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Dokumentenidentifikation DE69735558T2 12.04.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001310246
Titel Verwendung von Bronopol zur Behandlung von Krankheiten von Fischeiern
Anmelder Vericore Ltd., Leyland, Lancashire, GB
Erfinder Braidwood, Julian Charles, Carlisle, Cumbria CA4 9AA, GB
Vertreter PFENNING MEINIG & PARTNER GbR, 80339 München
DE-Aktenzeichen 69735558
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 29.07.1997
EP-Aktenzeichen 030026736
EP-Offenlegungsdatum 14.05.2003
EP date of grant 29.03.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.04.2007
IPC-Hauptklasse A61K 31/047(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61P 31/02(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft die Behandlung von Pilzinfektionen (speziell Saprolegnia parasitica) von Fischeiern, insbesondere, aber nicht ausschließlich Forelle, Lachs und Lachsartige im allgemeinen. Die Erfindung liefert auch die Behandlung von anderen Fischerkrankungen, wie bakteriellen Infektionen (beispielsweise bakterielle Kiemenerkrankung – Flavobacterium branchiophilum und Cytophaga psychrophila), Protozoeninfektionen, wie die von Ciliaten (beispielsweise Ichthyophtirius multifiliis) und Flagellatén (beispielsweise Ichthyobodo necatrix).

Saprolegnia parasitica ist ein sich schnell ausbreitender und fataler Pilzparasit, der sowohl Fische als auch Fischeier befällt. Er wird herkömmlich mit Malachitgrün (Diaminotriphenylmethan) behandelt, aber obwohl diese Behandlung sehr wirksam ist, weist die Verwendung von Malachitgrün mehrere potentielle Probleme auf: Die Verbindung wurde als mögliches Carzinogen und Teratogen genannt, obwohl diese Wirkungen bisher nicht bewiesen sind, da sie ein starker Farbstoff ist, tendiert sie zur Verfärbung von Wasser und kann unter bestimmten Umständen eine Färbung des Fisches verursachen, der behandelt wurde, sie hat eine relativ lange Zurückhalteperiode, so dass signifikante Rückstande bei behandeltem Fisch vorhanden sein können, wenn dieser gefischt und zum Verzehr verkauft wird und die Verbindung ist nicht als Tierarzneimittel zugelassen und deren Verwendung ist derzeit in US Staatsfischereien verboten. Der Artikel von D.J. Alderman in Journal of Fish Diseases 8 (1985), 289-298 liefert eine Zusammenfassung der Verwendung von Malachitgrün bei der Behandlung von Fischerkrankungen und diskutiert einige der hiermit assoziierten Probleme.

Eine derzeit verfügbare Alternative zu Malachitgrün ist Formalin, das die Substanz ist, die derzeit in US Staatsfischereien verwendet wird. Jedoch kann die Substanz aufgrund ihrer reizenden Eigenschaften nur unter strikt kontrollierten Bedingungen verwendet werden. Es besteht daher ein Bedarf für eine verbesserte Behandlung von Pilzerkrankungen und anderen Erkrankungen bei Fischen, insbesondere eine, die eine hohe Wirksamkeit mit einer geringen Toxizität vereinigt. Viele Versuche zur Identifizierung von neuen Behandlungen wurden in der Vergangenheit versucht und die Ergebnisse des Screenings von 40 potentiellen Alternativsubstanzen sind im Artikel von D.J. Alderman beschrieben, der in Journal of Fish Diseases 5 (1982) 113-123 erschienen ist, der auch Standardprotokolle für den Test der Behandlungen mit den potentiellen Substanzen beschreibt. Jedoch ist trotz dieser und anderer Arbeiten (wie sie im Artikel von T.A. Bailey beschrieben sind, der in Acquaculture 38 (1984) 97-104 beschrieben ist) den Anmeldern nicht bekannt, dass eine geeignete Alternativbehandlung zu Malachitgrün und Formalin den Markt erreicht hat.

Es wurde nun festgestellt, dass Bronopol (2-Brom-2-nitropropan-1,3-diol) eine gute Aktivität bei relativ geringen Konzentrationen gegen Saprolegnia parasitica aufweist und sicher anzuwenden ist. Bronopol ist eine bekannte Verbindung und wird in Konzentrationen zwischen 0,01 und 0,2 % als antimikrobielles Konservierungsmittel und Antiseptikum in topischen pharmazeutischen Formulierungen, Kosmetika und Toilettenartikel verwendet.

Kombinationen mit Bronopol sind auch in der Tiermedizin bekannt. Beispielsweise bezieht sich die GB 2 263 063 A auf eine Kombination aus Bronopol, Formaldehyd und einem quarternären Ammoniumsalz, die bei der Behandlung von Ulcerationen, bakerieller Kiemenerkrankung und systemischen bakteriellen Infektionen wirksam ist. Es werden keine Effekte des Bronopol enthaltenden Gemisches bei der Behandlung von Pilz- oder Myxobakterieninfektionen bei Fischeiern erwähnt.

Die HU 38 833 beschreibt ein Gemisch aus Bronopol, Bradophen und Silicon, das tiermedizinische Anwendung als Fungizid aufweist, jedoch wird nicht erwähnt, ob ein solches Gemisch in einer wässrigen Umgebung auf Fisch oder andere Wasserorganismen wirksam wäre.

Es ist jedoch in "Handbook of Pharmaceutical Excipients", das von The Pharmaceutical Press (1994) veröffentlicht wurde, beschrieben, dass einer der Hauptnachteile von Bronopol die relativ schwache Aktivität gegen Hefen und Schimmelpilze ist. Es ist daher überraschend, dass Bronopol bei relativ geringen Konzentrationen gegen Saprolegnia wirksam ist.

Wie dies detaillierter beschrieben wird, wurde von Bronopol gezeigt, dass es gegen Saprolegnia parasitica Infektion bei Lachs, Forelle und Forelleneiern wirksam ist. Es wird jedoch daher erwartet, dass die Behandlung gegen dieselbe Infektion in anderen lachsartigen Spezies und auf jeden Fall bei Fischeiern wirksam ist. Es wird erwartet, dass es auch eine Wirksamkeit gegen andere Pilzinfektionen gibt. Ferner kann es auch als prophylaktisches Mittel verwendet werden, da von Bronopl in den später beschriebenen Versuchen gezeigt wurde, dass es das Ausbreiten der Infektion verhindert oder verlangsamt.

Bronopol ist ein im Handel erhältliches Produkt, das von einer Vielzahl an Quellen verfügbar ist. Es kann durch die Umsetzung von Nitromethan mit Paraformaldehyd in einer alkalischen Umgebung, gefolgt von einer Bromierung hergestellt werden. Es ist auch bekannt, dass einige Verbindungen (wie 5-Brom-5-nitro-1,3-dioxan) unter Freisetzung von Bronopol zerfallen und die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung solcher Verbindungen anstelle von Bronopol.

Daher liefert die Erfindung in einem Aspekt die Verwendung von Bronopol zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe von Pilzinfektionen bei Fischeiern. Genauer gesagt betrifft die Erfindung die Verwendung von Bronopol bei der Behandlung und/oder Prophylaxe von Saprolegnia parasitica. Eine bestimmte Verwendung der Erfindung ist die Behandlung von Fischeiern von Lachsartigen, insbesondere Forelle und Lachs.

Die Erfindung erstreckt sich auch auf die Verwendung von Bronopol zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Fischeiern, die an einer Pilzinfektion leiden, durch die Verabreichung von Bronopol in einem Behandlungsbad in einer pharmazeutisch wirksamen Menge. Vorzugsweise umfasst das Verfahren das Anhalten des Wasserdurchflusses durch das Bad während der Verabreichung der Behandlung, vorzugsweise für einen Zeitraum von nicht weniger als 30 Minuten.

Vorzugsweise liegt die Konzentration von Bronopol im Behandlungsbad im Bereich von 1 mg/l (ppm) bis 1000 mg/l, vorzugsweise 5 mg/l bis 200 mg/l und idealerweise 10 mg/l bis 100 mg/l. Bronopol ist eine feste kristalline Substanz und kann als Lösung in einem polaren Lösemittel wie Wasser oder Dowanol (Dipropylenglycolmonoethylether) hergestellt werden.

Der Versuch 1 (siehe später) wird in schwach alkalischen Bedingungen (etwa pH 7,4 bis 7,5) ausgeführt und es ist möglich, dass diese Bedingungen für die durch Bronopol gezeigte Antipilzaktivität vorteilhaft sind.

Während der Versuche wird Bronopol auch gegen andere Fischerkrankungen getestet und ist wirksam gegen Ichthyobodo nécatrix, der ein ektoparasitärer Flagellatenprotozoe ist, Flavobacterium branchiophilum (der verursachende Organismus der bakteriellen Kiemenerkrankung) und Cytophaga psychrophila, das ein Myxobakterium ist und der verursachende Organismus des Regenbogenforellensyndroms, der Kaltwassererkrankung, der Sattelrücken- und Hirnstielerkrankung bei lachsartigen Fischen. Die Aktivität gegen Cytophaga zeigt eine mögliche Wirkung gegen Myxobakterien im allgemeinen und die Aktivität gegen Ichthyobodo fegt auch eine Wirksamkeit gegen Flagellaten im allgemeinen, wie auch Ciliatenprotozoen, wie Ichthyophthirius multifiliis nahe.

Daher weitet ein weiterer Aspekt der Erfindung die Verwendung von Bronopol zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe einer Protozoeninfektion, wie durch einen Flagellaten (beispielsweise Ichthyobodo necatrix) oder einen Ciliaten (wie Ichthyophthirius multifiliis) bei Fisch oder anderen Wasserorganismen, insbesondere lachsartigem Fisch und speziell Forelle aus.

In einem alternativen Aspekt erstreckt sich die Erfindung auf die Verwendung von Bronopol zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe einer bakteriellen Kiemenerkrankung (beispielsweise Flavobacterium branchophilum) bei Fisch oder anderen Wasserorganismen, insbesandere lachsartigem Fisch und speziell Forelle.

Die Erfindung umfasst auch die Verwendung von Bronopol zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung solcher Protozoen- oder Flavobakterieninfektionen bei Fischen oder anderen Wasserorganismen durch die Verabreichung von Bronopol in einem Behandlungsbad in einer pharmazeutisch wirksamen Menge. Vorzugsweise wird Bronopol in einer Konzentration zwischen 1 und 500 mg/l, bevorzugter zwischen 10 und 100 mg/l verabreicht.

Es ist möglich, dass Bronopol auch bei der Behandlung von Fischen wirksam ist, die an einer Myxobakterieninfektion leiden und die Erfindung erstreckt sich daher auch auf die Verwendung von Bronopol zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe von Myxobakterieninfektionen (insbesondere Cytophaga psychrophila) von Fisch oder anderen Wasserorganismen, insbesondere lachsartigem Fisch und speziell Forelle.

Die Erfindung wird hierin später im Detail durch Beispiele unter Bezugnahme auf die folgenden Experimente beschrieben.

Versuch 1 In vitro Wirksamkeit von Bronopol gegen Saprolegnia parasitica

Dieser Versuch wird mittels der in Journal of Fish Diseases (1982) 5, 113-123 beschriebenen Verfahren ausgeführt, die oben zitiert sind.

Herstellung des Impfguts

Eine Kultur von Saprolegnia parasitica wird bei 16°C auf Agar aus Flusswasser, Glucose, Hefeextrakt (RGY) gehalten, der Hefeextrakt (1 g), D-(+)-Glucose (5 g) und Agar (12 g) in 1 l Flusswasser enthält. Die RGY Platten werden mit dem Testorganismus angeimpft und bei 25°C inkubiert, bis das Wachstum gerade den vollen Durchmesser der Platte bedeckt (etwa 72 Stunden). Es werden Scheiben aus den äußeren 10 mm der Kultur mittels einer Stanzvorrichtung mit 4 mm (konstruiert aus einer Gelchromatographievertiefungsstanzvorrichtung, an die ein Griff angebracht wurde) und als Standardimpfgut für die Tests verwendet.

Test 1A Verfahren

Bronopol wird auf eine Aktivität gegenüber Saprolegnia parasitica Kulturen bei verschiedenen Konzentrationen, die von 50 mg/l bis 100 mg/l reichen, unter Verwendung des Protokolls II des vorher erwähnten J. Fish Diseases Artikel folgendermaßen getestet. Es werden Polycarbonatfiltermembranen mit einer Porosität von 0,2 &mgr;m und einem Durchmesser von 25 mm (Nuclepore, Sterlin) sterilisiert und dann auf die Oberfläche von RGY Platten (7 pro 90 mm Petrischale) gegeben. Dann wird ein 4 mm Scheibenstandardimpfgut invertiert im Zentrum des Filters platziert. Die die Filter enthaltenden Schalen werden dann inkubiert, bis die entstehende Myzelmatte fast die Kante der Filter erreicht hat. Das ursprüngliche Impfgut wird dann (soweit möglich) mittels heißer Pinzettenspitzen abgezogen, um die Zerstörung der lose haftenden Myzelmatte zu vermeiden. Die Myzelmatten werden zusammen mit den Trägerfiltern von der Agaroberfläche der Filter abgehoben, in leere, sterile Petrischalen überführt und vollständig in die Bronopollösung in ausgewählten Konzentrationen eingetaucht. Am Ende der 1 Stunde betragenden Expositionszeit wird die Bronopollösung durch Absaugen entfernt und durch 2 Waschschritte mit sterilem Flusswasser (jeweils für 5 und 30 Minuten) ersetzt, bevor die Myzelmatte und die Filter mit dem Filter als oberstes auf die Oberfläche einer frischen RGY Platte überführt werden. Nach einer Inkubation bei 16°C für 24 Stunden wird jedes neue Wachstum über die Kanten der Filter an 4 Punkten um das Filter herum in Abständen von 90° gemessen.

Das Experiment wird mittels 6 getrennter Kulturproben bei jeder Bronopolkonzentration ausgeführt und wird unter Verwendung von Malachitgrün anstelle von Bronopol wiederholt. Es wird. auch ein Negativkontrolltest ohne Wirkstoff ausgeführt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.

Diskussion

In diesem Test werden nackte Pilzhyphen gegenüber Bronopol exponiert, was einen hemmenden Effekt gegen anschließendes vegetatives Wachstum bei 50 ppm für 5 Minuten zeigt. Eine Exposition für 10 Minuten bei 500 ppm verhindert das gesamte vegetative Wachstum bei diesem Testverfahren.

Test 1B Verfahren

In diesem Test wird Bronopol auf eine Wirksamkeit gegenüber Saprolegnia parasitica unter Verwendung des anspruchsvolleren Protokolls III des vorher erwähnten J. Fish Diseases Artikels getestet, wobei das Verfahren folgendermaßen abläuft:

Vier scheibenförmige Impfmaterialien werden in jedes Kompartiment einer sterilen Replidish (25 Kompartimentierungen in 5 Reihen, Sterilin) gegeben. Fünf unterschiedliche Testkonzentrationen werden für 5 verschiedene Expositionszeiten angewendet und können so vierfach in einer Schale ausgeführt werden. Die Testkonzentrationen werden aseptisch in Volumina von 2,5 ml zu jedem Kompartiment für die Standardexpositionszeiten gegeben, die 5, 10, 20, 40 und 80 Minuten betragen. Am Ende der einzelnen Expositionszeiten werden die Testlösungen aus den Kompartimenten durch Absaugen entfernt. Jeder Satz Scheiben wird dann in situ mit einem zweimaligen Wechsel an sterilem Flusswasser gewaschen (jeweils für 5 und 30 Minuten) und dann in weiteren 2,5 ml an sterilem Flusswasser in situ für 72 Stunden bei 16°C inkubiert. Anschließend werden die Scheiben unter einem Stereomikroskop mittels einer transmittierten Dunkelfeldbeleuchtung untersucht und auf das Vorkommen oder die Abwesenheit von neuem Wachstum auf der Agarscheibenoberfläche ausgewertet. In allen Zweifelsfällen, insbesondere an der Grenzlinie zwischen Wachstum und keinem Wachstum werden die Scheiben in RGY für weitere 72 Stunden bei 16°C überführt, um genau die Lebensfähigkeit des Mycels innerhalb der Scheibe zu bestimmen. Der Test wird wiederholt, wobei Malachitgrünoxalat anstelle von Bronopol verwendet wird.

Die Ergebnisse werden sowohl als Effekt auf die Zoosporulation als auch in Bezug auf die Wirkung auf das vegetative Wachstum ausgedrückt und sind in den folgenden Tabellen gezeigt:

Diskussion

Bronopol hat einen deutlichen Effekt auf die unmittelbare Zoosporulation bei so kurzen Expositionen wie 5 Minuten und Konzentrationen von 100 ppm oder (möglicherweise) wenige. Dieser Test verwendet ein Agarstopfenverfahren, worin der das Myzel enthaltende Agar offensichtlich einen Schutz für die Hyphen bietet, aber Bronopol immer noch penetriert und eine Exposition für 20 Minuten bei 1000 ppm das gesamte anschließende Wachstum verhindert und diese Konzentration auch einen signifikanten Effekt bei so kurzen Zeiten wie 5 Minuten aufweist. Ferner scheint die geringere Exposition bei 100 ppm für 80 Minuten ebenfalls einen hemmenden Effekt aufzuweisen.

Versuch 2

In vivo Wirksamkeit von Bronopol gegen Saprolegnia parasitica Infektion bei Forelleneiern Etwa 913 000 Regenbogenforelleneier werden in diesem Versuch verwendet, der zwischen drei Farmstationen aufgeteilt wird. In jedem Fall werden die Eier sorgfältig in Wasser bei gleicher Temperatur getaucht, nachdem alle Fäkalien, Blut oder weiße (tote) Eier entfernt wurden. Die Eier werden verfolgt, bis sie das Augenstadium erreicht haben und werden dann durch Fallenlassen in Wasser aus einer Höhe von etwa 0,5 m geschockt. Der Zweck des Schocks ist es, alle schwachen oder unfruchtbaren Eier zu töten, die aufgrund der Ruptur der inneren Membran weiß werden. Tote Eier werden entfernt und gezählt. Der Versuch wird fortgesetzt, bis die Eier schlüpfen, wonach tote Eier erneut entfernt und gezählt werden. Während des Versuchs wird das Maß an Pilzinfektion (aufgrund von Saprolegnia) verfolgt.

Die erste Farmstation (Station 1) wird mit Grundwasser betrieben und die Eier werden in einem Trog und Schalensystem nach dem Ablaichen bis zum Schlüpfen gehalten. Die Inkubatorvolumina betragen 101 l mit einer Wasseraustauschgeschwindigkeit von 40 l/min (wobei die Zeit für den Wasseraustausch 2,5 Minuten beträgt).

Die Station 2 wird auch mit Grundwasser betrieben. Nach dem Ablaichen bis zum Schock werden die Eier in vertikalen Inkubatoren mit einem Volumen von 20 l gehalten. Die Wasseraustauschgeschwindigkeit beträgt 13,6 l/min und die Zeit für den Wasseraustausch 1,5 Minuten. Vom Schock bis zum Schlüpfen werden die Eier in einem Trog und Schalensystem gehalten, wobei die Inkubatorvolumina 145 l betragen und die Wasseraustauschgeschwindigkeit 27 l/min beträgt (die Wasseraustauschzeit beträgt 5,4 Minuten). Die Eier an der Station 2 werden in 3 Ansätze eingeteilt, die getrennt und zu unterschiedlichen Zeiten getestet werden.

Die Station 3 wird mit Flusswasser betrieben und die Eier werden in einem Trog und Schalensystem nach dem Ablaichen bis zum Schlüpfen gehalten. Die Inkubatoren haben ein Volumen von 190 l mit einer Wasseraustauschgeschwindigkeit von 10 l/min und einer Wasseraustauschzeit von 19 Minuten.

An jeder Station (und für jeden Ansatz in Station 2) werden die Eier in 3 Behandlungsgruppen aufgeteilt, wobei eine eine Bronopolbehandlung, eine eine Malachitgrünbehandlung und eine keine Behandlung erhält (um als Negativkontrolle zu dienen). Die Anzahl an Eiern in jeder Gruppe ist wie folgt:

Bronopol wird bei einer Konzentration von 500 g/l oben auf die Inkubatoren gegeben und über die Eier durch das hereinkommende Wasser verteilt. Der Wasserfluss wird dann abgeschaltet, wenn die Behandlung etwa halb durch den Trog gelaufen ist. Es wird dann ein Ansatz für 30 Minuten gebildet, worin die Konzentration des Bronopols im allgemeinen im Bereich von 1 mg/l bis 50 mg/l liegt.

Malachitgrün wird als Spülbehandlung verwendet. Es wird oben auf den Inkubator verabreicht und mit dem hereinkommenden Wasser durch die Eier gespült (der Wasserfluss wird nicht abgeschaltet). Dies ist das gewöhnliche Verfahren an allen Stationen. Die Dosierung variiert von Station zu Station wie folgt: Station 1 15 mg/l, Station 2 40 mg/l, Station 3 5 mg/l.

Die Eier sowohl in den Bronopol- als auch Malachitgrüngruppen werden jeden Tag nach dem Ablaichen bis zum Schlüpfen behandelt.

Das Pilzwachstum wird visuell als Prozentsatz an Eiern, die mit Pilzwachstum bedeckt sind, jeden zweiten Tag der Studie an den Stationen 1 und 2 und jeden Tag an der Station 3 visuell ermittelt. Die Ergebnisse sind graphisch in den 1 bis 3 dargestellt und sind in der folgenden Tabelle 2B zusammengefasst:

Die Tabelle 2B zeigt, dass Bronopol zu keinem Pilzwachstum für 46,63 % der Tage führt, die die Eier behandelt werden. Dies kann mit 41,57 % für Malachitgrün und 28,09 %, wenn keine Behandlung angewendet wird, verglichen werden. Sowohl Bronopol als auch Malchitgrün verhindern, dass die Eier zu mehr als 25 % mit Pilzwachstum bedeckt werden.

Tote Eier werden gezählt und beim Schock und Schlüpfen entfernt und die Anzahl an toten Eiern wird für jeden Fall in den folgenden Tabellen 2C bis 2K aufgeführt. Die Tabellen 2 L und 2 M zeigen die Gesamtmortalitäten jeweils beim Schock und Schlüpfen. (Die Station 1 berichtet keine Mortalitäten beim Schlüpfen und daher kommt der geringere ursprüngliche Wert in Tabelle 2 M).

Schlussfolgerung

Bronopol scheint bei der Kontrolle von Pilzinfektionen bei lachsartigen Eiern genauso wirksam zu sein, wie Malachitgrün. Die Gesamtmortalitäten beim Schlüpfen sind für Malachitgrün und Bronopol niedriger als die Negativkontrolle mit jeweils 14,20 %, 17,70 % und 47,66 % an toten Eiern.

Versuch 3 – Referenzversuch In vivo Wirksamkeit von Bronopol gegen Saprolegnia parasitica Infektion bei Lachs Verfahren

105 Atlantiklachse (Salmon salar) gemischten Geschlechts mit einem Alter von etwa 8 Monaten, die im Mittel etwa 30 g wiegen, werden in drei Behandlungsgruppen von jeweils 35 Fischen eingefeilt. Jede Gruppe wird in frischem Wasser bei 12,5°C in einem 210 Liter Fiberglastank gehalten. Die Fische werden täglich mit 2 % ihres Körpergewichts an "Biomar" Produktionsfutter gefüttert. Nach 2 Wochen Akklimatisierung werden alle drei Gruppen künstlich mit Saprolegnia parasitica infiziert, wobei der Tag der Infektion als Tag 0 des Versuchs bezeichnet wird. Die Gruppen werden dann an den Tagen 1, 3 und 5 folgendermaßen behandelt:

Am Tag 8 des Versuchs werden alle Fische getötet und das Infektionsausmaß jedes Fisches wird gemäß dem folgenden Bewertungssystem untersucht:

  • (*Tote Fische werden entfernt, wenn Todesfälle auftreten, um die Kontamination des Wassers zu vermeiden).

Ergebnisse

Die Anzahl an Fischen in jeder Kategorie des obigen Bewertungssystems und die Gesamtbewertung für jede Gruppe sehen folgendermaßen aus:

Die kumulativen Mortalitätszahlen für jeden Versuchstag sind graphisch in 4 angegeben.

Schlussfolgerung

Bionopol ist gegen eine Saprolegnia Infektion wirksam und verringert auch die Mortalitäten um 50 % im Vergleich sowohl zu der Gruppe ohne Behandlung als auch zu der mit Malachitgrün behandelten.

Versuch 4-Referenztest In vivo Wirksamkeit von Bronopol gegen Ichthyobodo necatrix Infektion in der Regenbogenforelle Verfahren

Regenbogenforellen (Oncorhyncus mykiss) mit einem mittleren Gewicht von 15 g werden in diesem Versuch verwendet und in einem gemeinsamen Becken mit 6 Individuen zusammengebracht, die stark mit Ichthyobodo infiziert sind. Die Infektion der vorher gesunden Individuen wird nach 5 Tagen durch eine Mikroskopie von entnommenen Kiemenproben bestätigt. Die Bronopolbehandlung wird einer Gruppe von 20 Fischen unter Verwendung desselben Verfahrens wie in Versuch 3 verabreicht. Der Versuch wird mittels einer Gruppe an 19 infizierten Fischen wiederholt, die mit Formalin (einer Standardbehandlung für Ichthyobodo) behandelt werden, wobei eine weitere Gruppe an 20 infizierten Fischen keine Behandlung erhält und als Kontrolle wirkt. 7 Tage nach der Behandlung wird die mittlere Anzahl an Parasiten pro Kiemenfilament in jeder Gruppe (durch Zählen der Anzahl an Parasiten bei 5 Fischen auf jeweils 10 Filamenten) ermittelt und nach 14 Tagen wird eine weitere Zählung ausgeführt, wobei die einzelnen Fische entweder als ohne Infektion kategorisiert werden oder in eine von 4 infizierten Kategorien gemäß dem Ausmaß der Infektion eingeteilt werden.

  • Keine Mortalitäten beobachtet

Schlussfolgerung

Bronopol zeigt eine gute Aktivität gegen eine Ichthyobodo Infektion bei der Regenbogenforelle. Obwohl es weniger wirksam als Formalin ist, trägt dessen Verwendung weniger Risiko. Es kann angenommen werden, dass Bronopol eine ähnliche Wirksamkeit gegen eine Ichthyobodo Infektion in anderen Lachsartigen und bei Fisch und Wasserorganismen im allgemeinen aufweist und dass es auch bei der Prophylaxe dieser Erkrankung brauchbar ist.

Versuch 5 In vitro Wirksamkeit von Bronopol gegen Cytophaga psychrophila Verfahren

Zuerst wird die minimale bakterizide Konzentration (MBC) für Bronopol gegen Cytophaga psychrophila etabliert, indem man den Organismus in Medium anzieht und dann unterschiedliche Verdünnungen an Bronopol zugibt, um zu ermitteln, welche Konzentration Cytophaga töten könnte.

Dann werden basierend auf den MBC Ergebnissen die Kontaktzeiten ermittelt, die zum Töten von Cytophaga erforderlich sind. Eine bekannte Anzahl an lebensfähigen Bakterien wird zu destilliertem Wasser gegeben und gegenüber verschiedenen Konzentrationen an Bronopol für 2 bis 40 Minuten exportiert. Dann werden die Bakterien durch Filtration extrahiert und die extrahierten Bakterien werden auf die Lebensfähigkeit getestet, indem man ihr Wachstum in einem Kulturmedium durch Messen der optischen Dichte bei 520 nm untersucht.

Ergebnisse

Die Ergebnisse werden graphisch in 5 dargestellt. Die minimale Testkonzentration, die wirksam ist, beträgt 5 mg/l (ppm), es ist aber wahrscheinlich, dass die tatsächlich minimal wirksame Konzentration zwischen 1 mg/l und 5 mg/l liegt. Es wird auch festgestellt, dass eine Expositionszeit von bis zu 40 Minuten erforderlich ist, um das bakterielle Wachstum nach einem Wiederanimpfen auf frisches Medium zu verhindern, wenn Konzentrationen zwischen 5 mg/l und 400 mg/l verwendet werden, wobei die erforderliche Expositionszeit bei einer Konzentration von 1000 mg/l auf etwa 4 Minuten und bei 2000 mg/l auf etwa 2 Minuten verringert wird.

Schlussfolgerung

Von Bonopol wird gezeigt, dass es gegen Cytophaga psychrophila bei so geringen Konzentrationen wie 5 mg/l wirksam ist. Cytophaga ist ein Beispiel für die Bakteriengruppe, die als Myxobakterien bekannt ist, die durch eine schützende Mukopolysaccharidschicht gekennzeichnet sind und die im allgemeinen gegen Desinfektionsmittel resistent sind (beispielsweise beträgt die Dosis an Iodophordesinfektionsmittel, die zum Töten von Cytophaga erforderlich ist, etwa 2000 mg/l). Basierend auf den bekannten Verwendungen von Bronopol ist diese Aktivität daher überraschend und kann eine Aktivität gegen Myxobakterien im allgemeinen anzeigen. Bronopol dürfte eine geeignete Desinfektionsbehandlung für Fischtanks und deren Ausrüstung sein und kann auch bei der Behandlung und/oder Prophylaxe für verschiedene Erkrankungen brauchbar sein, die durch diesen Organismus bei Forellen oder anderen lachsartigen Fischen verursacht werden und ebenfalls (falls diese auftreten) bei anderen Fischen und Wasserorganismen.

Versuch 6 – Referenzversuch In vivo Wirksamkeit von Bronopol gegen eine Infektion von Flavobacterium branchophilum bei der Regenbogenforelle

Mehrere Tanks mit jeweils 150 Regenbogenforellen mit einer Besatzdichte von 100 g/l werden in diesem Experiment einbezogen. Der Fisch ist im Mittel 15 g groß. Die Wassertemperatur beträgt 11°C und das Wasser wird mit einer Geschwindigkeit von einmal pro Stunde ausgetauscht.

Ein Fischtank wird als Negativkontrolle gehalten und weder infiziert noch behandelt. Ein zusätzlicher Tank wird infiziert, aber nicht behandelt, um als Positivkontrolle zu dienen. Zwei Tanks werden mit Chloramin-T (eine herkömmliche Behandlung) mit einer Konzentration von 10 mg/l behandelt. 3 Tanks werden mit Bronopol jeweils mit den folgenden Konzentrationen behandelt: 5, 25 und 50 mg/l.

Die Fische werden am Tag 0 infiziert und die Tanks werden entweder mit Chloramin-T oder Bronopol an den Tagen 2 und 4 des Experiments behandelt. Alle 6 Tanks, die experimentell mit F branchiophilum infiziert sind, werden mit den jeweiligen Therapeutika gleichzeitig für 1 Stunde in einem statischen Bad mit Belüftung behandelt.

Die Wirksamkeit jeder Behandlung wird durch klinische Anzeichen, bakterielle Kiemenantigenspiegel, die durch einen Enzymimmuntest (EIA) gemessen werden, Motalitätsraten und kumulative Mortalität und schließlich durch histologische Untersuchung gemessen.

Die Kiemenproben für den EIA werden aus 5 Fischen in jedem Tank vor der experimentellen Infektion und vor der Behandlung gewonnen. Weitere Kiemenproben werden 6 und 36 Stunden nach der anfänglichen Behandlung gewonnen, nachdem die Gruppen erneut mit identischen Konzentrationen desselben Therapeutikums auf identische Weise behandelt wurden. Es werden erneut Kiemenproben von 5 Fischen aus jedem Tank 6 und 36 Stunden nach der zweiten Behandlung entnommen. Die Mortalität in jedem Tank wird jeden Tag aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind graphisch in den 6 bis 8 gezeigt.

Auf der Grundlage der Mortalität und den EIA Daten ist die geringste Bronopolkonzentration (5 mg/l, 5) unwirksam. Die Mortalität hängt invers mit der Dosis an Bronopol (6) zusammen.

Es ist ersichtlich, dass die Mortalität eng mit den bakteriellen Antigenmengen zusammenhängt, die auf den Kiemen detektiert werden und dass der EIA ein brauchbares Werkzeug zur Verfolgung der Wirksamkeit eines Therapeutikums zur Eliminierung von Bakterien von der Oberfläche der Kiemen ist. Wie die Mortalität ist die bakterielle Kiemenantigenkonzentration bei den meisten Probenzeiten umgekehrt proportional zur Dosis des Therapeutikums (8). Zwei der höchsten Konzentrationen an Bronopol eliminieren die Bakterien wirksam von der Kiemenoberfläche nach der zweiten Behandlung (8). Es ist ersichtlich, dass Bronopol gegen Flavobacterium branchophilum wirksam ist und dass im Versuch Bronopol mit 25 mg/l und 50 mg/l die Mortalitäten unter den infizierten Fischen sowohl im Vergleich zum unbehandelten Fisch als auch zum Fisch verringert, der mit Chloramin-T behandelt wird.

Versuch 7 – Referenzversuch In vivo Wirksamkeit von Bronopol gegen Saprolegnia parasitica in Braunforellen Verfahren

Dieser Versuch wird angelegt, um die Wirksamkeit von Bronopol bei der Behandlung von Braunforellen zu ermitteln, die natürlicherweise mit Saprolegnia parasitica infiziert sind. 40 Fische werden im Versuch verwendet und sie werden in 2 Gruppen gleichmäßig eingeteilt, die in getrennten Tanks gehalten werden. Ein stark erkrankter Fisch, der stark mit Saprolegnia parasitica infiziert ist, wird mit der Intention in jeden Tank gegeben, die anderen Fische natürlich zu infizieren. An den Tagen 1, 3 und 5 des Versuchs werden die Fische in einer Gruppe in einem 50 mg/l Bad an Bronopol für 15 Minuten behandelt, während der Fisch in der zweiten Gruppe unbehandelt bleibt und als Kontrolle wirkt. Das Ausmaß der Infektion der Fische in beiden Gruppen wird am Tag 7 des Versuchs ermittelt.

Ergebnisse

In beiden Gruppen sterben die stark erkrankten Fische am Tag 1 des Versuchs, werden aber jeweils im Tank belassen, um die gute Infektionsprovokation für die verbleibenden Fische sicherzustellen. Am Tag 7 des Versuchs wird festgestellt, dass alle Fische in der Kontrollgruppe stark mit Saprolegnia infiziert sind und sie werden aus humanitären Gründen getötet. Im Gegensatz dazu sind die Fische in der Bronopolbehandlungsgruppe alle gesund und haben keine sichtbaren Anzeichen einer Saprolegnia Infektion.

Schlussfolgerung

Eine wiederholte Behandlung mit Bronopol bei einer Konzentration von 50 mg/l scheint als Behandlung für eine Saprolegnia Infektion bei Braunforellen und/oder als Prophylaktikum zur Verhinderung der Infektion sehr wirksam zu sein.


Anspruch[de]
Verwendung von Bronopol (2-Brom-2-nitropropan-1,3-diol) zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer der folgenden Erkrankungen von Fischeiern: Pilzinfektionen, Protozoeninfektionen durch Flagellaten, Protozoeninfektionen durch Ciliaten, bakterielle Kiemenerkrankung und Infektionen durch Myxobakterien. Verwendung von Bronopol (2-Brom-2-nitropropan-1,3-diol) zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Prophylaxe von Saprolegnia parasitica Infektionen bei Fischeiern. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Fischeier Lachsfischeier sind. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Bronopol durch Umsetzung von Nitromethan mit Paraformaldehyd in einer alkalischen Umgebung, gefolgt von einer Bromierung hergestellt wird. Verwendung nach einem vorangehenden Anspruch, worin das Bronopol als Lösung in einem polaren Lösemittel hergestellt wird.






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