportional zur freigesetzten Menge des FAD/Reland aktiviert wird, ändert die Farbe und kann visuell wie bei einem Thermometer abgelesen werden. Zum Beispiel kann eine Skala mit Zahlen, die Konzentrationen entsprechen, längs des Streifens bereitgestellt werden. Alternativ kann der Ablesebereich, statt eine Zahlenskala zu enthalten, in Farbzonen unterteilt sein, die halbquantitative Werte darstellen. Zum Beispiel könnten spezifische Farben einer niedrigen, mittleren, hohen und sehr hohen Konzentration zugeordnet werden. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform befindet sich der oben erwähnte „thermometerförmige" Streifen in einer laminierten Vorrichtung, wie es in der anhängigen US-Patentanmeldung von Serex mit der Serien-Nr. 08/047 156, eingereicht am 13. April 1993, Patent angemeldet von Lee Own und Fitzpatrick, beschrieben wird.

VERGLEICHSBEISPIEL 1: FREISETZUNGSASSAY FÜR COTININ

Cotinin und trans-3'-Hydroxycotinin sind die Hauptmetaboliten von Nicotin (Langone et al., 1973, Biochem. 12: 5025–30, Jacob et al., 1991, J. Chromatography 222: 61–70, Neurath et al., 1987, Int. Arch. Occup. Environ. Health 59: 199–201). Sie erscheinen im Urin im Verhältnis 1:3 (Neurath et al., oben). Der Nachweis des Cotinins im Urin, Serum oder Speichel ist das am häufigsten eingesetzte biochemische Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Nicotinexposition (Fitzpatrick, 1991, Clinical Chemistry News, Bd. 11). Im Gegensatz zu anderen Drogen kommt Nicotin aufgrund des Passivrauchens auch in Körperflüssigkeiten von Personen, die es nicht konsumieren, vor. Der interessante Bereich für einen Cotinin-Assay reicht von 0,010 &mgr;g/ml, der für die Testung von Speichel und Blut erforderlich ist, bis zu 10 &mgr;g/ml für Urin von Tabakkonsumenten (Greenberg et al., 1984, N. Engl. J. Med. 310: 1075–78, Matsukura et al., 1984, N. Engl. J. Med. 311: 828–31, Sepkovic et al., 1986, JAMA 256: 86„ Jarvis et al., 1987, Am. J. Public Health 77: 1435–8, Sherpers und Wald, 1988, Arch. Toxicol. 62: 395–7, Langone et al., 1988, J.I.M. 114: 73–8).

In diesem Beispiel werden Cotinin-Freisetzungsassays unter Einsatz von N-Propylcarboxyinorcotinin und N-Isopropylcarboxylnorcotinin als Relanden mit niedriger Affinität beschrieben. Cis-3'-Hydroxycotinin wurde ebenfalls untersucht. Die Freisetzungsassays wurden in einem dem EMIT®-Assay ähnlichen homogenen Format und im heterogenen Format (Mikrotiterplatten, ELISA-Format) durchgeführt und mit einem herkömmlichen kompetitiven Assay für Cotinin verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die erfindungsgemäßen Freisetzungsassays genauer sind und eine geringere Anfälligkeit gegenüber einer Kreuzreaktivität zeigen als bekannte Assays. Weiterhin hat der erfindungsgemäße Freisetzungsassay eine Standardkurve, die linear ist, mit r = 0,999 (siehe 4), und einen dynamischen Bereich, der fast 3 Zehnerpotenzen größer ist als der derzeit bekannter kompetitiver Assays oder Dissoziationsassays oder Sandwich-Assays.

Die folgenden Abschnitte zum Thema Materialien und Methoden stellen allgemeine Beschreibungen der hergestellten und in den Assays eingesetzten Reagenzien sowie der verwendeten Verfahren dar.

MATERIALIEN UND METHODEN

Zu den verwendeten Instrumenten gehörten ein SLT Lab-Instruments 340ATTC Microtiter Plate Reader und ein COBAS MIRE Autoanalyzer. Die Urinproben stammten aus einer Gruppe der Allgemeinbevölkerung, die zuvor auf Cotinin untersucht worden war. Die Proben wurden bei –20°C gelagert.

Alle Chemikalien stammten von Sigma Aldrich, sofern nichts anderes festgestellt wird. Cis- und trans-Hydroxycotinin wurden beim Labor von George Neurath (siehe Neurath et al., oben) gekauft. Glucose-6-phosphatdehydrogenase (G6PD) war von Beckman. Der Nicotin Metabolite Assay Kit, NiMA AutoMates®, und die ELISA-Kits, der Tobacco Screen® und der Cotinine Trace Quantities CotiTraq®-Test, das TMB-Chromogen-System, die Antiseren gegen Cotinin, der Peroxidase-markierte Anti-Cotinin-Antikörper und die Cotinin-Urinstandards können kommerziell von Serex Inc. (Maywood, New Jersey) bezogen werden.

DER REZEPTOR

Ein Antiserum gegen Carboxylcotinin wurde wie folgt gewonnen: 320 mg des Hämocyanins der Schlüssellochnapfschnecke (KLH) wurden in 40 ml entionisiertem Wasser gelöst. Dazu wurden 300 mg trans-4-Carboxylcotinin unter Rühren gegeben, bis es sich aufgelöst hatte. Es wurden 300 mg 1-Ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimid (EDC) unter Rühren zu der Reaktionsmischung gegeben, und es wurde über Nacht bei Raumtemperatur weitergerührt. Das KLH-Carboxylcotinin-Konjugat (das Immunogen) wurde 8 Stunden bei 2 bis 8°C gegen phosphatgepufferte Saline dialysiert. Die Dialyseflüssigkeit wurde einmal nach 4 Stunden gewechselt.

Kaninchen wurden gemäß Standardprotokollen mittels über mehrere Monate verteilter, wiederholter Injektionen mit dem Immunogen in Freunds Adjuvans immunisiert. Blutproben wurden in festgelegten Abständen entnommen, und die Zunahme des Antikörpertiters wurde mittels eines Enzymimmunoassays für Cotinin gemessen. Es wurden auch Messungen der Antikörperaffinität und der Kreuzreaktivität durchgeführt. Sobald diese Assays eine zufriedenstellende Leistungsfähigkeit des Antikörpers anzeigten, wurde den Kaninchen das Blut entnommen und Seren wurden isoliert und gepoolt. Das Antiserum wurde bei –40°C gelagert.

Die IgG-Fraktion wurde über eine Ammoniumsulfatfällung vom Serum abgetrennt. Eine Immunaffinitätssäule wurde über das Koppeln von succinyliertem Hydroxycotinin über seine Carboxygruppe an Aminosepharose 4B hergestellt. Der affinitätsgereinigte Antikörper wurde mittels des Natriummetaperiodat-Verfahrens mit Meerrettichperoxidase markiert.

PRÄPARATION DER RELANDEN

1-Isopropyl-4-carboxyl-5-(3-pyridyl)-2-pyrrolidinon (hier im Folgenden N-Isopropylnorcotinin genannt) und 1-Propyl-4-carboxyl-5(3-pyiridyl)-2-pyrrolidinon (hier im Folgenden N-Propylnorcotinin genannt) (1C und 1D) wurden gemäß den Verfahren von Cushman & Castagnoli (1972, J. Org. Chem. 37: 1268) hergestellt. Es wurden, um das Ganze kurz zusammenzufassen, zu einer Lösung von 17 g Pyridin-3-carboxylaldehyd in 50 ml Benzol eine benzolische Lösung von 8 g Isopropylamin (oder 8 g Propylamin) und 12 g Molekularsiebpellets gegeben. Die Mischung wurde in einem Kolben bei 20°C über Nacht gerührt. Die Lösung wurde durch zwei Lagen Filterpapier, Whatman Nr. 2, filtriert und bei vermindertem Druck eingedampft, wodurch das Imin als ein gelbes Öl erhalten wurde. Die Struktur der Produkte wurde mittels NMR bestätigt.

N-Isopropylnorcotinin und N-Propylnorcotinin wurden wie folgt hergestellt. Zwölf g N-3-Pyridylidenisopropylimin oder N-3-Pyridylidenpropylimin und 15 g Succinanhydrid wurden 24 Stunden in 100 ml Xylol refluxiert. Nach dem Abkühlen der Mischung wurde die obere Schicht abgegossen und verworfen. Der Rückstand in Form eines braunen Öls wurde in 300 ml einer 5%igen Natriumbicarbonatlösung gelöst, mit zwei 250-ml-Portionen Chloroform gewaschen und durch Adsorption mit 1 g Aktivkohle entfärbt. Die Suspension wurde filtriert, und das gelbe Filtrat wurde auf einem Dampfbad zur Entfernung von Chloroformspuren erhitzt. Der pH wurde mit Phosphorsäure auf 4,7 eingestellt, um das Produkt auszufällen. Die rohe Carbonsäure wurde durch Filtration gesammelt und aus siedendem Ethanol umkristallisiert, wodurch 4 g weiße Kristalle erhalten wurden. Die Strukturen der Verbindungen wurden mittels NMR bestätigt.

HERSTELLUNG VON GLUCOSE-6-PHOSPHAT-DEHYDROGENASE (G6PD)-KONJUGATEN

Konjugate von N-Isopropylnorcotinin, N-Propylnorcotinin und cis-3'-Hydroxycotinin mit Glucose-6-phosphatdehydrogenase wurden mittels der von Rubenstein und Ullman (1975, US-Patent Nr. 3 875 011) beschriebenen Verfahren hergestellt. Es wurden, um das ganze kurz zusammenzufassen, zu 1 ml 0,1 M Natriumcarbonatpuffer, pH 9,0, 0,43 ml Glucose-6-phosphatdehydrogenase (2,8 mg), 20 mg NADH (Dinatriumsalz), 10 mg Glucose-6-phosphat und 300 &mgr;l Carbitol gegeben. Die Lösung („Enzymlösung") wurde, um sie abzukühlen, bei 4°C gelagert.

In ein leeres Teströhrchen wurden 26 mg N-Propyl- oder N-Isopropylnorcotinin, 12 mg N-Hydroxysuccinimid, 21 mg Dicyclohexylcarbodiimid und 1,0 ml Dimethylformamid gegeben. Diese Mischung ließ man 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen, damit sich der aktivierte Cotininester bildete. Nach 1 Stunde wurden in 15-minütigen Abständen 10 &mgr;l der Reaktionsmischung zu der kalten Enzymlösung gegeben, bis insgesamt 70 &mgr;l zugegeben worden waren (insgesamt 90 Minuten). Fünfzehn Minuten nach der letzten Zugabe der Reaktionsmischung wurde das modifizierte Enzym gegen fünf Wechsel aus jeweils 1 Liter 0,055 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,9, für jeweils mindestens drei Stunden dialysiert.

Die G6PD dient als Markierung, wenn sie an den Relanden konjugiert und in einem homogenen System eingesetzt wird. Wenn der konjugierte Reland in einem heterogenen System eingesetzt wird, wird die G6PD nicht als Markierung verwendet, sonder als ein Trägerprotein zur Verbesserung der Befestigung des Haptens an der festen Phase. Bei einer Konjugation mit der G6PD liegt der Reland in multimerer Form vor, und die Assoziationskonstante ist bis 5 Zehnerpotenzen größer als die der monomeren Form. Ein Reland in dieser Form wir nicht bevorzugt, wenn Komplexe mit einer Langzeitstabilität von bis zu 6 Monaten benötigt werden, wie es der Fall wäre, wenn die Komplexe in Form eines Kits bereitgestellt werden sollten. Für derartige Zwecke wird im Allgemeinen ein Reland von unter 5000 Dalton eingesetzt.

REAGENZIEN FÜR DEN HOMOGENEN FREISETZUNGSASSAY

Die Reagenzienlösungen für den homogenen Freisetzungsassay für Cotinin wurden in Form von drei getrennten Lösungen, der Reagenzien A, A+ und B, hergestellt. Das Reagens A bestand aus dem Glucose-6-phosphatdehydrogenase-Reland-Konjugat mit einer Proteinkonzentration von 0,74 &mgr;g/ml, 0,05 M Tris-Puffer, 5 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, 1,75 mg/ml Glucose-6-phosphat, 0,5% BSA und Konservierungsmitteln, bei einem pH von 7,9. Das Reagens A+ bestand aus dem Antiserum im Puffer für das Reagens A.

Die Reagenzien A und A+ wurden vor der Verwendung gemischt, um die Arbeitslösung A herzustellen, die bei 4°C eine Woche stabil ist.

Das Reagens B bestand aus 3,3 mg/ml NAD in 0,02 M Tris-Puffer, pH 7,0.

Die Kreuzreaktivität wurde mit Cotinin- und/oder trans-3'-Hydroxycotinin-Lösungen getestet, die wie folgt hergestellt wurden. Zu 10 ml eines negativen Urinpools wurden 100 &mgr;g Cotinin oder trans-3'-Hydroxycotinin des gleichen negativen Urinstandards gegeben, um Lösungen von 5, 2,5, 1,25, 0,62, 0,31 und 0,16 &mgr;g/ml Cotinin oder trans-3'-Hydroxycotinin zu erhalten.

Zur Herstellung der Lösung von Cotinin und trans-3'-Hydroxycotinin im Verhältnis 1:3 wurde ein 10-ml-Aliquot des negativen Urinstandards mit 100 &mgr;g Cotinin und 300 &mgr;g trans-3'-Hydroxycotinin versetzt. Diese Lösung wurde gemischt, und mit dem gleichen negativen Urinstandard wurde eine Verdünnungsreihe hergestellt, so dass Verdünnungen von 5 (15), 2,5 (7,5), 1,25 (3,75), 0,62 (1,87), 0,31 (0,94) und 0,16 (0,48) &mgr;g/ml Cotinin (Hydroxycotinin) erhalten wurden.

Die Kreuzreaktivität wurde mittels der folgenden Formel berechnet:

FREISETZUNGSASSAY IM (HETEROGENEN) ELISA-FORMAT

Mikrotiterplatten von Corning wurden über Nacht mit 100 &mgr;l Glucose-6-phosphatdehydrogenase, konjugiert mit entweder N-Propylnorcotinin oder N-Isopropylnorcotinin, in einer Konzentration von 1 &mgr;g Protein pro ml PBS beschichtet. Die Wells wurden geleert, getrocknet und mit einem Trockenmittel bis zur Verwendung gelagert. Zur Aktivierung für die Freisetzung wurde die Platte eine Stunde mit 100 &mgr;l Meerrettichperoxidasemarkiertem, affinitätsgereinigtem Anti-Cotinin-Antikörper inkubiert. Überschüssiger Antikörper wurde durch zwei Waschungen mit 0,05% Tween 20 in PBS entfernt.

Zu einer mit dem oben hergestellten Antikörper:Reland-Komplex beschichteten Mikrotiterplatte wurden pro Well 10 &mgr;l Urinstandards (0, 0,5, 2 und 8 &mgr;g Cotinin/ml) und 90 &mgr;l destilliertes Wasser gegeben. Nach 2 Minuten wurden 50 &mgr;l des Überstands in unbeschichtete Wells übertragen, die 100 &mgr;l TMB enthielten, und 10 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde mit 50 &mgr;l 2 N H2SO4 gestoppt, und es wurde die Extinktion bei 450 nm bestimmt.

Die Ergebnisse des Assays sind in der 2 gezeigt. Die Freisetzung des mit der festen Phase komplexierten markierten Antikörpers wurde im Überstand nachgewiesen, wenn freies Cotinin in der Probe vorlag. Im Gegensatz zu herkömmlichen kompetitiven Immunoassays war die Extinktion oder das Signal direkt proportional zur Konzentration des Analyten. Die besten Freisetzungseigenschaften zeigte cis-Hydroxycotinin (Kurve 1), gefolgt von Isopropylcotinin (Kurve 2), wobei die N-Propyl-Verbindung (Kurve 3) die geringste Freisetzung zeigte. Trotz der besseren Freisetzung der Hydroxycotininkonjugate wird die Hydroxycotininverbindung nicht als ein für dieses System geeigneter Reland angesehen, und zwar aufgrund ihrer Tendenz, einen Komplex zu bilden, der mit der Zeit nicht mehr freisetzbar wird. Im ELISA-Format vermindert der Endpunkt-Freisetzungsassay die Zeit für den Assay auf unter 15 Minuten (2 Minuten für die Freisetzungsreaktion und 10 Minuten für die TMB-Farbentwicklung) im Vergleich zu den 1 bis 2 Stunden, die normalerweise für das herkömmliche Cotinin-ELISA-Format benötigt werden. Die Zeit für den vorliegenden Assay könnte weiter verkürzt werden, zum Beispiel durch das Automatisieren der Assayschritte, wie durch das Durchführen eines Reaktionsgeschwindigkeitsassays mit einem automatischen Instrument. Der Freisetzungsassay vermindert auch die Zahl der Assayschritte um wenigstens die Hälfte. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass die Freisetzung in Gegenwart des Analyten ein positives Signal liefert.

Der herkömmliche homogene Assay

Das Format des NiMA-AutoMates® (Handelsname von Serex Inc., Maywood, New Jersey) ist ein homogener kompetitiver Assay oder Assay vom EMIT-Typ, wie er von Tubenstein, Schneider und Ullman (1972, oben) beschrieben wurde. Die Immunreaktion besteht aus zwei Schritten: AK + Analyt → AK:Analyt + AKAK:Analyt + AK + Ligand:Enzym → AK:Ligand:Enzym + AK:Analyt

Es wurde, um das ganze kurz zusammenzufassen, die Probe mehrere Minuten mit dem Antiserum vorinkubiert. Zu dieser Reaktionsmischung wurde die mit dem Cotinin-Liganden konjugierte Glucose-6-phosphatdehydrogenase (Enzym) gegeben. Der Antikörper, der in der Probe nicht mit Cotinin in Wechselwirkung getreten ist, bindet an das Cotinin an der Glucose-6-phosphatdehydrogenase. Die Bindung des Antikörpers an den mit dem Enzym verknüpften Liganden hemmt die Enzymaktivität, und somit steht die Enzymaktivität in direkter Beziehung zur Konzentration des Analyten in der Probe. Die Enzymaktivität der Glucose-6-phosphatdehydrogenase wurde durch das Verfolgen der Bildung von NADH bei 340 nm gemessen, das sich bildet, wenn das Enzym Glucose-6-phosphat zu Gluconolacton-6-phosphat oxidiert und NAD zu NADH reduziert.

Die herkömmlichen homogenen Assays wurden mit dem COBAS MIRA-Gerät gemäß den Parametern der NiMA-AutoMates®-Anleitung wie folgt durchgeführt:

Zweihundert &mgr;l Reagens A wurden mit 10 &mgr;l der Probe 75 Sekunden bei 37°C inkubiert. Es wurden fünfzig &mgr;l des Reagens B zugegeben, und die Mischung wurde 25 Sekunden inkubiert. Die Extinktion wurde während der letzten 250 Sekunden abgelesen. Die Gesamtzeit für den Assay betrug 5,83 Minuten.

Der Freisetzungsassay im homogenen Format

Der erfindungsgemäße homogene Assay wurde auf dem Cobas Mira im AutoMates®-Format (Handelsname von Serex Inc., Maywood, New Jersey) durchgeführt, wobei das gleiche Enzymsystem und die gleichen Reagenzien (mit Ausnahme des Relanden) wie beim herkömmlichen homogenen Assay verwendet wurden, wobei das ganze aber wie folgt modifiziert wurde, um eine Freisetzungsreaktion zu erhalten: AK: Reland-Enzym + Analyt → AK:Analyt + Reland-Enzym

Zur Herstellung des AK:Reland-Enzym-Produkts wurden das Reland:Enzym-Konjugat in Puffer und das Antiserum (AK) in Puffer mindestens eine Stunde gemischt, um eine Arbeitslösung A zu bilden, die bei 4°C eine Woche stabil ist. Die Reaktion wurde durch die Zugabe der Probe (25 &mgr;l) und von NAD (10 &mgr;l Reagens B) zu 200 &mgr;l des Arbeitsreagens A (25 Sekunden inkubiert) gestartet. Die Extinktion wurde während der letzten 200 Sekunden abgelesen. Die Gesamtzeit für den Assay betrug 5,0 Minuten. Wie beim herkömmlichen kompetitiven Assay wurde die Enzymaktivität über das Verfolgen der Bildung von NADH bei 340 nm gemessen. Die Enzymaktivität ist der Konzentration des Analyten in der Probe direkt proportional.

Die Dosis-Wirkungskurven für den herkömmlichen homogenen Assay (NiMa®) (Kurve 2) und den homogenen Freisetzungsassay (Kurve 1) demonstrieren den stark erhöhten Arbeitsbereich des Freisetzungsassays (3). Wie aus der 3 hervorgeht, liegt die maximale Cotininmenge, die mittels des herkömmlichen kompetitiven Assays vom EMIT-Typ gemessen werden kann, bei 2 &mgr;g/ml. Außerdem liegt das untere Ende der Empfindlichkeit des Freisetzungsassays bei 10 ng/ml im Vergleich zu 50 ng/ml für den herkömmlichen Assay (siehe Tabelle 1). Der Arbeitsbereich des Freisetzungsassays ist vergrößert, da der Freisetzungsassay nicht kompetitiv ist, und da er ein System ist, das im Gleichgewicht beginnt. Es ist deshalb möglich, höhere Ausgangskonzentrationen des Enzymkomplexes einzusetzen, ohne das Rauschen zu erhöhen und die Empfindlichkeit am unteren Ende zu verlieren. Bei herkömmlichen kompetitiven Immunoassays verändert der Zusatz von mehr Reagenzien die Empfindlichkeit des Assays, indem er die letztendlichen Gleichgewichtsbedingungen verschiebt. Die Enzymkonzentrationen, die für die Demonstration des Freisetzungsassays verwendet wurden, lagen bei 0,50 &mgr;g/ml im Vergleich zu 0,03 &mgr;g/ml für den herkömmlichen homogenen (assoziativen) Assay. Jedoch enthielt der Assay vom herkömmlichen Typ ungefähr 8-mal mehr Antikörper pro Enzymmolekül als der Freisetzungsassay. Das Verhältnis von Antikörper zu Enzym bestimmt die Assayempfindlichkeit.

Ein Vergleich des kompetitiven Formats und des Freisetzungsformats ist in der folgenden Tabelle 1 dargestellt, um weitere Variable anzugeben.

Die Tabelle 1 zeigt, dass der Freisetzungsassay 17-mal mehr Enzym und 2-mal mehr Antikörper einsetzt als der kompetitive Assay. Aber die erhöhten Enzym- und Antikörpermengen führen nicht zu einer verringerten Empfindlichkeit, wie es beim kompetitiven Immunoassay der Fall ist. (Es könnten kleinere Mengen aller Reaktionspartner im Freisetzungsassay eingesetzt werden, aber das begrenzt den oberen Bereich des Assays). Die 4 zeigt den außerordentlichen Arbeitsbereich des Assays von 0,01–1000 &mgr;g/ml. In dem gezeigten Beispiel führt eine 17-fache Erhöhung des Reaktionspartners zu einer mehr als 1000-fachen Erhöhung des Arbeitsbereiches des Assays, ohne dass es zu einem Verlust an Empfindlichkeit oder Genauigkeit am unteren Ende der Kurve kommt. Diese Formulierung spricht auf 10 ng/ml an und kann zur Quantifizierung von Speichelproben verwendet werden. Das Verhältnis von Antikörper zu Enzym des herkömmlichen Assays setzt 8-mal mehr Antikörper pro Enzymmolekül ein als der Freisetzungsassay. Beim Freisetzungsassay können alle Antikörpermoleküle an Relanden, die mit Enzymen konjugiert sind, gebunden werden und sind imstande, vom Analyten freigesetzt zu werden. Beim herkömmlichen Assay liegt ein großer Überschuss an Antikörper vor, was die Reaktionszeit erniedrigt, aber auch die Empfindlichkeit erniedrigt. Die Fähigkeit des Freisetzungsassays, die Aktivität eines viel größeren Prozentsatzes des Antikörpers in der Reaktionsmischung zu verfolgen, erhöht die Empfindlichkeit und erniedrigt das Hintergrundrauschen und die Reaktionszeit. Die Freisetzung erfolgt hier aus dem Multimer und liegt bei bis zu 100%, was die Unfähigkeit des Multimers zu einer nennenswerten Kompetition anzeigt.

KREUZREAKTIVITÄT: TRANS-HYDROXYCOTININ

Die höhere Spezifität des Freisetzungsassays im Vergleich zum herkömmlichen Assay wurde bestätigt, indem gezeigt wurde (Tabelle 2), dass trans-3'-Hydroxycotinin, ein Metabolit des Nicotins, viel weniger im Freisetzungsassay stört (kreuzreagiert) als in einem herkömmlichen kompetitiven Assay. Das ist deshalb wichtig, weil trans-3'-Hydroxycotinin und andere Metaboliten das Nachweissystem für Cotinin in Immunoassays stören.

Der Freisetzungsassay zeigte zwar ein Viertel der Kreuzreaktivität des herkömmlichen Assays mit Hydroxycotinin, aber es kam nicht zu einer Kreuzreaktivität am unteren Ende der Kurve, d.h. wo die Konzentrationen in der klinischen Praxis kritisch sind. Wichtig ist, dass das größte Ausmaß der Störung beim herkömmlichen Assay am unteren Ende der Kurve gesehen wurde, d.h. gerade in dem Teil des Assays, in dem keine Kreuzreaktivität gewünscht ist.

KREUZREAKTIVITÄT VON N-ISOPROPYLNORCOTININ

Um die Stabilität und Freisetzbarkeit des Antikörper-Reland-Komplexes weiter zu testen, charakterisierten wir die Fähigkeit von N-Isopropylnorcotinin zur Störung der verschiedenen Cotinin-Assays von Serex, die alle den gleichen Antikörper einsetzten. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 gezeigt.

Der Reland N-Isopropylcotinin zeigte weniger als 0,4% Kreuzreaktivität mit dem Nachweisantikörper (der gleiche für alle Assays), sogar in so hohen Konzentrationen wie 100 &mgr;g/ml, ein Punkt, der deutlich außerhalb des physiologischen Bereiches liegt. Der Reland zeigt bis zu 100 &mgr;g/ml keine Kreuzreaktivität mit dem auf der G-6-P-DH mit ihm komplexierten Antikörper.

KLINISCHE DATEN

Der Freisetzungsassay identifizierte korrekt die 106 klinischen Proben als Raucher (mehr als 0,5 &mgr;g/ml Cotinin). Die homogenen Freisetzungsassays NiMA AutoMates® und Tobacco Screen® (ein ELISA-Test, der von Serex für Assays von Urinproben auf Cotinin vermarktet wird) wurden unter Verwendung einer Ausschlussgrenze von 0,5 &mgr;g/ml Cotinin miteinander verglichen. Die Tabelle 5 zeigt, dass der erfindungsgemäße homogene Freisetzungsassay zu 100% mit beiden Testverfahren korreliert (Tobacco Screen® korreliert zu 100% mit HPLC-Ergebnissen).

ASSAYGENAUIGKEIT

Der homogene Freisetzungsassay und der homogene NiMA®-Assay für Cotinin wurden mittels eines COBAS MIRA bezüglich ihrer Genauigkeit unter Verwendung einer negativen Urinprobe und von Urinproben mit 0,5 &mgr;g/ml und 2 &mgr;g/ml untersucht (Tabelle 6). Die Genauigkeit wird dazu verwendet, den Variationskoeffizienten für wiederholte Tests der gleichen Probe zu zeigen. Der Freisetzungsassay zeigte eine über 2-fache Verbesserung der Genauigkeit gegenüber dem kompetitiven Assay. Obwohl die Konzentrationen der Reaktionspartner 17-mal höher waren als beim NiMa®-Assay, hatte der Freisetzungsassay eine höhere Genauigkeit.

Die mit dem erfindungsgemäßen Freisetzungsassay gesehene, mehr als zweifache Verbesserung der Genauigkeit beruht wahrscheinlich auf mehreren Faktoren: Das Ausgangssystem befindet sich im Gleichgewicht; es erfolgt nur eine Reaktion, die Dissoziation; und die Matrix hat wahrscheinlich weniger Auswirkungen auf die Reaktion, wie aus der erniedrigten Kreuzreaktivität hervorgeht.

BEISPIEL 2: FREISETZUNGSASSAY FÜR OSTEOPOROSEMARKER

Der Marker für einen unten gezeigten Osteoporose-Assay ist freies Pyridinolin, ein gut bekanntes Abbauprodukt des Knochens und Knorpels. Der Marker kann gemäß den Verfahren von Akiba K. und Nakamura N., 1977, BBRC 76: 1124 hergestellt werden.

Kandidaten für Relanden wurden aus Pyridin-Analogen ausgewählt, die aus dem Aldrich-Katalog ausgesucht wurden. Zwei Analoge, Pyridoxamin und Pyridoxal, wurden wie folgt mit Biotin markiert:

Synthese eines Pyrodoxal-Biotin-Konjugats

Zu einer Mischung der Pyridoxal-HCl-Salzes (5,7 mg, 0,028 mmol) mit Biotinhydrazid (7,9 mg, 0,031 mmol) in DMF (1 ml) wurde Triethylamin (4,7 &mgr;l, 0,033 mmol) gegeben. Die Mischung wurde bei 4°C über Nacht gerührt, und das Lösemittel wurde bei vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mit 0,1 Trifluoressigsäure in H2O behandelt, und das Lösemittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde dann aus Methanol umkristallisiert, wodurch 5,0 mg des Pyridoxal-Biotin-Konjugats in Form eines gebrochen weißen Pulvers erhalten wurden.

Synthese des Pyridoxamin-Biotin-Konjugats

Zu einer Suspension von Pyridoxaminhydrochlorid (11,8 mg, 0,049 mmol) in 1,5 ml DMF wurde Triethylamin (Et3N) (20,5 &mgr;l, 0,15 mmol) gegeben. Dann wurde N-Hydroxysuccinamidbiotin (18 mg, 0,054 mmol) zu der obigen klaren Lösung gegeben, und die resultierende Lösung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde eingeengt, und der Rückstand wurde mittels präparativer Dünnschichtchromatographie (1% Et3N – 10% MeOH in CH2Cl2) gereinigt, wodurch 10,1 mg des Pyridoxamin-Biotin-Konjugats in Form eines schwach pinkfarbenen Pulvers erhalten wurden.

BINDUNGEN BIOTINYLIERTER ANALOGER AN EINEN MONOKLONALEN ANTIKÖRPER GEGEN PYRIDINOLIN

Biotinyliertes Pyridoxamin und biotinyliertes Pyridoxal wurden wie folgt an einen Antipyridinolin-Antikörper gebunden:

Antipyridinolin (monoklonaler Antikörper aus dem PYRALINKS-KIT, der von Metra Inc., Kalifornien, hergestellt wird) wurde in einer Konzentration von 4,6 &mgr;g/ml PBS über Nacht bei Raumtemperatur auf eine Mikrotiterplatte aufgebracht. Die mit dem Antikörper beschichtete Platte wurde mit unterschiedlichen Konzentrationen des biotinyliertes Reland-Kandidaten (10 &mgr;l Reland + 90 &mgr;l PBS 0/6% Tween 20, pH 7,4) über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platte wurde dann ausgewaschen und 30 Minuten mit einem Avidin-Meerrettichperoxidase-Konjugat (Jackson Immuno Research Lab., Pennsylvania) in einer Konzentration von 0,1 mg/ml in einer Lösung von Rinderserumalbumin, 1 mg/ml PBS, pH 7,4, und 0,06% Tween 20 inkubiert. Nach dem Waschen wurde die gebundene Peroxidase mit TMB gemessen. Die Menge der gebundenen Peroxidase war direkt der Menge des an den Antikörper auf der festen Phase gebundenen biotinylierten Analogen proportional. Die mit Pyridoxal-Biotin erhaltenen Ergebnisse sind in der 12 gezeigt. Wie man sieht, führte das Biotin-Pyridoxal-Konjugat zu einer höheren Bindung an den Antikörper.

FREISETZUNG VON BIOTINYLIERTEM PYRIDOXAL AUS DEM KOMPLEX MIT DEM ANTIKÖRPER DURCH FREIES PYRIDINOLIN

Der Antipyridinolin-Antikörper wurde wie oben beschrieben auf Mikrotiterplatten befestigt. Die mit dem Antikörper beschichtete Platte wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 100 &mgr;l einer Lösung des biotinylierten Pyridoxals in einer Endkonzentration von 200 &mgr;g/ml in PBS, pH 7,4 inkubiert. Nach dem Waschen wurde die Platte mit einem Avidin-Peroxidase-Konjugat (von Jackson Imm. Res. Lab.) in einer Konzentration von 0,1 &mgr;g/ml in 1 mg/ml Rinderserumalbumin in Waschpuffer, pH 7,4, 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Wegwaschen des überschüssigen Avidin-Peroxidase-Konjugats wurde die Freisetzung mit freiem Pyridinolin (METRAsupra) durchgeführt. Es wurden der Platte 100 &mgr;l unterschiedlicher Pyridinolinmengen (0, 0,09 &mgr;/ml, 0,9 &mgr;g/ml) in PBS 10 Minuten bei Raumtemperatur zugegeben. Dann wurden 75 &mgr;l der flüssigen Phase in eine anderen Mikrotiterplatte übertragen und zu 75 &mgr;l einer Serex-TMB-Lösung gegeben, die 1/10 mit entionisiertem Wasser verdünnt worden war. Die Menge der freigesetzten Peroxidase spiegelte die Menge des biotinylierten Relanden, der aus dem Komplex mit dem Antikörper freigesetzt worden war, wider. Die Ergebnisse sind in der 13 gezeigt.

BEISPIEL 3: FREISETZUNGSASSAY FÜR GLYKIERTES HÄMOGLOBIN

Dieses Beispiel demonstriert die Machbarkeit eines Freisetzungsassays für ein Protein, glykiertes Hämoglobin (Hb Glc). Ein derartiges Format führt im Vergleich zu herkömmlichen kompetitiven Assays oder Sandwich-Assays zu einer leichteren Durchführung und zu einer verbesserten Genauigkeit. Insbesondere scheint der erfindungsgemäße Assay für Hb Glc hinsichtlich seiner Fähigkeit, zwischen glykierten und nicht glykierten Formen des Hämoglobins (Hb) zu unterscheiden, deutlich überlegen zu sein.

Hb Glc macht bis zu 4% des Hämoglobins in einer normalen Probe aus. Diese Menge kann bei Diabetikern 2- bis 3-mal höher sein. Somit ist Hb Glc ein nützlicher prognostischer Marker für die Kontrolle der Glykämie während des letzten Monats. Es gibt am Hämoglobin drei Stellen für eine Glykierung in vivo zusätzlich zu der Glykierungsmodifikation des Hämoglobins A1C (Hb A1c). Hämoglobin A1c ist ein Hämoglobin, das am aminoterminalen Valin der Beta-Kette des Hämoglobins glykiert ist. Die anderen drei Glykierungsstellen des Moleküls können beim Hb A1c glykiert sein, müssen es aber nicht. In normalen Proben können 2 bis 4% des Hämoglobins als Hb A1c vorliegen, und diese Menge kann bei Diabetikern auch 2- bis 3-mal höher sein.

Zwei monoklonale Antikörper, die für humanes Glyko-Hämoglobin spezifisch sind, wurden von Exocell (Philadelphia, Pennsylvania) bezogen, und zwar Klon A, 1,58 mg/ml E85.1A, Lot 94H 4.142, und Klon B, 2 mg/ml E85-1B, Lot 94C 3.01). HbAo (nicht glykiertes Hb) und HbG1c wurden von Exocell bezogen. Die Antikörper wurden jeweils gegen glykiertes und nicht glykiertes Hb, beide von Exocell, wie folgt titriert:

Herkömmlicher Assay für die Bestimmung

Eine Mikrotiterplatte wurde mit Hb Ao oder HvGlc in PBS in einer Konzentration von 10 &mgr;g/ml beschichtet. Der Klon A und der Klon B wurden 1:20 in PBS verdünnt, und 100 &mgr;l wurden zu jedem Well gegeben und 1 Stunde inkubiert. Die Platte wurde mit PBS gewaschen und eine Stunde mit einem mit alkalischer Phosphatase markierten Antimaus-Antikörper (Sigma A3688) inkubiert. Nach dem Waschen wurde die alkalische Phosphatase mit p-Nitrophenylphosphat (PNPP) (Kirkegaard & Perry Labs, Maryland) 60 Minuten lang nachgewiesen, 5. Beide Klone interagierten sowohl mit glykiertem (dunkleres Muster) als auch nicht glykiertem Hb. Der Klon B war offenbar reaktiver.

Die Reaktivität gegenüber nicht glykiertem Hb lag zwischen 50% und 70% derjenigen, die mit glykiertem Hb gefunden wurde. Somit ist dieser Antikörper in einem herkömmlichen Assayformat, wenn 90 bis 98% nicht glykiertes Hb + 2 bis 10% glykiertes Hb vorliegen, für das glykierte Hämoglobin nicht hochspezifisch.

Die Kreuzreaktivität zwischen glykiertem und nicht glykiertem Hämoglobin, die mit dem monoklonalen Antikörper von Exocell gesehen wurde, war erwartet worden. Es gibt nur einen kleinen Unterschied zum glykierten Hb Glc, und zwar das glykierte Lysin, wobei der Rest des Epitops in jedem Molekül gleich ist.

Die Hämoglobinsequenz, gegen die beide Antikörper gerichtet sind, wurde als die Beta-17-Stelle (Lysin) identifiziert, aber es sieht so aus, dass es eine Kreuzreaktivität mit der Beta-66-Stelle gibt, die sehr ähnlich ist (beide Stellen teilen die Sequenz Gly-Lys-Val). Außerdem wird berichtet, dass der Antikörper sowohl mit in-vivo- als auch mit in-vitro-glykiertem Hb reagiert. Die Sequenzen der angenommenen Glykierungsstellen sind unten gezeigt: Beta Lys-17 W G K V N V D Beta Lys-66 K A N G K V L G A

Es wurde ein Peptid mit der Sequenz acetyliertes Amino (Ac-) Trp Gly Lys Val Leu Gly Ala Gly Gly als potenzieller Reland hergestellt. Dieses Peptid, ein Hybrid, das aus den beiden der obigen Sequenzen konstruiert wurde, wurde in einer Konzentration von 0,5 mg/ml in PBS, pH 7,4, bei Raumtemperatur in einer 6-tägigen Behandlung mit 0,5% Glucose zur Erzielung einer Glykierung eingesetzt. Das glykierte Peptid wurde mit Albumin konjugiert und als Festphasenreagens in einen ELISA-Assay wie folgt eingesetzt:

Mikrotiterplatten wurden mit Albumin in einer Konzentration von 5 &mgr;g/ml in PBS, pH 7,4, über Nacht beschichtet. Die Platte wurde dann mit Carbodiimid (Sigma E6383) in einer Konzentration von 10 &mgr;g/ml behandelt, und es wurden 100 &mgr;l des glykierten Peptids in einer Konzentration von 10 &mgr;g/ml zugegeben, und dann ließ man es über Nacht reagieren. Sowohl der Klon A als auch der Klon B banden an das Peptid, und keiner von ihnen wurde durch glykiertes Hämoglobin an der Bindung gehindert. Das zeigt, dass das glykierte Peptid die Antikörper zu gut band und somit nicht als Reland geeignet war.

Da die Glykierung des Peptids zusammen mit der Konjugation ein Produkt erzeugte, das eine zu hohe Affinität für den Antikörper hatte, wurde das nicht glykierte Peptid als Reland ausgewählt. Der Reland wurde zur Untersuchung über eine Konjugation mit Biotin markiert, so dass ein Reland-Biotin-Konjugat gebildet wurde. Das Produkt wurde mittels Dünnschichtchromatographie gereinigt und bezüglich seiner Fähigkeit, die monoklonalen Anti-Hb Glc- Antikörper zu binden, getestet.

Im Einzelnen wurde die Fähigkeit des Reland-Biotin-Konjugats, durch Hb und Hb Glc freigesetzt zu werden, getestet. Ein Antikörper:Reland-Komplex wurde mit dem Klon B gebildet, da der Klon B den höheren Titer hatte. Das Reland-Biotin wurde separat mit jedem monoklonalen Anti-Hb Glc-Antikörper inkubiert. Nach der 72-stündigen Inkubation bei 4°C wurde das nicht komplexierte Reland-Biotin-Konjugat durch eine Ultrafiltration unter Verwendung von Amicon CENTRICON-30-Einheiten mit einem Ausschlussmolekulargewicht der Membran von 30 000 entfernt.

Es wurde die Freisetzung des Relanden durch glykiertes Hb getestet: zu dem vorgeformten Komplex aus Antikörper und Reland wurde entweder Hb Ao (Sigma) oder Hb Glc gegeben, gefolgt von einer Inkubation für 30 Minuten. Das Hb Ao (Sigma) wurde von Hb A1C befreit. Glykiertes Hb wurde aus Hb Ao (Sigma) durch eine 7-tägige Inkubation mit 0,5% Glucose in PBS, pH 7,4, präpariert. Das Ausmaß der Freisetzung wurde wie folgt gemessen:

Nach der Inkubation des Komplexes mit dem Analyten wurde die gesamte Mischung in eine Avidin-beschichtete Platte übertragen, wo die gesamte Biotinmarkierung binden sollte, d.h. sowohl der freigesetzte Biotin-Reland als auch der nicht freigesetzte Komplex Biotin-Reland-Antikörper. Die mit dem HRP-Antikörper nachgewiesene Menge des an die Platte gebundenen Antikörpers war proportional der Menge des nicht freigesetzten Konjugats aus Biotin und Reland, die noch mit dem Antikörper komplexiert war. Somit entspricht eine niedrige Extinktion einer hohen Freisetzung. Die Daten sind in der 6 gezeigt. Diese Daten zeigen eindeutig eine höhere Freisetzung durch Hb Glc als durch Hb Ao.

Glykiertes Hämoglobin war imstande, eine signifikante Menge des an den Relanden gebundenen Antikörpers freizusetzen. Diese Fähigkeit, zwischen der nicht glykierten und der glykierten Form zu unterscheiden, übertraf signifikant die Fähigkeiten dieser Klone, zwischen den beiden Formen in einem herkömmlichen Assay zu unterscheiden, wie in der 7 gezeigt ist.

BEISPIEL 4: FREISETZUNGSASSAY FÜR THEOPHYLLIN

Dieses Beispiel berichtet die Entwicklung eines Freisetzungsassays für Theophyllin. Theophyllin wird bei der Behandlung von Asthma eingesetzt. Es hat einen sehr engen therapeutischen Bereich, wobei zu wenig prophylaktisch unwirksam ist und zu viel hochtoxisch ist. Deshalb müssen die Theophyllinspiegel sorgfältig kontrolliert werden, insbesondere bei Kindern und bei denjenigen, die andere Substanzen, die den Metabolismus von Theophyllin beeinflussen könnten, einnehmen.

Kandidaten für Relanden wurden ausgewählt, indem Verbindungen aus der Liste der kreuzreagierenden Substanzen, die vom Hersteller des Antikörpers bereitgestellt wurde, ausgewählt wurden. Theobromin mit einer berichteten Kreuzreaktivität von 0,6% wurde so modifiziert (siehe unten), dass es die Bindung an eine Markierung ermöglichte, und bezüglich seiner Kreuzreaktivität in einem kompetitiven ELISA für Theophyllin wie folgt untersucht:

1-Acetyltheobromin (ThBr-1-Ac) wurde mit Theobromin (ThBr) bezüglich der Fähigkeit verglichen, mit dem Analyten (in diesem Falle biotinyliertem Theophyllin (Th)) um die Bindung an eine Antikörper-beschichtete Platte in einem herkömmlichen kompetitiven ELISA-Format konkurrieren zu können (10):

Ein monoklonaler Anti-Theophyllin-Antikörper (Theophyllin 8) (OEM Concepts, Toms River, New Jersey) wurde in einer Konzentration von 8 &mgr;g/ml auf Mikrotiterplatten befestigt. Die mit dem Antikörper beschichteten Microwells wurden mit Theobromin und 1-Acetyltheobromin in Konzentrationen von 0, 1, 10, 100 und 1000 &mgr;g/ml und mit Theophyllin-Peroxidase (von BiosPacific Inc., Kat.-Nr. V57520) in einer Verdünnung von 1:500 in Kontakt gebracht. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, und nach dem Waschen wurde die Menge der gebundenen Peroxidaseaktivität mittels mit entionisiertem Wasser 1:20 verdünntem TMB von Serex nachgewiesen. Wie in der 10 gezeigt ist, war Theobromin, aber nicht Theobromin-1-acetat, imstande, die Bindung von Theophyllin an den Antikörper zu hemmen. Somit konnte Theobromin-1-acetat nicht signifikant mit dem Analyten um die Bindung an den Antikörper konkurrieren, was seine potenzielle Eignung als Reland in einem erfindungsgemäßen Freisetzungsassay für Theophyllin anzeigt. Man beachte auch, dass es bei Relandenkonzentrationen von 1 und 10 &mgr;g/ml zu einer 20%igen Zunahme der Extinktion kam. Das ist eine üblicherweise mit Relanden assoziierte Eigenschaft.

Biotin-Konjugate eines kompetitiven Theophyllin-Liganden, 8-Carboxypropyldimethylxanthin (8-CP-Theophyllin), und der Theophyllin-Reland (Theobromin-1-acetat) wurden wie folgt synthetisiert:

19 mg 8-CP-Theophyllin (Sigma C4041) und 18 mg ThBr-1-Ac (synthetisiert gemäß Wolfes und Kornick, Deutsches Patent Nr. 352980, 25. April 1920) wurden mit N-Hydroxysuccinamid und Dicyclohexylcarbodiimid (beide von Sigma) in ihre aktiven Ester überführt. Die aktivierten Ester wurden mit 10 mg 5-(Biotinamido)phenylamin (Pierce, Nr. 21345) umgesetzt, das in 0,6 ml destilliertem Wasser mit einem pH, der mit Natriumbicarbonat auf 7 eingestellt worden war, gelöst war. Beide Biotin-Konjugate wurden durch präparative Dünnschichtchromatographie gereinigt, wobei homogene Produkte erhalten wurden.

Es wurde die zeitabhängige Komplexbildung eines jeden der Biotin-Konjugate mit dem monoklonalen Anti-Theophyllin-Antikörper (OEM. Concepts, Toms River, New Jersey) untersucht. Zu Mikrotiterplatten, die mit Anti-Theophyllin-Antikörper in einer Konzentration von 8 &mgr;g/ml in PBS, pH 7,4, beschichtet worden waren, wurden 10 &mgr;l des biotinylierten Liganden oder Relanden mit den Konzentrationen von 40 &mgr;g/ml, 1 &mgr;g/ml und 0,25 &mgr;/ml sowie 90 &mgr;l Waschpuffer (PBS + 0,06% Tween 20) zugegeben. Die Platten wurden 0, 50, 60, 120, 240, 360 und 5400 Minuten (90 Stunden) inkubiert, und danach wurden die Platten gewaschen. Das Ausmaß der Komplexbildung wurde über die Zugabe von Avidin-Peroxidase (2,2 mg/ml, 1:80 000 in BSA-Waschpuffer verdünnt) und 30-minütige Inkubation bestimmt. Die Avidin-Peroxidase wurde entfernt, die Platte wurde mit PBS gewaschen, und die Menge der Peroxidasemarkierung wurde durch Zugabe von 150 &mgr;l TMB pro Well nachgewiesen. Man ließ die Enzymreaktion 15 Minuten ablaufen, danach wurde mit 50 &mgr;l 2 N H2SO4 gestoppt. Es wurde die Extinktion bei 450 nm gemessen.

Die Ergebnisse sind in den 8A, 8B und 8C gezeigt. Die 8A (Bindung des Liganden und Relanden bei 40 &mgr;g/ml) zeigt, dass die Bindung der Ligand-Biotin-Konjugate nach ungefähr 5 Minuten praktisch vollständig war. Aber die Bindung des Relanden erforderte 360 Minuten. Bei niedrigeren Konzentrationen, 8B (1 &mgr;g/ml) und 8C (0,25 &mgr;g/ml), war die Bindung des CP-Theophyllins nach 5 Minuten praktisch vollständig, aber eine stabile Bindung des Relanden Theobromin-1-acetat erforderte eine ungefähr einwöchige Inkubation. Man beachte, dass die Zeit die niedrigere Konzentration nicht vollständig kompensiert.

KONZENTRATIONSABHÄNGIGKEIT DER RELAND-REZEPTOR-BILDUNG

Mikrotiterplatten wurden mit Anti-Theophyllin-Antikörper wie beschrieben beschichtet und mit Biotin-Reland (Theobromin-1-acetat) und Biotin:Ligand (8-CP-Theophyllin) in Konzentrationen von 0,0005 &mgr;g/ml bis 500 &mgr;g/ml (10 &mgr;l Biotin-Konjugat + 90 &mgr;l PBS) 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Das gebundene Biotin wurde über eine Inkubation mit Avidin-Peroxidase (Jackson, Pennsylvania) in einer Verdünnung von 1:80 000 in PBS, 0,1% BSA und 0,06% Tween für 30 Minuten bei Raumtemperatur nachgewiesen. Die Enzymaktivität wurde mittel TMB von Serex in einer Verdünnung von 1:20 in entionisiertem Wasser 15 Minuten lang gemessen, und die Reaktion wurde mit 2 N H2SO4 gestoppt. Die Ergebnisse sind in der 11 gezeigt. Die Bindung des Ligand-Biotin erfolgt bei 1 &mgr;g/ml oder 10–7 M, während der Reland eine > 200-fach höhere Konzentration von > 250 &mgr;g/ml, d.h. 4,6 × 10–4 M, erfordert. Wir beobachteten immer wieder, dass der Reland nicht wirkungsvoll bindet, es sei denn, er wird in einer Konzentration im Bereich von 10–8 bis 10–3 M, am bevorzugtesten zwischen 0,5 bis 5 × 10–4 bereitgestellt.

Freisetzungskinetik und Stabilität der Komplexe

Es wurde die Freisetzungskinetik für diese Biotin-Konjugate bestimmt (9A und 9B). Die Freisetzungskomplexe wurden wie folgt gebildet:

Zu auf Mikrotiterplatten befestigten (siehe oben) Antikörpern wurden 10 &mgr;l eines jeden Biotin-Konjugats ein einer Konzentration von 1 &mgr;g/ml für 8-CP-Theophyllin, Ligand, und 100 &mgr;g/ml für ThBr, Reland, gegeben, und das ganze wurde mit 90 &mgr;l PBS, 0,06% Tween 20, pH 7,4, eine Stunde auf der Platte bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen der Platte wurde ein Theophyllin-Standard von 1 &mgr;g/ml oder eine PBS-Kontrolle zugegeben. Nach den angegebenen Zeiten zwischen 5 Minuten und 90 Stunden wurden Proben von 75 &mgr;l entnommen und bezüglich der Freisetzung untersucht. Die Menge des freigesetzten Biotin-Ligand oder Biotin-Reland wurde über den Nachweis der Fähigkeit des freigesetzten Biotins zur Hemmung der Bindung von Biotin-Meerrettichperoxidase (Jackson Immuno Research, Pennsylvania) in einer Verdünnung von 1:40 000 in PBS auf einer Platte bestimmt, die mit 10 &mgr;g/ml Avidin (Sigma) in PBS, pH 7,4, über Nacht beschichtet worden war. Man ließ die Enzymreaktion 15 min ablaufen und stoppte sie dann mit 2 N H2SO4. Die Extinktion wurde bei 450 nm bestimmt.

Die PBS-Kontrolle zeigt, dass es sowohl für den Liganden als auch für den Relanden zu einer Abnahme der Bindung während der ersten 30 Minuten kam, aber nicht während der verbleibenden 90 Stunden. Diese Zeit von 30 Minuten, während der es zu einer spontanen Abnahme kommt, kann die Zeit repräsentieren, während der der Antikörper:Ligand oder der Antikörper:Reland eine stabilere Konformation mit einer geringeren Dissoziationsgeschwindigkeit, als sie der ursprüngliche Immunkomplex hat, annimmt. Das zeigt an, dass die Dissoziationskonstanten (Kd) des Relanden und des Liganden ähnlich sind und dass beide sehr niedrig sind, im Gegensatz zu Freytag, der einen Unterschied der Kd-Werte angibt.

Wenn ein Komplex des Liganden 8-CP-Theophyllin mit 1 &mgr;g/ml Theophyllin in Kontakt gebracht wurde, erforderte eine signifikante Freisetzung 30 Minuten, wobei es während der gesamten 90 Stunden zu einer weiteren Freisetzung kam (9A). Im Gegensatz dazu erfolgte die vollständige Freisetzung des ThBr praktisch sofort und erforderte weniger als 5 Minuten; und es kam zu keiner weiteren Freisetzung, was bestätigte, dass für ThBr, den Relanden, die Freisetzung unabhängig von der Kd ist.

BEISPIEL 5: NACHWEIS VON THEOPHYLLIN DURCH VERWENDUNG VON APOGLUCOSEOXIDASE IM NACHWEISSYSTEM EINES FREISETZUNGSASSAYS

Der verwendete Theophyllin-Reland war Theobromin-1-acetat, das wie folgt an FAD gekoppelt wurde:

Zu 24 mg Theobromin-1-acetat, das in 1 ml Dimethylformamid gelöst war, wurden 13 mg N-Hydroxysuccinamid und 25 mg Dicyclohexylcarbodiimid gegeben. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde das aktivierte Theobromin-1-acetat mit N6-Aminohexyl-FAD, das gemäß dem Verfahren von Carrico & Johnson (US-Patent Nr. 4 255 566) hergestellt worden war, in 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9, gemischt. Nach der Umsetzung über Nacht wurde die rohe Präparation durch präparative Dünnschichtchromatographie in einem Lösemittelsystem aus Ethanol/1 M Triethylammoniumbicarbonat (9:1) gereinigt. Die letztliche Konzentration des Reland-FAD-Konjugats wurde spektralphotometrisch mittels des molaren Extinktionskoeffizienten für FAD bei 450 nm bestimmt.

Ein Anti-Theophyllin-Antikörper (Biodesign, Maine) mit einer Kreuzreaktivität mit Theobromin-1-acetat-FAD von unter 0,01% wurde auf einem Protein-G-Agarosegel (1 mg AK auf 0,4 ml Protein-G-Agarose) durch langsames Überkopfmischen auf einem Mischer bei 4°C über Nacht, gefolgt von zwei Waschungen durch Zentrifugation, immobilisiert.

BEDINGUNGEN FÜR DIE RELANDEN-BINDUNG

30 &mgr;l Gel wurden in die Wells einer Millipore-Filtrationsvorrichtung in einer Konzentration von 3,35 × 10–6 M Antikörper/Well (6,7 × 10–6 M Bindungsstellen) verteilt und auf eine Relanden-Konzentration von 2,9 × 10–4 M, 38 × 10–5 M oder 3,8 × 10–6 M gebracht. Man ließ das Reland-FAD 2 Stunden bei Raumtemperatur binden, und dann wurde das Gel extensiv gewaschen, woran sich ein Absaugen zur Entfernung von nicht gebundenem Reland-FAD anschloss.

NACHWEIS DES VOM AK GEBUNDENEN RELAND/FAD

  • A. Der Antikörper:Reland-FAD-Komplex wurde durch Zugabe von 40 &mgr;l 1 mg/ml ApoGO und Inkubation unter Schütteln bei Raumtemperatur für 15 Minuten nachgewiesen. Die ApoGO band an das FAD des Komplexes. Die nicht gebundene ApoGO wurde durch Absaugen entfernt. Die Menge der gebundenen ApoGO wurde durch Zugabe von 20 &mgr;l Meerrettichperoxidase (2,5 &mgr;g/ml) und 50 &mgr;l TMB/Glucose (0,5 mg TMB/ml + 500 mg Glucose/ml) bestimmt. Nach 2 Minuten wurde die Flüssigkeit abgesaugt, und die Extinktion bei 620 nm wurde in einem SLT-Mikrotiterplatten-Readers bestimmt. Es wurden 50 &mgr;l 2 N H2SO4 zugegeben, und es wurde die Extinktion bei 450 nm bestimmt: Bei einer Konzentration von 2,9 × 10–4 M kommt es zu einer signifikanten Bindung. Unter 10–4 M kommt es nicht zu einer signifikanten Bindung, wie bereits im Beispiel 4 beschrieben wurde.
  • B. Zur Bestimmung der Grenzen des dynamischen Bereiches des ApoGO-Nachweissystems für FAD-Reland wurden 60 &mgr;l Reland-FAD direkt in die ApoGO-Nachweislösung gegeben, und dann ließ man das ganze 3 Minuten reagieren, ehe wie oben mit Säure gestoppt und die Extinktion bei 450 nm abgelesen wurde: Der Hintergrund ist sehr niedrig. Der Nachweisbereich des Assays liegt bei 10–9 bis 10–6 M für Zeiträume, die für einen On-Site-Assay einsetzbar sind, d.h. von unter 10 Minuten.
  • C. Zur Beurteilung der Freisetzung wurde ein Immunkomplex wie folgt gebildet:

    Reland-FAD wurde mit Anti-Theophyllin-Antikörper-beschichteter Agarose wie oben umgesetzt, wobei eine Relandenkonzentration von 1,9 × 10–4 M und eine Antikörperkonzentration von 5,15 × 10–6 M eingesetzt wurden. Überschüssiges Reland-FAD wurde durch Zentrifugation und extensive Waschungen entfernt. Die mit dem Immunkomplex beschichteten Agarosekügelchen wurden in 8 Wells der oben beschriebenen Filtrationsplatte verteilt und abgesaugt. Der Freisetzungsassay wurde durchgeführt, indem zu den Kügelchen 60 &mgr;l eines Theophyllin-Standards (Theophyllin Sigma T-1633d) in PBS, pH 7,4, gegeben wurden und das ganze unter Schütteln 10 Minuten inkubiert wurde. Der freigesetzte Reland wurde abgesaugt und dann bezüglich seiner Fähigkeit zur Aktivierung der ApoGO wie folgt gemessen:

    Zu 60 &mgr;l der abgesaugten Lösung wurden 30 &mgr;l ApoGO in einer Konzentration von 1,5 mg/ml, 25 &mgr;l Meerrettichperoxidase in einer Konzentration von 2,5 &mgr;g/ml und 50 &mgr;l TMB/Glucose (0,5 mg TMB pro mi + 500 mg Glucose pro dl) gegeben. Die Reaktion wurde nach 3 Minuten mit 50 &mgr;l 2 N H2SO4 abgestoppt, und die Extinktion bei 450 nm wurde bestimmt. Man beachte, dass es bei 0,5 &mgr;g/ml zu einer vollständigen Freisetzung kommt, dass die Empfindlichkeit des Tests zwischen 10–7 und 10–6 M liegt, und dass die maximale Freisetzung bei ungefähr 10–6 M erreicht wird, was anzeigt, dass bei 2,7 × 10–6 M der gesamte FAD-Reland freigesetzt worden ist. Es wird geschätzt, dass 30 &mgr;l der beschichteten Kügelchen der Reaktionsmischung maximal 5,5 × 10–6 M AK enthalten, so dass die maximale Relandenkapazität bei ungefähr 10 × 10–6 liegen würde, was ferner anzeigt, dass die Freisetzung vollständig war, d.h. dass der Reland zu 100% freigesetzt wurde. Der obige Komplex könnte mehrere Tage gelagert werden, ohne dass sich die Reaktivität verändern würde.

    Das gleiche Reagenziensystem wurde auf einer Biodyne-B-Nylonmembran von Pall eingesetzt und visuell abgelesen, wobei ähnliche Ergebnisse erhalten wurden. Im Membranformat wird der Immunkomplex von der ApoGO über eine physikalische Trennung auf der Membran entweder auf der gleichen Oberfläche oder durch das Aufbringen einiger Reagenzien auf der gegenüberliegenden Oberfläche getrennt. Zum Beispiel haben wir gezeigt, dass Pall-Biomembranen auf beiden Seiten imprägniert werden können, ohne dass es zu einer Penetration auf die andere Seite kommt, wodurch eine physikalische Trennung bereitgestellt wird, oder durch den Einsatz einer zweiten Membran, die sich in Kontakt mit der ersten befindet. Wenn der FAD-Reland durch den Analyten freigesetzt wird, wandert er zur ApoGO und den anderen Nachweisreagenzien und erzeugt eine Farbe, die direkt dem freigesetzten Reland/FAD und der Konzentration des Analyten proportional ist.

DISKUSSION HETEROGENES FORMAT

Während Assaysysteme, die eine Dissoziation vorgeformter Antikörper-Liganden-Komplexe beinhalten (Cocola et al., 1979, Analytical Biochem. 99: 121–8, Hinds et al., 1984, Chin. Chem. 30: 1174–8, Hinds et al., 1985, Chin. Chem. Acta 149: 10–15), kompetitive Liganden als Bindungspartner eingesetzt haben, ist der erfindungsgemäße Freisetzungsassay ein nicht-kompetitives System. Das wird in der Tabelle 4 oben demonstriert, wo gezeigt wird, dass der Reland nicht konkurriert. Es ist auch bemerkenswert, dass, im Gegensatz zu den erfindungsgemäßen Freisetzungsassays, für die kompetitiven Dissoziationsassays, die von Cocola et al., Hinds et al., 1984 und Hinds et al., 1968, oben, beschrieben wurden, nicht gezeigt wurde, dass sie signifikante Vorteile gegenüber anderen kompetitiven Immunoassay-Methoden bieten. Auch wenn wir uns bei der vorliegenden Erfindung nicht auf irgendeine bestimmte Theorie festlegen wollen, stellen wir die Hypothese auf, dass der Antikörper über Wechselwirkungen sehr niedriger Affinität an den Freisetzungsliganden bindet, und dass der Antikörper in Abwesenheit von Bindungspartnern höherer Affinität eine Konformationsänderung zu einem metastabilen Komplex, der freisetzbar ist, durchläuft. Es kann sein, dass der Komplex zu stabil wird, wie es mit herkömmlichen Liganden-Konjugaten beobachtet wird. Zum Beispiel wurde N-Isopropylnorcotinin ausgewählt, da es eine großräumige Gruppe an einer immunologisch unkritischen Stelle bereitstellt, um die Freisetzung nach der Bildung eines stabilen Komplexes zu ermöglichen.

SCHLUSSFOLGERUNGEN

Wir haben ein Assayverfahren entwickelt, wobei wir die Fähigkeit von Rezeptoren ausgenützt haben, eine induzierte Anpassung an einen Bindungspartner anzunehmen, für den sie eine sehr niedrige Affinität haben, das heißt den Freisetzungsliganden oder Relanden. Der Freisetzungsassay stellt einen stabilen vorgeformten Rezeptor:Reland-Komplex bereit, der in Gegenwart des Analyten schnell dissoziieren kann. Das Freisetzungssystem kann mit allen Immunoassayformaten verwendet werden. Der Freisetzungsassay hat gegenüber herkömmlichen oder assoziativen Assays verschiedene inhärente Vorteile:

  • 1. Durch das Eliminieren eines Schrittes der Immunreaktion spart die Freisetzung Zeit und Schritte sowie mögliche Fehlerquellen, wodurch die Assayzeiten verkürzt und die Assaytechniken vereinfacht werden.
  • 2. Die Freisetzung, d.h. die Dissoziation, ist von Haus aus weniger anfällig gegenüber Störungen, was sie genauer macht.
  • 3. Die Fähigkeit, den gesamten Antikörper im Assay zu bestimmen, vermindert das Rauschen und macht einen 1000- bis 10 000-fachen Empfindlichkeitsbereich möglich. Diese Methodik, die empfindlichere Marker einsetzt, erweitert den theoretischen Bereich gegenüber dem theoretischen Bereich, der derzeit in herkömmlichen Assayformaten zur Verfügung steht, sowohl nach oben als auch nach unten. Die Zugabe größerer Mengen der Reaktionspartner senkt die Empfindlichkeit nicht ab, wie bei herkömmlichen Immunoassays, sondern erweitert den oberen Empfindlichkeitsbereich.
  • 4. Ein wichtiger Vorteil der Freisetzung besteht aus den die milden Bedingungen, unter denen die Dissoziation erfolgt.
  • 5. Der weite Bereich, die positive Korrelation mit der Gegenwart des Analyten und das geringe Rauschen des Systems zeigen, dass das Format des Freisetzungsassays dazu verwendet werden kann, viele Analyten in einer Reaktionsmischung zu bestimmen.


Anspruch[de]
Verfahren zur Gewinnung eines Freisetzungsliganden für den Einsatz in einem Assay, bei dem der Freisetzungsligand einen Komplex mit einem Rezeptor bildet, der an einen Analyten, der nachgewiesen werden soll, bindet, sogar wenn der Rezeptor an den Freisetzungsliganden gebunden ist, umfassend

das Identifizieren monomerer und multimerer Verbindungen, die mit dem Analyten strukturell verwandt sind,

das Screenen der Verbindungen zur Identifizierung von Verbindungen, die an den Rezeptor binden, und

das Identifizieren der Verbindungen, die an den Rezeptor binden, aber nicht mit einem Komplex aus dem Rezeptor und dem Analyten reassoziieren, um die monomeren Verbindungen auszuwählen, die an den Rezeptor mit einer Assoziationskonstante von 1% oder weniger der Assoziationskonstante des Analyten für den Rezeptor binden, und der monomeren und multimeren Verbindungen, die eine Assoziationskonstante für den Rezeptor haben, die kleiner oder gleich 105 M–1 ist, und die nicht nachweisbar mit dem Analyten um die Bindung an den Rezeptor konkurrieren, und wobei der gegebene Komplex aus dem Freisetzungsliganden und dem Rezeptor eine Dissoziationskonstante hat, die derjenigen eines Komplexes aus dem Analyten und dem Rezeptor ähnlich ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindungen durch das Synthetisieren der Analyten mit einer oder mehreren Substitutionen) in der chemischen Struktur hergestellt werden. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindungen durch das Isolieren des an den Rezeptor gebundenen Epitops des Analyten und das Modifizieren des Epitops zur Veränderung der Bindungseigenschaften hergestellt werden. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Assoziationskonstante des monomeren Freisetzungsliganden zwischen 103 und 105 M–1 liegt. Verfahren zur Gewinnung eines Komplexes aus einem Rezeptor und einem Freisetzungsliganden, wobei der Komplex einen Rezeptor umfasst, der an einen monomeren oder multimeren Freisetzungsliganden, der mit einem Analyten strukturell verwandt ist, gebunden ist, wobei der Rezeptor imstande ist, an den Analyten zu binden, sogar wenn der Rezeptor an den Freisetzungsliganden gebunden ist, und die monomere Form des Freisetzungsliganden imstande ist, an den Rezeptor mit einer Assoziationskonstante von 1% oder weniger der Assoziationskonstante des Analyten für den Rezeptor zu binden, wobei die monomere Form des Freisetzungsliganden eine Assoziationskonstante für den Rezeptor hat, die kleiner oder gleich 105 M–1 ist, der Freisetzungsligand nicht nachweisbar mit dem Analyten um die Bindung an den Rezeptor konkurriert und nicht mit einem Komplex aus dem Rezeptor und dem Analyten reassoziiert und der gegebene Komplex eine Dissoziationskonstante hat, die derjenigen eines Komplexes aus dem Rezeptor und dem Analyten ähnlich ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Gewinnen des Freisetzungsliganden mittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 1,

b) Inkubieren des Freisetzungsliganden mit dem Rezeptor.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Assoziationskonstante des monomeren Freisetzungsliganden zwischen 103 und 105 M–1 liegt. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die monomere Form des Freisetzungsliganden an den Rezeptor mit einer Assoziationskonstante von 0,2% oder weniger der Assoziationskonstante des Analyten für den Rezeptor bindet. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Freisetzungsligand mit einer Markierung markiert ist, die nach der Freisetzung des Freisetzungsliganden vom Rezeptor nachweisbar wird. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Rezeptor ein Antikörper oder Antikörperfragment ist. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Rezeptor immobilisiert ist. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Freisetzungsligand ein Molekulargewicht von unter 5 000 Dalton hat. Verfahren zur Bestimmung des Vorkommens oder der Menge eines Analyten in einer Probe, das umfasst:

a) Inkontaktbringen eines Komplexes aus einem Rezeptor und einem Freisetzungsliganden, der gemäß einem beliebigen der Ansprüche 5 bis 11 erhalten wurde, mit einer Probe, die im Verdacht steht, dass sie den Analyten, der nachgewiesen werden soll, enthält, und

b) Nachweisen der Dissoziation des Freisetzungsliganden aus dem Rezeptorkomplex als Maß für das Vorkommen oder die Menge des Analyten in der Probe.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Freisetzungsligand mit einer Markierung markiert ist, die nach der Freisetzung des Freisetzungsliganden vom Rezeptor nachweisbar ist, wobei die Menge des gebundenen Analyten proportional zur nachgewiesenen Menge der Markierung ist. Verfahren nach Anspruch 12, das ferner vor dem Schritt a) das Inkontaktbringen des Freisetzungsliganden mit dem Rezeptor in Abwesenheit des Analyten umfasst. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 5 bis 11, das ferner das Immobilisieren des Komplexes auf einer festen Trägerphase umfasst. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die feste Phase, auf der der Komplex immobilisiert ist, eine Membran umfasst, die ein Reaktionsfeld umfasst, das eine Indikatorzone enthält, wobei der Komplex aus dem Rezeptor und dem Freisetzungsliganden im Reaktionsfeld lokalisiert ist und wenigstens ein Teil der Nachweisvorrichtung für das Anzeigen des Vorkommens oder der Menge des Rezeptors oder Freisetzungsliganden nach der Dissoziation aus dem Komplex aus dem Rezeptor und dem Freisetzungsliganden in der Indikatorzone lokalisiert ist. Verfahren nach Anspruch 15, wobei Komplexe aus Rezeptor und Freisetzungsligand für multiple Analyten immobilisiert sind.






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