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Dokumentenidentifikation DE69735745T2 12.04.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0000840113
Titel Verfahren und Vorrichtung zur Elektrophorese auf einem Mikrochip
Anmelder Shimadzu Corp., Kyoto, JP
Erfinder Nakanishi, Hiroaki, Nara 630, JP;
Arai, Akihiro, Kyoto 603, JP;
Iwata, Yosuke, Joyo-shi, Kyoto 610-11, JP
Vertreter Wilhelms, Kilian & Partner, 81541 München
DE-Aktenzeichen 69735745
Vertragsstaaten CH, DE, FR, GB, LI, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 10.10.1997
EP-Aktenzeichen 971176169
EP-Offenlegungsdatum 06.05.1998
EP date of grant 26.04.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.04.2007
IPC-Hauptklasse G01N 27/447(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Analyse einer sehr kleinen Menge von Analyten eines weiten Bereichs, insbesondere Biopolymeren wie etwa Proteinen oder Nukleinsäuren, mit hoher Geschwindigkeit und in hoher Auflösung, und ist auch eine Vorrichtung für diesen Zweck. Genauer ist sie eine Vorrichtung, die sich auf ein Mikrochip-Elektrophoreseverfahren, das einen Mikrochip verwendet, bezieht. Der Mikrochip wird hergestellt, indem eine Nut zum Zuführen einer Flüssigkeit auf die Oberfläche von wenigstens einem eines Paares von transparenten Plattenteilen ausgebildet wird. Das andere Plattenteil ist mit Löchern an Stellen versehen, die den Nuten entsprechen. Diese Plattenteile werden unter Einwärtspositionierung der Nut miteinander verklebt, wodurch mittels der Nut ein Trennkanal ausgebildet wird. Durch Auffüllen des Trennkanals mit einer Migrationsflüssigkeit, Eingeben einer Probe in ein Ende desselben und Anlegen einer Migrationsspannung an den Trennkanal wird die Probe im Trennkanal elektrophoresiert.

Beschreibung des Standes der Technik

Im Falle einer Analyse einer sehr kleinen Menge an Protein oder Nukleinsäure wird eine Elektrophoresevorrichtung, wie etwa eine Kapillar-Elektrophoresevorrichtung, allgemein verwendet. Bei der Kapillar-Elektrophoresevorrichtung wird ein Migrationspuffer in eine Glaskapillare mit einem Innendruchmesser von nicht mehr als 100 &mgr;m gefüllt. Eine Probe wird an einem Ende eingeführt, gefolgt von dem Anlegen einer hohen Spannung an der Kapillare, um den Analyten in der Kapillare wandern zu lassen. Die Kapillare, die eine große Oberfläche in Bezug auf ihr Volumen, d. h., hohe Kühleffizienz, hat, gestattet das Anlegen einer hohen Spannung und kann eine sehr kleine Menge einer Probe, wie etwa einer DNA, mit hoher Geschwindigkeit in hoher Auflösung analysieren.

Die Kapillare ist jedoch infolge ihres kleinen Durchmessers zerbrechlich, obwohl sie üblicherweise durch eine Polymidbeschichtung geschützt wird. Der Benutzer muss daher extrem sorgfältig arbeiten, wenn die Kapillare ausgetauscht wird. Aus diesem Grund wurde ein Kapillar-Elektrophoresechip, genannt Mikrochip, vorgeschlagen. Dieser Mikrochip wird durch Verbinden von zwei Substraten ausgebildet, wie dies in D. J. Harrison et al., Anal. Chim. Acta 283 (1993), Seiten 361 bis 366 beschrieben ist. Die 1A bis 1C zeigen ein Beispiel eines solchen Mikrochips. Dieser Mikrochip besteht aus einem Paar transparenter Substrate (etwa Glasplatten 51 und 52). Schneidende Elektrophorese-Kapillarnuten 54 und 55 sind an einer Oberfläche des Substrats 52 ausgebildet, während Reservoire 53 an dem Substrat 51 als Löcher an Stellen vorgesehen sind, die den Enden von Nuten 54 bzw. 55 entsprechen.

Bei Verwendung dieses Mikrochips sind die Substrate 51 und 52, wie in 1C gezeigt, so überlappt, dass eine elektrophoretische Pufferlösung aus irgendeinem Reservoir 53 in Nuten 54 und 55 eingegeben wird. Nachfolgend wird eine Probe in das Reservoir 53, das einem Ende einer kürzeren Nut 54 entspricht, eingegeben, während ein Paar von Elektroden zwischen Reservoiren 53, die den beiden Enden der Nut 54 entsprechen, zum Anlegen einer hohen Spannung zu einer vorgeschriebenen Zeit an die Probeneingabe, eingesetzt ist. Auf diese Weise wird die Probe in die Nut 54 herein zerstreut.

Danach wird ein weiteres Paar von Elektroden zwischen Reservoiren 53, die den beiden Enden der längeren Nut 55 entsprechen, zum Anlegen einer Migrationsspannung eingesetzt. Die Probe, die am Schnittpunkt 56 zwischen Nuten 54 und 55 zugegen ist, wird in der Nut 55 elektrophoresiert. Ein Detektor, wie etwa ein Ultraviolett-Sichtbarlichtphotometer, ein Fluoreszenzphotometer oder ein elektrochemischer Detektor wird an einer korrekten Stelle zur Nut 55 zur Feststellung der getrennten Komponenten angeordnet.

Herkömmliche Mikrochip-Elektrophoresevorrichtungen, die optische Detektoren zur Feststellung von Bestandteilen verwenden, benutzen einen laserinduzierten Fluoreszenznachweis als Nachweismittel. Keine Vorrichtung führt einen Nachweis durch Absorption in einem ultraviolett-sichtbaren Bereich durch. Wenn Ultraviolett-Sichtbarabsorptionsnachweis anzuwenden ist, ist er als Verfahren des Einführens von einfallendem Licht senkrecht zu einem Kanal und Feststellens von Zielkomponenten, die eine bestimmte spezifische Position eines Nachweisteils durchlaufen, mit Mitteln, wie etwa einer Photozelle, denkbar, womit eine Trennung auf ähnliche Weise, wie bei einer herkömmlichen Kapillar-Elektrophoresevorrichtung bestätigt wird.

Wenn Licht in einen Mikrochip senkrecht zu seiner Oberfläche im Falle einer Kapillar-Elektrophorese eingeführt wird, lässt sich eine optische Weglänge von nur ungefähr 20 &mgr;m gewinnen, was ungefähr 2/5 dessen bei einer herkömmlichen Kapillar-Elektrophorese ist. Auch ist bei der herkömmlichen Kapillar-Elektrophorese die optische Weglänge (ungefähr 50 &mgr;m) so kurz, dass ihre schlechte Empfindlichkeit trotz ihrer hohen Auflösung ein ernster Nachteil ist. Es ist zwar denkbar, einen Kanal eines Zellenteils aufzublähen, um die optische Weglänge zu erhöhen, wie dies bei einer Blasenzelle oder dergleichen beobachtet wird, es ist aber immer noch schwierig eine ausreichende optische Weglänge zu verwirklichen.

Ein Mikrochip-Elektrophoreseverfahren gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 1 und ein Mikrochip-Elektrophoreseverfahren gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 2 sind aus WO 97/30347 A bekannt, die Stand der Technik gemäß Art. 57(3) EPÜ ist.

WO 93/14389 A beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung für den Extinktionsnachweis, welches eine Zylinderlinse und Filter aufweist. Die Trennungen aus Kapillar-Elektrophorese werden online durch Fokussieren eines Lichtbündels in Form einer Lichtlinie oder Lichtbahn auf den Kapillarkanal festgestellt. Die Verwendung einer Glaskapillare in einem Mikrochip für Elektrophoresevorrichtungen ist beispielsweise aus FAN Z. H. et al: „Micromachining of capillary electrophoresis injectors and separators on glass chips and evaluation of flow at capillary intersections", Analytical Chemistry, Bd. 66, Heft 1, 1. Januar 1994, Seiten 117-184, XP000426228 bekannt.

ÜBERBLICK ÜBER DIE ERFINDUNG

Dementsprechend ist die vorliegende Erfindung dafür gedacht, die Nachweisempfindlichkeit bei der Mikrochip-Elektrophorese zu verbessern.

Die Erfindung ist wie in den Ansprüchen 1 und 2 definiert.

Ein typischer Mikrochip umfasst ein Paar von transparenten Plattenteilen. Eine Nut zur Zufuhr einer Flüssigkeit ist an einer Oberfläche von wenigstens einem der Plattenteile ausgebildet, das andere Plattenteil ist mit Löchern an Stellen, die der Nut entsprechen, versehen, und diese Plattenteile werden unter Einwärtsrichten der Nut miteinander verbunden, womit durch die Nut ein Trennkanal ausgebildet wird.

Zur Gewinnung von Migrationsmustern längs des Trennkanals, während das Anlegen der Migrationsspannung gestoppt wird, umfassen die Lichteinstrahlmittel eine Lichtquelle und ein optisches System, welches einen vorgeschriebenen Bereich des Trennkanals mit linearkondensiertem Licht bestrahlt. Die Lichtnachweismittel umfassen eine Anzahl von Photodetektoren, welche längs des Trennkanals zur gleichzeitigen Feststellung von Licht aus Probenkomponenten in dem Trennkanal, die mit Licht durch die Lichteinstrahlmittel bestrahlt worden sind, angeordnet sind. Der Datenverarbeitungs/Steuerteil führt wiederholt Messungen mit den Lichtnachweismitteln durch, wobei die Messsignale in jedem Photodetektor akkumuliert werden.

Bei einem aktualisierten Aufbau umfassen die Lichteinstrahlmittel eine Lichtquelle, welche sich längs des Trennkanals erstreckt, und eine Zylinderlinse, welche so angeordnet ist, dass Licht in der Breitenrichtung längs des Trennkanals kondensiert und Licht aus der Lichtquelle in den Trennkanal eingeführt wird. Die Lichtnachweismittel umfassen eine Zylinderlinse, die so angeordnet ist, dass Licht in der Breitenrichtung längs des Trennkanals kondensiert und aus dem Trennkanal zu den Photodetektoren geleitet wird.

Zur Gewinnung von Migrationsmustern längs des Trennkanals, während das Anlegen der Migrationsspannung gestoppt wird, umfassen die Lichteinstrahlmittel eine Lichtquelle und ein optisches System, welches den Trennkanal mit einem Lichtbündel bestrahlt. Die Lichtnachweismittel umfassen einen einzelnen Photodetektor, welcher so angeordnet ist, dass er Licht von der Probe im Trennkanal durch Licht von den Lichteinstrahlmitteln nachweist. Eine Anordnung, welche die Lichteinstrahlmittel und die Lichtnachweismittel enthält, und der Mikrochip können eine Relativbewegung längs des Trennkanals durchführen. Der Datenverarbeitungs/Steuerteil bewegt diese Anordnung oder den Mikrochip wiederholt längs des Trennkanals, um Nachweissignale mit den Lichtnachweismitteln an jeder Stelle des Trennkanals zu akkumulieren.

Die Lichtnachweismittel sind so eingerichtet, dass sie Lichtabsorption durch Probenkomponenten im Trennkanal nachweisen. Entweder die Lichteinstrahlmittel oder die Lichtnachweismittel weisen spektroskopische Mittel auf, die eine Wellenlänge zur Messung der Extinktion auswählen.

Die Anzahl der Messwiederholungen zur Sammlung von Information wird vorzugsweise automatisch berechnet und durch den Datenverarbeitungs/Steuerteil gesteuert. Hierzu umfasst der Datenverarbeitungs/Steuerteil eine Berechnungsformel, welche einen Diffusionskoeffizienten der Probe und einen Peakverschlechterungsgrad als Parameter zur Berechnung der Anzahl von Messwiederholungen durch Lichteinstrahlung in den Trennkanal enthält, und berechnet automatisch die Messwiederholungszahl und steuert die wiederholte Messung durch Eingabe solcher Parameter.

Als konkretes Beispiel zur Berechnung der Anzahl von Messwiederholungen enthält der Datenverarbeitungs/Steuerteil die folgende Berechnungsformel zur Gewinnung einer Zeit t' bis zu einer Verschlechterung der Anzahl theoretischer Böden auf N' als eine Zeit, die eine wiederholte Messung gestattet. t' = (L2/N' – &sgr;2)/2D

Der Datenverarbeitungs/Steuerteil berechnet die Anzahl von Messwiederholungen auf der Grundlage der Zeit t'. In obiger Formel stellt L eine Länge des Trennkanals (Kapillare), &sgr; eine Standardabweichung des Peak und D den Diffusionskoeffizienten dar.

In einem weiteren Beispiel zur Berechnung der Anzahl von Messwiederholungen enthält der Datenverarbeitungs/Steuerteil die folgende Berechnungsformel zur Gewinnung einer Zeit t' bis zu einer Verschlechterung der Anzahl theoretischen Böden auf N' als eine Zeit, die eine wiederholte Messung gestattet. t' = L2(1/N' – 1/N)/2D

Der Datenverarbeitungs/Steuerteil berechnet die Anzahl von Messwiederholungen auf der Grundlage der Zeit t'.

Wenn die an den Trennkanal angelegte Migrationsspannung nach vollständiger Trennung der Zielkomponenten beseitigt wird, wirkt auf die getrennten Komponenten anders als bei der Flüssigchromatographie keine Trägheitskraft; die Komponenten werden auf natürliche Weise zerstreut und verbleiben im Kanal. Die Lichtnachweismittel messen wiederholt die Absorption mit Licht, das auf den Gesamtkanal aufgebracht wird, oder die Fluoreszenz in diesem Zustand. Die Stellung eines jeden Photodetektors der Lichtnachweismittel entspricht derjenigen des Kanals, weshalb die Lichtintensität an jeder Stelle des Kanals gemessen und wiederholt akkumuliert wird. Während die Komponenten im Kanal auf natürliche Weise während der Messung zerstreut werden, ist das Signal/Rausch-Verhältnis 17,3, wobei angenommen ist, dass es etwa 2,5 Sekunden bis zur Verschlechterung der Peakform um ungefähr 90 % im Sinne der Anzahl theoretischer Böden dauert. Eine Akkumulation wird in dieser Zeitdauer 300 Mal durchgeführt, wie später noch beschrieben wird.

Bei dem herkömmlichen Verfahren des Vorsehens eines Detektors an einem Teil eines Trennkanals zur Feststellung von Zielkomponenten, die diesen Ort durchlaufen, ist die Analyse erst abgeschlossen, wenn die Trennung abgeschlossen ist und die letzte Zielkomponente diesen Ort durchläuft. Bei der vorliegenden Erfindung andererseits kann eine Messung in dem Zeitpunkt ausgeführt werden, zu dem die letzte Zielkomponente vollständig abgetrennt ist, wodurch die Messzeit verkürzt wird.

Es ist möglich, durch Wiederholung der Messung und Akkumulieren der Messwerte das Signal/Rausch-Verhältnis zu verbessern, wodurch die Nachweisempfindlichkeit verbessert wird.

Während beim bekannten Nachweisverfahren die Peakbreite eines Elektropherogramms mit abnehmender Migrationsgeschwindigkeit zunimmt, sind mittels der vorliegenden Erfindung die Zielkomponenten bei der gleichen Migrationszeit, weshalb ein elegantes Elektropherogramm mit regulären Peakbreiten gewonnen werden kann.

Da die Anzahl der Messwiederholungen automatisch berechnet wird, ist es nicht erforderlich, manuell komplizierte Rechnungen durch zuführen, weshalb ein fehlerhaftes Arbeiten durch Fehlberechnung nicht bewirkt wird.

Die vorstehenden und weitere Aufgaben, Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen deutlicher werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1A und 1B sind Draufsichten, die transparente Plattenteile zeigen, die einen Mikrochip gemäß dem Stand der Technik und der vorliegenden Erfindung bilden, und 1C ist eine Vorderansicht, die den zusammengebauten Mikrochip zeigt;

2 ist eine schematische perspektivische Ansicht, die eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt;

3 ist ein Schaltbild, welches ein Photozellenfeld bei der Ausführungsform zeigt;

4 ist ein Blockdiagramm, welches ein Steuersystem bei der Ausführungsform zeigt;

5 ist ein Flussdiagramm, welches das Arbeiten der Ausführungsform wiedergibt;

6A ist eine schematische Vorderansicht, welche einen Trennkanal bei Anhalten der Trennung und ein Photozellenfeld in der Ausführungsform zeigt, 6B ist ein Wellenformdiagramm, welches ein Chromatogramm der Ausführungsform zeigt, und 6C ist ein Wellenformdiagramm, welches ein Elektropherogramm des Standes der Technik zeigt; und

7 ist ein Flussdiagramm, welches das Arbeiten einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

2 zeigt eine Vorrichtung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Mikrochip 5 ist in 1C gezeigt. Um einen konstanten Bereich seines Trennkanals 55 zu bestrahlen, wird Licht einer Lichtquelle 1 längs des Trennkanals 25 linear ausgedehnt und durch Zylinderlinse 2 in paralleles Licht umgewandelt. Eingeführt in ein Bandpassfilter 3, wird das vom Bandpassfilter 3 durchgelassene Filter zu einer bestimmten Wellenlänge gemacht, wird durch Zylinderlinse 4 kondensiert und in den Trennkanal 55 des Mikrochips 5 eingeführt. Zylinderlinse 6 ist an einer gegenüberliegenden Seite des Mikrochips 5 vorgesehen, um das vom Trennkanal 55 durchgelassene Licht zu kondensieren, und das mit der Zylinderlinse 6 kondensierte Licht wird in ein Photozellenfeld 7 eines Lichtdetektors eingeführt und nachgewiesen. Die Zylinderlinsen 2, 4 und 6, das Bandpassfilter 3 und das Photozellenfeld 7 sind kürzer als, aber im Wesentlichen identisch in der Länge zu dem Trennkanal 55. Das Photozellenfeld 7 umfasst 512 Photodioden, welche linear entlang der Längsrichtung des Trennkanals 55 als Nachweiselemente angeordnet sind.

Das Bandpassfilter 3, welches auf der Lichteinstrahlseite bei dieser Ausführungsform angeordnet ist, kann alternativ auch auf der Lichtnachweisseite, d. h., im Lichtweg zwischen Mikrochip 5 und Photozellenfeld 7 angeordnet sein.

Das Photozellenfeld 7 hat einen in 3 gezeigten Schaltungsaufbau. Das Photozellenfeld 7 hat ungerade Photodioden 11 und gerade Photodioden 12, welche abwechselnd auf Geraden angeordnet sind. Die Gesamtzahl der Photodioden 11 und 12 ist 512. Das Photozellenfeld 7 ist ferner mit 512 Blindphotodioden 13 versehen, welche die gleiche Charakteristik wie die für die Messung verwendeten Photodioden 11 und 12 haben. Aus MOS-FETs bestehende Schaltelemente 14 sind mit den Photodioden 11, 12 bzw. 13 verbunden. Ein ungerades Schieberegister 15 oder ein gerades Schieberegister 16 ist mit jedem Schaltelement 14 verbunden, so dass EIN- und AUS-Zustände eines jeden Schaltelements 14 durch ein Signal aus dem Schieberegister 15 oder 16 geschaltet werden.

Bezugszeichen 17 und 18 bezeichnen Betätigungssignaleingangsanschlüsse des geraden bzw. ungeraden Schieberegisters 15 und 16, Bezugszeichen 19 und 18 bezeichnen gerade bzw. ungerade Rücksetzsignaleingangsanschlüsse, Bezugszeichen 21 und 22 bezeichnen Ausgangsanschlüsse für die ungeraden bzw. geraden Photodioden 11 und 12, Bezugszeichen 23 und 24 bezeichnen Ausgangsanschlüsse für die Blindphotodioden 13 und Cv bezeichnet Kondensatoren.

Die Elektrophoresevorrichtung umfasst einen in 4 gezeigten Steuerteil 40, der diese elektrophoretische Vorrichtung steuert. Steuerteil 40 ist durch einen eine CPU enthaltenden Mikrocomputer, einen RAM und einen ROM gebildet. Eingänge 17 bis 20 des Photozellenfelds 7 sind mit dem Steuerteil 40 verbunden. Ausgänge 21 bis 24 des Photozellenfelds 7 sind mit dem Steuerteil 40 über einen Verstärker 41 und A/D-Wandler 42 verbunden. Ferner sind mit dem Steuerteil 40 ein Steuerpult 43 mit Tasten für einen Bediener zur Eingabe von Befehlen und eine Bildröhre (Kathodenstrahlröhre) für Anzeigen, ein X-Y-Drucker 44 zum Auftragen von Messergebnissen sowie eine Spannungsquelle 34 verbunden.

Bei dieser Ausführungsform wird Licht aus der Lichtquelle 1 durch die Zylinderlinse 2 in Parallellicht umgewandelt, durchläuft das Bandpassfilter 3 zur Umwandlung in Licht mit nur einer speziellen Wellenlänge und wird auf den Trennkanal 55 des Mikrochips 5 durch die Zylinderlinse 4 kondensiert. Das den Trennkanal 55 durchlaufende Licht wird durch die Zylinderlinse 6 erneut in paralleles Licht umgewandelt und auf das Photozellenfeld 7 gegeben.

Das Arbeiten dieser Ausführungsform wird nun unter Bezugnahme auf das in 5 gezeigte Flussdiagramm beschrieben.

Wenn ein Programm gestartet wird, wird eine Initialisierung durchgeführt, um eine Spannungsquelle 34 in einen EIN-Zustand zu bringen und einen Drucker 44 auf seine Anfangsposition zu setzen (Schritt S1). Der Bediener stellt Trennparameter, wie etwa eine Probeneinführungszeit, eine Probeneinführungsspannung und eine Migrationsspannung, über das Steuerpult 43 ein (Schritt S2). Dann stellt der Bediener Messparameter, wie etwa eine Migrationsendzeit (= Akkumulationstartzeit) und eine Akkumulationszeit ein (Schritt S3). Das Programm wartet auf einen Startbefehl (Schritt S4).

Wie bei der herkömmlichen Mikrochip-Elektrophorese bringt der Bediener eine Probe ein und drückt einen Startknopf des Steuerpults 43. Eine elektrophoretische Trennung wird begonnen und die Migrationsspannung am Trennkanal 55 des Mikrochips 5 beruhend auf den Parametern, die im Programm eingestellt worden sind, angelegt (Schritt S4 und S5). Damit wird die Probe in den Trennkanal 55 bewegt und getrennt.

Wenn die eingestellte Migrationszeit abgelaufen ist (Schritt S6), werden Zielkomponenten im Trennkanal 55 getrennt. Es wird angenommen, dass Zielkomponenten a, b, c und d, wie in 6A gezeigt, getrennt werden. Kapillar-Elektrophorese (identisch mit dieser Mikrochip-Elektrophorese) ist durch die Tatsache gekennzeichnet, dass, wenn eine für die Elektrophorese angelegte hohe Spannung weggenommen wird, Komponenten in einer Kapillare in situ, ohne Einfluss durch eine Trägheitskraft, verbleiben. Daher werden die Komponenten a, b, c und d auf natürliche Weise zerstreut. Eine Messung wird gemäß der im Schritt S3 vorgenommenen Einstellung begonnen (Schritt S7). Jede Photodiode des Photozellenfelds 7 entspricht dabei einer Stelle des Kanals 55. Das Photozellenfeld 7, welches mit den 512 Photodioden versehen ist, die in Abständen von 25 &mgr;m angeordnet sind, hat eine Länge von 12,8 mm. Dementsprechend werden Lichtabsorptionsbilder in einer Auflösung von 25 &mgr;m im Bereich der Länge von 12,8 mm des Trennkanals 55 gewonnen. Die in 6A gezeigten Trennzustände werden als Ultraviolett-Absorptionsbilder, wie sie in 6B gezeigt sind, gewonnen.

Der Steuerteil 40 tastet das Photozellenfeld 7 wiederholt ab und führt eine Akkumulation durch, wodurch das in 6B gezeigte Signal/Rausch-Verhältnis rasch zunimmt (Schritte S7, S8 und S9). Wenn die Akkumulation abgeschlossen ist, gibt der Steuerteil 40 die Messergebnisse auf den Drucker 44 aus (Schritt S10) und schaltet zum Beenden des Programms die Spannungsquelle 34 ab (Schritte S11 und S12).

Die Zeit für eine wiederholte Messung kann mit einem Standard des Verschlechterungsgrads der Anzahl theoretischer Böden N entschieden werden. Die Anzahl theoretischer Böden N wird beim Beenden der Elektrophorese durch natürliche Diffusion verschlechtert. Bei Beenden mit einer Verschlechterung von beispielsweise 10 % kann das Abtasten ungefähr 300 Mal durchgeführt werden, wobei angenommen ist, dass eine Wiederholzeit von 2,5 s vorliegt und eine einzelne Abtastung 8 ms benötigt (wie später noch beschrieben wird) und das Signal/Rausch-Verhältnis um den Faktor 17,3 erhöht ist. Das Signal/Rausch-Verhältnis wird im Falle einer Abtastung mit höherer Geschwindigkeit oder von Analysekomponenten mit kleinen Diffusionskoeffizienten weiter erhöht.

6C zeigt ein Elektropherogramm, das durch Feststellen von Zielkomponenten, die eine spezifische Position eines Nachweisteils bei herkömmlicher Kapillar-Elektrophorese durchlaufen, gewonnen ist. Verglichen mit dem in 6B gezeigten, sind das Signal/Rausch-Verhältnis kleiner, die Messzeit länger und die Peakbreiten von Komponenten mit geringen Migrationsgeschwindigkeiten größer.

Die Anzahl der Messwiederholungen, die nach Beenden des Anlegens der Migrationsspannung zulässig ist, wird beschrieben.

Im Allgemeinen wird die Anzahl theoretischer Böden N durch eine Kapillar-(Trennkanal-)Länge L und eine Standardabweichung &sgr; von Peaks folgendermaßen ausgedrückt: N = (L/&sgr;)2(1)

Nimmt man an, dass die Kapillarlänge L gleich 2 cm und die Anzahl theoretischer Böden N 1000 ist, dann ist &sgr;2 = 4/10000 ≒ 1/2500 eine Anzahl theoretischer Böden N' nach t' Sekunden gerechnet vom Beenden des Anlegens der Migrationsspannung lässt sich folgendermaßen ausdrücken: N' = L2/(&sgr;2 + &sgr;'2)(2) wobei &sgr;' die Standardabweichung der Peaks nach t' Sekunden gerechnet vom Beenden des Anlegens der Migrationsspannung darstellt. Wenn D einen Diffusionskoeffizienten und t Zeit darstellt, wird die natürliche Diffusion eines gelösten Stoffes in einem Lösungsmittel folgendermaßen ausgedrückt: &sgr;2 = 2Dt(3)

Daher ist, N' = L2/(&sgr;2 + 2Dt')(4)

Daher ist die Zeit vor Verschlechterung der Anzahl theoretischer Böden N auf den Wert N', d. h., die Zeit t', während welcher eine wiederholte Messung vor Verschlechterung der Anzahl theoretischer Böden N auf den Wert N' möglich ist, folgende: t' = (L2/N' – &sgr;2)/2D(5)

Wenn die Zeit t', während welcher eine wiederholte Messung möglich ist, gewonnen ist, lässt sich die Anzahl der Abtastungen leicht berechnen, da die für eine einzelne Abtastung des Photozellenfelds 7 nötige Zeit offensichtlich ist.

Tabelle 1 veranschaulicht für einige Lösungsstoffbeispiele Zeiten vor der Reduktion der Anzahl theoretischer Böden auf (N'/N).

Es ist bekannt, dass ein gelöster Stoff in einem Lösungsmittel nur natürliche Diffusion verursacht, wenn während der Migration in Kapillar-Elektrophorese die Migrationsspannung beseitigt wird. Im Falle einer abtastenden Ultraviolett-Extinktionsmessung parallel zum Trennkanal 55 unter Beseitigung der angelegten Spannung ist eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses in Entsprechung zur Anzahl der Abtastungen zu erwarten.

Wenn ein Photodiodenfeld-Detektor für einen Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographen als das Photozellenfeld 7 verwendet wird, beträgt die für das Abtasten benötigte Zeit 8 ms. Ein gelöster Stoff mit Ultraviolettabsorption hat allgemein ein Molekulargewicht von wenigstens 100, und die Anzahl theoretischer Böden N eines solchen gelösten Stoffs wird nicht auf mehr als 90 % für wenigstens 2,5 Sekunden verschlechtert. Nimmt man an, dass die Abtastung 300 Mal in 2,5 Sekunden durchgeführt wird, lässt sich das Rauschen n', welches durch 300-maliges Abtasten erreicht wird, im Verhältnis zum Rauschen n der Messung einer einzelnen Abtastung folgendermaßen ausdrücken: N' = n/(300)1/2= n/17,3

Es lässt sich also eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses mit dem Faktor 17,3 erwarten.

Wenn die Wiederholzeit durch Einsetzen numerischer Werte für die Parameter in den Ausdruck (5) gewonnen wird, lässt sich die Anzahl der Abtastungen entscheiden. Diese Berechnung ist jedoch kompliziert und erfordert eine zeitraubende manuelle Berechnung durch den Bendiener vor der Messung, was zu einer fehlerhaften Handhabung bewirkt durch Fehlberechnung, führen kann. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Ausdruck (5) im Steuerteil 40 gespeichert, der ein Rechner zur automatischen Durchführung dieser Berechnung mit einfachem Eingeben notwendiger Parameter in den Steuerteil 40 ist. Die dabei durchgeführten Vorgänge sind im Flussdiagramm der 7 beschrieben.

Wenn ein Programm gestartet wird, wird eine Initialisierung durchgeführt, um die Spannungsquelle 34 in einen EIN-Zustand zu bringen und den Drucker 44 in seine Ausgangsstellung einzustellen (Schritt S1). Der Bediener benutzt dann das Steuerpult 43 (Schritt S2) zur Einstellung der Trennparameter, welche die Probeninjektionszeit, die Probeninjektionsspannung und die Migrationsspannung enthalten. Auch enthalten sind die Messparameter für die Migrationsendzeit (= Akkumulationstartzeit) und die Akkumulationszeit.

Der Bediener gibt dann die Parameter zur Entscheidung der Abtastanzahl, d. h., den Diffusionskoeffizienten D, die Kapillarlänge L und den zulässigen Grad an Verschlechterung (entsprechend dem Wert n') der Anzahl theoretischer Böden N, die durch die Wartezeit durch die wiederholte Messung bewirkt wird, ein (Schritt S3). Das Programm wartet dann auf eine Startbefehl (Schritt S4).

Ähnlich zur allgemeinen Mikrochip-Elektrophorese injiziert der Bediener die Probe und drückt den Startknopf des Steuerpults 42. Die elektrophoretische Trennung der Probe wird gemäß dem Programm gestartet und die Migrationsspannung an den Trennkanal 55 des Mikrochips 5 auf der Grundlage der eingestellten Parameter angelegt (Schritte S4 und S5). Damit wird die Probe in den Trennkanal 55 bewegt und getrennt. Wenn die eingestellte Migrationszeit endet (Schritt S6), sind Zielkomponenten im Trennkanal 55 getrennt.

Die Messung im Photozellenfeld 7 wird durch die folgenden Schritte gewonnen: eine erste Abtastung wird durchgeführt (Schritt S7) und die Standardabweichung &sgr; von Probenpeaks auf der Grundlage der Messergebnisse gewonnen, wobei diese zur Berechnung der Anzahl von Abtastungen anhand des Ausdrucks (5) verwendet werden (Schritt S8). Das Photozellenfeld 7 wird mit der berechneten Anzahl von Abtastungen wiederholt abgetastet und die Ergebnisse werden akkumuliert (Schritt S9). Nach Abschluss der Akkumulation werden Messergebnisse auf den Drucker 44 ausgegeben (Schritt S10) und die Spannungsquelle 43 abgeschaltet, womit das Programm endet (Schritte S11 und S12).

Aus der Beziehung des Ausdrucks (1) lässt sich der Ausdruck (5) folgendermaßen umformen: t' = L2(1/N'-1/N)/2D(5a)

Bei der Berechnung der Anzahl von Abtastungen während Schritt S8 kann die Anzahl theoretischer Böden N des Probenpeaks auf der Grundlage der Messergebnisse der ersten Abtastung gewonnen werden.

Wenn der zulässige Verschlechterungsgrad der Anzahl theoretischer Böden N durch die Anzahl theoretischer Böden N bei der ersten Messung bestimmt worden ist und über die Länge L des Trennkanals 55 entschieden worden ist, ist der vom Bediener eingegebene Parameter nur der Diffusionskoeffizient D. Ferner kann der Diffusionskoeffizient D auch bestimmt werden, wenn über eine Zielprobe und ein Lösungsmittel entschieden worden ist, wodurch die Anzahl der Abtastungen ohne Eingabe eines Parameters automatisch berechnet werden kann.

Als weitere Ausführungsform kann das Abtasten für Messungen wiederholt werden, indem Lichteinstrahlmittel einer Messvorrichtung mit einer Lichtquelle und einem optischen System, welche einen Trennkanal mit einem bündeligen Licht bestrahlen, vorgesehen werden, wobei Lichtnachweismittel mit einem einzelnen Photodetektor, welcher zur Feststellung von Licht von einer Probe im Trennkanal durch Licht von den Lichteinstrahlmitteln positioniert ist, vorgesehen werden. Entweder werden die Lichteinstrahlmittel und die Lichtnachweismittel noch unfixiert längs des Trennkanals eines Mikrochips gehaltert, oder der Mikrochip soll längs des Trennkanals in Bezug auf die Lichteinstrahlmittel und die Lichtnachweismittel beweglich sein. Im Falle wandernder Riesenmoleküle, wie etwa DNAs, oder bei Verwendung einer Gelflüssigkeit als Pufferlösung ist es denkbar, dass Diffusion (natürliche Diffusion) einer Probe kaum stattfindet und die Akkumulation ohne Hochgeschwindigkeitsabtastung durchgeführt werden kann.

Die vorliegende Erfindung wurde im Einzelnen beschrieben und dargestellt, es versteht sich jedoch, dass dies nur als Veranschaulichung und Beispiel und nicht als die Erfindung einschränkend zu verstehen ist, welche nur durch die beigefügten Ansprüche beschränkt wird.


Anspruch[de]
Elektrophoretisches Verfahren auf einem Mikrochip, welches die Schritte des Auffüllens eines Trennkanals (55) eines Mikrochips (5) mit einer elektrophoretischen Pufferlösung, des Einführens einer Probe in das eine Ende, des Anlegens einer Migrationsspannung längs des Trennkanals (55) zur Elektrophorese und des Messens von Absorption oder Lichtemission von der Probe durch Bestrahlen des Trennkanals (55) mit Licht aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass

das Licht so eingestrahlt wird, das es sich längs des Trennkanals (55) über einen vorgeschriebenen Bereich erstreckt, welcher getrennte Zielkomponenten in der Probe enthält; und

der Messschritt nach Beenden des Anlegens der Migrationsspannung mit vollständiger Trennung der Zielkomponenten in der Probe durchgeführt wird und wiederholt wird, um Messwerte an jeder Stelle des Trennkanals (55) zur Bestimmung von Migrationsmustern zu akkumulieren.
Vorrichtung zur Elektrophorese auf einem Mikrochip, welche aufweist:

einen Mikrochip (5), welcher einen Trennkanal (55), der in einem transparenten Teil ausgebildet und mit einer elektrophoretischen Pufferlösung gefüllt ist, in welche eine Probe in das eine Ende eingebracht wird, eine Migrationsspannungsversorgungseinheit zur Anlegung einer Migrationsspannung längs des Trennkanals (55) zur Elektrophorese und Trennung der Probe in dem Trennkanal (55), Lichteinstrahlmittel (1, 2, 3, 4) zur Bestrahlung des Trennkanals (55) mit Licht, Lichtnachweismittel (6, 7) zur Feststellung von Absorption oder Lichtemission durch Probenkomponenten, die in dem Trennkanal (55) getrennt werden, und einen Datenverarbeitungs/Steuerteil, welcher die Migrationsspannungsversorgungseinheit steuert und Messungen mit den Lichtnachweismitteln (6, 7) zur Bestimmung von Migrationsmustern und nachfolgendes Durchführen einer Datenverarbeitung aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass

die Lichteinstrahlmittel (1, 2, 3, 4) das Licht so einstrahlen, dass es sich längs des Trennkanals (55) über einen bestimmten Bereich erstreckt;

die Lichteinstrahlmittel (6, 7) die Absorption oder Lichtemission über den vorgeschriebenen Bereich des Trennkanals (55) hinweg feststellen; und

der Datenverarbeitungs/Steuerteil die Migrationsspannungsversorgungseinheit so steuert, dass sie mit Abschluss der Trennung von Zielkomponenten in der Probe das Anlegen der Trennspannung beendet und die Nachweismittel (6, 7) so steuert, dass die Messungen wiederholt werden, um so Messsignale derselben an jeder Stelle des Trenndurchgangs (55) zur Bestimmung von Migrationsmustern zu akkumulieren.
Vorrichtung zur Elektrophorese auf einem Mikrochip nach Anspruch 2, wobei der Mikrochip (5) ein Paar von transparenten Plattenteilen (51, 52) aufweist, eine Nut zum Einfüllen einer Flüssigkeit in einer Oberfläche von wenigstens einem der Plattenteile (51, 52) ausgebildet ist, eines der Plattenteile (51, 52) mit Löchern (53) an der Nut entsprechenden Stellen versehen ist, und diese Plattenteile (51, 52) so verbunden sind, dass die Nut nach innen weist, womit der Trennkanal (55) ausgebildet wird. Vorrichtung zur Elektrophorese auf einem Mikrochip nach Anspruch 2, wobei

die Lichteinstrahlmittel (1, 2, 3, 4) die Lichtquelle (1) und ein optisches System (2, 3, 4) aufweisen, welches den Trennkanal (55) in einem vorgeschriebenen Bereich mit linear kondensiertem Licht bestrahlt,

die Lichtnachweismittel (6, 7) eine Anzahl von Photodetektoren aufweisen, die längs des Trennkanals (55) für ein gleichzeitiges Feststellen von Licht von Probenkomponenten, die in den Trennkanal (55) eingeführt worden sind und mit dem Licht durch die Lichteinstrahlmittel (1, 2, 3, 4) bestrahlt werden, angeordnet sind, und

der Datenverarbeitungs/Steuerteil Messungen mit den Lichtnachweismitteln (6, 7) wiederholt durchführt und ihre Messsignale in jedem der Photodetektoren zur Bestimmung von Migrationsmustern akkumuliert.
Vorrichtung zur Elektrophorese auf einem Mikrochip nach Anspruch 4, wobei

die Lichteinstrahlmittel (1, 2, 3, 4) die Lichtquelle (1), welche sich linear längs des Trennkanals (55) erstreckt, sowie eine Zylinderlinse (4), welche für ein Kondensieren des Lichts breitenweise längs des Trennkanals (55) und für ein Einführen von Licht der Lichtquelle (1) in den Trennkanal (55) angeordnet ist, und

die Lichteinstrahlmittel (6, 7) eine Zylinderlinse (6) aufweisen, die für ein Kondensieren von Licht breitenweise längs des Trennkanals (55) und für ein Leiten des Lichts aus dem Trennkanal (55) zu den Photodetektoren (7) angeordnet ist.
Vorrichtung zur Elektrophorese auf einem Mikrochip nach Anspruch 4, wobei

die Lichtnachweismittel (6, 7) für eine Feststellung einer Lichtabsorption durch Probenkomponenten in den Trennkanal (55) eingerichtet sind,

und

entweder die Lichteinstrahlmittel (1, 2, 3, 4) oder die Lichtnachweismittel (6, 7) spektroskopische Mittel (3), welche eine Wellenlänge zur Messung von Extinktion auswählen, aufweisen.
Vorrichtung zur Elektrophorese auf einem Mikrochip nach Anspruch 2, wobei

die Lichteinstrahlmittel (1, 2, 3, 4) eine Lichtquelle sowie ein optisches System, das den Trennkanal mit einem Lichtbündel bestrahlt, aufweisen,

die Lichtnachweismittel einen einzelnen Photodetektor, welcher so angeordnet ist, dass er Licht von der Probe im Trennkanal (55) durch das Licht aus den Lichteinstrahlmitteln feststellt, aufweisen,

ein Satz, welcher die Lichteinstrahlmittel und die Lichtnachweismittel enthält, und der Mikrochip (5) sich relativ zueinander längs des Trennkanals (55) bewegen können, und

der Datenverarbeitungs/Steuerteil, welcher den Satz oder den Mikrochip (5) wiederholt längs des Trennkanals (55) bewegt und Nachweissignale mit den Lichtnachweismitteln an jeder Stelle längs des Trennkanals (55) akkumuliert, womit die Migrationsmuster gewonnen werden.
Vorrichtung zur Elektrophorese auf einem Mikrochip nach Anspruch 7, wobei

die Lichtnachweismittel so eingerichtet sind, dass sie Lichtabsorption durch die Probenkomponenten in dem Trennkanal (55) nachweisen, und

entweder die Lichteinstrahlmittel oder die Lichtnachweismittel spektroskopische Mittel aufweisen, welche Wellenlänge zur Messung von Extinktion auswählen.
Vorrichtung zur Elektrophorese auf einem Mikrochip nach Anspruch 2, wobei der Datenverarbeitungs/Steuerteil eine Berechnungsformel, welche einen Diffusionskoeffizienten der Probe und einen Peakverschlechterungsgrad als Parameter enthält, zur Berechnung der Anzahl von wiederholten Messungen mit Lichteinstrahlung in den Durchgangskanal (55) und zur automatischen Berechnung der Anzahl wiederholter Messungen durch Eingabe der Parameter und Steuerung wiederholter Messungen aufweist. Vorrichtung zur Elektrophorese auf einem Mikrochip nach Anspruch 9, wobei

der Datenverarbeitungs/Steuerteil die folgende Berechnungsformel zur Gewinnung einer Zeit t' bis zur Verschlechterung einer theoretischen Bodenzahl auf N' als die Zeit, die die wiederholte Messung zulässt, aufweist: t' = (L2/N' – &sgr;2)/2D wobei L eine Länge des Trennkanals (55) darstellt, &sgr; eine Standardabweichung eines Peak darstellt, und D den Zerstreuungskoeffizienten darstellt, für eine Berechnung der Anzahl wiederholter Messungen auf der Grundlage der Zeit t'.
Vorrichtung zur Elektrophorese auf einem Mikrochip nach Anspruch 9, wobei

der Datenverarbeitungs/Steuerteil die folgende Berechnungsformel zur Gewinnung einer Zeit t' bis zur Verschlechterung einer theoretischen Bodenzahl auf N' als die Zeit, die eine wiederholte Messung zulässt, aufweist: t' = L2(1/N' – 1/N)/2D wobei L eine Länge des Trennkanals (55) und D den Diffusionskoeffizienten darstellt, zur Berechnung der Zahl wiederholter Messungen auf der Grundlage der Zeit t'.






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