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Dokumentenidentifikation DE69736847T2 12.04.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001466971
Titel Herstellung von Laktamen aus aliphatischen Alpha,Omega-Dinitrilen
Anmelder E.I. du Pont de Nemours and Co., Wilmington, Del., US
Erfinder Fallon, Robert Donald, Elkton, MD 21921, US;
Di Cosimo, Robert, Rockland, DE 19732, US;
Gavagan, John Edward, Wilmington, DE 19810, US;
Herkes, Frank Edward, Wilmington, DE 19808, US
Vertreter derzeit kein Vertreter bestellt
DE-Aktenzeichen 69736847
Vertragsstaaten DE, FR, GB, NL
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 07.05.1997
EP-Aktenzeichen 040764631
EP-Offenlegungsdatum 13.10.2004
EP date of grant 18.10.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.04.2007
IPC-Hauptklasse C12N 9/78(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 9/88(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
1. GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Mikroorganismen nützlich für die Herstellung von 5-gliedrigen oder 6-gliedrigen Ring-Lactamen aus aliphatischen &agr;,&ohgr;-Dinitrilen durch eine Kombination von biologischen und chemischen Methoden. Spezieller wird zuerst ein aliphatisches &agr;,&ohgr;-Dinitril in ein Ammoniumsalz einer &ohgr;-Nitrilcarbonsäure in wässriger Lösung unter Verwendung eines Katalysators umgewandelt, der über eine aliphatische Nitrilase (EC 3.5.5.7)-Aktivität verfügt oder einer Kombination von Nitril-Hydratase (EC 4.2.1.84)- und Amidase (EC 3.5.1.4)-Aktivitäten. Das Ammoniumsalz der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure wird sodann direkt in das entsprechende Lactam durch Hydrierung der wässrigen Lösung ohne Abtrennung des Intermediats &ohgr;-Nitrilcarbonsäure oder &ohgr;-Aminocarbonsäure umgewandelt. Wenn das aliphatische &agr;,&ohgr;-Dinitril ebenfalls unsymmetrisch an dem &agr;-Kohlenstoffatom substituiert ist, erzeugt die Nitrilase das &ohgr;-Nitrilcarbonsäure-Ammoniumsalz, das aus der Hydrolyse der &ohgr;-Nitril-Gruppe mit mehr als 98% Regioselektivität resultiert, wodurch lediglich eines der zwei möglichen Lactamprodukte während der nachfolgenden Hydrierung erzeugt wird.

2. BESCHREIBUNG DES VERWANDTEN GEBIETES

Nitrile lassen sich leicht in die entsprechenden Carbonsäuren mit Hilfe einer Vielzahl chemischer Prozesse umwandeln, wobei diese Prozesse im typischen Fall stark saure oder basische Reaktionsbedingungen und hohe Reaktionstemperaturen erfordern und in der Regel unerwünschte Nebenprodukte und/oder große Mengen anorganischer Salze als unerwünschte Nebenprodukte erzeugen. Verfahren, bei denen eine durch Enzym katalysierte Hydrolyse Nitril-Substrate in die entsprechenden Carbonsäuren umgewandelt werden, sind häufig bevorzugte chemische Methoden, da diese Verfahren oftmals bei Umgebungstemperatur ablaufen, nicht die Anwendung stark saurer oder basischer Reaktionsbedingungen erfordern und keine großen Mengen an unerwünschten Nebenprodukten erzeugen. Ein weiterer Vorteil der Enzym katalysierten Hydrolyse von Nitrilen gegenüber der chemischen Hydrolyse besteht darin, dass bei der Hydrolyse eine Vielzahl von aliphatischen oder aromatischen Dinitrilen die Enzym katalysierte Reaktion stark regioselektiv sein kann, wo lediglich eine der zwei Nitril-Gruppen zu dem entsprechenden Ammoniumsalz der Carbonsäure hydrolysiert wird.

Ein Nitrilase-Enzym wandelt ein Nitril direkt in das entsprechende Ammoniumsalz der Carbonsäure in wässriger Lösung ohne die intermediäre Erzeugung eines Amids um. Die Verwendung aromatischer Nitrilasen für die Hydrolyse aromatischer Nitrile zu den entsprechenden Ammoniumsalzen der Carbonsäure ist seit vielen Jahren bekannt, jedoch ist erst vor kurzem über die Verwendung aliphatischer Nitrilasen berichtet worden. Von Kobayashi et al. (Tetrahedron, (1990) Bd. 46, 5587–5590; J. Bacteriology, (1990), Bd. 172, 4807–4815) ist eine aliphatische Nitrilase beschrieben worden, die aus Rhodococcus rhodochrous K22 isoliert wurde, die die Hydrolyse aliphatischer Nitrile zu den entsprechenden Ammoniumsalzen der Carbonsäure katalysiert; ebenfalls wurden mehrere aliphatische &agr;,&ohgr;-Dinitrile hydrolysiert und Glutaronitril zu 4-Cyanobutansäure-Ammoniumsalz mit 100%iger molarer Umwandlung unter Verwendung von Dauerzellen als Katalysator umgewandelt worden. Es ist eine Nitrilase von Comamonas testosteroni isoliert worden, die in der Lage ist, eine Reihe von aliphatischen &agr;,&ohgr;-Dinitrilen in das entsprechende Ammoniumsalz von &ohgr;-Nitrilcarbonsäure oder das Ammoniumsalz der Dicarbonsäure umzuwandeln (CA 2 103 616 (11.02.1994); S. Lévy-Schil, et al., Gene, (1995) Bd. 161, 15-20); und zwar für die Hydrolyse von Adiponitril mit einer maximalen Ausbeute an 5-Cyanovaleriansäure-Ammoniumsalz von ca. 88%, die vor der vollständigen Umwandlung des 5-Cyanovaleriansäure-Ammoniumsalzes zu Adipinsäure-Diammoniumsalz erhalten wurde.

Von M. L. Gradley und C. J. Knowles (Biotechnology Lett., (1994), Bd. 16, 41–46) ist die Verwendung von Suspensionen von Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 berichtet worden, die über eine aliphatische Nitrilase-Aktivität zur Hydrolyse mehrerer 2-Methylalkylnitrile verfügen. Die vollständige Umwandlung von (+/–)-2-Methylbutyronitril in 2-Methylbutansäure-Ammoniumsalz wurde erhalten, obgleich die Hydrolyse von (+/–)-2-Methylhexannitril für das (+)-Enantiomer enantiospezifisch zu sein scheint. C. Bengis-Garber und A. L. Gutman (Appl. Microbiol. Biotechnol., (1989), Bd. 32, 11–16) haben Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 als Katalysator für die Hydrolyse mehrerer Dinitrile verwendet. In dieser Arbeit wurden Fumaronitril und Succinonitril in die entsprechenden Ammoniumsalze der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure umgewandelt, während Glutaronitril, Adiponitril und Pimelonitril in die entsprechenden Diammoniumsalze der Dicarbonsäure umgewandelt wurden.

Es kann eine Kombination von 2 Enzymen, Nitril-Hydratase (NHase), und Amidase verwendet werden, um aliphatische Nitrile in die entsprechenden Ammoniumsalze der Carbonsäure in wässriger Lösung umzuwandeln. Hierbei wird das aliphatische Nitril zunächst in ein Amid mit Hilfe der Nitril-Hydratase umgewandelt und anschließend das Amid mit Hilfe der Amidase in das entsprechende Ammoniumsalz der Carbonsäure umgewandelt. Es ist von einer großen Vielzahl von Bakterienarten bekannt, dass sie ein diverses Spektrum von Nitril-Hydratase- und Amidase-Aktivitäten besitzen, einschließlich Rhodococcus, Pseudomonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Bacteridium, Brevibacterium, Corynebacterium und Micrococcus. Es sind sowohl wässrige Suspensionen dieser Mikroorganismen als auch die isolierten Enzyme verwendet worden, um Nitrile in Amide und Carbonsäure-Ammoniumsalze umzuwandeln.

Von P. Hönicke-Schmidt und M. P. Schneider (J. Chem. Soc., Chem. Commun., (1990), 648–650) ist ein immobilisierter Rhodococcus sp.-Stamm CH 5 zur Umwandlung von Nitrilen und Dinitrilen zu Carbonsäure-Ammoniumsalzen bzw. &ohgr;-Nitrilcarbonsäure-Ammoniumsalzen verwendet worden. Die Zellen enthalten sowohl eine Nitril-Hydratase- als auch Amidase-Aktivität, die Glutaronitril zu 4-Cyanobutansäure-Ammoniumsalz in einer 79%igen isolierten Ausbeute bezogen auf 92% Umwandlung von Substrat umwandelt. Von A. J. Blakely et al. (FEMS Microbiology Lett., (1995), Bd. 129, 57–62) sind die Nitril-Hydratase- und Amidase-Aktivität von Suspensionen von Rhodococcus AJ270 zur regiospezifischen Hydrolyse von Malononitril und Adiponitril zur Erzeugung lediglich der entsprechenden &ohgr;-Nitrilcarbonsäure-Ammoniumsalze verwendet worden. H. Yamada et al. (J. Ferment. Technol., (1980), Bd. 58, 495–500) beschreiben die Hydrolyse von Glutaronitril zu einer Mischung von 4-Cyanobutyramid, 4-Cyanobutansäure, Glutarsäure und Ammoniak unter Verwendung von Pseudomonas sp. K9, die sowohl eine Nitril-Hydratase als auch Amidase enthalten. K. Yamamoto et al. (J. Ferment. Bioengineering, 1992, Bd. 73, 125–129) beschreiben die Verwendung von Corynebacterium sp. CH 5-Zellen, die sowohl eine Nitril-Hydratase- als auch Amidase-Aktivität enthalten, um trans-1,4-Dicyanocyclohexan zu trans-4-Cyanocyclohexancarbonsäure-Ammoniumsalz mit einer Ausbeute von 99,4% umzuwandeln.

J. L. Moreau et al. (Biocatalysis, (1994), Bd. 10, 325–340) beschreiben die Hydrolyse von Adiponitril zu Adipinsäure, Adipamid und Adipaminsäure durch die intermediäre Bildung von 5-Cyanovaleriansäure unter Verwendung von Brevibacterium sp. R312 (Nitril-Hydratase- und Amidase-Aktivität). A. Kerridge et al. (Biorg. Medicinal Chem., (1994), Bd. 2, 447–455) berichten über die Verwendung von Brevibacterium sp. R312 (Nitril-Hydratase- und Amidase-Aktivität) zur Hydrolyse von prochiralen 3-Hydroxyglutaronitril-Derivaten zu den entsprechenden (S)-Cyanosäure-Ammoniumsalzen. In der EP-P-178 106 B1 (31. März, 1993) wird die selektive Umwandlung einer der Cyano-Gruppen eines aliphatischen Dinitrils zu der entsprechenden Carbonsäure, dem Amid, dem Ester oder Thioester unter Anwendung der Mononitrilase-Aktivität (definiert entweder als Nitrilase oder eine Kombination von Nitril-Hydratase/Amidase) offenbart, die von Bacillus, Bacteridium, Micrococcus oder Brevibacterium deriviert sind. Zusätzlich zu den zahlreichen Beispielen bakterieller Katalysatoren, die über eine Nitrilase-Aktivität oder Nitril-Hydratase/Amidase-Aktivität verfügen demonstrieren Y. Asano et al. (Agric. Biol. Chem., (1980), Bd. 44, 2497–2498), dass der Fungus Fusarium merismoides TG-1 Glutaronitril zu 4-Cyanobutansäure-Ammoniumsalz und 2-Methylglutaronitril zu 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz hydrolysierte.

Im Stand der Technik ist keine Stelle gefunden worden, in der die Hydrierung von Ammoniumsalzen aliphatischer &ohgr;-Nitrilcarbonsäuren in wässriger Lösung zur direkten Erzeugung der entsprechenden Lactame beschrieben wurde. Im eng verwandten Gebiet beschreibt die US-P-4 329 498 die Hydrierung von Muconsäure-mononitril zu 6-Aminocapronsäure (6-ACA) in wasserfreiem Ethanol, der mit Ammoniak gesättigt ist, indem ein Raney-Nickel-Katalysator-#2 verwendet wird. Nach Entfernung des Hydrierungskatalysators und Erhitzen der ethanolischen Lösung von 6-ACA bis 170° bis 200°C war der Ringschluss von 6-ACA zu Caprolactam zu erwarten. Der reduktive Ringschluss entweder von &bgr;-Chinoxalinylpropansäuren (E. C. Taylor et al., J. Am. Chem. Soc., (1965), Bd. 87, 1984–1990) oder des verwandten 2-(2-Carboxyethyl)-3(4H)-chinoxalon (E. C. Taylor et al., J. Am. Chem. Soc., (1965), Bd. 87, 1990–1995) durch Hydrierung in 1 N Natriumhydroxid-Lösung unter Verwendung von Raney-Nickel als Katalysator soll Berichten zufolge die entsprechenden 5-gliedrigen Ring-Lactame erzeugen, jedoch lediglich nach Entfernung des Katalysators aus dem Produktgemisch und nach einer Ansäuerung des resultierenden Filtrats. Die Autoren führen aus, dass bei jeder beliebigen dieser Reduktionen die "Lactam-Erzeugung lediglich in sauer Lösung ablaufen kann" (S. 1992, zweiter Abschnitt), was wahrscheinlich die Gegenwart der protonierten Carbonsäure und nicht des Carboxylatsalzes erfordert. Die US-P-4 730 040 offenbart ein Verfahren für die Herstellung von Caprolactam, indem eine wässrige Lösung von 5-Formylvaleriansäure mit Ammoniak und Wasserstoff in Gegenwart eines Hydrierungskatalysators umgesetzt wird, wonach Ammoniak aus dem Produktgemisch abgetrennt und die resultierende Lösung von 6-ACA bis 300°C erhitzt wird.

In früheren Arbeiten sind Einzeller offenbart worden, die sowohl über Nitril-Hydratase- als auch Amidase-Aktivitäten verfügen und die zur Umwandlung von Nitrilen und Dinitrilen in verschiedene Ammoniumsalze von Säuren verwendet wurden. Im Stand der Technik ist jedoch keine Stelle gefunden worden, in der der Ringschluss von Ammoniumsalzen von aliphatischen &ohgr;-Aminocarbonsäuren unter den Bedingungen der Hydrierungsreaktion der vorliegenden Erfindung (d.h. in einer wässrigen Lösung, die eine Überschuss an zugesetztem Ammoniumhydroxid enthält) zur Erzeugung der entsprechenden Lactame beschrieben wurde. Im nahe verwandten Gebiet ist der Ringschluss von aliphatischen &ohgr;-Aminocarbonsäuren (nicht jedoch der Ammoniumsalze) zu den entsprechenden Lactamen unter einer Vielzahl von Reaktionsbedingungen veröffentlicht worden. Von F. Mares und D. Sheehan (Ind. Eng. Chem. Process Des. Dev., (1978), Bd. 17, 9-16) ist der Ringschluss von 6-Aminocapronsäure (6-ACA) zu Caprolactam unter Verwendung von Wasser oder Ethanol als Lösemittel beschrieben worden. In Wasser war die Reaktion der Cyclisierung bei Konzentrationen unterhalb von 1 Mol/kg (ca. 1 M) reversibel und die Konzentration von Caprolactam nahm mit steigender Temperatur zu; bei einer Gesamtkonzentration von 6-ACA und Caprolactam von 0,85 Mol/kg (ca. 0,85 M) wurde von einer Zunahme des prozentualen Caprolactams von 38,7% bei 180°C zu 92,2% bei 250°C berichtet. In Ethanol wurde eine Caprolactam-Ausbeute bei 200°C von 98% erhalten, was der Veröffentlichung zufolge auf eine Verschiebung des Gleichgewichtes zurückzuführen ist, die die freie Säure/freie Amin-Form von 6-ACA in Ethanol begünstigt und weniger die intramolekulare Alkylammoniumcarboxylat-Form von 6-ACA, die in Wasser vorherrscht. Ein Verfahren für die Herstellung von Caprolactam aus 6-ACA wurde auch in der US-P-4 599 199 beschrieben, wo 6-ACA in ein Aluminiumoxid-Wirbelbett in Gegenwart von Dampf bei 290° bis 400°C eingeführt wurde. Die Synthese von 5-, 6- und 7-gliedrigen Ring-Lactamen durch Cyclodehydratation von aliphatischen &ohgr;-Aminosäuren und Aluminiumoxid- oder Siliciumdioxid-Gel in Toluol bei kontinuierlicher Entfernung des während der Reaktion erzeugten Wassers ist von A. Bladé-Font (Tetrahedron Letters, (1980), Bd. 21, 2443–2446) berichtet worden. Danach ist eine freie Amino-Gruppe (unprotoniert) erforderlich, damit die Cyclodehydratation stattfindet.

Im Stand der Technik ist keine Stelle gefunden worden, in der die Hydrierung von Ammoniumsalzen aliphatischer &ohgr;-Nitrilcarbonsäuren in wässriger Lösung, die Methylamin enthält, zur direkten Erzeugung der entsprechenden N-Methyllactame beschrieben worden. Im nahe verwandten Gebiet wurde 1,5-Dimethyl-2-pyrrolidinon durch Hydrierung einer wässrigen Lösung von Levulinsäure und Methylamin in Wasser unter Verwendung eines Raney-Nickel-Katalysators bei 140°C und einem Überdruck von 1.000 bis 2.000 psig Wasserstoff hergestellt (R. L. Frank et al., Org. Syntheses, (1954), Coll. Bd. 3, 328–329). Das resultierende Methylammoniumsalz der 4-N-Methylaminopentansäure wurde sodann zu dem entsprechenden Lactam durch Filtration der Produktmischung und Destillation des Filtrats zur Entfernung von Wasser und Methylamin cyclisiert. N-Alkyllactame sind auch mit Hilfe der direkten Hydrierung einer wässrigen Mischung hergestellt worden, die 2-Methylglutaronitril enthielt, ein primäres Alkylamin und einen Hydrierungskatalysator, wobei der Prozess eine Mischung von 1,3- und 1,5-Dialkylpiperidon-2 lieferte (US-P-5 449 780). N-substituierte 2-Pyrrolidinone sind durch Reaktion von &ggr;-Valerolacton mit einem Alkylamin bei 110° bis 130°C und anschließendem Erhitzen der resultierenden Mischung bis 250° bis 270°C und gleichzeitigem Abdestillieren von Wasser hergestellt worden (F. B. Zienty und G. W. Steahly, J. Am. Chem. Soc., (1947), Bd. 69, 715–716).

Die vorgenannten Verfahren für die Herstellung von Lactamen oder N-Alkyllactamen haben ein oder mehrere der folgenden Nachteile: die Anwendung von Temperaturen oberhalb von 250°C, um hohe Ausbeuten an Lactamen bei Verwendung von Wasser als Lösemittel zu erhalten, die Entfernung von Wasser aus dem Reaktionsgemisch, um das Gleichgewicht in Richtung auf die Lactam-Erzeugung zu verschieben, die Einstellung des pH-Wertes des Reaktionsgemisches auf einen Säurewert zugunsten der Lactamerzeugung oder die Verwendung eines organischen Lösemittels, worin das Ausgangsmaterial schwer löslich ist. Viele dieser Prozesse erzeugen unerwünschte Abproduktströme oder Mischungen von Produkten, die nicht ohne weiteres abgetrennt werden können. Ein bedeutender Vorteil wäre ein Verfahren für die Umwandlung eines aliphatischen &agr;,&ohgr;-Dinitrils in das entsprechende Lactam oder N-Methyllactam in wässriger Lösung mit hoher Ausbeute und hoher Regioselektivität bei geringer Erzeugung von Nebenprodukt oder Abproduktstrom und mit einer leichten Methode zur Produktgewinnung.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Mikrorganismen der Erfindung sind nützlich für die Herstellung 5-gliedriger Ring-Lactame oder 6-gliedriger Ring-Lactame aus aliphatischen &agr;,&ohgr;-Dinitrilen hat die folgenden Schritte:

  • (a) Kontaktieren eines aliphatischen &agr;,&ohgr;-Dinitrils in einem wässrigen Reaktionsgemisch mit einem Enzym-Katalysator, gekennzeichnet entweder durch:

    1) eine aliphatische Nitrilase-Aktivität, oder

    2) eine Kombination von Nitril-Hydratase und Amidase-Aktivitäten,

    wodurch das aliphatische &agr;,&ohgr;-Dinitril in ein Ammoniumsalz der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure umgewandelt wird;
  • (b) Kontaktieren des aus Schritt (a) resultierenden wässrigen Produktgemisches mit Wasserstoff und einem Hydrierungskatalysator, wodurch das Ammoniumsalz der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure direkt umgewandelt wird zu dem entsprechenden Lactam ohne Isolierung des Intermediats aus &ohgr;-Nitrilcarbonsäure, Ammoniumsalz der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure, &ohgr;-Aminocarbonsäure oder Ammoniumsalz der &ohgr;-Aminocarbonsäure; und
  • (c) Gewinnen des Lactams aus dem aus Schritt (b) resultierenden wässrigen Produktgemisches.

Vor dem Schritt (b) können Ammoniumhydroxid, Ammoniak-Gas oder Methylamin der wässrigen Produktmischung von Schritt (a) zugesetzt werden. Diese Zugabe kann Null bis 4 val im Bezug auf die Menge an vorhandenem Ammoniumsalz der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure betragen.

In einer weiteren Ausführungsform wird ein aliphatisches &agr;,&ohgr;-Dinitril mit der Formel NCCXa(R)(CH2)nCN verwendet, worin a Null oder 1 beträgt, X ist Wasserstoff, wenn a = 1 gilt und R = H, unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder unsubstituiertes oder substituiertes Alkenyl oder unsubstituiertes oder substituiertes Alkyliden und worin n 1 oder 2 beträgt.

Mikroorganismen, die durch eine aliphatische Nitrilase-Aktivität gekennzeichnet sind und in dem Prozess verwendbar sind, sind: Acidovorax facilis 72-PF-15 (ATCC 55747), Acidovorax facilis 72-PF-17 (ATCC 55745) und Acidovorax facilis 72W (ACC 55746). Ein Mikroorganismus, der durch eine Kombination von Nitril-Hydratase- und Amidase-Aktivitäten gekennzeichnet ist und in dem Prozess verwendbar ist, ist Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D (ATCC 55744).

Eine weitere Ausführungsform ist ein Verfahren zur Herstellung von 5-gliedrigen Ring-Lactamen oder 6-gliedrigen Ring-Lactamen aus aliphatischen &agr;,&ohgr;-Dinitrilen, umfassend:

  • (a) Kontaktieren eines aliphatischen &agr;,&ohgr;-Dinitrils entweder der Formel: worin R1 und R2 beide H sind und R3, R4, R5 und R6 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H, unsubstituiertem oder substituiertem Alkyl oder unsubstituiertem oder substituiertem Alkenyl in einem wässrigen Reaktionsgemisch mit einem Enzymkatalysator, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Acidovorax facilis 72W (ACC 55746), Acidovorax facilis 72-PF-15 (ATCC 55747), Acidovorax facilis 72-PF-17 (ATCC 55745) und Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D (ATCC 55744), wodurch das aliphatische &agr;,&ohgr;-Dinitril in ein Ammoniumsalz der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure umgewandelt wird;
  • (b) Kontaktieren des aus Schritt (a) resultierenden wässrigen Produktgemisches mit Wasserstoff und einem Hydrierungskatalysator, wodurch das Ammoniumsalz der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure direkt umgewandelt wird zu dem entsprechenden Lactam ohne Isolierung des Intermediats aus &ohgr;-Nitrilcarbonsäure, Ammoniumsalz der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure, &ohgr;-Aminocarbonsäure oder Ammoniumsalz der &ohgr;-Aminocarbonsäure;
  • (c) Gewinnen des Lactams aus dem aus Schritt (b) resultierenden wässrigen Produktgemisch.

Eine weitere Ausführungsform ist ein Verfahren für die Herstellung 5-gliedriger Ring-Lactame oder 6-gliedriger Ring-Lactame aus aliphatischen &agr;,&ohgr;-Dinitrilen, umfassend:

  • (a) Kontaktieren eines aliphatischen &agr;,&ohgr;-Dinitrils entweder der Formel: worin R7, R8, R9, R10, R11 und R12 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H, unsubstituiertem oder substituiertem Alkyl oder unsubstituiertem oder substituiertem Alkenyl, und worin entweder eines oder beide R7 oder R8 nicht H sind;

    in einem wässrigen Reaktionsgemisch mit Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D (ATCC 55744), wodurch das aliphatische &agr;,&ohgr;-Dinitril in ein Ammoniumsalz der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure umgewandelt wird;
  • (b) Kontaktieren des aus Schritt (a) resultierenden wässrigen Produktgemisches mit Wasserstoff und einem Hydrierungskatalysator, wodurch das Ammoniumsalz der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure direkt umgewandelt wird zu dem entsprechenden Lactam ohne Isolierung des Intermediats aus &ohgr;-Nitrilcarbonsäure, Ammoniumsalz der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure, &ohgr;-Aminocarbonsäure oder Ammoniumsalz der &ohgr;-Aminocarbonsäure;
  • (c) Gewinnen des Lactams aus dem aus Schritt (b) resultierenden wässrigen Produktgemisch.

Schließlich werden neuartige Verbindungen wie folgt gewährt:

eine Verbindung der Formel III worin M+ entweder H+ oder NH4 + ist; und

eine Verbindung der Formel IV worin M+ entweder H+ oder NH4 + ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER BIOLOGISCHEN HINTERLEGUNGEN

Die Anwender haben für die folgenden biologischen Hinterlegungen im Rahmen des Budapester Vertrages gesorgt:

Wie hierin verwendet wird, bezeichnet "ATCC" die "American Type Culture Collection" als Internationale Hinterlegungsstelle in 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA. Die "ATCC-Nr." ist die Zugriffsnummer zu den Kulturen der Hinterlegung bei der ATCC.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Es ist ein Verfahren zur Herstellung von Lactamen aus aliphatischen &agr;,&ohgr;-Dinitrilen mit hohen Ausbeuten entwickelt worden, bei dem eine Kombination von enzymatischen und chemischen Reaktionen genutzt wird. In den Fällen, wo das &agr;,&ohgr;-Dinitril unsymmetrisch substituiert ist, erhält man eine hohe Regioselektivität von einem der zwei möglichen Lactamprodukte (Reaktionsschema 1). worin sind:

a Null oder 1;

X Wasserstoff, wenn a = 1 gilt;

n 1 oder 2;

R = H, unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder unsubstituiertes oder substituiertes Alkenyl oder unsubstituiertes oder substituiertes Alkyliden; und

R1 H, -CH3.

Die Produkte der vorliegenden Erfindung sind als Präkursoren für Polymere, Lösemittel und hochwertigen Chemikalien in der landwirtschaftlichen und pharmazeutischen Industrie verwendbar. Bei dem Verfahren werden Temperaturen unterhalb von 250°C eingesetzt, um eine hohe Ausbeute an Lactam zu erhalten, sofern Wasser als Lösemittel verwendet wird. Im Vergleich zu früher bekannten chemischen Lactam-Prozessen erzeugt das erfindungsgemäße Verfahren wenig Abprodukt und erlaubt eine leichte Vorgehensweise bei der Produktgewinnung.

Sofern nicht anders angegeben, gelten in der Patentanmeldung die folgenden Abkürzungen und Definitionen:

"Enzymkatalysator" bezieht sich auf einen Katalysator, der gekennzeichnet ist entweder durch eine Nitrilase-Aktivität oder eine Kombination einer Nitril-Hydratase-Aktivität und einer Amidase-Aktivität. Der Katalysator kann in Form ganzer mikrobieller Zellen vorliegen, in Form einer/mehrerer permeabilisierter mikrobieller Zelle(n), einer oder mehrerer Zellkomponenten eines mikrobiellen Zellextraktes, teilweise gereinigten Enzyms/Enzyme oder gereinigten Enzyms/Enzyme.

"Hydrierungskatalysator" bezieht sich auf ein Material, das die Hydrierung beschleunigt, ohne selbst verbraucht zu werden oder einer chemischen Veränderung zu unterliegen.

"Wässriges Produktgemisch" wird zur Bezeichnung einer wässrigen Mischung verwendet, die ein aus dem entsprechenden Verfahrensschritt resultierendes Produkt enthält.

A. Umwandlung eines aliphatischen &agr;,&ohgr;-Dinitrils in das entsprechende Ammoniumsalz einer &ohgr;- Nitrilcarbonsäure mit hoher Ausbeute und hoher Regioselektivität

Der erste Schritt dieses Verfahrens ist die Umwandlung eines aliphatischen &agr;,&ohgr;-Dinitrils in das entsprechende Ammoniumsalz einer &ohgr;-Nitrilcarbonsäure unter Verwendung eines Enzymkatalysators. Der Enzymkatalysator verfügt entweder über eine Nitrilase-Aktivität, wo die Nitrilase das &agr;,&ohgr;-Dinitril direkt in das entsprechende Ammoniumsalz einer &ohgr;-Nitrilcarbonsäure umwandelt (Gleichung 1), oder über eine Kombination von zwei Enzym-Aktivitäten, nämlich der Nitril-Hydratase (NHase) und Amidase, wo das aliphatische &agr;,&ohgr;-Dinitril zuerst in ein &ohgr;-Nitrilalkylamid mit Hilfe der Nitril-Hydratase umgewandelt wird und anschließend das &ohgr;-Nitrilalkylamid mit Hilfe der Amidase in das entsprechende Ammoniumsalz einer &ohgr;-Nitrilcarbonsäure umgewandelt wird (Gleichung 2):

Aus Bodenproben ist eine neuartige Mikrobe Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746) isoliert worden, die an aliphatischen Nitrilen oder Dinitrilen exponiert wurde und die 2-Ethylsuccinonitril als eine Stickstoffquelle nutzen könnte. Bei Verwendung als ein mikrobieller, ganzzelliger Katalysator für die Hydrolyse von unsymmetrisch substituierten &agr;-Alkyl-&agr;,&ohgr;-dinitrilen, wie beispielsweise 2-Methylglutaronitril (2-MGN) oder 2-Ethylsuccinonitril (2-ESN), wird eine Mischung von Produkten erhalten. Im Verlaufe der Reaktionen der Hydrolyse werden zusätzlich zu der gewünschten &ohgr;-Nitrilcarbonsäure entsprechende Dicarbonsäuremonoamide und Dicarbonsäuren erzeugt. Es ist entdeckt worden, dass das Erhitzten einer Suspension von Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746) in einem geeigneten Puffer bei 50°C für eine kurze Zeitdauer eine unerwünschte Nitril-Hydratase-Aktivität des ganzzelligen Katalysators deaktiviert, der die Erzeugung der unerwünschten Dicarbonsäuremonoamide katalysiert (die durch eine Amidase weiter umgewandelt werden zu der entsprechenden Dicarbonsäure). Auf diese Weise wird ein ganzzelliger Katalysator hergestellt, der über eine Nitrilase-Aktivität verfügt, die ein &agr;-Alkyl-&agr;,&ohgr;-dinitril in lediglich das Ammoniumsalz der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure umwandelt, das aus der Hydrolyse der &ohgr;-Nitril-Gruppe resultiert.

Die Wärmebehandlung von Suspensionen von Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746) bei 50°C für eine Stunde erzeugt einen mikrobiellen ganzzelligen Katalysator, der 2-Methylglutaronitril (2-MGN) zu 4-Cyanopentansäure (4-CPA)-Ammoniumsalz, 2-Methylenglutaronitril (2-MEGN) zu 4-Cyano-4-pentensäure (4-CPEA)-Anunoniumsalz oder 2-Ethylsuccinonitril (2-ESN) zu 3-Cyanopentansäure (3-CPA)-Ammoniumsalz mit außerordentlich hoher Regioselektivität derart umwandelt, dass bei vollständiger Umwandlung des Nitrils mindestens eine Ausbeute von 98% des Ammoniumsalzes der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure durch Hydrolyse der &ohgr;-Nitril-Gruppe erzeugt wird (Tabelle 1):

Es gibt gegenwärtig keine nichtenzymatischen Methoden für die selektive Hydrolyse von lediglich einer Nitril-Gruppe eines aliphatischen Dinitrils zu entweder einer Amid-Gruppe oder einer Carbonsäure-Gruppe bei vollständiger Umwandlung des Dinitrils. Wenn eine derartige Reaktion zu einer unvollständigen Umwandlung (<20% Umwandlung) ausgeführt wird, um eine hohe Selektivität im Bezug auf ein Monoamid- oder Monosäure-Hydrolyseprodukt zu erhalten, wird zur Abtrennung des Produktes von nicht umgesetztem Dinitril und für die Rückführung des Dinitrils in die nachfolgende Reaktion ein Trennungsschritt erforderlich. Nichtenzymatische Hydrolysereaktionen umfassen typischerweise auch ein Erhitzen von Lösungen des Nitrils oder Dinitrils bei erhöhten Temperaturen und oftmals in Gegenwart einer starken Säure oder Base, während im Gegensatz dazu die enzymkatalysierte Reaktion, wie sie vorstehend beschrieben wurde, bei Umgebungstemperatur in wässriger Lösung und bei neutralem pH-Wert ohne zugesetzte Säure oder Base ausgeführt wird.

Es sind zwei Mutanten des Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746)-Stammes präpariert worden, die lediglich sehr geringe Mengen der unerwünschten Nitril-Hydratase-Aktivität aufweisen, die für die Erzeugung unerwünschter Nebenprodukte verantwortlich ist. Diese Mutantenstämme, von Acidovorax facilis 72-PF-15 (ATCC 55747) und Acidovorax facilis 72-PF-17 (ATCC 55745) erfordern keine Wärmebehandlung der Zellen vor der Verwendung als Katalysator für die Hydrolyse eines aliphatischen &agr;,&ohgr;-Dinitrils zu dem entsprechenden Ammoniumsalz einer &ohgr;-Nitrilcarbonsäure. Im Tabelle 2 wird ein Vergleich der Ausbeuten von 4-CPA und 2-Methylglutarsäure (2-MGA) gezeigt, die durch Hydrolyse von 2-MGN unter Verwendung von unbehandelten und wärmebehandelten Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746) und des unbehandelten Acidovorax facilis 72-PF-15 (ATCC 55747)-Mutantenstammes erhalten worden:

Bei Verwendung von wärmebehandelten Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746) als Katalysator für die Hydrolyse wässriger Lösungen der unsubstituierten aliphatischen &agr;,&ohgr;-Dinitrile, Succinonitril (SCN, 1,25 M) oder Glutaronitril (GLN, 1,5 M), werden die entsprechenden Ammoniumsalze der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure, 3-Cyanopropansäure (3-CPRA) und 4-Cyanobutansäure (4-CBA) in Ausbeuten von 99,7% bzw. 92,3% erzeugt, und die entsprechenden Dicarbonsäuren sind lediglich beobachtete Nebenprodukte. Sofern dieser gleiche Katalysator für die Umwandlung von Adiponitril (ADN) zu 5-Cyanopentansäure (5-CPA)-Ammoniumsalz verwendet wird, ist das Hauptprodukt Adipinsäure (ADA)-Diammoniumsalz. (>50% Ausbeute). Weder Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746) noch Acidovorax facilis 72-PF-15 (ATCC 55747) sind als Katalysator für die Herstellung von 5-CPA-Ammoniumsalz mit hoher Ausbeute geeignet.

Es wurden mehr als 30 verschiedene mikrobielle Kulturen, die aus Bodenproben isoliert wurden, die an aliphatischen Nitrilen oder Dinitrilen exponiert wurden und die auf verschiedenen Nitrilen oder Amiden als Stickstoffquelle wachsen könnten, einem Screening auf hohe Selektivität für die 5-CPA-Erzeugung unterzogen. Es wurde eine zweite neuartige Mikrobe, Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D (ATCC 55744) isoliert (unter Verwendung von 2-Methylglutaramid als Stickstoffquelle), die mehrere Nitril-Hydratase- und Amidase-Aktivitäten enthielt. Bei Verwendung als ganzzelliger Katalysator für die Hydrolyse von ADN setzt sich das resultierende Produktgemisch hauptsächlich aus ADA-Diammoniumsalz, Adipamid (ADAM) und Adipaminsäure (ADMA) zusammen, wobei lediglich eine geringe Ausbeute an 5-CPA-Anunoniumsalz beobachtet wurde. Wiederum wurde festgestellt, dass ein Erhitzen der Mikrobe bei 50°C für eine kurze Zeitdauer eine unerwünschte Nitril-Hydratase-Aktivität in großem Maße deaktivierte und einen mikrobiellen Katalysator mit einer Nitril-Hydratase-Aktivität zurückließ, die ADN zu 5-Cyanovaleramid umwandelt, sowie eine Amidase, die 5-Cyanovaleramid zu 5-CPA-Ammoniumsalz umwandelt. Die Wärmebehandlung von Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D bei 50°C für eine Stunde fuhrt zu einem mikrobiellen Zellen-Katalysator, der 5-CPA in Ausbeuten bis zu 97% bei vollständiger Umwandlung von ADN erzeugt.

Die Fähigkeit zur Eliminierung unerwünschter Nitril-Hydratase durch Wärmebehandlung, während gleichzeitig eine relativ wärmestabile Nitrilase-Aktivität oder Nitril-Hydratase-Aktivität für die Umwandlung von Dinitrilen zu Cyanosäuren zurückbleibt, war bisher noch nicht bekannt und wäre nicht vorherzusagen gewesen, da die Temperaturstabilität des Nitrilase- oder Nitril-Hydratase-Enzyms unbekannt war. Es wird erwartet, dass eine Wärmebehandlung bei Temperaturen zwischen 35° und 70°C zwischen 10 und 120 Minuten die beschriebene nützliche Wirkung erzielen wird.

B. Herstellung von 5- oder 6-gliedrigen Ring-Lactamen

Es ist ein Verfahren für die Herstellung von 5-gliedrigen oder 6-gliedrigen Ring-Lactamen mit hohen Ausbeuten durch direkte Hydrierung des Produktgemisches des Ammoniumsalzes von &ohgr;-Nitrilcarbonsäure entdeckt worden, das durch enzymkatalysierte Hydrolyse aliphatischer &agr;,&ohgr;-Dinitrile in wässriger Lösung erzeugt wurde. Dieses Verfahren erfordert nicht die Abtrennung des Ammoniumsalzes der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure von dem Produktgemisch der Hydrolysereaktion vor dem Schritt der Hydrierung, noch erfordert es die Umwandlung des Ammoniumsalzes der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure zur freien Säure (z.B. Umwandlung von 4-CPA-Anunoniumsalz zu 4-CPA) vor der Hydrierung oder Abtrennung des resultierenden Ammoniumsalzes der &ohgr;-Aminocarbonsäure von dem Produktgemisch der Hydrierung und die Umwandlung des Ammoniumsalzes der freien Carbonsäure zum Ringschluss.

Nach dem Herstellen eines wässrigen Produktgemisches, das das Ammoniumsalz einer &ohgr;-Nitrilcarbonsäure enthält, aus einem aliphatischen &agr;,&ohgr;-Dinitrile unter Verwendung eines Enzymkatalysators (Gleichung 3) war zu erwarten, dass die Entfernung des Enzymkatalysators und Reaktion der resultierenden wässrigen Lösung mit Wasserstoff und einem stöchiometrischen Überschuss von zugesetztem Ammoniak (Ammoniumhydroxid) in Gegenwart eines geeigneten Hydrierungskatalysators eine wässrige Lösung erzeugt, die ein Ammoniumsalz der aliphatischen &ohgr;-Aminocarbonsäure enthält (Gleichung 4):

Die Verwendung eines Überschusses an Ammoniak während der Hydrierung eines Nitrils zum entsprechenden Amin ist erforderlich, um die reduktive Alkylierung eines Imin-Intermediats (erzeugt während der Hydrierung der Nitril-Gruppe zu einem Amin) durch das Produkt &ohgr;-Aminocarbonsäure zu begrenzen, das zu einer Dim-Ererzeugung und einem Ausbeuteverlust führt. Diese Methode ist ausreichend dokumentiert (De Bellefon et al., Catal. Rev. Sci. Eng., (1994), Bd. 36, 459–506) und wird üblicherweise von der Fachwelt für die Hydrierung von Nitrilen praktiziert.

Anhand des Standes der Technik war zu erwarten, dass das durch Hydrierung eines Ammoniumsalzes der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure erzeugte Ammoniumsalz der &ohgr;-Aminocarbonsäure in die freie Säure hätte umgewandelt werden müssen und isoliert werden müssen (Gleichung 5), bevor eine thermisch eingeleitete Ringschlussreaktion zur Erzeugung des gewünschten Lactams hätte ausgeführt werden können (Gleichung 6). Nach Mares et al. (supra), existieren 6-Aminocapronsäure (6-ACA) (Gleichung 6, n = 3, R = H) und Caprolactam als eine reversible Gleichgewichtsmischung bei Konzentrationen unterhalb von 1,0 M/kg (etwa 1,0 M) in Wasser und die Konzentration von Caprolactam nimmt mit steigender Temperatur zu. Bei einer Gesamtkonzentration der 6-ACA und des Caprolactams von 0,85 Mol/kg (etwa 0,85 M) nahm der prozentuale Anteil von Caprolactam nach Angaben von Mares et al. von 38,7% bei 180°C auf 92,2% bei 250°C zu.

In dem vorliegenden Fall, wo ein Überschuss an zugesetztem Ammoniak (als Ammoniumhydroxid) vorliegt und der pH-Wert des Reaktionsgemisches zwischen 9 und 10 liegt, war nicht zu erwarten, dass das Ammoniumsalz von 6-ACA unter Erzeugung größerer Mengen von Caprolactam bei Temperaturen der Hydrierung unterhalb von 200°C zum Ringschluss kommen würde. Die pKa-Werte der Carbonsäure-Gruppe und der protonierten Amin-Gruppe von 6-Aminocapronsäure betragen 4,373 bzw. 10,804 (Lange's Handbook of Chemistry, J. A. Dean, Herausg., 14. Ausgabe, (1992), McGraw-Hill, NY, S. 8,22 (als 6-Aminohexansäure)), während der pKa-Wert von NH4 + 9,25 beträgt. Bei einem pH-Wert des Reaktionsgemisches zwischen 9 und 10 lässt sich berechnen, dass mindestens 99,997% des 6-ACA in der Lösung als das Ammoniumsalz der Carbonsäure existieren und darüber hinaus näherungsweise die Hälfte der Amin-Gruppen des Ammoniumsalzes der 6-Aminocapronsäure ebenfalls protoniert ist. Daher war nicht zu erwarten, dass größere Mengen des 6-ACA-Ammoniumsalzes unter Erzeugung von Caprolactam unter den Bedingungen der Hydrierung nach der vorliegenden Erfindung zum Ringschluss kommen würden, wo die Verdrängung eines Hydroxyl-Anions (OH-) aus dem Intermediat der Ringschlussreaktion, wie sie in Gleichung (7) dargestellt ist, nicht begünstigt wird.

Sofern Hydrierungen von wässrigen Lösungen von 5-CPA-Ammoniumsalz (hergestellt durch enzymatische Hydrolyse von ADN) in Gegenwart von Null bis 2,0 M NH4OH bei Temperaturen von 70° bis 160°C ausgeführt wurden, wurde eine vollständige Umwandlung von 5-CPA- zu 6-ACA-Ammoniumsalz mit geringer Bildung von Nebenprodukt beobachtet und, wie vorhergesagt, Ausbeuten an Caprolactam (das resultierende 7-gliedrige Ring-Lactam) von weniger als 3% erhalten (Tabelle 3):

Ausbeuten von Caprolactam von weniger als 3% wurden auch erhalten, wenn wässrige Lösungen, die durch Mischen von authentischer 6-ACA und Ammoniumhydroxid hergestellt wurden, unter den gleichen Bedingungen der Hydrierungsreaktion behandelt wurden wie bei der Hydrierung des Ammoniumsalzes von 5-CPA, das durch enzymatische Hydrolyse von ADN hergestellt wurde. Der Ringschluss des Ammoniumsalzes von 6-ACA in wässrigen Lösungen, die durch Hydrierung von 5-CPA-Ammoniumsalz bei 70°C hergestellt wurden, wurde bei Temperaturen oberhalb von 200°C versucht, indem zuerst der Hydrierungskatalysator entfernt und anschließend die etwa 1,0 M 6-ACA-Ammoniumsalz-Produktmischungen für 2 Stunden bei 280°C erhitzt wurden. Es wurden Ausbeuten an Caprolactam von weniger als 18% erzeugt (Tabelle 4). Diese Ergebnisse demonstrieren, dass lediglich sehr geringe Ausbeuten an Caprolactam durch die direkte Hydrierung wässriger Lösungen von 5-CPA-Ammoniumsalz in Gegenwart von überschüssigem Ammoniak erhalten werden. Dieses war angesichts der vorhergesagten Unfähigkeit des 6-ACA-Ammoniumsalzes, einen Ringschluss einzugehen, speziell in Gegenwart von überschüssigem Ammoniumhydroxid zu erwarten.

Es war ebenfalls zu erwarten, dass, wenn wässrige Mischungen von 3-Cyanopentansäure (3-CPA)-Ammoniumsalz (hergestellt durch enzymatische Hydrolyse von 2-Ethylsuccinonitril (2-ESN)) oder 4-Cyanovaleriansäure (4-CPA)-Ammoniumsalz (hergestellt durch enzymatische Hydrolyse von 2-Methylglutaronitril (2-MGN)) von 70° bis 160°C in Gegenwart von überschüssigem Ammoniak hydriert wurden, die entsprechenden Ammoniumsalze der &ohgr;-Aminocarbonsäure erzeugt würden und dass diese Salze hätten als freie Säuren isoliert werden müssen, bevor die Ringschlussreaktion zu dem entsprechenden Lactam hätte ausgeführt werden können (wie das der Fall bei dem 5-CPA-Ammoniumsalz ist). Obgleich die pKa-Werte der Carbonsäure und die protonierten Aminfunktionalitäten des Produktes 4-Amino-3-ethylbutansäure oder 5-Amino-4-methylpentansäure nicht veröffentlicht worden sind, kann man durchaus annehmen, dass diese pKa-Werte ähnlich denjenigen des 6-ACA-Isomers sind.

Unerwartet erzeugte die Hydrierung wässriger Lösungen von 3-CPA-Ammoniumsalz (erzeugt durch enzymatische Hydrolyse von 2-ESN) in Gegenwart von Raney-Nickel und überschüssigem Ammoniak bei pH 9 bis 10 und Temperaturen von 70° bis 180°C für 2 Stunden das entsprechende Lactam 4-Ethylpyrrolidin-2-on (4-EPRD) direkt und dieses mit Ausbeuten bis zu 91% (Tabelle 5). Die Ausbeute an 4-EPRD nahm außerdem mit steigender Konzentration von zugesetztem Ammoniumhydroxid (zugesetzt zusätzlich zu der Konzentration von Ammonium-Ion, die bereits als das Ammoniumsalz der Carbonsäure vorhanden war) zu, womit sich zeigt, wie wünschenswert es ist, die Hydrierung wässriger Lösungen der Ammoniumsalze der Mononitrilsäuren in Gegenwart von zugesetztem Ammoniak auszuführen, um die wohl bekannten Reaktionen der reduktiven Alkylierung, die Dimer und Polymer erzeugen (Tabelle 6), zu begrenzen.

Die Hydrierung wässriger Lösungen von 4-CPA-Ammoniumsalz (erzeugt durch enzymatische Hydrolyse von 2-MGN) in Gegenwart von Raney-Nickel und überschüssigem Ammoniak bei pH 9 bis 10 und bei 160°C für 2 Stunden erzeugt das entsprechende Lactam 5-Methyl-2-piperidon (5-MPPD) direkt und dieses mit Ausbeuten bis zu 96% (Tabelle 7):

Hydrierung wässriger Lösungen der Ammoniumsalze von 3-Cyanopropansäure (3-CPRA) oder 4-Cyanobutansäure (4-CBA) (erzeugt durch enzymatische Hydrolyse der entsprechenden &agr;,&ohgr;-Dinitrile) erzeugt die entsprechenden Lactame 2-Pyrrolidinon und 2-Piperidon mit Ausbeuten von 91,0% bzw. 93,5%. Die Hydrierung wässriger Lösungen von 4-Cyano-4-pentensäure (4-CPEA)-Ammoniumsalz (erzeugt durch enzymatische Hydrolyse von 2-Methylenglutaronitril) führt zur Hydrierung sowohl des Nitrils als auch der Kohlenstoff Kohlenstoff Doppelbindung unter Erzeugung von 5-Methyl-2-piperidon mit einer Ausbeute bis zu 85%.

Durch Zusetzen eines Überschusses an Ammoniak (als Ammoniumhydroxid) zu den Hydrierungsreaktionen, um die reduktive Alkylierung während der Hydrierung von Nitrilen zu Aminen zu begrenzen, hätten mehrere zusätzliche Reaktionen unter Erzeugung von Nebenprodukt auftreten können (De Bellefon et al., Catal. Rev. Sci. Eng., (1994), Bd. 36, 459–506). In der Fachwelt ist gut bekannt, dass eine übliche Methode für die Herstellung eines Amids oder Carbonsäure aus einem Nitril darin besteht, dass man eine wässrige Mischung des Nitrils in Gegenwart eines sauren oder basischen Katalysators erhitzt. Daher wäre eine zu erwartende konkurrierende Reaktion des Ammoniumsalzes einer Mononitril-Carbonsäure unter den Hydrierungsbedingungen, wie sie in der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangen, die basisch katalysierte Hydrolyse der Nitril-Gruppe unter Erzeugung entweder des Dicarbonsäure-Monoamidammoniumsalzes oder des Dicarbonsäure-Diammoniumsalzes. Diese unerwünschten Nebenprodukte von Amid/Säure und Dicarbonsäure-Ammoniumsalzen werden während der Hydrierungen erzeugt, allerdings im Vergleich zu den Ausbeuten an Lactam in sehr geringen Ausbeuten.

Eine zweite Reaktion unter Erzeugung von Nebenprodukt zwischen dem vorhandenen überschüssigen Ammoniak und dem Produkt Lactam hätte zur Erzeugung einer Gleichgewichtsmischung des Lactams mit dem erwarteten Ammonolyseprodukt, ein &ohgr;-Aminocarboxamid, führen können. Die hohen Ausbeuten der 5-gliedrigen und 6-gliedrigen Ring-Lactame, die unter den erfindungsgemäßen Reaktionsbedingungen erreicht werden, legen nahe, dass die Ammonolyse (oder basisch katalysierte Hydrolyse) der Produkt-Lactame nicht von Bedeutung ist.

Darüber hinaus wurden zum Herstellen von Lactamen aus aliphatischen &agr;,&ohgr;-Dinitrilen N-Methyl-Lactame durch Ersetzen von Methylamin für Ammoniak in der Hydrierung wässriger Lösungen der Ammoniumsalze von 4-CPA oder 3-CPA hergestellt. Der Zusatz von einem bis vier Äquivalenten Methylamin (pKa 10,62 für das protonierte Amin) zu einer wässrigen Lösung von 4-CPA, die ein Äquivalent Ammonium-Ion (pKa 9,25) enthält, hätte erwartungsgemäß eine größere Menge an freiem Ammoniak (in Folge der relativen Unterschiede der pKa-Werte von protoniertem Methylamin und Ammonium-Ionen in Wasser) erzeugen müssen. Dieses freie Ammoniak könnte dann mit dem unprotonierten Methylamin bei der Reaktion mit dem Intermediat Imin konkurrieren, das während der Hydrierung der Nitril-Gruppe erzeugt wird, und zur Erzeugung einer Mischung der Ammoniumsalze von 5-Amino-4-methylpentansäure bzw. 5-N-Methylamino-4-methylpentansäure führen, die wiederum unter Erzeugung von 5-MPPD bzw. 1,5-Dimethyl-2-piperidon (1,5-DMPD) cyclisieren.

Die relativen Ausbeuten an 5-MPPD und 1,5-DMPD, die durch Hydrierung von 1,0 M wässrigen Lösungen des Ammoniumsalzes von 4-CPA erzeugt werden, erweisen sich als abhängig von der Wahl des Katalysators. Raney-Nickel und Ruthenium-auf-Aluminiumoxid erzeugen jeweils 5-MPPD als das Lactam-Hauptprodukt und dieses selbst bei Gegenwart von 3,0 M Methylamin, während 1,5-DMPD das Hauptprodukt ist, wenn 5% Pd/C oder 4,5% Pd/0,5% Pt/C als Katalysator bei der gleichen Methylamin-Konzentration verwendet werden. Sofern 5% Pd/C als Katalysator verwendet werden, steigt die Ausbeute an 1,5-DMPD mit zunehmender Konzentration von Methylamin (Tabelle 8).

Der Ersatz von 2,0 M Methylamin für Ammoniak bei der Hydrierung wässriger Lösungen von 1,0 M 3-CPA-Ammoniumsalz bei 140°C und Verwendung eines Pd/C-Katalysators erzeugt 4-Ethyl-1-methylpyrrolidin-2-on (4-EMPRD) bzw. 4-EPRD mit Ausbeuten von 69,8% bzw. 20,4% bei einer Umwandlung von 96%.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN METHODEN UND MATERIALIEN: Mikrobielle Katalysatoren für die Herstellung von &ohgr;-Nitrilcarbonsäuren

Es wurden 2 Mikroorganismen zur Verwendung als mikrobieller Katalysator für die Umwandlung von aliphatischen &agr;,&ohgr;-Dinitrilen zu den entsprechenden &ohgr;-Nitrilcarbonsäuren isoliert: Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746) und Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D (ATCC 55744).

Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746) wurde aus einem in Orange, Texas eingesammelten Boden isoliert. Die Standardprozeduren der Anreicherung wurden mit dem folgenden Medium angewendet (E2-Basalmedium, pH 7,2):

Die folgenden Ergänzungen wurden an dem E2-Basalmedium für die vorstehend beschriebenen Anreicherungen vorgenommen:

Es wurden Stämme unabhängig auf der Basis von Wachstum und Ammoniakerzeugung auf dem Anreicherungs-Nitril ausgewählt. Es wurden Isolate durch wiederholtes Durchleiten von Bacto® Brain Heart-Infusion-Agar (Difco, Detroit, Michigan) gefolgt von einem Screening auf Ammoniak-Produktion von dem Anreicherungsnitril gereinigt. Die gereinigten Stämme wurden auf der Grundlage ihres Nutzungsprofils der Kohlenstoffquelle auf einem Biolog®-Testsystem identifiziert (Hayward, CA, USA), indem Gram-negative Testplatten verwendet wurden.

Zum Testen von Nitril-Hydrolyse-Aktivität wurde E2-Basalmedium mit 10 g/l Glucose verwendet, um A. facilis 72W aufzuziehen. Das Medium wurde mit 25 mM (±)-2-Methylglutaronitril ergänzt. Es wurde ein 10 ml Volumen von ergänztem E2-Medium mit 0,1 ml gefrorener Stammkultur beimpft. Nach dem Aufziehen über Nacht bei Raumtemperatur (22° bis 25°C) auf einer Schüttelvorrichtung mit 250 U/min wurden 10 ml Inoculum zu 990 ml frischem Medium in einem 21 Kolben zugesetzt. Die Zellen wurden über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren mit ausreichend hoher Geschwindigkeit aufgezogen, um eine Blasenbildung in dem Medium hervorzurufen. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet, ein Mal mit 50 mM Phosphat-Puffer (pH 7,2)/15% Glycerin gewaschen und die konzentrierte Zellpaste sofort auf Trockeneis eingefroren und bei –65°C aufbewahrt. Ebenfalls wurde in den 1 l-Fermentationen 10 mM Adiponitril verwendet. Die Fermentationen wurden nach 16 bis 20 Stunden Wachstum angehalten. Die Zellsuspension wurde bis 4°C abgeschreckt, durch Zentrifugieren geerntet und bei –60°C eingefroren, gefolgt von einer Wäsche mit 15% Glycerin in 0,05 M Phosphat-Puffer von pH 7,2. Es wurden aufgetaute Zellpasten zum Testen auf Nitril-Hydrolyse-Aktivität verwendet. Die gewünschte Eigenschaft der Mikroorganismen ist eine Nitril-Hydrolyse-Aktivität, die zum regiospezifischen Angriff einer Dinitril-Verbindung in Abwesenheit von störender Amidase-Aktivität in der Lage ist. Die Mikroorganismen haben die Neigung, einer Mutation zu unterliegen. Einige Mutationen können für die gewünschte Nitril-Umwandlung günstig sein. Daher können sogar Mutanten des eigentlichen Bakterienstammes zur Ausführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Außerdem wurden Standard-Anreicherungsprozeduren angewendet für Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D mit E2-Basalmedium, pH 7,2, die insofern modifiziert waren, dass sie ein Zehntel der Konzentration in dem vorstehen beschriebenen Standard-Basalmedium an Vitaminen aufwiesen. Die folgenden Ergänzungen wurden an dem modifizierten E2-Basalmedium für die Anreicherungen vorgenommen:

Es wurden Bakterienstämme unabhängig auf der Grundlage des Wachstums auf Anreicherungs-Nitrilamid ausgewählt. Die Isolate wurden durch wiederholtes Überleiten auf Agarplatten unter Verwendung des vorgenannten Mediums gereinigt. Die gereinigten Bakterienstämme wurden auf der Grundlage ihres Nutzungsprofils der Kohlenstoffquelle auf einem Biolog®-Testsystems identifiziert (Hayward, CA, USA), indem Gram-negative Testplatten verwendet wurden.

Beim Testen der Nitril-Hydrolyse-Aktivität wurde modifiziertes E2-Basalmedium mit 6,0 g/l entweder Glucose oder Glycerin zum Aufziehen von Zellmaterial verwendet. Das Medium wurde mit 1,0% MGAM ergänzt. Es wurde ein 250 ml Schüttelkolben (nicht mit Prallflächen versehen) mit einem Gehalt von 50 ml ergänztem E2-Medium mit 0,2 ml gefrorener Stammkultur beimpft und für 72 Stunden bei 30°C auf einer Schüttelvorrichtung bei 200 U/min aufgezogen. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet und mit 10 ml von 20 mM KH2PO4, pH 7,0, gewaschen. Die Zellen wurden in 10 ml-Reaktionen mit einem Gehalt von 20 mM KH2PO4, pH 7,0, und 0,1 M entweder Methylglutaronitril oder Methylglutaramid auf regiospezifische Hydrolyse unter Anwendung der HPLC einem Screening unterworfen. Die gewünschte Eigenschaft des Mikroorganismus ist eine Nitril-hydrolysierende Aktivität, die zum regiospezifischen Angriff auf eine Dinitril-Verbindung in Abwesenheit von störender Amidase-Aktivität in der Lage ist. Die Mikroorganismen haben die Neigung, einer Mutation zu unterliegen. Einige Mutationen können für die gewünschte Nitrilumwandlung günstig sein. Daher können selbst Mutanten des eigentlichen Bakterienstamms zur Ausführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf spezielle, vorstehen erwähnte Organismen beschränkt, sondern schließt die Verwendung von Varianten und Mutanten davon ein, die die gewünschte Eigenschaft erhalten. Derartige Varianten und Mutanten lassen sich aus Elternstämmen mit Hilfe zahlreicher bekannter Maßnahmen erzeugen, wie beispielsweise Röntgenstrahlung, UV-Strahlung und chemischer Mutagene.

Zur Erzeugung von Biokatalysatoren für die Prozessdemonstration (Beispiele 1 bis 26) wurden die folgenden Medien verwendet:

Um das Wachstum einzuleiten, wurden 10 ml des entsprechenden Mediums mit 0,1 ml gefrorener Stammkultur beimpft. Nach einer Aufzucht bei 28°C unter Schütteln bei 250 U/min über Nacht wurde die wachsende Zellsuspension in 1 l des gleichen Mediums in einen 2 l Kolben gegeben und die Aufzucht bei 28°C unter Schütteln fortgesetzt. Sodann wurde die wachsende Zellsuspension von 1 l zu 9 l des gleichen Mediums in einen 10 l Fermentationskessel gegeben und die Inkultunahme fortgesetzt. Die Nennbedingungen in dem Fermentationsreaktor betrugen: ≥80% Sauerstoff Sättigung, 25°C, pH 7,2, 300 bis 1.000 U/min. Nach 20 bis 91 Stunden wurde der Behälter bis 8° bis 12°C abgeschreckt und bis zu einer Endkonzentration von 10% Glycerin zugesetzt. Das Zellmaterial wurde durch Zentrifugieren geerntet. Die konzentrierte Zellpaste wurde sofort auf Trockeneis eingefroren und bis zum Gebrauch bei –70°C aufbewahrt. Der Fachwelt sind zahlreiche andere Ergänzungen bekannt, die als Kohlenstoff und Stickstoffquellen für das Zellwachstum in E2-Basalmedium dienen können. Zur Erzeugung von Biokatalysator können sowohl diese als auch komplexe Nährmedien verwendet werden. Das vorstehend beschriebene spezielle Medium ist nicht als einschränkend zu betrachten.

Auswahl von mutanten Bakterienstämmen von Acidovorax facilis 72W mit mangelnder NHase-Aktivität

Es wurden Mutanten von Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746) mit verringerter Kapazität zur Erzeugung von unerwünschtem 2-Methylglutarsäure-Nebenprodukt während der Hydrolyse von 2-MGN zu 4-CPA auf der Grundlage ihrer Unfähigkeit zur Nutzung von 2-MGN als Kohlenstoff und Energiequelle ausgewählt. Insbesondere wurde eine Übernacht-Kultur des Stammes A. facilis 72W, der auf LB/Succinat-Medium (1% (Gewicht/Volumen) Bacto-Trypton (Difco, Detroit, Michigan, USA), 0,5% (Gewicht/Volumen) Bacto-Hefeextrakt (Difco), 1% (Gewicht/Volumen) NaCl, 0,5% (Gewicht/Volumen) Natriumsuccinat-Hexahydrat) aufgezogen war, für näherungsweise 30 Minuten an 100 &mgr;g/ml-Lösung von N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, einem Mutagen-bildenden Mittel, exponiert. Dieses führte zu einer 99,9%igen Verringerung lebensfähiger Zellen in der Kultur. Die mutagenisierten Zellen wurden von dem Mutagen durch Zentrifugieren in sterilen 1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,2, freigewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden erneut in LB/Succinat-Medium suspendiert und über Nacht bei 30°C aufgezogen. Die Zellen wurden sodann durch Zentrifugieren in sterilem 50 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,2, gewaschen und erneut in E2-Minimalmedium (ohne Glucose) mit einem Gehalt von 0,2% (Volumen/Volumen) 2-Methylglutaronitril und den Antibiotika Cycloserin, 0,2 mg/ml, und Piperazillin, 40 &mgr;g/ml, suspendiert. Die Zellen wurden über Nacht bei 30°C inkubiert und wiederum in sterilem 50 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,2, gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden auf Agarplatten ausgestrichen, die ein nichtselektives Medium enthielten: E2-Minimalmedium (ohne Glucose) plus 0,2% (Volumen/Volumen) 2-Methylglutaronitril und 0,5% (Gewicht/Volumen) Natriumsuccinat-Hexahydrat bei einer Konzentration von 40 bis 100 koloniebildenden Einheiten pro Platte. Die Platten wurden für näherungsweise 48 Stunden bei 30°C inkubiert, um eine Entwicklung der Kolonien zu ermöglichen. Die Kolonien, die sich entwickelten, wurden auf Agarplatten, die selektives Medium enthielten: E2-Minimalmedium (ohne Glucose) plus 0,2% (Volumen/Volumen) 2-MGN, Replika-plattiert. Die Platten wurden für 48 Stunden bei 30°C inkubiert, um eine Entwicklung der Kolonien zu ermöglichen. Die Mutanten mit den gewünschten Eigenschaften zeigten auf dem selektiven Medium kein gutes Wachstum. Daher wurden nach 48 Stunden replizierte Platten verglichen und Bakterienstämme, die lediglich auf nichtselektivem Medium ein Wachstum zeigten, für das weitere Testen aufbewahrt.

Insgesamt wurden näherungsweise 5.120 Kolonien von 89 Platten und 19 Bakterienstämmen mit den gewünschten Eigenschaften kontrolliert und identifiziert. Diese Mutanten-Stämme wurden weiter auf Wachstum in Flüssigkeit, E2-Minimalmedium (ohne Glucose) plus 0,2% (Volumen/Volumen) 2-MGN getestet. Bakterienstämme, die wenig oder kein Wachstum in diesem Medium zeigten, wurden auf ihre Fähigkeit zur Erzeugung von 2-Methylglutarsäure während des Wachstums in flüssigem Medium einem Screening unterzogen, das aus E2-Minimalmedium (ohne Glucose) plus 0,2% (Volumen/Volumen) 2-MGN und 0,5% (Gewicht/Volumen) Natriumsuccinat-Hexahydrat bestand. Als Ergebnis dieses Prozesses wurden 2 mutante Bakterienstämme als Acidovorax facilis 72-PF-15 (ATCC 55747) und Acidovorax facilis 72-PF-17 (ATCC 55745) identifiziert und zur weiteren Entwicklung aufgrund ihrer stark herabgesetzten Leistung zur Erzeugung von 2-Methylglutarsäure ausgewählt.

Aliphatische &agr;,&ohgr;-Dinitril-Hydrolysereaktionen

Es wurde eine wässrige Lösung angesetzt, die das Ammoniumsalz einer aliphatischen &ohgr;-Nitrilcarbonsäure enthielt, indem das entsprechende aliphatische &agr;,&ohgr;-Dinitril mit einer wässrigen Suspension des geeigneten Enzymkatalysators (wie vorstehend im Abschnitt A angegeben) gemischt wurden. Es lassen sich ganze mikrobielle Zellen als Katalysator ohne jede Vorbehandlung verwenden. Alternativ können sie in einer Polymermatrix immobilisiert werden (z.B. Alginatkügelchen oder Polyacrylamid-Gel (PAG)-Partikel) oder auf einem unlöslichen festen Träger (z.B. Celite), um die Gewinnung und Wiedergewinnung des Katalysators zu erleichtern. Methoden für die Immobilisierung von Zellen in einer Polymermatrix oder auf einem unlöslichen festen Träger sind umfangreich veröffentlicht worden und sind in der Fachwelt gut bekannt. Das Nitrilaseenzym oder die Nitril-Hydratase- und Amidase-Enzyme können ebenfalls von den ganzen Zellen isoliert und direkt als Katalysator verwendet werden, oder das/die Enzym(e) lassen sich in einer Polymermatrix oder auf einem unlöslichen Träger immobilisieren. Diese Methoden sind ebenfalls umfangreich veröffentlicht worden und der Fachwelt gut bekannt.

Einige der aliphatischen &agr;,&ohgr;-Dinitrile, die in der vorliegenden Erfindung als Ausgangsmaterial verwendet werden, sind lediglich mäßig wasserlöslich. Ihre Löslichkeit ist außerdem von der Temperatur der Lösung und der Salzkonzentration (Puffer und/oder &ohgr;-Nitrilcarbonsäure-Ammoniumsalz) in der wässrigen Phase abhängig. Beispielsweise wurde ermittelt, dass Adiponitril eine Löslichkeitsgrenze von etwa 0,60 M (25°C, 20 mM Phosphat-Puffer, pH 7) hat und unter den gleichen Bedingungen 2-Methylglutaronitril eine Löslichkeitsgrenze von etwa 0,52 M hat. In diesem Fall wird die Erzeugung einer wässrigen Lösung eines Ammoniumsalzes der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure bei einer größeren Konzentration als die Löslichkeitsgrenze des Ausgangs-&agr;,&ohgr;-Dinitrils unter Verwendung eines Reaktionsgemisches erreicht, das sich zu Beginn aus zwei Phasen zusammensetzt: eine wässrige Phase, die den Enzymkatalysator und aufgelöstes &agr;,&ohgr;-Dinitril enthält, und eine organische Phase (das ungelöste &agr;,&ohgr;-Dinitril). Mit fortschreitender Reaktion löst sich das Dinitril in der wässrigen Phase auf und es wird möglicherweise ein einphasiges Produktgemisch erhalten.

Die Konzentration des Enzymkatalysators in dem Reaktionsgemisch ist abhängig von der spezifischen katalytischen Aktivität des Enzymkatalysators und wird so gewählt, dass die gewünschte Reaktionsgeschwindigkeit erhalten wird. Das Nasszellengewicht der mikrobiellen Zellen, die als Katalysator in den Hydrolysereaktionen verwendet werden, liegt im typischen Fall bei 0,001 g bis 0,100 g Nasszellen pro Milliliter des gesamten Reaktionsvolumens und bevorzugt bei 0,002 g bis 0,050 g Nasszellen pro Milliliter. Die spezifische Aktivität der mikrobiellen Zellen (IU/g Nasszellengewicht) wird ermittelt, indem die Umwandlungsgeschwindigkeit einer 0,10 M Lösung eines Dinitrilsubstrats zu demgewünschten &ohgr;-Nitrilcarbonsäure-Produkt bei 25°C unter Verwendung eines bekannten Gewichts des mikrobiellen Zellkatalysators gemessen wird. Eine "IU" (Internationale Einheit) der Enzymaktivität ist als der Betrag der Enzymaktivität definiert, der zur Umwandlung von einem Mikromol Substrat zu Produkt pro Minute erforderlich ist.

Die Temperatur der Hydrolysereaktion wird so gewählt, dass sowohl die Reaktionsgeschwindigkeit als auch die Stabilität der Enzymkatalysatoraktivität optimiert sind. Die Temperatur der Reaktion kann von etwas oberhalb des Gefrierpunktes der Suspension (etwa 0°C) bis zu 60°C reichen, wobei ein bevorzugter Bereich der Reaktionstemperatur bei 5° bis 35°C liegt. Die mikrobielle Zellkatalysator-Suspension kann angesetzt werden, indem die Zellen in destilliertem Wasser oder in einer wässrigen Lösung eines Puffers suspendiert werden, der den Anfangs-pH-Wert der Reaktion zwischen 5,0 und 10,0 und bevorzugt zwischen 6,0 und 8,0 bewahrt. Mit dem Ablaufen der Reaktion kann sich der pH-Wert des Reaktionsgemisches in Folge der Bildung eines Ammoniumsalzes der Carbonsäure aus der entsprechenden Nitril-Funktionalität des Dinitrils verändern. Die Reaktion kann bis zur vollständigen Umwandlung von Dinitril ohne eine pH-Wert-Kontrolle ablaufen oder es kann eine geeignete Säure oder Base im Verlaufe der Reaktion zugesetzt werden, um den gewünschten pH-Wert aufrecht zu erhalten.

Die Endkonzentration des aliphatischen &ohgr;-Nitrilcarbonsäure-Aminoniumsalzes in dem Produktgemisch bei vollständiger Umwandlung des &agr;,&ohgr;-Dinitrils kann von 0,001 M bis zur Löslichkeitsgrenze des aliphatischen &ohgr;-Nitrilcarbonsäure-Ammoniumsalzes reichen. Im typischen Fall liegt die Konzentration des &ohgr;-Nitrilcarbonsäure-Ammoniumsalzes im Bereich von 0,10 M bis 2,0 M. Das Produktgemisch der Hydrolysereaktion kann in der nachfolgenden Hydrierungsreaktion nach der Gewinnung des Enzymkatalysators durch Zentrifugieren und/oder Filtration direkt verwendet werden. Die &ohgr;-Nitrilcarbonsäure kann auch aus dem Produktgemisch (nach Entfernung des Katalysators) abgetrennt werden, indem der pH-Wert des Reaktionsgemisches zwischen 2,0 und 2,5 mit konzentrierter HCl eingestellt wird und die resultierende Lösung mit Natriumchlorid gesättigt wird und die &ohgr;-Nitrilcarbonsäure mit einem geeigneten organischen Lösemittel extrahiert wird, wie beispielsweise Ethylacetat, Ethylether oder Dichlormethan. Die vereinten organischen Extrakte werden sodann vereint, mit einem geeigneten Trocknungsmittel gerührt (z.B. Magnesiumsulfat), filtriert und das Lösemittel abgetrieben (z.B. durch Rotationsverdampfung), um das gewünschte Produkt in hoher Ausbeute und hoher Reinheit (im typischen Fall mit einer Reinheit von 98 bis 99%) zu erzeugen. Nach Erfordernis kann das Produkt durch Umkristallisation oder durch Destillation weiter gereinigt werden.

Hydrierung/Ringschluss von &ohgr;-Nitrilcarbonsäure-Ammoniumsalzen

Die katalytische Hydrierung ist eine bevorzugte Methode zum Herstellen eines aliphatischen Amins aus einem aliphatischen Nitril. In der vorliegenden Erfindung kommt die während der Hydrierung erzeugte &ohgr;-Aminocarbonsäure zum Ringschluss zu dem entsprechenden 5-gliedrigen oder 6-gliedrigen Ring-Lactam. Eine wässrige Lösung eines Ammoniumsalzes einer &ohgr;-Nitrilcarbonsäure (hergestellt durch Zentrifugation und Filtration des wässrigen Produktgemisches, das durch die enzymatische Hydrolyse des entsprechenden aliphatischen &agr;,&ohgr;-Dinitrils erzeugt wird) wird zuerst mit konzentriertem Ammoniumhydroxid und Wasser gemischt, um eine Lösung zu erzeugen, die 1 bis 4 stöchiometrische Äquivalente von zugesetztem Ammoniumhydroxid enthält. Das Ammoniumhydroxid wird zugesetzt, um die reduktive Alkylierung der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure durch das Produkt &ohgr;-Aminocarbonsäure im Verlaufe der Hydrierung zu begrenzen. Um eine optimale Ausbeute des gewünschten Lactams zu erzielen wird ein 2- bis 3-facher stöchiometrischer Überschuss des Ammoniumhydroxids im Bezug auf die in dem Reaktionsgemisch vorhandene Menge der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure bevorzugt. Wahlweise kann Ammoniak-Gas für das zum Reaktionsgemisch zugesetzte Ammoniumhydroxid ersetzt werden. Die Anfangskonzentration des Ammoniumsalzes der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure in dem Reaktionsgemisch der Hydrierung kann von 5% bis 20 Gew.% der Lösung liegen, wobei ein bevorzugter Bereich bei 7,5% bis 12,5 Gew.% liegt.

Für die Herstellung eines N-Methyllactams wird Methylamin für das Ammoniumhydroxid oder Ammoniak ersetzt, indem 1 bis 4 stöchiometrische Äquivalente im Bezug auf die in dem Reaktionsgemisch vorhandene &ohgr;-Nitrilcarbonsäure verwendet werden. Um eine optimale Ausbeute des gewünschten N-Methyllactams zu erzielen, wird ein 3- bis 4-facher stöchiometrischer Überschuss von Methylamin im Bezug auf die Menge der im Reaktionsgemisch vorhandenen &ohgr;-Nitrilcarbonsäure bevorzugt.

Zu dem vorstehend beschriebenen Reaktionsgemisch der Hydrierung wird anschließend ein geeigneter Hydrierungskatalysator zugesetzt und das resultierende Gemisch unter Druck mit Wasserstoffgas erhitzt, um das Ammoniumsalz der &ohgr;-Nitrilcarbonsäure zu dem entsprechenden 5-gliedrigen oder 6-gliedrigen Lactam umzuwandeln. Die für diese Aufgabe geeigneten Hydrierungskatalysatoren schließen die verschiedenen Platinmetalle ein, ohne auf diese beschränkt zu sein, wie beispielsweise Iridium, Osmium, Rhodium, Ruthenium, Platin und Palladium – aber auch verschiedene andere Übergangsmetalle, wie beispielsweise Kobalt, Kupfer, Nickel und Zink. Der Katalysator kann ohne Träger sein (beispielsweise als Raney-Nickel oder Platinoxid) oder kann einen Träger aufweisen (beispielsweise Palladium-auf-Kohlenstoff Platin-auf-Aluminiumoxid oder Nickel-auf-Kieselgur).

Der Hydrierungskatalysator wird bei einer Mindeskonzentration verwendet, die ausreichend ist, um die gewünschte Reaktionsgeschwindigkeit und die Gesamtumwandlung der Ausgangsmaterialien unter den gewählten Reaktionsbedingungen zu erlangen. Diese Konzentration lässt sich leicht experimentell ermitteln. Der Katalysator kann in Mengen von 0,001 bis 20 Gewichtsteilen oder mehr Katalysator pro 100 Teile in der Reaktion eingesetzte &ohgr;-Nitrilcarbonsäure verwendet werden. Die Katalysatorbeladung in dem Reaktionsgemisch beträgt im typischen Fall 1% bis 10% (Gewicht Katalysator/Gewicht &ohgr;-Nitrilcarbonsäure), wobei 3% bis 5% Katalysatorbeladung bevorzugt sind. Raney-Nickel (z.B. Raney-Nickel-Katalysator mit Cr-Promotor (Grace Davison Raney 2400 als aktiver Metallkatalysator)) ist ein bevorzugter Katalysator bei Reaktionen, die in Gegenwart von zugesetztem Ammoniak ablaufen, um Lactame zu erzeugen, während 5% oder 10% Palladium-auf-Kohlenstoff oder 4,5% Palladium/0,5% Platin-auf-Kohlenstoff bei Reaktionen bevorzugt sind, die in Gegenwart von zugesetztem Methylamin zur Erzeugung von N-Methyllactamen ablaufen.

Die Hydrierungstemperatur und Druck lassen sich weitreichend variieren. Die Temperatur kann in der Regel im Bereich von 45° bis 200°C und vorzugsweise von 70° bis 180°C liegen. Der Wasserstoffdruck liegt in der Regel im Bereich von etwa Atmosphärendruck bis etwa 100 Atm und bevorzugt bei 30 bis 60 Atm. Die Hydrierung wird vorzugsweise ohne jede pH-Wert-Einstellung des Reaktionsgemisches ausgeführt, die unter Zusatz eines Überschusses an Ammoniumhydroxid, Ammoniak oder Methylamin in der Regel zwischen einem pH-Wert von 9 bis 12 liegt. Innerhalb dieses pH-Wert-Bereiches kann der exakte Wert eingestellt werden, um den gewünschten pH-Wert zu erhalten, indem eine beliebige kompatible und nicht störende Base oder Säure zugesetzt werden. Geeignete Basen schließen ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: Alkalimetallhydroxide, -carbonate, -hydrogencarbonate und -phosphate, während geeignete Säuren einschließen, ohne auf diese beschränkt zu sein: Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure.

Die Lyse der mikrobiellen Zellkatalysatoren während der Hydrolysereaktion oder Verunreinigungsstoffe, die aus der Katalysatorherstellung vorhanden sind, könnten Verbindungen in das Reaktionsgemisch der Hydrierung eingebracht haben (z.B. Thiole), die die Katalysatoraktivität vergiften könnten. Es wurde keinerlei Vergiftung oder Deaktivierung der Hydrierungskatalysatoren beobachtet im Vergleich zur Hydrierung von Mischungen von &ohgr;-Nitrilcarbonsäure-Ammoniumsalzen, die über die mikrobielle Hydrolyse mit der Hydrierung wässriger Lösungen der gleichen &ohgr;-Nitrilcarbonsäure erzeugt wurden, die von den Hydrolyse-Produktmischungen abgetrennt und vor der Hydrierung gereinigt wurden.

Das Lactam oder N-Methyllactam lassen sich mühelos von dem Produlktgemisch der Hydrierung abtrennen, indem die Mischung zunächst zur Gewinnung des Hydrierungskatalysators filtriert wird wonach das Produkt direkt aus dem resultierenden wässrigen Filtrat destilliert werden kann. Das während der Ringschlussreaktion erzeugte oder dem Reaktionsgemisch zugesetzt Ammoniak, kann ebenfalls zur Rückführung in den Kreislauf mit Hilfe dieses Destillationsprozesses gewonnen werden, womit die Erzeugung von unerwünschten anorganischen Salzen als Abprodukte vermieden wird. Die Lactame oder N-Methyllactame lassen sich auch durch Filtrieren des Hydrierungsgemisches, Einstellung des pH-Wertes des Filtrates auf etwa 7 mit konzentrierter HCl und Sättigung mit Natriumchlorid, Extraktion des Lactams oder N-Methyllactams (chargenweise) oder kontinuierliche Extraktion mit einem organischen Lösemittel gewinnen, wie beispielsweise Ethylacetat, Dichlormethan oder Ethylether, wobei die Gewinnung des organischen Extraktes durch Destillation oder Kristallisation erfolgt. In den beigefügten Beispielen sind die isolierten Ausbeuten, die bei dieser Methode angegeben werden, nicht optimiert, wobei diese Methode einfach zur Anwendung gebracht wurde, um gereinigtes Produkt zur Analyse und Bestätigung der chemischen Identität zu erhalten.

In den folgenden Beispielen, die zur weiteren Veranschaulichung der Erfindung dienen und diese nicht beschränken, sind die prozentualen Angaben der Gewinnung der aliphatischen &agr;,&ohgr;-Dinitrile und der Ausbeuten der Hydrolyseprodukte, die während der mikrobiellen Hydrolysereaktionen erzeugt werden, auf die Anfangsmenge des in dem Reaktionsgemisch vorhandenen &agr;,&ohgr;-Dinitrils bezogen (sofern nicht anders angegeben) und mit Hilfe der HPLC unter Anwendung eines Brechzahl-Detektors und entweder einer Supelcosil LC-18-DB-Säule (25 cm × 4,6 mm Durchmesser) oder einer Bio-Rad-HPX-87H-Säule (30 cm × 7,8 mm Durchmesser) ermittelt. Die Ausbeuten an Lactamen und N-Methyllactamen, die mit Hilfe der Hydrierung wässriger Lösungen von &ohgr;-Nitrilcarbonsäure-Ammoniumsalzen erzeugt wurden, sind auf die Ausgangskonzentration des in dem Reaktionsgemisch vorhandenen &ohgr;-Nitrilcarbonsäure-Ammoniumsalzes bezogen (sofern nicht anders angegeben) und wurden mit Hilfe der Gaschromatographie unter Verwendung einer DB-1701-Kapillarsäule (30 m × 0,53 mm ID, Filmdicke 1 Mikrometer) ermittelt.

BEISPIEL 1 4-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)

Zunächst wurden 0,60 g (Nasszellgewicht) gefrorene Acidovorax facilis 72W (ATCC 55764)-Zellen (zuvor wärmebehandelt bei 50°C für 1 Stunde vor dem Gefieren) in ein 15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben, gefolgt von einer Zugabe von 12 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0). Nachdem die Zellen aufgetaut und suspendiert wurden, wurde die resultierende Suspension zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das resultierende Zellpellet wurde erneut in einem Gesamtvolumen von 12 ml dieses gleichen Phosphat-Puffers suspendiert. In ein zweites 15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen wurden 0,1081 g (0,114 ml, 1,00 mM, 0,100 M) 2-Methylglutaronitril eingewogen und anschließend 9,89 ml der A. facilis 72W (ATCC 55746)-Zellsuspension (0,494 g Nasszellgewicht) zugesetzt und die resultierende Suspension auf einer rotierenden Plattform bei 27°C gemischt. Es wurden Proben (0,300 ml) abgezogen und zentrifugiert und anschließend 0,180 ml des Überstandes in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (10 K MWCO) gegeben und mit 0,020 ml einer wässrigen Lösung von 0,750 M N-Methylpropionamid (HPLC, externe Standardlösung) gemischt. Es wurde ausreichend 1,0 M HCl zugesetzt, um den pH-Wert der Probe bis ca. 2,5 abzusenken, und die resultierende Lösung filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 1,0 Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten an 4-Cyanopentansäure und 2-Methylglutarsäure 99,3% bzw. 0,7% ohne zurückbleibendes 2-Methylglutaronitril.

BEISPIEL 2 (VERGLEICHSBEISPIEL) 4-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)

Die in Beispiel 1 beschriebene Prozedur wurde unter Verwendung von Acidovorax facilis 72W (ATCC 55764)-Zellen wiederholt, die nicht bei 50°C für 1 Stunde vor dem Gefieren wärmebehandelt worden waren. Nach 1,0 Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten an 4-Cyanopentansäure und 2-Methylglutarsäure 62,7% bzw. 34,6% ohne zurückbleibendes 2-Methylglutaronitril.

BEISPIEL 3 4-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)

Zunächst wurden 1,136 g (Nasszellgewicht) gefrorene Acidovorax facilis 72W (ATCC 55764)-Zellen (zuvor wärmebehandelt bei 50°C für 1 Stunde vor dem Gefieren) in ein 50 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben, gefolgt von 21,6 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0). Nachdem die Zellen aufgetaut und suspendiert worden waren, wurde die resultierende Suspension zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das resultierende Zellpellet wurde erneut in einem Gesamtvolumen von 22,7 ml dieses gleichen Phosphat-Puffers suspendiert. In ein 15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen wurden 0,4355 g (0,458 ml, 4,00 mM, 0,403 M) 2-Methylglutaronitril eingewogen und anschließend 9,54 ml der A. facilis 72W (ATCC 55746)-Zellsuspension (0,477 g Nasszellgewicht) zugesetzt und die resultierende Suspension auf einer rotierenden Plattform bei 27°C gemischt. Es wurden Proben (0,300 ml) 1:4 mit destilliertem Wasser verdünnt und anschließend zentrifugiert und 0,180 ml des Überstandes in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (10 K MWCO) gegeben und mit 0,020 ml einer wässrigen Lösung von 0,750 M N-Methylpropionamid (HPLC, externe Standardlösung) gemischt. Es wurde ausreichend 1,0 M HCl zugesetzt, um den pH-Wert der Probe bis etwa 2,5 abzusenken, wonach die resultierende Lösung filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert wurde. Nach 4,0 Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten an 4-Cyanopentansäure und 2-Methylglutarsäure 99,4% bzw. 0,6% ohne zurückbleibendes 2-Methylglutaronitril.

BEISPIEL 4 4-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)

Die in Beispiel 3 beschriebene Prozedur wurde mit der Ausnahme wiederholt, dass 1,086 g (1,143 ml, 10,04 mM, zweiphasige Reaktion, 1,00 M Produkt) von 2-Methylglutaronitril mit 8,86 ml der wärmebehandelten A. facilis 72W (ATCC 55746)-Zellsuspension (0,443 g Nasszellgewicht) in einem 15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen auf einer rotierenden Plattform bei 27°C gemischt wurden. Es wurden Proben (0,300 ml) 1:10 mit destilliertem Wasser verdünnt und anschließend zentrifugiert und 0,180 ml des Überstandes in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (10 K MWCO) gegeben und mit 0,020 ml einer wässrigen Lösung von 0,750 M N-Methylpropionamid (HPLC, externe Standardlösung) gemischt. Es wurde ausreichend 1,0 M HCl zugesetzt, um den pH-Wert der Probe bis etwa 2,5 abzusenken, wonach die resultierende Lösung filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert wurde. Nach 15,25 Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten an 4-Cyanopentansäure und 2-Methylglutarsäure 98,7% bzw. 1,3% ohne zurückbleibendes 2-Methylglutaronitril.

BEISPIEL 5 4-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)

Die in Beispiel 1 beschriebene Prozedur wurde unter Verwendung einer Suspension von Acidovorax facilis-Mutantenstamm 72-PF-15 (ATCC 55747) wiederholt, die nicht bei 50°C für 1 Stunde wärmebehandelt wurde. Nach 3,0 Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten an 4-Cyanopentansäure und 2-Methylglutarsäure 96,8% bzw. 3,6% ohne zurückbleibendes 2-Methylglutaronitril.

BEISPIEL 6 4-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)

Die in Beispiel 3 beschriebene Prozedur wurde unter Verwendung einer Suspension von Acidovorax facilis-Mutantenstamm 72-PF-15 (ATCC 55747) wiederholt, die nicht bei 50°C für 1 Stunde wärmebehandelt wurde. Es wurde eine Mischung von 0,4355 g (0,458 ml, 4,00 mM, 0,403 M) 2-Methylglutaronitril und 9,54 ml der A. facilis-Mutantenstammes 72-PF-15-Zellsuspension (0,477g Nasszellgewicht) in einem 15 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen auf einer rotierenden Plattform bei 27°C gemischt. Nach 6,0 Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten an 4-Cyanopentansäure und 2-Methylglutarsäure 98,8% bzw. 1,2% ohne zurückbleibendes 2-Methylglutaronitril.

BEISPIEL 7 4-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)

Die in Beispiel 4 beschriebene Prozedur wurde unter Verwendung einer Suspension von Acidovorax facilis-Mutantenstamm 72-PF-15 (ATCC 55747) wiederholt, die nicht bei 50°C für 1 Stunde wärmebehandelt wurde. Es wurde eine Mischung von 1,086 g (1,143 ml, 10,04 mM, 1,0 M) 2-Methylglutaronitril und 8,86 ml der A. facilis-Mutantenstammes 72-PF-15 (ATCC 55747)-Zellsuspension (0,443g Nasszellgewicht) in einem 15 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen auf einer rotierenden Plattform bei 27°C gemischt. Nach 15,25 Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten an 4-Cyanopentansäure und 2-Methylglutarsäure 99,2% bzw. 0,8% ohne zurückbleibendes 2-Methylglutaronitril.

BEISPIEL 8 4-CYANOPENTANSÄURE-ABTRENNUNG

In einen 2 l-Erlenmeyerkolben, der mit einem Magnetrührstab ausgestattet war, wurden 150 g (Nasszellgewicht) gefrorene Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746) (nicht zuvor bei 50°C für 1 Stunde vor dem Gefrieren wärmebehandelt) eingewogen. Anschließend wurde Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) zu einem Gesamtvolumen von 1,50 l zugesetzt. Nachdem die Zellen aufgetaut und suspendiert worden waren, wurde die resultierende Suspension in einem Wasserbad für 1 Stunde bis 50°C erhitzt, anschließend bis 10°C in einem Eis/Wasserbad gekühlt, zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das resultierende Zellpellet wurde ein Mal durch erneute Suspension in 1,50 l des gleichen Phosphat-Puffers gewaschen, gefolgt von einer Zentrifugation. Das gewaschene Zellpellet wurde in einen mit einem Magnetrührstab ausgestatteten 4 l-Erlenmeyerkolben gegeben und anschließend in einem Gesamtvolumen von 2,5 l Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) suspendiert. Unter Rühren wurden 129,6 g (136,4 ml, 1,20 Mol, 0,400 M) 2-Methylglutaronitril zugesetzt und das Endvolumen auf 3,00 l mit dem gleichen Phosphat-Puffer eingestellt. Die Mischung wurde bei 25°C gerührt und Proben in regelmäßigen Abständen gezogen und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 21,5 Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten an 4-Cyanopentansäure (4-CPA) und 2-Methylglutarsäure 99,5% bzw. 0,5% ohne zurückbleibendes 2-Methylglutaronitril.

Das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert, das Zellpellet zur Wiederverwendung gewonnen und der resultierende Überstand dekantiert und unter Verwendung einer Amicon-2,5 l-Filtereinheit filtriert, die mit einem YM-10-Filter (10K MWCO) ausgestattet war. Das Filtrat wurde in einen 4,0 l Kolben gegeben und der pH-Wert der Lösung auf 2,5 mit 6 N HCl eingestellt. Zu der Lösung wurde anschließend Natriumchlorid unter Rühren bis zur Sättigung zugesetzt und sodann 1,0 l-Portionen der resultierenden Lösung mit 4 × 500 ml Ethylether extrahiert. Die vereinten Etherextrakte wurden getrocknet (MgSO4), filtriert und die Lösung durch Rotationsverdampfung bei vermindertem Druck auf 1,0 l eingeengt. Zu der Lösung wurden sodann 1,2 l Hexan und 0,200 ml Ethylether zugesetzt und die resultierende Lösung bis –78°C gekühlt. Der resultierende weiße kristalline Feststoff wurde durch schnelle Vakuumfiltration abgetrennt und mit 300 ml kaltem (5°C) Hexan gewaschen. Das restliche Lösemittel wurde unter hohem Vakuum (150 mTorr) entfernt, um 120,3 g (79% isolierte Ausbeute) an 4-Cyanopentansäure (Sp. 31,9° bis 32,6°C) zu ergeben.

BEISPIEL 9 4-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)

Das gewonnene Zellpellet aus Beispiel 8 wurde in mehreren aufeinanderfolgenden 3,0 l-Chargenreaktionen für die Hydrolyse von 2-Methylglutaronitril zu 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz wiederverwendet. Bei Konzentrationen des 2-Methylglutaronitrils oberhalb von 0,400 M wurde die Löslichkeit des Dinitrils in der wässrigen Zellsuspension überschritten und diese Reaktionen liefen als zweiphasige wässrige/organische Mischungen ab, bis das verbleibende 2-Methylglutaronitril in dem Reaktionsgemisch löslich war. In der nachfolgenden Tabelle sind die Endkonzentrationen von 4-CPA-Ammoniumsalz, das erzeugt wurde, und die prozentualen Ausbeuten an 4-CPA und 2-Methylglutarsäure zusammengestellt. Bezogen auf das Trockengewicht des Zellkatalysators (1 g Nassgewicht = 0,20 g Trockengewicht) wurden 86 g 4-CPA/g Trockengewicht Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746) erzeugt.

BEISPIEL 10 3-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)

Zuerst wurden 0,60 g (Nasszellgewicht) gefrorene Acidovorax facilis 72W (ATCC 55764) (zuvor wärmebehandelt bei 50°C für 1 Stunde vor dem Gefrieren) in ein 15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben, gefolgt von einer Zugabe von 10 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0). Nachdem die Zellen aufgetaut und suspendiert waren, wurde die resultierende Suspension zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das resultierende Zellpellet wurde erneut in einem Gesamtvolumen von 10 ml dieses gleichen Phosphat-Puffers suspendiert. In ein zweites 15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen wurden 0,1080 g (0,112 ml, 1,00 mM, 0,100 M) 2-Ethylsuccinonitril, 8,00 ml der A. facilis 72W-Zellsuspension (0,5 g Nasszellgewicht) zugesetzt, das Gesamtvolumen mit Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) auf 10,0 ml eingestellt und die resultierende Suspension auf einer rotierenden Plattform bei 27°C gemischt. Es wurden Proben (0,300 ml) abgezogen und zentrifugiert und anschließend 0,180 ml des Überstandes in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (0,22 Mikrometer) gegeben und mit 0,020 ml einer wässrigen Lösung von 0,750 M N-Methylpropionamid (HPLC, externe Standardlösung) gemischt. Die resultierende Lösung wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 1,0 Stunden betrug die HPLC-Ausbeuten an 3-Cyanopentansäure 100% ohne zurückbleibendes 2-Ethylsuccinonitril und ohne dass andere Nebenprodukte beobachtet wurden.

BEISPIEL 11 3-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)

Die in Beispiel 10 beschriebene Prozedur wurde wiederholt, indem 0,4337 g (0,449 ml, 4,01 mM, 0,401 M) 2-Ethylsuccinonitril und 8,00 ml der wärmebehandelten A. facilis 72W (ATCC 55746)-Zellsuspension (0,5 g Nasszellgewicht) in einem Gesamtvolumen von 10,0 ml (eingestellt mit Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0)) verwendet wurde. Es wurden Proben (0,100 ml) gezogen, mit Wasser auf 1:4 verdünnt und zentrifugiert; 0,180 ml Überstand sodann in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (0,22 Mikrometer) gegeben und mit 0,020 ml einer wässrigen Lösung von 0,750 M N-Methylpropionamid (HPLC, externe Standardlösung) gemischt. Die resultierende Lösung wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 8,0 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute an 3-Cyanopentansäure 100% ohne zurückbleibendes 2-Ethylsuccinonitril und ohne dass andere Nebenprodukte beobachtet wurden.

BEISPIEL 12 3-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)

Die in Beispiel 10 beschriebene Prozedur wurde wiederholt, indem 1,087 g (1,13 ml, 10,1 mM, zweiphasige Reaktion, 1,01 M Produkt) von 2-Ethylsuccinonitril und 8,00 ml der wärmebehandelten A. facilis 72W (ATCC 55746)-Zellsuspension (0,5 g Nasszellgewicht) in einem Gesamtvolumen von 10,0 ml (eingestellt mit Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0)) verwendet wurde. Es wurden Proben (0,100 ml) gezogen, mit Wasser auf 1:10 verdünnt und zentrifugiert; 0,180 ml Überstand sodann in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (0,22 Mikrometer) gegeben und mit 0,020 ml einer wässrigen Lösung von 0,750 M N-Methylpropionamid (HPLC, externe Standardlösung) gemischt. Die resultierende Lösung wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 71 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute an 3-Cyanopentansäure 100% ohne zurückbleibendes 2-Ethylsuccinonitril und ohne dass andere Nebenprodukte beobachtet wurden.

BEISPIEL 13 3-CYANOPENTANSÄURE-ABTRENNUNG

In einen mit einem Magnetrührstab ausgestatteten 4,0 l-Erlenmeyerkolben wurden 161 g gefrorene Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746)-Zellen (zuvor bei 50°C für 1 Stunde vor dem Gefrieren wärmebehandelt) und 1,60 l Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) bei 27°C gegeben. Die Zellen wurden unter Rühren aufgetaut und suspendiert und sodann 325 g (336,0 ml, 3,00 Mol) 2-Ethylsuccinonitril unter Rühren zugesetzt und das Gesamtvolumen der Mischung auf 2,40 l mit Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) eingestellt. Die resultierende Mischung wurde bei 27°C gerührt und Proben (0,100 ml) gezogen, mit Wasser auf 1:10 verdünnt und zentrifugiert, 0,180 ml des Überstandes in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (0,22 Mikrometer) gegeben und mit 0,020 ml einer wässrigen Lösung von 0,750 M N-Methylpropionamid (HPLC, externe Standardlösung) gemischt. Die resultierende Lösung wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 183 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute an 3-Cyanopentansäure 100% ohne zurückbleibendes 2-Ethylsuccinonitril und ohne dass andere Nebenprodukte beobachtet wurden. Das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert, das Zellpellet zur Wiederverwendung gewonnen und 2,3 1 des resultierenden Überstandes dekantiert und unter Verwendung einer Amicon-2,5 l-Filtereinheit filtriert, die mit einem YM-10-Filter (10K MWCO) ausgestattet war. Die Konzentration des 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalzes in dem Filtrat betrug 1,26 M.

Es wurde eine 300 ml-Portion des vorstehend beschriebenen Filtrats mit einem Gehalt von 1,26 M 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz auf pH 2,5 mit ca. 60 ml 6 N HCl eingestellt und anschließend mit Natriumchlorid gesättigt und mit 4 × 200 ml Ethylether extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösemittel durch Rotationsverdampfung bei vermindertem Druck und 28°C abgetrieben. Das resultierende leicht gelbe viskose Öl wurde unter hohem Vakuum (50 mTorr) gerührt, um restliches Lösemittel bei 28°C zu entfernen, wonach bis –20°C für 2 bis 3 Stunden gekühlt wurde, um 3-Cyanopentansäure als einen kristallinen weißen Feststoff zu erzeugen (45,9 g, 96% Ausbeute), Sp. 33,0° bis 34,0°C.

BEISPIEL 14 3-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)

Die in Beispiel 10 beschriebene Prozedur wurde unter Verwendung einer Suspension von Acidovoraz facilis-Mutanten-Bakterienstamm 72-PF-15 (ATCC 55747) wiederholt, die nicht bei 50°C wärmebehandelt worden waren. Nach 1,0 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute an 3-Cyanopentansäure 100% ohne zurückbleibendes 2-Ethylsuccinonitril und ohne dass andere Nebenprodukte beobachtet wurden.

BEISPIEL 15 3-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)

Die in Beispiel 14 beschriebene Prozedur wurde unter Verwendung von 0,4325 g (0,455 ml, 4,00 mM, 0,400 M) 2-Ethylsuccinonitril und 8,00 ml (0,5 g Nasszellgewicht) einer Suspension von Acidovorax facilis-Mutanten-Bakterienstamm 72-PF-15 (ATCC 55747), die nicht bei 50°C wärmebehandelt worden war, in einem Gesamtvolumen von 10,0 ml (eingestellt mit Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0)) verwendet wurden. Nach 25 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute an 3-Cyanopentansäure 100% ohne zurückbleibendes 2-Ethylsuccinonitril und ohne dass andere Nebenprodukte beobachtet wurden.

BEISPIEL 16 3-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)

Die in Beispiel 14 beschriebene Prozedur wurde wiederholt, indem 1,087 g (1,14 ml, 10,1 mM, zweiphasige Reaktion, 1,01 M Produkt) 2-Ethylsuccinonitril und 8,00 ml (0,5 g Nasszellgewicht) einer Suspension von Acidovorax facilis-Mutanten-Bakterienstamm 72-PF-15 (ATCC 55747), die nicht bei 50°C wärmebehandelt worden war, in einem Gesamtvolumen von 10,0 ml (eingestellt mit Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0)) verwendet wurden. Nach 71 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute an 3-Cyanopentansäure 76,6% mit 25,1% zurückbleibendem 2-Ethylsuccinonitril und ohne dass andere Nebenprodukte beobachtet wurden.

BEISPIEL 17 4-CYANO-4-PENTENSÄURE-ABTRENNUNG

In einen 500 ml-Erlenmeyerkolben, der mit einem Magnetrührstab ausgestattet war, wurden 50,0 g gefrorene Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746)-Zellen (zuvor bei 50°C für 1 Stunde vor dem Gefrieren wärmebehandelt) und 450 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) bei 27°C gegeben. Die Zellen wurden unter Rühren aufgetaut und suspendiert und anschließend zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wurde in einem Gesamtvolumen von 863 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) in einem 1,0 l-Kolben erneut suspendiert und anschließend 133 g (137,0 ml, 1,25 Mol) 2-Methylenglutaronitril unter Rühren bei 27°C zugesetzt. Bei Konzentrationen an 2-Methylenglutaronitril oberhalb von 0,400 Mol wurde die Löslichkeit des Nitrils in der wässrigen Zellsuspension überschritten, wobei diese Reaktionen als zweiphasige wässrige/organische Mischungen abliefen, bis das verbleibende 2-Methylenglutaronitril in dem Reaktionsgemisch löslich war. Es wurden Proben (0,100 ml) gezogen, auf 1:10 mit Wasser verdünnt und zentrifugiert und anschließend 0,150 ml des Überstandes in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (0,22 Mikrometer) gegeben und mit 0,150 ml einer wässrigen Lösung von 0,150 M N-Methylpropionamid (HPLC, externe Standardlösung) gemischt. Die resultierende Lösung wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 26 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute an 4-Cyano-4-pentensäure 100% ohne zurückbleibendes 2-Methylenglutaronitril und ohne dass andere Nebenprodukte beobachtet wurden. Das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert, das Zellpellet zur Wiederverwendung gewonnen und der Überstand unter Verwendung einer Amicon-2,5 l-Filtereinheit filtriert, die mit einem YM-10-Filter (10K MWCO) ausgestattet war. Die Endkonzentration des 4-Cyano-4-pentensäure-Ammoniumsalzes in dem Filtrat betrug 1,298 M.

Es wurde eine 100 ml-Portion des Filtrats mit einem Gehalt des vorstehend beschriebenen Produktgemisches von 4-Cyano-4-pentensäure-Ammoniumsalz auf pH 2,7 mit 6 N HCl eingestellt und anschließend mit Natriumchlorid gesättigt und mit 4 × 100 ml Ethylether extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Volumen der vereinten Extrakte mit Hilfe der Rotationsverdampfung bei vermindertem Druck und 28°C auf 100ml reduziert. Zu der Etherlösung wurden 200 ml Hexan zugesetzt und die resultierende Lösung bis –78°C gekühlt. Der resultierende weiße Feststoff, der sich auskristallisierte, wurde durch rasche Vakuumfiltration abgetrennt und mit 100 ml kaltem (5°C) Hexan gewaschen. Das restliche Lösemittel wurde unter hohem Vakuum (150 mTorr) abgetrieben, um 9,80 g (60%) isolierte Ausbeute an 4-Cyano-4-pentensäure (Sp. 26,5° bis 27,0°C, aufbewahrt bei –20°C) zu ergeben.

BEISPIEL 18 4-CYANO-4-PENTENSÄURE (AMMONIUMSALZ)

Das aus Beispiel 17 (Acidovorax facilis 72W (ATCC 557646)-Zellen) gewonnene Zellpellet wurde in einer zweiten aufeinanderfolgenden 1,0 l-Charge von Reaktionen für die Hydrolyse von 2-Methylenglutaronitril zu 4-Cyano-4-pentensäure-Ammoniumsalz wiederverwendet. Bei Konzentrationen an 2-Methylenglutaronitril oberhalb von 0,400 Mol wurde die Löslichkeit des Nitrils in der wässrigen Zellsuspension überschritten, wobei diese Reaktionen als zweiphasige wässrige/organische Mischungen abliefen, bis das verbleibende 2-Methylenglutaronitril in dem Reaktionsgemisch löslich war. Das Zellpellet wurde in einem Gesamtvolumen von 781 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) in einem 1,0 l-Kolben erneut suspendiert und sodann 212 g (219,0 ml, 2,00 Mol) 2-Methylenglutaronitril unter Rühren bei 27°C zugesetzt. Es wurden Proben (0,100 ml) gezogen, mit Wasser auf 1:20 verdünnt und zentrifugiert und anschließend 0,150 ml des Überstandes in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (0,22 Mikrometer) gegeben und mit 0,150 ml einer wässrigen Lösung von 0,150 M N-Methylpropionamid (HPLC, externe Standardlösung) gemischt. Die resultierende Lösung wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 53 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute an 4-Cyano-4-pentensäure 100% ohne zurückbleibendes 2-Methylenglutaronitril und ohne dass andere Nebenprodukte beobachtet wurden.

BEISPIEL 19 3-CYANOPROPANSÄURE (AMMONIUMSALZ)

Zuerst wurden 0,50 g (Nasszellgewicht) gefrorene Acidovorax facilis 72W (ATCC 55764) (zuvor wärmebehandelt bei 50°C für 1 Stunde vor dem Gefrieren) in ein 15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben, gefolgt von einer Zugabe von 10 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0). Nachdem die Zellen aufgetaut und suspendiert waren, wurde die resultierende Suspension zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das resultierende Zellpellet wurde erneut in einem Gesamtvolumen von 10 ml dieses gleichen Phosphat-Puffers suspendiert. In ein zweites 15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen wurden 0,3236 g (4,00 mM, 0,400 M) Succinonitril in einem Gesamtvolumen von 8,00 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) aufgelöst und anschließend 2,00 ml der A. facilis 72W (ATCC 55746)-Zellsuspension (0,10 g Nasszellgewicht) zugesetzt und die resultierende Suspension auf einer rotierenden Plattform bei 27°C gemischt. Es wurden Proben (0,100 ml) gezogen, mit Wasser auf 1:4 verdünnt und zentrifugiert und anschließend 0,150 ml des Überstandes in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (0,22 Mikrometer) gegeben und mit 0,015 ml 0,1 M HCl und 0,150 ml einer wässrigen Lösung von 0,100 M Propansäure (HPLC, externe Standardlösung) gemischt. Die resultierende Lösung wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 3,0 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute an 3-Cyanopentansäure 100% ohne zurückbleibendes Succinonitril und ohne dass andere Nebenprodukte beobachtet wurden.

BEISPIEL 20 3-CYANOPROPANSÄURE-ABTRENNUNG

In einen 500 ml-Erlenmeyerkolben, der mit einem Magnetrührstab ausgestattet war, wurden 20,0 g gefrorene Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746)-Zellen (zuvor bei 50°C für 1 Stunde vor dem Gefrieren wärmebehandelt) und 200 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) bei 27°C gegeben. Die Zellen wurden unter Rühren aufgetaut und suspendiert und anschließend zentrifugiert und der Überstand verworfen. Diese Waschprozedur wurde wiederholt. Das resultierende Zellpellet wurde erneut in einem Gesamtvolumen von 1,00 1 Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) mit einem Gehalt von 101,1 g (1,25 Mol, 1,25 M) Succinonitril suspendiert und die resultierende Mischung in einem 1 l-Kolben gemischt, der in ein Wasserbad bei 27°C gesetzt wurde. Es wurden Proben (0,100 ml) gezogen, auf 1:10 mit Wasser verdünnt und zentrifugiert und anschließend 0,150 ml des Überstandes in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (0,22 Mikrometer) gegeben und mit 0,015 ml 0,1 M HCl und 0,150 ml einer wässrigen Lösung einer 0,100 M Propansäure (HPLC, externe Standardlösung) gemischt. Die resultierende Lösung wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 1,0 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute an 3-Cyanopropansäure und Succinsäure 99,7% bzw. 0,3% ohne zurückbleibendes Succinonitril. Das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert und der Überstand unter Verwendung einer Amicon-2,5 l-Filtereinheit filtriert, die mit einem YM-10-Filter (10K MWCO) ausgestattet war. Die Endkonzentration von 3-Cyanopropansäure-Ammoniumsalz in dem Filtrat betrug 1,31 M.

Es wurde eine 200 ml-Portion des Filtrats, das das vorstehend beschriebene Produktgemisch von 3-Cyanopropansäure-Ammoniumsalz enthielt, mit 6 N HCl auf pH 2,5 eingestellt und anschließend mit Natriumchlorid gesättigt und mit 4 × 200 ml Ethylether extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösemittel durch Rotationsverdampfung bei vermindertem Druck abgetrieben. Das resultierende farblose Öl wurde in 150 ml Ethylether aufgelöst und anschließend 100 ml Hexan zugesetzt und die resultierende Lösung bis –78°C gekühlt. Der resultierende weiße Feststoff, der auskristallisierte, wurde mit Hilfe der Vakuumfiltration abgetrennt und restliches Lösemittel unter hohem Vakuum (150 mTorr) abgetrieben, um 14,32 g (55% isolierte Ausbeute) an 3-Cyanopropansäure (Fp. 49,5° bis 51,0°C) zu ergeben.

BEISPIEL 21 4-CYANOBUTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)

Zuerst wurden 0,50 g (Nasszellgewicht) gefrorene Acidovorax facilis 72W (ATCC 55764) (zuvor wärmebehandelt bei 50°C für 1 Stunde vor dem Gefrieren) in ein 15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben, gefolgt von einer Zugabe von 10 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0). Nachdem die Zellen aufgetaut und suspendiert waren, wurde die resultierende Suspension zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das resultierende Zellpellet wurde erneut in einem Gesamtvolumen von 10 ml dieses gleichen Phosphat-Puffers suspendiert. In ein zweites 15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen wurden 0,3830 g (4,03 mM, 0,400 M) Glutaronitril in einem Gesamtvolumen von 6,00 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) gegeben und anschließend 4,00 ml der A. facilis 72W (ATCC 55746)-Zellsuspension (0,20 g Nasszellgewicht) zugesetzt und die resultierende Suspension auf einer rotierenden Plattform bei 27°C gemischt. Es wurden Proben (0,100 ml) gezogen, mit Wasser auf 1:4 verdünnt und zentrifugiert und anschließend 0,150 ml des Überstandes in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (0,22 Mikrometer) gegeben und mit 0,015 ml 0,1 M HCl und 0,150 ml einer wässrigen Lösung von 0,150 M Kaliumacetat (HPLC, externe Standardlösung) gemischt. Die resultierende Lösung wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 4,0 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute an 4-Cyanobutansäure und Glutarsäure 85,1% bzw. 8,2% mit 5,7% zurückbleibendem Glutaronitril.

BEISPIEL 22 4-CYANOBUTANSÄURE-ABTRENNUNG

In einen 250 ml-Erlenmeyerkolben, der mit einem Magnetrührstab ausgestattet war, wurden 15,0 g gefrorene Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746)-Zellen (zuvor bei 50°C für 1 Stunde vor dem Gefrieren wärmebehandelt) und 135 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) bei 27°C gegeben. Die Zellen wurden unter Rühren aufgetaut und suspendiert und anschließend zentrifugiert und der Überstand verworfen. Diese Waschprozedur wurde wiederholt. Das resultierende Zellpellet wurde erneut in einem Gesamtvolumen von 100 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) suspendiert und diese Zellsuspension in einen 500 ml-Kolben gegeben, der einen Magnetrührstab enthielt, 42,78 g (0,450 Mol) Glutaronitril und 157,2 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0). Die resultierende Mischung, die 1,5 M Glutaronitril enthielt, wurde bei 27°C gerührt. Es wurden Proben (0,100 ml) gezogen, auf 1:10 mit Wasser verdünnt und zentrifugiert. Anschließend wurden 0,200 ml des Überstandes in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (0,22 Mikrometer) gegeben und mit 0,020 ml 0,1 M HCl und 0,200 ml einer wässrigen Lösung von 0,150 M Kaliumacetat (HPLC, externe Standardlösung) gemischt. Die resultierende Lösung wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 4,0 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute an 4-Cyanobutansäure-Ammoniumsalz und Glutarsäure-Diammoniumsalz 92,3% bzw. 7,7% ohne zurückbleibendes Glutaronitril.

Das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert und der Überstand unter Verwendung einer Amicon-2,5 l-Filtereinheit filtriert, die mit einem YM-10-Filter (10K MWCO) ausgestattet war. Das Filtrat, welches das vorstehend beschrieben Produktgemisch von 4-Cyanobutansäure-Ammoniumsalz enthielt, wurde mit 6 N HCl auf pH 3,5 eingestellt und anschließend mit Natriumchlorid gesättigt und mit 4 × 300 ml Ethylether extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösemittel durch Rotationsverdampfung bei vermindertem Druck abgetrieben, gefolgt von einem Rühren unter Vakuum (100 mTorr), um 35,3 g (62% Ausbeute) an 4-Cyanobutansäure als ein blassgelbes Öl zu ergeben, das beim Stehen auskristallisierte. Der Feststoff wurde aus 1:1 Ethylacetat/Hexan bei 5°C umkristallisiert (Fp. 39,6° bis 40,2°C).

BEISPIEL 23 5-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)

Zuerst wurden 2,0 g (Nasszellgewicht) gefrorene Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D (ATCC 55744)-Zellen (zuvor wärmebehandelt bei 50°C für 1 Stunde vor dem Gefrieren) in ein 50 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben, gefolgt von einer Zugabe von 30 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0). Nachdem die Zellen aufgetaut und suspendiert waren, wurde die resultierende Suspension zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das resultierende Zellpellet wurde erneut in einem Gesamtvolumen von 30 ml dieses gleichen Phosphat-Puffers suspendiert. In ein zweites 15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen wurden 0,1085 g (0,114 ml, 1,00 mM, 0,100 M) Adiponitril eingewogen und anschließend 9,29 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) und 0,60 ml der Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D (ATCC 55744)-Zellsuspension (0,040 g Nasszellgewicht) zugesetzt und die resultierende Suspension auf einer rotierenden Plattform bei 27°C gemischt. Es wurden Proben (0,300 ml) gezogen und zentrifugiert und anschließend 0,180 ml, des Überstandes in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (10 K MWCO) gegeben und mit 0,020 ml einer wässrigen Lösung von 0,750 M N-Ethylacetamid (HPLC, externe Standardlösung) und ausreichend 1,0 M HCl gemischt, um den pH-Wert der Probe auf etwa pH 2,5 abzusenken. Die resultierende Lösung wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 5,0 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute an 5-Cyanopentansäure, Adipaminsäure, Adipamid und Adipinsäure 96,6%, 1,7%, 1,4% und 0,3% ohne zurückbleibendes Adiponitril.

BEISPIEL 24 5-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)

Die in Beispiel 23 beschriebene Prozedur wurde wiederholt, indem 0,4338 g (0,457 ml, 4,01 mM, 0,401 M) Adiponitril und 3,00 ml der wärmebehandelten Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D (ATCC 55744)-Zellsuspension (0,20 g Nasszellgewicht) in einem Gesamtvolumen von 10,0 ml (eingestellt mit Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0)) verwendet wurden. Es wurden Proben (0,100 ml) gezogen, mit Wasser auf 1:4 verdünnt und zentrifugiert und anschließend 0,180 ml des Überstandes in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (10 K MWCO) gegeben und mit 0,020 ml einer wässrigen Lösung von 0,750 M N-Ethylacetamid (HPLC, externe Standardlösung) und ausreichend 1,0 M HCl gemischt, um den pH-Wert der Probe auf etwa pH 2,5 abzusenken. Die resultierende Lösung wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 5,0 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute an 5-Cyanopentansäure, Adipaminsäure, Adipamid und Adipinsäure 94,0%, 4,0%, 0,6% und 1,4% ohne zurückbleibendes Adiponitril.

BEISPIEL 25 5-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)

Die in Beispiel 23 beschriebene Prozedur wurde wiederholt, indem 1,084 g (1,14 ml, 10,0 mM, zweiphasige Reaktion, 1,00 M Produkt) Adiponitril und 7,5 ml der wärmebehandelten Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D (ATCC 55744)-Zellsuspension (0,50 g Nasszellgewicht) in einem Gesamtvolumen von 10,0 ml (eingestellt mit Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0)) verwendet wurden. Es wurden Proben (0,100 ml) gezogen, mit Wasser auf 1:10 verdünnt und zentrifugiert und anschließend 0,180 ml des Überstandes in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (10 K MWCO) gegeben und mit 0,020 ml einer wässrigen Lösung von 0,750 M N-Ethylacetamid (HPLC, externe Standardlösung) und ausreichend 1,0 M HCl gemischt, um den pH-Wert der Probe auf etwa pH 2,5 abzusenken. Die resultierende Lösung wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 24,0 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute an 5-Cyanopentansäure, Adipaminsäure, Adipamid und Adipinsäure 90,0%, 4,2%, 0,0% und 5,7% ohne zurückbleibendes Adiponitril.

BEISPIEL 26 5-CYANOPENTANSÄURE-ABTRENNUNG

In einen 2 l-Erlenmeyerkolben, der mit einem Magnetrührstab ausgestattet war, wurde eine Suspension von 4,0 g Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D (ATCC 55744)-Zellen (zuvor bei 50°C für 1 Stunde wärmebehandelt) in 1,72 1 Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) bei 27°C gegeben. Anschließend wurden unter Rühren zu der Suspension 270,4 g (284,3 ml, 2,5 Mol, etwa 1,25 M Produkt-Endkonzentration) Adiponitril gegeben und die resultierende Mischung bei 27°C gerührt. Es wurden Proben (0,200 ml) gezogen, auf 1:5 mit Wasser verdünnt und zentrifugiert und anschließend 0,200 ml des Überstandes in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (10 K MWCO) gegeben und ausreichend 1,0 M HCl zugesetzt, um den pH-Wert der Probe bis etwa pH 2,5 abzusenken. Die resultierende Lösung wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 63 Stunden verlangsamte sich die Hydrolysereaktion deutlich, so dass zusätzlich 10,0 g des gleichen mikrobiellen Zellkatalysators der Mischung zugesetzt wurden. Nach 86 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute an 5-Cyanopentansäure, Adipaminsäure, Adipamid und Adipinsäure 88,2%, 4,7%, 6,6% und 0,0% ohne zurückbleibendes Adiponitril. Das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert und der Überstand unter Verwendung einer Amicon 2,5 l-Filtereinheit filtriert, die mit einem YM-10-Filter (10K MWCO) ausgestattet war.

Es wurde eine 200 ml-Portion des Filtrats, das das vorstehend beschriebene Produktgemisch von 5-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (1,13 M) enthielt, mit 6 N HCl auf pH 2,5 eingestellt, anschließend mit Natriumchlorid gesättigt und mit 4 × 200 ml Ethylether extrahiert. Die vereinten Etherextrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösemittel durch Rotationsverdampfung bei vermindertem Druck abgetrieben. Der verbleibende Ether wurde durch Rühren der farblosen Flüssigkeit bei Raumtemperatur unter hohem Vakuum (60 mTorr) für 5 Stunden abgetrieben, um 27,32 g (95% isolierte Ausbeute) an 5-Cyanopentansäure zu ergeben. Die 5-Cyanopentansäure wurde sodann unter Vakuum (75 mTorr) bei 110° bis 112°C ohne Zersetzung destilliert.

BEISPIEL 27 5-METHYL-2-PIPERIDON AUS 4-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ

In einen 100 ml-Messzylinder wurden 54,4 ml einer wässrigen Reaktionsmischung mit einem Gehalt von 1,85 M 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (0,1 M 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz, erzeugt durch enzymatische Hydrolyse von 2-Methylglutaronitril; Beispiel 9, filtrierte Produktmischung aus Reaktion #5) gegeben und anschließend 12,9 ml konzentriertes Ammoniumhydroxid (29,3% NH3, 0,2 M NH3) zugesetzt und das Endvolumen auf 100 ml mit destilliertem Wasser eingestellt. Die Endkonzentrationen an 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz und zugesetztem Ammoniumhydroxid betrugen 1,0 M bzw. 2,0 M. Zu der resultierenden Lösung wurden 0,631 g (5 Gew.% 4-Cyanopentansäure) Raney Nickel mit Chrom-Promotor (Grace Davison Raney® 2400 Active Metal Catalyst) zugesetzt und die resultierende Mischung in einen 300 ml 314 SS-Rührautoklav, Engineers EZE-Seal gegeben, der mit einem Dispersimax® Turbinenimpeller ausgestattet war. Nach dem Spülen des Reaktors mit Stickstoff wurden die Inhaltsstoffe des Reaktors bei 1.000 U/min gerührt und bei 160°C unter 500 psig Überdruck mit Wasserstoff für 3 Stunden erhitzt. Nach dem Kühlen bis Raumtemperatur zeigte die gaschromatographische Analyse des abschließenden Reaktionsgemisches eine Ausbeute von 96,4% an 5-Methyl-2-piperidon ohne zurückbleibendes 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz.

Das Produktgemisch wurde zur Entfernung des Katalysators filtriert und anschließend mit 6 N HCl auf pH 6,0 eingestellt und mit Natriumchlorid gesättigt. Die resultierende Lösung wurde 5 Mal mit 100 ml Dichlormethan extrahiert und die vereinten organischen Extrakte über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösemittel durch Rotationsverdampfung unter vermindertem Druck abgetrieben, um ein farbloses Öl zu ergeben. Nach Entfernung des verbleibenden Lösemittels unter Vakuum (0,1 mmHg) kristallisierte das Öl unter Erzeugung eines weißen Feststoffes aus, der aus 150 ml Ethylether bei –78°C umkristallisiert wurde, um 6,69 g (59% isolierte Ausbeute) an 5-Methyl-2-piperidon (Fp. 55,5° bis 56,2°C) zu ergeben.

BEISPIEL 28 5-METHYL-2-PIPERIDON AUS 4-CYANOPENTANSÄURE

Die in Beispiel 27 beschriebene Reaktion wurde unter Verwendung von 12,71 g (0,100 Mol) kristalline 4-Cyanopentansäure (von der in Beispiel 8 beschriebenen Abtrennung) und 19,34 ml konzentriertes Ammoniumhydroxid (29,3% NH3, 0,3 Mol NH3) und zwar in einem Gesamtvolumen von 100 ml verwendet worden. Die Endkonzentrationen von 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz und Ammoniak betrugen 1,0 M bzw. 2,0 M. Die Analyse der abschließenden Reaktionsmischung mit Hilfe der Gaschromatographie zeigte 91,1% Ausbeute an 5-Methyl-2-piperidon ohne zurückbleibende 4-Cyanopentansäure.

BEISPIEL 29 5-METHYL-2-PIPERIDON AUS 4-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ

Es wurden Hydrierungen von 5 ml wässrigen Reaktionsgemischen mit einem Gehalt von 1,0 M 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (filtriertes Produktgemisch aus Beispiel 9, Reaktion #5), Null bis 3,0 M Ammoniumhydroxid und 5 Gew.% oder 10 Gew.% (bezogen auf das Gewicht der 4-Cyanopentansäure) eines Hydrierungskatalysators, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Raney Nickel-Katalysator mit Chrom-Promotor (Raney 2400), 5% Palladium-auf-Kohlenstoff, 10% Palladium-auf-Kohlenstoff, 5% Ruthenium-auf-Aluminiumoxid oder 10% Ruthenium-auf-Aluminiumoxid, die in Glasröhrchen bei 500 psig Überdruck Wasserstoffgas entweder bei 160° oder 180°C ausgeführt wurden, auf die Erzeugung des entsprechenden Lactam 5-Methyl-2-piperidon (5-MPPD) untersucht:

BEISPIEL 30 4-ETHYLPYRROLIDIN-2-ON AUS 3-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ

In einen 100 ml-Messzylinder wurden 79,4 ml einer wässrigen Reaktionsmischung mit einem Gehalt von 1,26 M 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (0,1 M 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz, erzeugt durch enzymatische Hydrolyse von 2-Ethylsuccinonitril; filtriertes Produktgemisch von Beispiel 13) gegeben und anschließend 12,9 ml konzentriertes Ammoniumhydroxid (29,3% NH3, 0,2 M NH3) zugesetzt und das Endvolumen auf 100 ml mit destilliertem Wasser eingestellt. Die Endkonzentrationen an 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz und zugesetztem Ammoniumhydroxid betrugen 1,0 M bzw. 2,0 M. Zu der resultierenden Lösung wurden 0,631 g (5 Gew.%/Gew.% 3-Cyanopentansäure) Raney Nickel mit Chrom-Promotor (Grace Davison Raney® 2400 Active Metal Catalyst) zugesetzt und die resultierende Mischung in einen 300 ml 314 SS-Rührautoklav, Engineers EZE-Seal gegeben, der mit einem Dispersimax® Turbinenimpeller ausgestattet war. Nach dem Spülen des Reaktors mit Stickstoff wurden die Inhaltsstoffe des Reaktors bei 1.000 U/min gerührt und bei 160°C unter 500 psig Überdruck mit Wasserstoff für 4 Stunden erhitzt. Nach dem Kühlen bis Raumtemperatur zeigte die Analyse des fertigen Reaktionsgemisches mit Hilfe der Gaschromatographie eine Ausbeute von 90,7% 4-Ethylpyrrolidin-2-on ohne zurückbleibendes 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz

BEISPIEL 31 4-ETHYLPYRROLIDIN-2-ON AUS 3-CYANOPENTANSÄURE

Die in Beispiel 30 beschriebene Reaktion wurde wiederholt, indem 12,71 g (0,100 Mol) kristalline 3-Cyanopentansäure (von der in Beispiel 13 beschriebenen Abtrennung) und 19,34 ml konzentriertes Ammoniumhydroxid (29,3% NH3, 0,3 Mol NH3) und zwar in einem Gesamtvolumen von 100 ml verwendet worden. Die Endkonzentrationen von 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz und zugesetztem Ammoniumhydroxid betrugen 1,0 M bzw. 2,0 M. Die Analyse der fertigen Reaktionsmischung (2 Stunden Reaktionsdauer) anhand der Gaschromatographie zeigte eine Ausbeute von 92,1% 4-Ethylpyrrolidin-2-on ohne zurückbleibende 3-Cyanopentansäure.

Das Produktgemisch wurde zur Entfernung des Katalysators filtriert und anschließend mit 6 N HCl auf pH 7,0 eingestellt und mit Natriumchlorid gesättigt. Die resultierende Lösung wurde 4 Mal mit 100 ml Dichlormethan extrahiert und die vereinten organischen Extrakte über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösemittel durch Rotationsverdampfung unter vermindertem Druck abgetrieben, um ein farbloses Öl zu ergeben. Nach Entfernung des verbleibenden Lösemittels unter Vakuum (0,1 mmHg) wurde das Öl in 150 ml Ethylether aufgelöst, das danach bis –78°C gekühlt wurde. Nach 1 Stunde wurde der weiße Feststoff, der auskristallisiert war, durch Vakuumfiltration aufgenommen, um insgesamt 8,96 g (79% isolierte Ausbeute) an 4-Ethylpyrrolidin-2-on (Fp. 40,5° bis 41,5°C) zu ergeben.

BEISPIEL 32 4-ETHYLPYRROLIDIN-2-ON AUS 3-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ

Die in Beispiel 30 beschriebene Reaktion wurde exakt entsprechend der Beschreibung mit der Ausnahme wiederholt, dass die eingesetzte Temperatur für die Hydrierung 140°C betrug. Die Analyse der fertigen Reaktionsmischung (4 Stunden Reaktionsdauer) anhand der Gaschromatographie zeigte eine Ausbeute von 87,2% an 4-Ethylpyrrolidin-2-on ohne zurückbleibende 3-Cyanopentansäure.

BEISPIEL 33 4-ETHYLPYRROLIDIN-2-ON AUS 3-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ

Die in Beispiel 30 beschriebene Reaktion wurde exakt entsprechend der Beschreibung mit der Ausnahme wiederholt, dass 1,262 g (10 Gew.%/Gew.% 3-Cyanopentansäure) Raney Nickel mit Chrom-Promotor (Grace Davison Raney® 2400 Active Metal Catalyst) eingesetzt wurden. Die Analyse der fertigen Reaktionsmischung (1,5 Stunden Reaktionsdauer) anhand der Gaschromatographie zeigte eine Ausbeute von 91,0% an 4-Ethylpyrrolidin-2-on ohne zurückbleibende 3-Cyanopentansäure.

BEISPIEL 34 4-ETHYLPYRROLIDIN-2-ON AUS 3-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ (TEMPERATURABHÄNGIGKEIT)

Es wurden Hydrierungen von 5 ml wässrigen Reaktionsgemischen mit einem Gehalt von 1,0 M 3-Cyanopentansäure (3-CPA)-Ammoniumsalz (filtriertes Produktgemisch aus Beispiel 13), 2,0 M Ammoniumhydroxid und 5 Gew.% oder 10 Gew.% Raney Nickel-Katalysator mit Chrom-Promotor (Raney 2400) (bezogen auf das Gewicht der 3-Cyanopentansäure), die in Glasschüttelröhrchen bei 500 psig Überdruck Wasserstoffgas und bei Temperaturen von 70° bis 180°C für 2 Stunden ausgeführt wurden, anschließend mit Hilfe der Hochdruckflüssigchromatogaphie auf Umwandlung von 3-CPA und mit Hilfe der Gaschromatographie auf Erzeugung von 4-Ethylpyrrolidin-2-on analysiert:

BEISPIEL 35 4-ETHYLPYRROLIDIN-2-ON AUS 3-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ (NH4OH-KONZENTRATIONSABHÄNGIGKEIT)

Es wurden Hydrierungen von 5 ml wässrigen Reaktionsgemischen mit einem Gehalt von 1,0 M 3-Cyanopentansäure (3-CPA)-Ammoniumsalz (filtriertes Produktgemisch aus Beispiel 13), von mit Null bis 3,0 M Ammoniumhydroxid und 5 Gew.% Raney Nickel-Katalysator mit Chrom-Promotor (Raney 2400) (bezogen auf das Gewicht der 3-Cyanopentansäure), die in Glasschüttelröhrchen bei 500 psig Überdruck Wasserstoffgas und bei Temperaturen von 160° oder 180°C für 2 Stunden ausgeführt wurden, anschließend mit Hilfe der Hochdruck-Flüssigchromatographie auf Umwandlung von 3-CPA und mit Hilfe der Gaschromatographie auf Erzeugung von 4-Ethylpyrrolidin-2-on analysiert:

BEISPIEL 36 4-ETHYLPYRROLIDIN-2-ON AUS 3-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ (3-CPA-KONZENTRATIONSABHÄNGIGKEIT)

Es wurden Hydrierungen von 5 ml wässrigen Reaktionsgemischen mit einem Gehalt von 1,0 M, 1,5 M oder 2,0 M 3-Cyanopentansäure (3-CPA) (isoliert aus dem filtrierten Produktgemisch aus Beispiel 13) und 2,0 M, 3,0 M oder 4,0 M Ammoniumhydroxid unter Verwendung von 5,0 Gew.% Raney Nickel-Katalysator mit Chrom-Promotor (Raney 2400) (bezogen auf das Gewicht der 3-Cyanopentansäure), die in Glasschüttelröhrchen bei 500 psig Überdruck Wasserstoffgas und bei Temperaturen von 160° oder 180°C für 2 Stunden ausgeführt wurden, anschließend mit Hilfe der Hochdruck-Flüssigchromatographie auf Umwandlung von 3-CPA und mit Hilfe der Gaschromatographie auf Erzeugung von 4-Ethylpyrrolidin-2-on analysiert:

BEISPIEL 37 CAPROLACTAM AUS 5-CYANOPENTANSÄURE-AMMONNMSALZ

Es wurden Hydrierungen von 5 ml wässrigen Reaktionsgemischen mit einem Gehalt von 1,0 M 5-Cyanopentansäure (5-CPA)-Ammoniumsalz (hergestellt aus der enzymatischen Hydrolyse von Adiponitril; filtriertes Produktgemisch aus Beispiel 26) Null M bis 2,5 M Ammoniumhydroxid und 5 Gew.% Raney Nickel-Katalysator mit Chrom-Promotor (Raney 2400) (bezogen auf das Gewicht der 5-Cyanopentansäure), die in Glasschüttelröhrchen bei 500 psig Überdruck Wasserstoffgas und bei Temperaturen von 70° bis 160°C für 2 Stunden ausgeführt wurden, anschließend mit Hilfe der Hochdruck-Flüssigchromatographie auf Umwandlung von 5-CPA und mit Hilfe der Gaschromatographie auf Erzeugung von Caprolactam analysiert:

Der Ringschluss des Ammoniumsalzes von 6-Aminocapronsäure (6-ACA) in den wässrigen Produktgemischen, die durch Hydrierung von 5-CPA-Ammoniumsalz bei 70°C (entsprechend der vorstehenden Beschreibung) hergestellt wurden, wurden bei einer höheren Temperatur versucht auszuführen, indem zuerst der Hydrierungskatalysator durch Filtration entfernt wurde und anschließend die etwa 1,0 M 6-ACA-Ammoniumsalz-Reaktionsgemische bei 280°C für 2 Stunden erhitzt wurden:

BEISPIEL 38 1,5-DIMETHYL-2-PIPERIDON AUS 4-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ

Es wurden Hydrierungen von 5 ml wässrigen Reaktionsgemischen mit einem Gehalt von 1,0 M 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (filtriertes Produktgemisch aus Beispiel 9, Reaktion #5) 3,0 M Methylamin und 5 Gew.% oder 10 Gew.% (bezogen auf das Gewicht von 4-Cyanopentansäure) eines Hydrierungskatalysators, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Raney Nickel-Katalysator mit Chrom-Promotor (Raney 2400), 5% Palladium-auf-Kohlenstoff, 5% Palladium-auf-Aluminiumoxid, 5% Ruthenium-auf-Aluminiumoxid oder 4,5% Palladium/0,5% Platin-auf-Kohlenstoff in Glasschüttelröhrchen bei 500 psig Überdruck Wasserstoffgas und bei 160°C für 2 Stunden ausgeführt, anschließend auf die Erzeugung von 1,5-Dimethyl-2-piperidon (5-DMPD) und 5-Methyl-2-piperidon (5-MPPD) analysiert:

BEISPIEL 39 1,5-DIMETHYL-2-PIPERIDON AUS 4-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ

Es wurden Hydrierungen von 5 ml wässrigen Reaktionsgemischen mit einem Gehalt von 1,0 M 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (filtriertes Produktgemisch aus Beispiel 9, Reaktion #5), 1,0 M bis 3,0 M Methylamin und 5 Gew.% (bezogen auf das Gewicht von 4-Cyanopentansäure) von 5% Palladium-auf-Kohlenstoff in Glasschüttelröhrchen bei 500 psig Überdruck Wasserstoffgas und bei 140°C für 2 Stunden ausgeführt und anschließend auf die Erzeugung von 1,5-Dimethyl-2-piperidon (5-DMPD), 5-Methyl-2-piperidon (5-MPPD) und 2-Methylglutarsäure (2-MGA) analysiert:

BEISPIEL 40 1,5-DIMETHYL-2-PIPERIDON AUS 4-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ

Es wurden Hydrierungen von 5 ml wässrigen Reaktionsgemischen mit einem Gehalt von 1,0 M 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (filtriertes Produktgemisch aus Beispiel 9, Reaktion #5), 1,0 M bis 4,0 M Methylamin und 5 Gew.% (bezogen auf das Gewicht von 4-Cyanopentansäure) von 5% Palladium-auf-Kohlenstoff in Glasschüttelröhrchen bei 500 psig Überdruck Wasserstoffgas und bei 160°C für 2 Stunden ausgeführt und anschließend auf die Erzeugung von 1,5-Dimethyl-2-piperidon (5-DMPD), 5-Methyl-2-piperidon (5-MPPD) und 2-Methylglutarsäure (2-MGA) analysiert:

BEISPIEL 41 1,5-DIMETHYL-2-PIPERIDON AUS 4-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ

Es wurden Hydrierungen von 5 ml wässrigen Reaktionsgemischen mit einem Gehalt von 1,0 M 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (filtriertes Produktgemisch aus Beispiel 9, Reaktion #5), 3,0 M bis 4,0 M Methylamin und 5 Gew.% (bezogen auf das Gewicht von 4-Cyanopentansäure) entweder 5% Palladium-auf-Kohlenstoff oder 4,5% Palladium/0,5% Platin-auf-Kohlenstoff in Glasschüttelröhrchen bei 500 psig Überdruck Wasserstoffgas und bei 180°C für 2 Stunden ausgeführt und anschließend auf die Erzeugung von 1,5-Dimethyl-2-piperidon (5-DMPD), 5-Methyl-2-piperidon (5-MPPD) und 2-Methylglutarsäure (2-MGA) analysiert:

BEISPIEL 42 1,5-DIMETHYL-2-PIPERIDON AUS 4-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ

In einen 100 ml-Messzylinder wurden 54,4 ml einer wässrigen Reaktionsmischung mit einem Gehalt von 1,84 M 4-Cyanopentansäure-Annnoniumsalz (0,1 Mol 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz, erzeugt durch enzymatische Hydrolyse von 2-Ethylsuccinonitril; filtriertes Produktgemisch von Beispiel 13) gegeben und anschließend 17,2 ml 40 gew.%iges Methylamin (6,21 g Methylamin, 0,2 Mol) zugesetzt und das Endvolumen auf 100 ml mit destilliertem Wasser eingestellt. Die abschließenden Konzentrationen von 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz und Methylamin betrugen 1,0 M bzw. 2,0 M. Zu der resultierenden Lösung wurden 0,636 g (5 Gew.%/Gew.% 3-Cyanopentansäure) von 5% Pd-auf-Kohlenstoff-Pulver zugegeben und die resultierende Mischung in einen 300 ml-Rührautoklav 314 SS Engineers EZE-Seal gegeben, der mit einem Dispersimax® Turbinenimpeller ausgestattet war. Nach dem Spülen des Reaktors mit Stickstoff wurden die Inhaltsstoffe des Reaktors bei 1.000 U/min gerührt und bei 140°C unter 500 psig Überdruck Wasserstoffgas für 4 Stunden erhitzt. Es wurden Proben (etwa 1,5 ml) mit Hilfe eines Probenahmeröhrchens im Verlaufe der Reaktion zur Analyse entnommen: Nach dem Kühlen bis Raumtemperatur zeigte die Analyse des abschließenden Reaktionsgemisches anhand der Gaschromatographie eine Ausbeute von 69,8% 4-Ethyl-1-methylpyrrolidin-2-on und eine Ausbeute von 20,4% an 4-Ethylpyrrolidin-2-on ohne zurückbleibendes 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz

Das Produktgemisch (61 ml nach der Probenahme) wurde zur Entfernung des Katalysators filtriert und anschließend mit 6 N HCl auf pH 7,0 eingestellt und mit Natriumchlorid gesättigt. Die resultierende Lösung wurde 4 Mal mit 100 ml Ethylether extrahiert und die vereinten organischen Extrakte über Magnesiumsulfat filtriert und das Lösemittel durch Rotationsverdampfung unter vermindertem Druck abgetrieben, um eine farblose Flüssigkeit zu ergeben. Die Flüssigkeit wurde bei 3,5 mmHg destilliert und die bei 70,0° bis 71,5°C siedende Fraktion aufgenommen, um 4,65 g (60% isolierte Ausbeute) an 1,5-Dimethyl-2-piperidon (5-DMPD) zu ergeben.

BEISPIEL 43 1,5-ETHYL-1-METHYLPYRROLIDON-2-ON AUS 3-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ

In einen 100ml-Messzylinder wurden 79,4 ml einer wässrigen Reaktionsmischung mit einem Gehalt von 1,26 M 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (0,1 Mol 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz, erzeugt durch enzymatische Hydrolyse von 2-Ethylsuccinonitril; Beispiel 13 als filtriertes Produktgemisch) gegeben und anschließend 17,2 ml 40gew.%iges Methylamin (6,21 g Methylamin, 0,2 Mol) zugesetzt und das Endvolumen auf 100 ml mit destilliertem Wasser eingestellt. Die abschließenden Konzentrationen von 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz und Methylamin betrugen 1,0 M bzw. 2,0 M. Zu der resultierenden Lösung wurden 0,636 g (5 Gew.%/Gew.% 3-Cyano-4-pentansäure) 5%Palladium-auf-Kohlepulver zugesetzt und das resultierende Gemisch in einen 300 ml-Rührautoklav "Engineers EZE-Seal" aus 314 SS gegeben, der mit einem Dispersimax® Turbinenimpeller ausgestattet war. Nach dem Spülen des Reaktors mit Stickstoff wurden die Inhaltsstoffe des Reaktors bei 1.000 U/min gerührt und bei 140°C unter 500 psig Überdruck Wasserstoffgas für 4 Stunden erhitzt. Es wurden Proben mit dem Probenahmerohr im Verlaufe der Reaktion zur Analyse entnommen (etwa 1,5 ml). Nach dem Kühlen bis Raumtemperatur zeigte die Analyse des abschließenden Reaktionsgemisches anhand der Gaschromatographie eine Ausbeute von 69,8% 4-Ethyl-1-methylpyrrolidin-2-on und eine Ausbeute von 20,4% an 4-Ethylpyrrolidin-2-on ohne zurückbleibendes 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz.

Das Produktgemisch (80 ml nach der Probenahme) wurde zur Entfernung des Katalysators filtriert und anschließend mit 6 N HCl auf pH 7,0 eingestellt und mit Natriumchlorid gesättigt. Die resultierende Lösung wurde 4 Mal mit 100 ml Dichlormethan extrahiert und die vereinten organischen Extrakte über Magnesiumsulfat getrocknet, filtiert und das Lösemittel durch Rotationsverdampfung unter vermindertem Druck abgetrieben, um eine farblose Flüssigkeit zu ergeben. Die Flüssigkeit wurde bei 16 mm Hg fraktioniert, destilliert und die bei 100,0° siedende Fraktion aufgenommen (5,15 g, 51% Ausbeute). Das resultierende 4-Ethyl-1-methyl-pyrrolidin-2-on enthielt <5% 4-Ethylpyrrolidin-2-on als Verunreinigung, so dass die Flüssigkeit erneut bei 40 mm Hg destilliert wurde und die bei 128°C siedende Fraktion aufgenommen wurde, um 3,71 g (37% isolierte Ausbeute) an 4-Ethyl-1-methylpyrrolidin-2-on (4-EMPRD) zu ergeben.

BEISPIEL 44 5-METHYL-2-PIPERIDON AUS 4-CYANO-4-PENTENSÄURE-AMMONIUMSALZ

Im einen 100 ml-Messzylinder wurden 77,0 ml einer wässrigen Reaktionsmischung mit einem Gehalt von 1,30 M 4-Cyano-4-pentensäure-Anunoniumsalz (0,1 Mol 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz, erzeugt durch enzymatische Hydrolyse von 2-Methylenglutaronitril; Beispiel 17) gegeben und anschließend 12,9 ml konzentriertes Ammoniumhydroxid (29,3% NH3, 0,2 Mol NH3) zugesetzt und das Endvolumen auf 100 ml mit destilliertem Wasser eingestellt. Die abschließenden Konzentrationen von 4-Cyano-4-pentensäure-Ammoniumsalz und zugesetztem Ammoniumhydroxid betrugen 1,0 M bzw. 2,0 M. Zu der resultierenden Lösung wurden 0,626 g (5 Gew.%/Gew.% 4-Cyano-4-pentensäure) Raney Nickel mit Chrom-Promotor (Grace Davison Raney® 2400 Active Metal Catalyst) zugesetzt und das resultierende Gemisch in einen 300 ml-Rührautoklav 314 SS Engineers EZE-Seal gegeben, der mit einem Dispersimax® Turbinenimpeller ausgestattet war. Nach dem Spülen des Reaktors mit Stickstoff wurden die Inhaltsstoffe des Reaktors bei 1.000 U/min gerührt und bei 50°C unter 500 psig Überdruck Wasserstoffgas für 5 Stunden erhitzt und anschließend für weitere 3 Stunden bei 160°C. Nach dem Kühlen bis Raumtemperatur zeigte die Analyse des abschließenden Reaktionsgemisches anhand der Gaschromatographie eine Ausbeute von 85,0% 5-Methyl-2-piperidon ohne zurückbleibendes 4-Cyano-4-pentensäure-Ammoniumsalz

BEISPIEL 45 2-PYRROLIDINON AUS 3-CYANOPROPANSÄURE-AMMONIUMSALZ

In einen 100 ml-Messzylinder wurden 75,8 ml einer wässrigen Reaktionsmischung mit einem Gehalt von 1,31 M 3-Cyanopropansäure-Ammoniumsalz (0,1 Mol 3-Cyanopropansäure-Ammoniumsalz, erzeugt durch enzymatische Hydrolyse von Succinonitril, Beispiel 20) gegeben und anschließend 19,4 ml konzentriertes Ammoniumhydroxid (29,3% NH3, 0,3 Mol NH3) zugesetzt und das Endvolumen auf 100 ml mit destilliertem Wasser eingestellt. Die abschließenden Konzentrationen von 3-Cyanopropansäure-Ammoniumsalz und zugesetztem Ammoniumhydroxid betrugen 1,0 M bzw. 3,0 M. Zu der resultierenden Lösung wurden 0,99 g (10 Gew.%/Gew.% 3-Cyanopropansäure) von Raney Nickel mit Chrom-Promotor (Grace Davison Raney 2400 Active Metal Catalyst) zugesetzt und das resultierende Gemisch in einen 300 ml-Rührautoklav 314 SS Engineers EZE-Seal gegeben, der mit einem Dispersimax® Turbinenimpeller ausgestattet war. Nach dem Spülen des Reaktors mit Stickstoff wurden die Inhaltsstoffe des Reaktors bei 1.000 U/min gerührt und bei 70°C unter 500 psig Überdruck Wasserstoffgas für 4,5 Stunden erhitzt und anschließend für weitere 5 Stunden bei 81°C. Die Analyse anhand der Gaschromatographie zeigte eine Ausbeute von 91,0% 2-Pyrrolidinon ohne zurückbleibendes 3-Cyanopropansäure-Ammoniumsalz.

BEISPIEL 46 2-PIPERIDON AUS 4-CYANOBUTANSÄURE-AMMONIUMSALZ

Die in Beispiel 22 beschriebene Prozedur wurde wiederholt. Nach 4,0 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute an 4-Cyanobutansäure-Ammoniumsalz und Glutarsäure-Diammoniumsalz 91,7% bzw. 7,5% ohne zurückbleibendes Glutaronitril. Die abschließende Konzentration von 4-Cyanobutansäure-Ammoniumsalz in dem zentrifugierten und filtrierten Reaktionsgemisch betrug 1,42 M. Es wurden in einen 100 ml-Messzylinder 70,6 ml (0,100 Mol 4-Cyanobutansäure-Ammoniumsalz) des filtrierten wässrigen Reaktionsgemisches gegeben und anschließend 19,4 ml konzentriertes Ammoniumhydroxid (29,3% NH3, 0,3 Mol NH3) zugesetzt und das Endvolumen auf 100 ml mit destilliertem Wasser eingestellt. Die abschließenden Konzentrationen an 4-Cyanopropansäure-Ammoniumsalz und zugesetztem Ammoniumhydroxid betrugen 1,0 M bzw. 3,0 M. Zu der resultierenden Lösung wurden 1,13 g (10 Gew.%/Gew.% 4-Cyanobutansäure) Raney Nickel mit Chrom-Promotor (Grace Davison Raney® 2400 Active Metal Catalyst) zugesetzt und das resultierende Gemisch in einen 300 ml-Rührautoklav 314 SS-Autoklav Engineers EZE-Seal gegeben, der mit einem Dispersimax Turbinenimpeller ausgestattet war. Nach dem Spülen des Reaktors mit Stickstoff wurden die Inhaltsstoffe des Reaktors bei 1.000 U/min gerührt und bei 70°C unter 500 psig Überdruck Wasserstoffgas für 3,5 Stunden erhitzt. Die Analyse anhand der Gaschromatographie zeigte eine Ausbeute von 29,7% 2-Piperidon ohne zurückbleibendes 4-Cyanobutansäure-Ammoniumsalz. Die Temperatur wurde für weitere 2 Stunden bis 180°C erhöht und die anschließende Analyse einer Probe mit Hilfe der Gaschromatographie zeigte eine Ausbeute von 93,5% 2-Pyrrolidinon.

BEISPIEL 47 5-METHYL-2-PIPERIDON AUS 4-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ

Es wurden 50 ml einer wässrigen Mischung mit einem Gehalt von 1,85 M 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (0,1 Mol 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz, hergestellt mit Hilfe der enzymatischen Hydrolyse von 2-Methylglutaronitril, Beispiel 9, filtriertes Produktgemisch aus Reaktion #5), 5,6 g 29%iges wässriges Ammoniumhydroxid und 44 ml deionisiertes Wasser in einen 300 ml Rührautoklav geladen. Zu dieser Lösung wurden 0,73 g (3 Gew.% bezogen auf 4-Cyanopentansäure) von 4,5% Pd/0,5% Pt-auf-Kohlenstoff-Katalysator zugesetzt. Der Autoklav wurde verschlossen und drei Mal mit Wasserstoff gespült, gefolgt von einem Erhitzen unter 100 psig Überdruck Wasserstoff bis 160°C und langsamem Rühren. Bei 160°C wurde der Druck bis 800 psig Überdruck erhöht und mit einem Maximum an Rühren begonnen. Nach 3 Stunden wurde der Reaktor gekühlt, belüftet und mit Stickstoff gespült. Die gaschromatographische Analyse des Produktgemisches zeigte eine Umwandlung von 96% an 4-Cyanopentansäure und eine Ausbeute von 95,5% (99,5% Selektivität) an 5-Methyl-2-piperidon.

BEISPIEL 48 1,5-DIMETHYL-2-PIPERIDON AUS 4-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ

Es wurden 100 ml einer wässrigen Mischung mit einem Gehalt von 1,85 M 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (0,2 Mol 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz, hergestellt mit Hilfe der enzymatischen Hydrolyse von 2-Methylglutaronitril, Beispiel 9, filtriertes Produktgemisch aus Reaktion #5) und 14 g (0,2 Mol) 40%iges wässriges Methylamin in einen 300 ml Autoklaven geladen. Zu dieser Lösung wurde 4,5% Pd/0,5% Pt-auf-Kohlenstoff-Katalysator zugesetzt. Der Autoklav wurde verschlossen und drei Mal mit Wasserstoff gespült, gefolgt von einem Erhitzen des Reaktionsgemisches unter 100 psig Überdruck Wasserstoff und langsamem Rühren. Bei Reaktionstemperatur wurde der Druck erhöht und mit einem Maximum an Rühren begonnen. Nach einer vorgegebenen Reaktionsdauer wurde der Reaktor gekühlt, belüftet und mit Stickstoff gespült. Die gaschromatographische Analyse des Produktgemisches von mehreren Durchläufen unter verschiedenen Reaktionsbedingungen ist nachfolgend zusammengestellt:

BEISPIEL 49 1,5-DIMETHYL-2-PIPERIDON AUS 4-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ

Es wurden Hydrierungen von 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz in 5 ml-Glasschüttelröhrchen bei 800 psig Überdruck unter Verwendung verschiedener Pd-auf-Kohlenstoff-Katalysatoren ausgeführt. Es wurden 4 ml der 1,85 M (7 mM) wässrigen 5-Cyanopentansäure (filtriertes Produktgemisch von Beispiel 9, Reaktion #5), 0,88 g (11,4 mM) 40%iges Methylamin und ein Katalysator aus der Gruppe, bestehend aus 5% Pd/C und 4,5% Pd/0,5% Pt/C in das Röhrchen geladen und 3 Stunden umgesetzt. Die gaschromatographische Analyse der Produktgemische nach dem Kühlen bis 25°C bei unterschiedlichen Reaktionsbedingungen ist nachfolgend zusammengestellt:


Anspruch[de]
Isolierte Mikroorganismen, gekennzeichnet durch eine aliphatische Nitrilase-Aktivität und ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acidovorax facilis 72W mit der Zugangsnummer ATCC 55746, Acidovorax facilis 72W-PF-15 mit der Zugangsnummer ATCC 55747 und Acidovorax facilis 72W-PF-17 mit der Zugangsnummer ATCC 55745. Isolierte Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D mit der Zugangsnummer ATCC 55744, gekennzeichnet durch eine Kombination von Nitrilhydratase-und Amidase-Aktivitäten.






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