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Dokumentenidentifikation DE69834404T2 12.04.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001003508
Titel ANTIMUTAGENMITTEL
Anmelder The Grassetti Family Trust, Jamestown, Calif., US
Erfinder Grassetti, R., Davide, deceased, US
Vertreter WUESTHOFF & WUESTHOFF Patent- und Rechtsanwälte, 81541 München
DE-Aktenzeichen 69834404
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 05.08.1998
EP-Aktenzeichen 989407861
WO-Anmeldetag 05.08.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/US98/16262
WO-Veröffentlichungsnummer 1999007368
WO-Veröffentlichungsdatum 18.02.1999
EP-Offenlegungsdatum 31.05.2000
EP date of grant 03.05.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.04.2007
IPC-Hauptklasse A61K 31/455(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61P 35/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Hintergrund der Erfindung 1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Inhibition von mutagenen Effekten von Karzinogenen und insbesondere die Verwendung der Verbindung 6,6'-Dithiodinicotinsäure in der Herstellung eines Medikamentes zum Inhibieren der Aktivität des Enzyms Poly(ADP-Ribose)-Polymerase zum Inhibieren des Auftretens von mutationsverursachtem Krebs in einem Menschen.

2. Hintergrund der Erfindung

Mutationen finden in zellulärer DNA unter dem Effekt von Ultraviolettlicht, Infrarotlicht, Röntgenstrahlen, ionisierender Strahlung und Chemikalien statt. Es wird allgemein anerkannt, dass die meisten Mutationen zu Krebs führen.

Das Enzym Poly(ADP-Ribose)-Polymerase (ADPRP) stand im Verdacht, eine regulatorische Rolle bei vielen zellulären Aktivitäten zu spielen, einschließlich DNA-Reparatur, Differenzierung und maligner Transformation. Untersuchungen von Inhibitoren von ADPRP haben Beweise für die Bedeutung von ADPRP in diesen zellulären Aktivitäten erbracht (M.J. Suto et al., 1991, Drugs of the Future, 16: 723 – 739). Viele Analoge von Nicotinamid, ein Produkt der Wirkung von ADPRP auf NAD, sind untersucht worden, in der Hoffnung, eine Verbindung zu finden, welche die Aktivität von ADPRP modulieren könnte. Es wäre wünschenswert, einen selektiven Inhibitor von ADPRP zu finden, welcher die maligne Transformation von humanen Zellen inhibieren könnte (ebenda).

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist festgestellt worden, dass 6,6'-Dithiodinicotinsäure einen antimutagenen Effekt besitzt. Die Anwendung der Erfindung basiert auf der Feststellung, dass 6,6'-Dithiodinicotinsäure ein nützliches Mittel für die Verhinderung von Mutationen ist, von denen die meisten zu Krebs führen.

Die Anwendung der Erfindung umfasst das Behandeln eines menschlichen Subjekts zum Inhibieren der mutagenen Effekte von Karzinogenen. Die Anwendung beinhaltet die Verabreichung einer Zusammensetzung an das Subjekt, welche eine ausreichende Menge an 6,6'-Dithiodinicotinsäure umfasst, um die Aktivität von Poly(ADP-Ribose)-Polymerase zu inhibieren, um dadurch die mutagenen Effekte, und insbesondere ihre karzinogenen Effekte, zu inhibieren. In einem anderen Aspekt beinhaltet die Erfindung ein Medikament zum Inhibieren des Auftretens von Mutationen und von Mutationen abgeleiteten Krebsarten, und beinhaltet die Verabreichung einer Zusammensetzung, welche eine ausreichende Menge an 6,6'-Dithiodinicotinsäure umfasst, an ein Subjekt.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung Allgemeine Beschreibung und Definitionen

Die Ausführung der vorliegenden Erfindung wird, es sei denn, es ist anderweitig angegeben, herkömmliche Molekular- und Zellbiologie, Zellkultur, Biochemie und organische und medizinisch-chemische Synthese innerhalb des Kenntnisstands auf dem Gebiet anwenden. Derartige Techniken sind in der Literatur vollständig erläutert; siehe Cancer Chemotherapy: Principles and Practice, Hrsg.: B.A. Chabner, J.M. Collins, Phil., Lippincott Publ., 1990; Cancer: Principles and Practice of Oncology; Hrsg.: de Vita, Jr., V.T., Hellman, S., und Rosenberg, S.A., Lippincott Co., Philadelphia, 1993; The Chemotherapy Source Book, Hrsg.: Perry, M.C., Williams and Wilkins Publ., Baltimore, 1991). Silverman, Richard B., The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, Academic Press, Inc. NY (1992); Smith, Michael B., Organic Synthesis, McGraw Hill, Inc., NY, (1994)).

Im Fachgebiet sind Verfahren zum Bestimmen therapeutisch wirksamer Mengen der in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Verbindungen allgemein bekannt. Derartige Verfahren beinhalten die Analyse der pharmazeutischen/pharmakokinetischen Parameter in einer Anti-Krebs- oder Antitumor-Therapie, d.h. zum Inhibieren des Wachstums von kanzerösen Tumoren (Wedge, S.R., Porteus, J.K., Newlands, E.S., Cancer Chemother. Pharmacol. (1997) 40: 266 – 272; Legha, S.S., Seminar in Oncology, (1997) 24: 54-24-31; Motzer, R.J., Vogelzang, N.J., Chemotherapy for Renal Cell Carcinoma, In: Raghaven, D., Scher, H.I., Leibel, S.A., et al. (Hrsg.) Principles and Practice of Genitourinary Oncology, Lippincott-Raven Publ., Philadelphia, S. 885 – 96, 1997; Bloom, H.J.; Medroxyprogesterone acetate (Provera) in the treatment of metastatic renal cancer, Br. J. Cancer (1971) 25: 250 – 65).

Die vorliegende Erfindung zeigt, dass in Gegenwart von 6,6'-Dithiodinicotinsäure der mutagene Effekt von karzinogenen Chemikalien, welche beispielhaft veranschaulicht werden durch Benzo-[a]-pyren, 2-Aflatoxin und 2-Aminofluoren, in großem Maße vermindert wird.

6,6'-Dithiodinicotinsäure (Carboxypyridindisulfid (CPDS) (D.R. Grassetti, 1986, Drugs of the Future, 11(7): 559 – 61) verhindert bekanntermaßen Metastasen in Mäusen (Grassetti, D.R., 1970, Nature 228: 282).

Die Beispiele 1, 2 und 3 führen Experimente auf, in welchen die antimutagenen Effekte von 6,6'-Dithiodinicotinsäure beobachtet wurden. Diese Experimente wurden mit einem mutanten Stamm von Salmonella typhimurium-Bakterien T-100 ausgeführt. Als die Zellen an variierende Mengen an Benzo-[a]-pyren, 2-Aflatoxin oder 2-Aminofluoren exponiert wurden, wurde eine Anzahl von Kolonien (mutant) gebildet. Als 6,6'-Dithiodinicotinsäure in der Kultur, vor der Zugabe von Karzinogen, vorhanden war, verringerte sich die Anzahl von Mutanten um etwa 70 %.

Wie im nachstehenden Beispiel 4 gezeigt, basiert die Anwendung der vorliegenden Erfindung auf der Feststellung, dass 6,6'-Dithiodinicotinsäure die Aktivität von Poly(ADP-Ribose)-Polymerase (ADPRP) inhibierte. Die Inhibition von ADPRP ist nützlich zum Blockieren der mutagenen Effekte von Karzinogenen (Suto und Suto (1991), Drugs of the Future, 16(8): 723 – 739). Es versteht sich, dass 6,6'-Dithiodinicotinsäure Alkalimetallsalze und Alkylester einschließt.

Die vorliegende Erfindung sieht eine pharmazeutische Zusammensetzung vor, welche eine wirksame Menge an 6,6'-Dithiodinicotinsäure in reiner Form oder als ein pharmazeutisch annehmbares Rohkonzentrat in Assoziation mit einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst. Solche Zusammensetzungen enthalten zweckmäßigerweise weniger als 1 Gew.-% und vorzugsweise 0,2 Gew.-% an 6,6'-Dithiodinicotinsäure und beinhalten die Verabreichung von wenigstens 0,1 mg/Kilo Körpergewicht an 6,6'-Dithiodinicotinsäure. Die Zusammensetzungen können durch herkömmliche Techniken hergestellt werden, so dass sie in herkömmlichen Formen vorliegen, beispielsweise Kapseln, Tabletten, Suppositorien, dispergierbare Pulver, Sirupe, Elixiere, Suspensionen oder Lösungen für eine enterale oder parenterale Verabreichung. Geeignete pharmazeutische Verdünnungsmittel oder Träger schließen, zum Beispiel Wasser, Alkohole, natürliche oder gehärtete Öle und Wachse, Calcium- und Natriumcarbonate, Kalziumphosphat, Kaolin, Talkum und Laktose sowie geeignete Konservierungsmittel, wie Ethyl-p-hydroxybenzoat, Suspendiermittel wie Methylzellulose, Traganth und Natriumalginat, Benetzungsmittel wie Lecithin, Polyoxyethylenstearat und Polyoxyethylensorbitanmonooleat, Granulierungs- und Zerfallsmittel, wie Stärke und Alginsäure, Bindemittel wie Stärke, Gelatine und Akazia und Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Stearinsäure und Talkum ein, um eine elegante und schmackhafte pharmazeutische Präparation bereitzustellen. Zusammensetzungen in Tablettenform können durch herkömmliche Techniken beschichtet werden, um die Zersetzung der Tablette und Absorption des aktiven Bestandteils im Magen-Darm-Trakt zu verzögern und dadurch eine anhaltende Wirkung über eine lange Zeitperiode bereitzustellen. Andere Verbindungen und Verfahren, welche im Fachgebiet zum Verzögern der Zersetzung oder für die zeitverzögerte oder zeitabgemessene Zuführung der aktiven Bestandteile bekannt sind, finden ebenfalls Verwendung bei der Formulierung der aktiven Bestandteile zur Verwendung in den Verfahren der Erfindung. Zum Beispiel kann 6,6'-Dithiodinicotinsäure auch mit Liposomen oder anderen Trägermitteln mit verzögerter Freisetzung kombiniert werden, um die Verbindungen vor Zersetzung zu schützen, bis sie ihre Ziele erreichen, und/oder die Bewegung der Verbindungen durch Gewebebarrieren zu erleichtern.

Die bevorzugten Zusammensetzungen vom Standpunkt der Einfachheit der Verabreichung sind feste Zusammensetzungen, insbesondere Feststoff-gefüllte Gelatinekapseln oder Tabletten.

Die hier getesteten Karzinogene sind stellvertretend für die Karzinogene, welche einen hauptsächlichen Teil von Luftverschmutzungsstoffen bilden, die durch Tabakrauch, die Auspuffrauchgase von Verbrennungsmotoren, neben anderen Quellen, verursacht werden.

Es ist beobachtet worden, dass 6,6'-Dithiodinicotinsäure keine toxische Verbindung ist. Sie kann in Dosen von wenigstens ungefähr 0,1 Gramm je Tag für unbegrenzte Zeitdauern eingenommen werden. Dies erfüllt die Anforderungen für ein nichttoxisches, kostengünstiges chemopräventives Mittel, welches oral verabreicht werden könnte.

Legenden zu den Tabellen 1, 2, 3

Der Effekt von 6,6'-Dithiodinicotinsäure (0,3 mg/Platte, in 0,2 M Natriumbicarbonat), welches jeder Platte im Ames-Test zugegeben wurde, bei welchem es sich um einen reversen Mutationsassay handelt (Ames, B.N., et al., 1975, Mutation Research 31: 347), mit Salmonella typhimurium-Bakterien T-100, wurde untersucht. Die 6,6'-Dithiodinicotinsäure wurde jeder Platte eine Stunde vor der Zugabe des Karzinogens zugesetzt. Die in den Tabellen berichteten Ergebnisse repräsentieren die Durchschnittswerte (Anzahl von Kolonien je Platte) von 3 einzelnen Bestimmungen.

BEISPIEL 4 INHIBITION VON ADPRP DURCH 6,6'-DITHIODINICOTINSÄURE

ADPRP wurde unter Anwendung des Verfahrens von Khan und Shall (Biochem. Soc. Transactions 4: 778 (1976)) mit verschiedenen Modifikationen aus Schweine-Thymus hergestellt. Die Enzymaktivität war ungefähr linear bis zu 15 – 20 Minuten mit einer NAD-Substrat-Konzentration von 25 &mgr;M. Die typische Maximum-Enzymaktivität betrug ungefähr 0,003 nMol gebildetes Produkt/Minute in dem Assay (d. h. ungefähr 0,1 % verwertetes Substrat). Die KM belief sich ungefähr auf 25 &mgr;M.

Unter Anwendung einer Standard-Assay-Mischung, welche 2 mM Dithiothreitol (DTT) und 100 &mgr;M Rohenzym/ml Inkubation enthielt, wurden drei Experimente durchgeführt, wobei 6,6'-Dithiodinicotinsäure bei Konzentrationen zugegeben wurde, variierend von 5 &mgr;g/ml bis 600 &mgr;g/ml (d.h. 1/60stel Mol-Äquivalent an DTT zu 2 Mol-Äquivalenten). Eine signifikante und spezifische Inhibition von ADPRP durch 6,6'-Dithiodinicotinsäure wurde bei 50 &mgr;g/ml bei einer nahezu vollständigen Inhibition bei 150 &mgr;g/ml und darüber (d. h. 0,5 Mol-Äquivalente an DTT und darüber) beobachtet. Keine Inhibition wurde bei 5 und 25 &mgr;g/ml beobachtet. Die Zugabe von überschüssigem DTT zu einer Inkubation, welche 150 &mgr;g/ml 6,6'-Dithiodinicotinsäure enthielt, erhöhte nicht das Ausmaß der Umwandlung von Substrat zu gebundenem Produkt.

Dieses sind die Werte für individuelle Inkubationen, welche bei entweder 7,5, 15 oder 20 Minuten gestoppt wurden. Diese Ergebnisse weisen daraufhin, dass 6,6'-Dithiodinicotinsäure ein effektiver Inhibitor von ADPRP ist, was die Basis der Zusammensetzung der Erfindung zur Behandlung eines menschlichen Subjekts bildet, um mutagene Effekte von Karzinogenen zu inhibieren, wobei die Zusammensetzung eine ausreichende Menge an 6,6'-Dithiodinicotinsäure (oder Derivate davon) umfasst, um die Aktivität von ADPRP in den Subjekten zu inhibieren, damit die mutagenen Effekte der Karzinogene inhibiert werden.


Anspruch[de]
Verwendung von 6,6'-Dithiodinikotinsäure in der Herstellung eines Medikamentes zur Prävention von Mutationen, die zu Krebs führen. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die 6,6'-Dithiodinikotinsäure in einer Menge von mindestens 0,1 mg/kg Körpergewicht zu verabreichen ist.






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