PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69834432T2 12.04.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001051434
Titel G-PROTEIN GEKOPPELTER REZEPTOR
Anmelder National Research Council of Canada, Ottawa, Ontario, CA
Erfinder AHMAD, Sultan AstraZeneca R&D Montreal, St. Laurent, Quebec H4S 1Z9, CA;
BANVILLE, Denis, Ste-Dorothee, Quebec H7X 3K4, CA;
FORTIN, Yves, Montreal, Quebec H3R 2E2, CA;
LEMBO, Paola AstraZeneca R&D Montreal, St. Laurent, Quebec H4S 1Z9, CA;
O'DONNELL, Dajan AstraZeneca R&D Montreal, St. Laurent, Quebec H4S 1Z9, CA;
SHEN, Shi-Hsiang, Beaconsfield, Quebec H9W 1C2, CA
Vertreter derzeit kein Vertreter bestellt
DE-Aktenzeichen 69834432
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 16.12.1998
EP-Aktenzeichen 989646146
WO-Anmeldetag 16.12.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/SE98/02348
WO-Veröffentlichungsnummer 1999032519
WO-Veröffentlichungsdatum 01.07.1999
EP-Offenlegungsdatum 15.11.2000
EP date of grant 03.05.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.04.2007
IPC-Hauptklasse C07K 14/72(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liegt auf dem allgemeinen Gebiet biologischer Rezeptoren sowie der verschiedenen Verwendungen, für die solche Rezeptoren eingesetzt werden können. Insbesondere betrifft die Erfindung Nukleinsäuren, die für neuartige G-Protein-gekoppelte Rezeptoren codieren, sowie die Rezeptoren per se.

Hintergrund und Stand der Technik

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden eine Familie von Proteinen, die eine gemeinsame strukturelle Anordnung teilen, die durch ein extrazelluläres N-terminales Ende, sieben hydrophobe Alpha-Helices, die mutmaßlich Transmembrandomänen bilden, sowie eine intrazelluläre C-terminale Domäne gekennzeichnet ist. GPCRs binden viele verschiedene Liganden, die über die Aktivierung transduzierender G-Proteine intrazelluläre Signale auslösen. (Caron, et al., Rec. Prog. Horm. Res. 48:277–290 (1993); Freedman et al., Rec. Prog. Horm. Res. 51:319–353 (1996)).

Mehr als 300 GPCRs wurden bislang kloniert, wobei allgemein angenommen wird, daß weit über 1000 derartige Rezeptoren existieren. Mechanistisch gesehen wirken ungefähr 50–60% aller klinisch relevanten Arzneistoffe über die Modulation der Funktionen verschiedener GPCRs (Cudermann, et al., J. Mol. Med. 73:51–63 (1995)). Von besonderem Interesse sind Rezeptoren, die in dorsalen Wurzelganglien lokalisiert sind. Dieser Bereich des zentralen Nervensystems enthält in dichter Anordnung primäre oder afferente sensible Neuronen, die an der Übertragung, Modulation und Empfindung von Schmerzen beteiligt sind. Somit können Rezeptoren aus diesem Bereich in Tests zur Identifizierung neuer Mittel für die Anästhesie und Analgesie verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung eines neuartigen G-Protein-gekoppelten Rezeptors, der sich von bereits bekannten Rezeptoren hinsichtlich der Struktur und seiner bevorzugten Expression in dorsalen Wurzelganglien unterscheidet. Ein dorsaler Wurzelrezeptor (DRR [Dorsal Root Receptor]) konnte aus der Ratte und sechs aus dem Menschen isoliert und sequenziert werden. Der Rezeptor aus der Ratte wurde mit rDRR-1 bezeichnet, und seine Aminosäuresequenz ist als SEQ ID NO:1 dargestellt. Die menschlichen Rezeptoren wurden mit

hDRR-1 (SEQ ID NO:3);

hDRR-2 (SEQ ID NO:5);

hDRR-3 (SEQ ID NO:7);

hDRR-4 (SEQ ID NO:9);

hDRR-5 (SEQ ID NO:11); und

hDRR-6 (SEQ ID NO:13) bezeichnet.

Falls nicht anders angegeben, bezieht sich der Begriff „DRR", wie er hier verwendet wird, auf alle Rezeptoren sowohl des Menschen als auch der Ratte.

In ihrem ersten Aspekt richtet sich die Erfindung auf weitgehend reine Proteine, umfassend die Aminosäuresequenz eines DRR der Ratte oder des Menschen, wie sie in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 oder 13 gezeigt ist.

Die Erfindung richtet sich ebenso auf ein weitgehend reines Polynukleotid, codierend für ein die Aminosäuresequenz des DRR der Ratte (wie in der SEQ ID NO: 1 dargestellt) oder eines menschlichen DRR (wie in den SEQ ID NOs 3, 5, 7, 9, 11 oder 13 dargestellt) umfassendes Protein. Dieser erfindungsgemäße Aspekt umfaßt Polynukleotide, die für die im Sequenzprotokoll gezeigten Aminosäuresequenzen umfassenden Proteine codieren, Expressionsvektoren, die solche Polynukleotide umfassen, sowie Wirtszellen, die mit solchen Vektoren transformiert sind. Ebenso umfaßt sind die von auf diese Weise hergestellten Wirtszellen produzierten rekombinanten DRR-Proteine der Ratte und des Menschen.

Vorzugsweise weist das den DRR der Ratte codierende Polynukleotid die in der SEQ ID NO: 2 dargestellte Nukleotidsequenz und das für einen menschlichen DRR codierende Polynukleotid die in der SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11 oder 13 gezeigte Nukleotidsequenz auf. Ebenso ist bevorzugt, daß die zur DRR-Expression verwendeten Vektoren und Wirtszellen diese bestimmten Polynukleotide enthalten.

In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Testen einer Testverbindung auf ihre Fähigkeit, an einen DRR der Ratte oder des Menschen zu binden: Dieses Verfahren wird durchgeführt, indem man eine DRR-Quelle mit Angiotensin II sowie mit der Testverbindung inkubiert. Die Quelle für den DRR sollte weitgehend frei von anderen Arten G-Protein-gekoppelter Rezeptoren sein, d.h. mehr als 85% derartiger vorhandener Rezeptoren sollten dem DRR entsprechen. Nach Beendigung der Inkubation wird die Fähigkeit der Testverbindung, an den DRR zu binden, über das Ausmaß, mit dem Ligandenbindung verdrängt wurde, bestimmt. Bei dem DRR der Ratte handelt es sich um rDRR-1, wie in der SEQ ID NO: 1 dargestellt. Bei dem menschlichen Rezeptor handelt es sich um hDRR-1 (SEQ ID NO: 3); hDRR-2 (SEQ ID NO: 5); hDRR-3 (SEQ ID NO: 7); hDRR-4 (SEQ ID NO: 9); hDRR-5 (SEQ ID NO: 11); oder hDRR-6 (SEQ ID NO: 13). Es können entweder rekombinanten DRR exprimierende transformierte Zellen in den Tests verwendet werden oder Membranen aus den Zellen präpariert und verwendet werden. Der Test kann von der Bestimmung der Aktivierung eines „Second Messenger"-Wegs, wie beispielsweise des Adenylcyclasewegs, begleitet sein, doch ist dies nicht essentiell. Dies sollte dabei helfen, zu bestimmen, ob eine Verbindung, die an DRR bindet, als Agonist oder Antagonist wirkt.

Ein alternatives Verfahren zur Bestimmung, ob es sich bei einer Testverbindung um einen Agonisten eines der hier offenbarten DRRs handelt, besteht in der Verwendung eines Zellsignalisierungstests, beispielsweise eines Tests, bei dem entweder intrazelluläre Adenylcyclaseaktivität oder die intrazelluläre Calciumkonzentration gemessen wird. Die Testverbindung wird dabei mit Zellen, die den DRR exprimieren, jedoch weitgehend frei von anderen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren sind, typischerweise einer mit einem für den DRR codierenden Expressionsvektor transfizierten Zelle, inkubiert. Testverbindungen werden als Agonisten dadurch identifiziert, daß sie eine statistisch signifikante Änderung der aus dem Zellsignalisierungstest erhaltenen Ergebnisse im Vergleich mit Kontrolltransfektanten, die der Testverbindung nicht ausgesetzt wurden, verursachen. Beispielsweise können die der Testverbindung ausgesetzten Zellen einen signifikanten Anstieg der Adenylcyclaseaktivität oder der intrazellulären Calciumkonzentration zeigen.

Die Erfindung umfaßt ebenso ein Verfahren zur Bestimmung davon, ob es sich bei einer Testverbindung um einen Antagonisten eines DRR handelt, wobei dies von der bekannten Aktivierung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren abhängt, die auftritt, wenn derartige Rezeptoren in großen Mengen exprimiert werden. Dieses Verfahren erfordert, daß für den Rezeptor codierende DNA in einem Expressionsvektor eingebaut wird, so daß sie sich in operativer Verknüpfung mit einem Promotor befindet, und daß der Vektor anschließend zur Transfektion einer entsprechenden Wirtszelle verwendet wird.

Zur Produktion von genügend Rezeptor, um eine konstitutive Rezeptoraktivierung (d.h. Aktivierung in Abwesenheit von natürlichen Liganden) zu erhalten, werden Expressionssysteme bevorzugt, die zur Produktion großer Proteinmengen fähig sind, wobei beispielsweise die DRR-DNA mit einem CMV-Promotor operativ verknüpft und in COS- oder HEK293-Zellen exprimiert werden kann. Nach der Transfektion werden Zellen mit aktivierten Rezeptoren daraufhin ausgewählt, daß sie eine erhöhte Aktivität in einem Zellsignalisierungstest relativ zu vergleichbaren Zellen, die entweder nicht transfiziert wurden oder mit einem Vektor transfiziert wurden, der nicht zur Expression eines funktionsfähigen DRR in der Lage ist, zeigen. Typischerweise werden Zellen entweder ausgewählt, weil sie einen statistisch signifikanten Anstieg der intrazellulären Adenylcyclaseaktivität oder einen statistisch signifikanten Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration zeigen. Die ausgewählten Zellen werden mit der Testverbindung in Kontakt gebracht, und der Zellsignalisierungstest wird wiederholt, um zu bestimmen, ob dies zu einer Abnahme der Aktivität relativ zu Kontrollzellen, die nicht mit der Testverbindung in Kontakt gebracht wurden, führt. Beispielsweise würde eine statistisch signifikante Abnahme entweder der Adenylcyclaseaktivität oder der Calciumkonzentration relativ zu Kontrollzellen andeuten, daß es sich bei der Testverbindung um einen Antagonisten des DRR handelt. In diesen Tests können alle der hier offenbarten DRRs eingesetzt werden.

Tests für Verbindungen, die mit einem DRR Wechselwirken, können durchgeführt werden, indem man eine den DRR enthaltende Quelle, die jedoch weitgehend frei von anderen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren ist (z.B. eine stabil transformierte Zelle), mit Angiotensin II sowohl in Gegenwart als auch Abwesenheit der Testverbindung inkubiert und die Modulation der intrazellulären Calciumkonzentration mißt. Dabei zeigt ein signifikanter Anstieg oder eine signifikante Abnahme der durch Angiotensin stimulierten Calciumverdrängung als Reaktion auf die Testverbindung eine am DRR stattfindende Wechselwirkung an. Zu den Rezeptoren, die in diesen Tests verwendet werden können, gehören DRR-1 der Ratte sowie menschlicher DRR-1, DRR-2, DRR-3, DRR-4, DRR-5 und DRR-6.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1. Nukleotidsequenz von rDRR-1: Klon 3B-32, der rDRR-1 codiert, wurde aus einer Rattengenombibliothek unter Verwendung des Promoter Finder Walking Kit isoliert (siehe Methoden. Clontech).

Das klonierte Gen wurde bei der internationalen Hinterlegungsbehörde Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH mit der Adresse Mascheroder Weg 1B, D-3300 Braunschweig, Deutschland, hinterlegt. Die Hinterlegung wurde am 27. November 1997 vorgenommen und mit der Zugangsnummer DSM 11877 versehen.

2. Abgeleitete Aminosäuresequenz von DRR-I: Klon 3B-32 codiert für ein Protein mit 337 Aminosäuren. Die Aminosäuresequenz beginnt mit dem ersten ATG in der Nukleotidsequenz.

3. Vergleichende Gegenüberstellung der abgeleiteten Aminosäuresequenzen des Klons 3B-32 (rDRR-1) und ihren fünf am stärksten homologen Sequenzen. Die eingerahmten und grau unterlegten Reste sind diejenigen, die mit der rDRR-1-Sequenz identisch sind.

4. Vergleichende Gegenüberstellung der Aminosäuren der menschlichen DRR-Homologe: Die Aminosäuresequenzen aller 6 menschlichen Homologen von rDRR-1 (hDRR-1; hDRR-2; hDRR-3; hDRR-4; hDRR-5; und hDRR-6) werden vergleichend gegenübergestellt. Die Aminosäurereste, die sich vom Klon 36 (HUMAN36.PR) unterscheiden, sind eingerahmt. Das Ausmaß der Identität zwischen diesen Sequenzen reicht von 77% bis fast 100%.

Definitionen

In der nachfolgenden Beschreibung werden eine Reihe von Ausdrücken verwendet, die sich auf rekombinante DNA-Technologie beziehen. Um für ein klares und einheitliches Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche, einschließlich des solchen Ausdrücken beizumessenden Umfangs, zu sorgen, werden die folgenden Definitionen bereitgestellt.

Klonierungsvektor: Eine Plasmid- oder Phagen-DNA oder andere DNA-Sequenz, die in der Lage ist, autonom in einer Wirtszelle zu replizieren und die durch eine Restriktionsendonukleaseerkennungsstelle oder eine geringe Anzahl davon gekennzeichnet ist. Ein Fremd-DNA-Fragment kann an diesen Stellen in den Vektor gespleißt werden, um die Replikation und Klonierung des Fragments zu ermöglichen. Der Vektor kann einen Marker enthalten, der sich zur Verwendung bei der Identifikation transformierter Zellen eignet. Beispielsweise können Marker eine Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz bereitstellen.

Expressionsvektor: Ein zu einem Klonierungsvektor ähnlicher Vektor, der jedoch in der Lage ist, die Expression der DNA, die in ihn kloniert wurde, nach der Transformation in einen Wirt zu induzieren. Die klonierte DNA wird normalerweise unter die Kontrolle bestimmter Regulationssequenzen, wie beispielsweise Promotoren oder Enhancer, gestellt (d.h. damit operativ verknüpft). Die Promotorsequenzen können konstitutiv, induzierbar oder reprimierbar sein.

Weitgehend rein: „Weitgehend rein", wie hier verwendet, bedeutet, daß das gewünschte Produkt im wesentlichen frei von verunreinigenden Zellbestandteilen ist. Ein „weitgehend reines" Protein bzw. eine „weitgehend reine" Nukleinsäure umfaßt typischerweise wenigstens 85% einer Probe, wobei höhere Prozentanteile bevorzugt sind. Zu den Verunreinigungen können Proteine, Kohlenhydrate oder Lipide gerechnet werden. Ein Verfahren zur Bestimmung der Reinheit eines Proteins oder einer Nukleinsäure besteht in der Elektrophorese einer Präparation in einer Matrix, wie beispielsweise Polyacrylamid oder Agarose. Die Reinheit erkennt man am Auftreten einer einzigen Bande nach Anfärbung. Zu weiteren Verfahren zur Beurteilung der Reinheit zählen die Chromatographie sowie die analytische Zentrifugation.

Wirt: Eine beliebige prokaryontische oder eukaryontische Zelle, die der Empfänger eines replizierbaren Expressionsvektors oder Klonierungsvektors ist, stellt den „Wirt" für diesen Vektor dar. Der Ausdruck umfaßt prokaryontische oder eukaryontische Zellen, die manipuliert wurden, um ein gewünschtes Gen auf deren Chromosom oder in deren Genom einzubauen. Beispiele für Zellen, die als Wirte dienen können, sind im Fachgebiet allgemein bekannt, ebenso wie Techniken zur Zelltransformation (siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor (1989)).

Promotor: Eine DNA-Sequenz, die sich typischerweise im 5-Bereich eines proximal zum Startcodon liegenden Gens befindet. Die Transkription wird am Promotor gestartet. Handelt es sich bei dem Promotor um den induzierbaren Typ, so erhöht sich die Transkriptionsgeschwindigkeit als Reaktion auf ein Induktionsmittel.

Komplementäre Nukleotidsequenz: Eine komplementäre Nukleotidsequenz, wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf die Sequenz, die sich aus einer normalen Basenpaarung ergeben würde. So hätte beispielsweise die Nukleotidsequenz 5-AGAC-3 die komplementäre Sequenz 5-GTCT-3.

Expression: Bei der Expression handelt es sich um den Vorgang, durch den ein Polypeptid aus DNA produziert wird. Der Vorgang beinhaltet die Transkription des Gens in mRNA sowie die Translation dieser mRNA in ein Polypeptid.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf DRR-Rezeptorproteine, für die Rezeptoren codierende Gensequenzen, ein Verfahren zum Testen von Verbindungen auf die Bindung an DRR-Rezeptoren sowie ein Verfahren zum Testen von Verbindungen auf ihre Fähigkeit, die DRR-Expression zu verändern. Die Rezeptoren sowie ihre Nukleinsäuren sind über ihre Strukturen definiert (wie in 1, 2 und 4 sowie SEQ ID-Nummern 1–14 dargestellt).

Es versteht sich, daß die vorliegende Erfindung nicht nur Sequenzen beschreibt, die mit denen in den Figuren beziehungsweise dem Sequenzprotokoll dargestellten identisch sind, sondern auch Sequenzen, bei denen es sich im wesentlichen um die gleichen Sequenzen handelt, sowie Sequenzen, die ansonsten weitgehend gleich sind und die zu einem Rezeptor führen, der die grundlegenden Bindungseigenschaften des DRR beibehält. So ist beispielsweise allgemein bekannt, daß zur Einführung von Variationen in eine Proteinstruktur Techniken, wie z.B. stellengerichtete Mutagenese, verwendet werden können. Variationen in einem DRR-Protein, die mit diesem oder einem ähnlichen Verfahren eingeführt wurden, sind beschrieben, vorausgesetzt, daß der erhaltene Rezeptor die grundlegenden qualitativen Bindungseigenschaften des unveränderten DRR beibehält. Somit betrifft die Erfindung Proteine, umfassend Aminosäuresequenzen, umfassend die Sequenz der SEQ ID NO: 1 (Ratte) und SEQ ID-Nummern 3, 5, 7, 9, 11 und 14 (Mensch).

I. Für DRR codierende Nukleinsäuresequenzen

Für DRRs codierende DNA-Sequenzen werden ausschließlich, oder zumindest stark bevorzugt, in dorsalen Wurzelganglien exprimiert, wobei diese Ganglien als eine Quelle für die Isolierung von für die Rezeptoren codierenden Nukleinsäuren dienen können. Darüber hinaus können Zellen und Zellinien, die einen DRR der Ratte oder des Menschen exprimieren, als eine Quelle für Nukleinsäure dienen. Dabei kann es sich entweder um kultivierte Zellen handeln, die keiner Transformation unterzogen wurden, oder um Zellinien, die spezifisch für die Expression von rekombinantem DRR manipuliert wurden.

In allen Fällen wird polyA+-mRNA aus den dorsalen Wurzelganglien isoliert, revers transkribiert und kloniert. Die so gebildete cDNA-Bibliothek kann dann einem Screening unterzogen werden, wobei Sonden, die von den im beiliegenden Sequenzprotokoll als SEQ ID-Nummer 2, 4, 6, 8, 10, 12 oder 14 dargestellten Sequenzen abgeleitet sind, je nach dem jeweiligen zu isolierenden DRR verwendet werden. Die Sonden sollten typischerweise eine Länge von wenigstens 14 Basen aufweisen und sollten von einem Teil der DRR-Sequenz abgeleitet sein, der schwach konserviert ist (siehe 3 und 4). Das Screening läßt sich auch unter Verwendung genomischer Bibliotheken mit einem DRR-Gen oder eines Teils des Gens, das bzw. der als Sonde bei der Isolierung weiterer DRR-Gene dient, durchführen. Beispielsweise kann ein Vollängen-rDRR-1 markiert und zum Screening einer menschlichen genomischen Bibliothek zur Isolierung von hDRR-1, hDRR-2 usw. verwendet werden (siehe Beispielteil).

Als Alternative lassen sich genomische DNA-Bibliotheken zur Isolierung von DRR-Genen verwenden, indem PCR-Amplifikationen mit Primern, die jeweils an einem Ende der Gene lokalisiert sind, durchgeführt werden (siehe Beispielteil für eine Beschreibung der Vorgehensweise). So kann beispielsweise menschliche genomische DNA unter Verwendung der Primer:

5'-GCAAGCTTTCTGAGCATGGATCCAACCGTC und

5'-CCCTCAGATCTCCAATTTGCTTCCCGACAG

amplifiziert werden.

Dies dient zur Amplifikation aller sechs menschlichen DRR-Gene, die hier als hDRR-1; hDRR-2, hDRR-3; hDRR-4; hDRR-5 und hDRR-6 identifiziert sind. Diese können dann in einen entsprechenden Vektor, z.B. pGEM-T (Promega) zur DNA-Sequenzanalyse kloniert werden.

II. Antikörper gegen DRRs der Ratte und des Menschen

Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Antikörper, die spezifisch an einen DRR der Ratte oder des Menschen binden, sowie ein Verfahren zur Herstellung solcher Antikörper. Antikörper, die „spezifisch an einen DRR binden", sind als solche definiert, die eine mindestens 100fach größere Affinität für den DRR als für irgendein anderes Protein aufweisen. Das Verfahren zur Herstellung solcher Antikörper kann entweder die Injektion des DRR-Proteins selbst in ein geeignetes Tier oder vorzugsweise die Injektion kurzer Peptide, die so hergestellt wurden, daß sie unterschiedlichen Bereichen des DRR entsprechen, beinhalten. Dabei sollten die Peptide wenigstens schon eine Länge von 5 Aminosäuren aufweisen und aus Bereichen ausgewählt sein, von denen man annimmt, daß sie nur in den jeweiligen, als Ziel dienenden DRR-Protein vorkommen. Somit sollten hochkonservierte Transmembranbereiche im allgemeinen bei der Auswahl von Peptiden zur Erzeugung von Antikörpern vermieden werden. Verfahren zur Herstellung und zum Nachweis von Antikörpern sind dem Fachmann allgemein bekannt, wie anhand von Standardreferenzwerken, wie etwa: (Harlow et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988)): Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (1982): Kennett, et al., Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses (1980): und Campbell, „Monoclonal Antibody Technolgy", in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, (1984)) zu sehen ist.

„Antikörper", wie hier verwendet, soll intakte Moleküle ebenso wie Fragmente, die ihre Fähigkeit zur Bindung an Antigen behalten (z.B. Fab- und F(ab)2-Fragmente) einschließen. Diese Fragmente werden typischerweise durch proteolytische Spaltung intakter Antikörper unter Verwendung von Enzymen, wie z.B. Papain (zur Herstellung von Fab-Fragmenten) oder Pepsin (zur Herstellung von F(ab)2-Fragmenten) produziert. Der Begriff „Antikörper" bezieht sich auch sowohl auf monoklonale Antikörper als auch polyklonale Antikörper. Polyklonale Antikörper stammen aus den Seren von mit dem Antigen immunisierten Tieren. Monoklonale Antikörper lassen sich mit der Hybridomtechnologie herstellen (Kohler, et al., Nature 256:495 (1975); Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas. Elsevier, M.Y., S. 563–681 (1981)). Dabei wird bei dieser Technologie im allgemeinen ein Tier, üblicherweise eine Maus, mit entweder intaktem DRR oder einem von dem DRR abgeleiteten Fragment immunisiert. Die Milzzellen der immunisierten Tiere werden extrahiert und mit geeigneten Myelomzellen, z.B. SP20-Zellen, fusioniert. Nach der Fusion werden die erhaltenen Hybridomzellen selektiv in HAT-Medium gehalten und anschließend mittels limitierender Verdünnung kloniert (Wands. et al., Gastroenterology 80:225–232 (1981)). Die über eine derartige Selektion erhaltenen Zellen werden dann getestet, um Klone, die zur Bindung an den DRR fähige Antikörper sezernieren, zu identifizieren.

Die Antikörper bzw. Fragmente von Antikörpern können zum Nachweis des Vorhandenseins von DRR-Protein unter Verwendung eines von verschiedenen Immuntests eingesetzt werden. So können die Antikörper beispielsweise in Radioimmuntests oder in immunometrischen Tests, die auch als „Two-Site"- oder „Sandwich"-Tests bekannt sind, eingesetzt werden (siehe Chard, T., „An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques", in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, North Holland Publishing Co., N.Y. (1978)). In einem typischen immunometrischen Test wird eine Menge an unmarkiertem Antikörper an einen festen Träger gebunden, der in der zu testenden Flüssigkeit, z.B. Blut, Lymphe, Zellextrakte usw., unlöslich ist. Nach der ersten Bindung von Antigen an immobilisierten Antikörper wird eine Menge an nachweisbar markiertem zweiten Antikörper (bei dem es sich um den gleichen wie oder einen anderen als den ersten Antikörper handeln kann) zugegeben, um den Nachweis und/oder die Quantifizierung von gebundenem Antigen zu gestatten (siehe z.B. Radioimmune Assay Method, Kirkham et al., Hrsg., S. 199–206, E & S. Livingstone, Edinburgh (1970)). Viele Variationen dieser Arten von Tests sind im Fachgebiet bekannt und können zum Nachweis des DRR verwendet werden.

Antikörper gegen einen DRR der Ratte oder des Menschen können auch bei der Reinigung entweder des intakten Rezeptors oder von Fragmenten des Rezeptors eingesetzt werden (siehe allgemein Dean et al., Affinity Chromatography, A Practical Approach, IRL Press (1986)). Dabei wird typischerweise Antikörper auf einer chromatographischen Matrix, wie z.B. Sepharose 4B immobilisiert. Die Matrix wird dann in eine Säule gepackt und die den gewünschten DRR enthaltene Präparation unter Bedingungen, die die Bindung fördern, z.B. unter Niedrigsalzbedingungen, über die Säule gegeben. Anschließend wird die Säule gewaschen und gebundener DRR unter Verwendung eines Puffers, der die Dissoziation vom Antikörper fördert, z.B. eines Puffers mit einem geänderten pH-Wert oder einer geänderten Salzkonzentration, eluiert. Der eluierte DRR kann in einen Puffer der Wahl überführt werden, beispielsweise durch Dialyse, und entweder gelagert oder direkt verwendet werden.

III. Radioligandentest auf Rezeptorbindung

Eine der Hauptverwendungen für DRR-Nukleinsäuren und rekombinante Proteine erfolgt in Tests, die zur Identifizierung von zur Bindung an DRR-Rezeptoren fähigen Agentien entwickelt wurden. Bei solchen Agentien kann es sich entweder um Agonisten, die die normalen Effekte der Rezeptorbindung imitieren, oder Antagonisten, die die normalen Effekte der Rezeptorbindung hemmen, handeln. Von besonderem Interesse ist die Identifizierung von Agentien, die an den DRR binden und Adenylcyclaseaktivität in den Zellen modulieren. Diese Agentien besitzen eine mögliche therapeutische Anwendung entweder als Analgetika oder Anästhetika.

In Radioligandenbindungstests wird eine DRR-Quelle zusammen mit einem Liganden, von dem man weiß, daß er an den Rezeptor bindet, sowie mit der auf Bindungsaktivität zu testenden Verbindung inkubiert. Die bevorzugte Quelle für DRR sind dabei Zellen, vorzugsweise Säugerzellen, die zur rekombinanten Expression des Rezeptors transformiert wurden. Die ausgewählten Zellen sollten keine wesentliche Menge irgendeines anderen G-Protein-gekoppelten Rezeptors, der an Liganden binden und Ergebnisse verfälschen könnte, exprimieren. Dies läßt sich leicht dadurch bestimmen, daß Bindungstests an Zellen, die aus dem gleichen Gewebe beziehungsweise der gleichen Zellinie wie diejenigen, die DRR rekombinant exprimieren, aber die keiner Transformation unterzogen wurden, stammen, durchgeführt werden.

Der Test kann entweder mit intakten Zellen oder mit aus den Zellen präparierten Membranen durchgeführt werden (siehe z.B. Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:10230–10234 (1993)). Dabei werden die Membranen mit einem für den DRR-Rezeptor spezifischen Liganden sowie mit einer Präparation der zu testenden Verbindung inkubiert. Nach vollständiger Bindung wird der Rezeptor von der Liganden und Testverbindung enthaltenden Lösung getrennt, z.B. durch Filtration, und die Menge an stattgefundener Bindung bestimmt. Vorzugsweise ist der verwendete Ligand nachweisbar mit einem Radioisotop, wie z.B. 125I markiert. Falls gewünscht, können jedoch auch statt dessen Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzmarkierungen verwendet werden. Unter den am häufigsten verwendeten Fluoreszenzmarkierungsverbindungen befinden sich Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd und Fluorescamin. Zu geeigneten Chemilumineszenzverbindungen gehören Luminol, Isoluminol, theromatischer Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz und Oxalatester. Jedes dieser Agentien, die zur Herstellung eines für die Verwendung im Test geeigneten Liganden verwendet werden können.

Nichtspezifische Bindung kann bestimmt werden, indem man die Bindungsreaktion in Gegenwart eines großen Überschusses an unmarkiertem Liganden durchführt. So kann beispielsweise markierter Ligand mit Rezeptor und Testverbindung in Gegenwart eines tausendfachen Überschusses an unmarkiertem Liganden inkubiert werden. Nichtspezifische Bindung sollte von der Gesamtbindung, d.h. der Bindung in Abwesenheit von unmarkiertem Liganden, subtrahiert werden, um die spezifische Bindung für die jeweils getestete Probe zu erhalten Die Tests können je nach Bedarf weitere Schritte, wie beispielsweise Waschen, Rühren, Schütteln, Filtern und dergleichen, beinhalten. Typischerweise werden Waschschritte nach der Trennung von membrangebundenem Liganden von in Lösung verbliebenem Liganden und vor der Quantifizierung der Menge an gebundenem Liganden z.B. durch Zählen von radioaktivem Isotop, eingefügt. Die in Gegenwart von Testverbindung erhaltene spezifische Bindung wird mit der in Gegenwart von markiertem Liganden allein erhaltene Bindung verglichen, um den Grad der Verdrängung der Rezeptorbindung durch die Testverbindung zu bestimmen.

Bei der Durchführung von Bindungstests muß darauf geachtet werden, Artifakte zu vermeiden, die es möglich machen, daß eine Testverbindung mit dem DRR-Rezeptor wechselzuwirken scheint, wenn tatsächlich die Bindung durch einen anderen Mechanismus gehemmt wird. So sollte die getestete Verbindung beispielsweise in einem Puffer vorliegen, der nicht selbst die Bindung von Ligand an DRR weitgehend hemmt, und vorzugsweise bei mehreren unterschiedlichen Konzentrationen getestet werden. Präparationen der Testverbindung sollten auch auf proteolytische Aktivität untersucht werden, wobei es wünschenswert ist, daß die Tests Antiproteasen beinhalten. Schließlich ist es höchst wünschenswert, daß Verbindungen, bei denen festgestellt wurde, daß sie die Bindung von Ligand an DRR-Rezeptor verdrängen, nochmals in einem Konzentrationsbereich untersucht werden, der zur Durchführung einer Scatchard-Analyse der Ergebnisse ausreicht. Diese Art von Analyse ist im Fachgebiet allgemein bekannt und läßt sich zur Bestimmung der Affinität einer Testverbindung für Rezeptor verwenden (siehe z.B. Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, 11.2.1–11.2.19 (1993); Laboratory Techniques and Biochemistry and Molecular Biology, Work, et al., Hrsg., N.Y. (1978) usw.). Bei der Analyse der Ergebnisse können Computerprogramme behilflich sein (siehe z.B. Munson, P., Methods Enzymol. 92:543–577 (1983); McPherson, G.A., Kinetic, EBDA Ligand, Lowry-A Collection of Radioligand Binding Analysis Programs, Elsevier-Biosoft. U.K. (1985)).

Die Aktivierung von Rezeptor durch die Bindung von Ligand kann mit einer Reihe unterschiedlicher Tests verfolgt werden. So können beispielsweise Adenylcyclasetests durchgeführt werden, indem man Zellen in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte anzieht und anschließend die verschiedenen Vertiefungen in Gegenwart oder Abwesenheit von Testverbindung inkubiert. cAMP kann dann in Ethanol extrahiert, lyophilisiert und in Testpuffer resuspendiert werden. Der Test von so gewonnenem cAMP kann unter Verwendung eines beliebigen Verfahrens zur Bestimmung der cAMP-Konzentration, z.B. des Biotrack cAMP Enzyme-Immunoassay System (Amersham) oder des Cyclic AMP [3H] Assay System (Amersham), durchgeführt werden. Typischerweise werden Adenylcyclasetests getrennt von Bindungstests durchgeführt, doch ist es auch möglich, Bindungs- und Adenylcyclasetests an einer einzigen Präparation von Zellen durchzuführen. Weitere „Zellsignalgebungstests", die zur Verfolgung von Rezeptoraktivität verwendet werden können, sind nachfolgend beschrieben.

IV. Identifizierung von DRR-Agonisten und -Antagonisten unter Verwendung von Zellsignalisierungstests

DRRs können auch zum Screening auf Arzneistoffkandidaten unter Verwendung von Zellsignalisierungstests eingesetzt werden. Zur Identifizierung von DRR-Agonisten wird die für einen Rezeptor codierende DNA in einem Expressionsvektor eingebaut und anschließend in einen geeigneten Wirt transfiziert. Die transformierten Zellen werden dann mit einer Reihe von Testverbindungen in Kontakt gebracht, wobei deren Effekte jeweils verfolgt werden. Unter den Tests, die verwendet werden können, befinden sich Tests zur Messung der cAMP-Produktion (siehe obige Diskussion), Tests zur Messung der Aktivierung von Reportergenaktivität oder Tests zur Messung der Modulation der Bindung von GTP-Gamma-S.

Zellsignalisierungstests können auch zur Identifizierung von DRR-Antagonisten verwendet werden. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren lassen sich in ihren aktiven Zustand selbst in Abwesenheit ihres zugehörigen Liganden versetzen, indem sie mit sehr hoher Konzentration in einem heterologen System exprimiert werden. So kann beispielsweise Rezeptor unter Verwendung der Baculovirusinfektion von Sf9-Insektenzellen überexprimiert werden, oder ein DRR-Gen kann mit einem CMV-Promotor operativ verknüpft und in COS- oder HEK293-Zellen exprimiert werden. In diesem aktivierten konstitutiven Zustand lassen sich Antagonisten des Rezeptors in Abwesenheit von Ligand durch Messen der Fähigkeit einer Testverbindung zur Hemmung konstitutiver Zellsignalisierungsaktivität identifizieren. Geeignete Tests hierfür sind wiederum cAMP-Tests, Reportergenaktivierungstests oder Tests zur Messung der Bindung von GTP-Gamma-S.

Ein bevorzugter Zellsignalisierungstest beruht auf der Beobachtung, daß mit DRRs stabil transfizierte Zellen eine Änderung der intrazellulären Calciumspiegel als Reaktion auf eine Inkubation in Gegenwart von Angiotensin II oder III zeigen (siehe Beispiel 5). Somit läßt sich eine Verfahrensweise zur Identifizierung von DRR-Agonisten oder -Antagonisten verwenden, die den oben erörterten Radiorezeptortests ähnlich ist, außer daß anstelle eines markierten Liganden Angiotensin II oder III verwendet wird und anstatt der gebundenen Radioaktivität die Calciumkonzentration gemessen wird. Die Konzentration von Calcium in Gegenwart von Testverbindung sowie Angiotensin II oder III wird mit der in Gegenwart von Angiotensin II bzw. III allein verglichen, um zu bestimmen, ob die Testverbindung am DRR-Rezeptor wechselwirkt. Eine statistisch signifikante Erhöhung von intrazellulärem Calcium als Antwort auf Testverbindung deutet dabei an, daß die Testverbindung als Agonist wirkt, wohingegen eine statistisch signifikante Abnahme von intrazellulärem Calcium anzeigt, daß sie als Antagonist wirkt.

V. Test auf die Fähigkeit zur Modulation der DRR-Expression

Ein Weg entweder zur Erhöhung oder zur Reduzierung der biologischen Effekte eines DRR besteht darin, das Ausmaß, in dem der Rezeptor in Zellen exprimiert wird, zu verändern. Daher sind Tests zur Identifizierung von Verbindungen, die die Expression entweder hemmen oder verstärken, von beträchtlichem Interesse. Diese Tests werden durchgeführt, indem man einen DRR exprimierende Zellen in Gegenwart einer Testverbindung anzieht und dann die Rezeptorexpression in diesen Zellen mit der Expression in Zellen, die unter im wesentlichen identischen Bedingungen, jedoch in Abwesenheit der Testverbindung angezogen wurden, vergleicht. Wie bei den oben erörterten Bindungstests ist es wünschenswert, daß die verwendeten Zellen weitgehend frei von konkurrierenden G-Protein-gekoppelten Rezeptoren sind. Ein Weg zur Quantifizierung der Rezeptorexpression besteht darin, daß man die DRR-Sequenz an eine für ein Peptid oder Protein, das sich leicht quantifizieren läßt, codierende Sequenz fusioniert. So kann die DRR-Sequenz beispielsweise an eine für Hämaglutinin codierende Sequenz, wie in Beispiel 5 beschrieben, ligiert und zur stabilen Transfektion von Zellen verwendet werden. Nach der Inkubation mit Testverbindung kann der Hämagglutinin/Rezeptor-Komplex immunpräzipitiert und einem Western-Blotting mit Anti-Hämaglutinin-Antikörper unterzogen werden.

Als Alternative kann zur Bestimmung der Rezeptorzahl eine Scatchard-Analyse von Bindungstests mit markiertem Liganden durchgeführt werden. Die Bindungstests können wie oben erörtert durchgeführt werden, wobei vorzugsweise Zellen zum Einsatz kommen, die zur rekombinanten Expression von DRR manipuliert wurden.

Eine bevorzugte Gruppe von Testverbindungen zur Aufnahme im DRR-Expressionstest besteht aus Oligonukleotiden, die zu verschiedenen Segmenten der DRR-Nukleinsäuresequenz komplementär sind. Diese Oligonukleotide sollten eine Länge von wenigstens 15 Basen aufweisen und von nicht konservierten Bereichen der Rezeptor-Nukleinsäuresequenz abgeleitet sein. Dabei können die Sequenzen auf den als SEQ ID-Nummern 2, 4, 6, 8, 10, 12 oder 14 dargestellten Sequenzen basieren.

Oligonukleotide, bei denen festgestellt wird, daß sie die Rezeptorexpression reduzieren, können derivatisiert oder konjugiert werden, um ihre Wirksamkeit zu erhöhen. So können beispielsweise Nukleosidphosphorothioate ihre natürlichen Gegenstücke ersetzen (siehe Cohen, J., Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press (1989)). Die Oligonukleotide können einem Patienten in vivo zum Zwecke der Hemmung der DRR-Expression zugeführt werden. Daran anschließend ist es bevorzugt, daß das Oligonukleotid in einer Form verabreicht wird, durch die seine Aufnahme durch die Zellen verbessert wird. So kann das Oligonukleotid beispielsweise mittels eines Liposoms oder konjugiert an ein Peptid, das von Zellen aufgenommen wird, zugeführt werden (siehe z.B. US-Patente Nr. 4,897,355 und 4,394,448; siehe auch nicht-US-Patentdokumente WO 8903849 und EP 0263740). Weitere Verfahren zur Verbesserung der Effizienz der Oligonukleotidzuführung sind im Fachgebiet allgemein bekannt und auch mit der vorliegenden Erfindung kompatibel.

Nach der Beschreibung der Erfindung wird diese leichter verstanden unter Verweis auf die folgenden Beispiele, die zur Veranschaulichung bereitgestellt werden und keine Beschränkung des Umfangs der Erfindung darstellen sollen.

BEISPIELE Beispiel 1: Klonierung von DRR-1 der Ratte Isolierung des cDNA-Fragments

Es wurden degenerierte Oligonukleotide zu hochkonservierten Bereichen der membranüberspannenden Transmembrandomänen 2 und 7 G-Protein-gekoppelter Rezeptoren mit den folgenden Nukleotidsequenzen synthetisiert:

5' GG CCG TCG ACT TCA TCG TC(A/T) (A/C)(T/C)C TI(G/T) CI(T/C) TIG C(A/C/G/T)G 3' (TM2:sense) SEQ ID NO: 15 und

5' (A/G)(C/A/T)(A/T) (A/G)CA (A/G)TA IAT IAT IGG (A/G)TT 3' (TM7:antisense) SEQ ID NO: 16.

Poly-A+-mRNA wurde aus kultivierten fötalen dorsalen Wurzelganglien der Ratte (Sprague-Dawley) isoliert. Die mRNA wurde unter Verwendung des First Strand cDNA-Synthesis-Kits (Pharmacia Biotech) reverstranskribiert, einer Amplifikationsreaktion mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung der Ampli-Taq-DNA-Polymerase (Perkin-Elmer Cetus) unter den folgenden Bedingungen unterzogen: 3 Minuten bei 94°C, 40 Zyklen von jeweils 1 Minute bei 94°C, 45°C und 72°C. Ein cDNA-PCR-Fragment, entsprechend etwa 650 bps, wurde isoliert und in den Vektor pGEM-T (Promega Corporation) subkloniert. Die Nukleotidsequenz des rekombinanten Klons wurde unter Verwendung des T7-Didesoxy-Kettenabbruchsequenzierungskits (Pharmacia Biotech) bestimmt, wobei sich nach Durchsuchen der Genbank/EMBL-Datenbanken herausstellte, daß diese Sequenz einmalig ist.

Die Vollängen-DRR-1-Sequenz der Ratte wurde aus genomischer Ratten-DNA unter Verwendung des 650 Basenpaar großen Fragments sowie des „Promoter Finder DNA Walking Kit" (Clontech, Cat. # K1806-1) erhalten. Dieser Kit enthält fünf Bibliotheken unklonierter, Adaptor-ligierter genomischer DNA-Fragmente. Die Verfahrensweise beinhaltet zwei aufeinanderfolgende PCR-Reaktionen. Beide Reaktionen wurden unter Verwendung des „Advantage Tth Polymerase Mix", der ebenso von Clontech bezogen wurde, durchgeführt, wobei den von der Lieferfirma empfohlenen Bedingungen gefolgt wurde. Die erste PCR-Reaktion wurde mit dem äußeren Adaptor-Primer (AP1), der mit dem Kit zur Verfügung gestellt wurde, sowie einem äußeren, genspezifischen Primer (GSP1), der von der Sequenz des DRR-1-PCR-Fragments abgeleitet wurde, durchgeführt. Die primären PCR-Gemische wurden verdünnt und als Matrize für die sekundäre (nested [=geschachtelte) PCR-Reaktion mit dem geschachtelten Adaptor-Primer (AP2) und einem geschachtelten genspezifischen Primer (GSP2) verwendet. Um die Sequenz des DRR-1-Gens der Ratte stromaufwärts von der Sequenz des ursprünglichen PCR-Fragments zu erhalten, wurden die folgenden Oligonukleotide verwendet:

GSP1: oligo YF3B59-B, 5'-CGCAGATGAGGTAGTACAGCATCAC SEQ ID NO: 17

GSP2: oligo MML-Rl. 5'-CTGTGAGAGAGATGGTAACATACAG SEQ ID NO: 18

Aus der ersten Bibliothek wurde ein 1,9 Kb großes Fragment AP2-MMLR1 und aus der dritten Bibliothek ein ungefähr 1,0 Kb großes Fragment gewonnen. Zur Identifizierung der Sequenz stromabwärts von der bekannten Sequenz wurden die folgenden Primer verwendet:

GSP1: oligo YF3B59-F2. 5'-GCATCCTTGACTGGTTCTTCTCAG SEQ ID NO: 19

GSP2: oligo MML-F1. 5'-GGGTGAGACTCATCATCATTTGTGG. SEQ ID NO: 20

Aus der ersten Bibliothek wurde ein ungefähr 1 Kb großes Fragment MMLF1-AP2 und aus der dritten Bibliothek ein etwa 600 bp großes Fragment erhalten. Die das vollständige vorhergesagte offene Leseraster von DRR-1 enthaltende zusammengesetzte Sequenz von 1154 Nukleotiden ist in 1 dargestellt. Dabei codiert das offene Leseraster für ein 337 Aminosäuren langes Protein (2) mit einer vorhergesagten Molekularmasse von 38,7 kD. Die Proteinsequenz enthält alle charakteristischen Merkmale G-Protein-gekoppelter Rezeptoren: sieben hydrophobe Helices, die wahrscheinlich Transmembrandomänen repräsentieren, eine potentielle Glycosylierungsstelle auf der N-terminalen extrazellulären Domäne (Position 30) sowie eine konservierte NPXXY-Sequenz an Position 285–289.

Beispiel 2: Klonierung menschlicher DRR-Rezeptorgene

Zur Identifizierung und Klonierung neuer menschlicher DNA-Sequenzen, die zum DRR-1-Gen der Ratte homolog und/oder damit verwandt sind, wurden zwei Ansätze verwendet. Zunächst wurde eine menschliche genomische Bibliothek einem Screening im Lambda-Vektor Fix II (Stratagene Cat. # 946203) unterzogen. Dabei wurden ungefähr 106 menschliche genomische Klone ausplattiert und zur Hybridisierung mit der mit 32P markierten DRR-1-Vollängensequenz der Ratte als Sonde auf Nitrocellulosemembran übertragen. Die Hybridisierung wurde bei 42°C über Nacht durchgeführt. Die Filter wurden bei Raumtemperatur bei niedriger Stringenz (1X SSC/0,1% SDS) gewaschen, um den Nachweis verwandter, jedoch nicht unbedingt identischer Sequenzen zu gestatten.

Die in positiven Phagen vorhandene inserierte menschliche DNA wurde mit PCR unter Verwendung des „Expand PCR Kit" von Boehringer-Mannheim unter Bedingungen, die die genaue Amplifikation sehr großer DNA-Fragmente gestatten, amplifiziert. Diese langen DNA-Fragmente wurden mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und in einen Plasmidvektor subkloniert. Die Anteile dieser Klone, die mit der Ratte-DRR-1-Gensonde hybridisierten, wurden mit dem ABI Cycle-Sequenzierkit sequenziert.

Ein zweiter Ansatz zur Identifizierung neuer menschlicher Sequenzen, die mit DRR-1 verwandt sind, beinhaltete die Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR), durchgeführt an menschlicher genomischer Gesamt-DNA. Primer wurden auf der Grundlage der oben beschriebenen menschlichen genomischen Klone synthetisiert und waren wie folgt:

HML.H, 5'-GCAAGCTTTCTGAGCATGGATCCAACCGTC, SEQ ID NO: 21

und

HML.Bg, 5'-CCCTCAGATCTCCAATTTGCTTCCCGACAG. SEQ ID NO: 22.

Die Amplifikation führte zu ungefähr 1 Kilobasen großen Fragmenten, die die gesamte codierende Sequenz der menschlichen Gene enthielten. Diese erhaltenen Fragmente wurden in den Vektor pGEM-T (Promega) zur DNA-Sequenzieranalyse subkloniert.

Unter Verwendung der obigen Strategien wurden sechs menschliche Klone isoliert:

Klon 7, SEQ ID Nummern 3 und 4;

Klon 18, SEQ ID Nummern 5 und 6;

Klon 23, SEQ ID Nummern 7 und 8;

Klon 24, SEQ ID Nummern 9 und 10;

Klon 36, SEQ ID Nummern 11 und 12; und

Klon 40, SEQ ID Nummern 13 und 14.

Keiner dieser Klone enthält Introns, und ihre vergleichende Gegenüberstellung ist in 3 zu sehen.

Auf der Ebene der Aminosäuresequenz weist der DRR-1-Klon der Ratte eine Identität zu den menschlichen Klonen von 47% bis 49% auf.

Auf der Ebene der Nukleinsäuren weist der DRR-1-Klon der Ratte zu den menschlichen Klonen eine Identität von 56% bis 58% auf. Das Niveau der Sequenzidentität innerhalb der menschlichen Klone (7, 18, 23, 24, 36, 40) liegt sehr hoch, zwischen 77% und 98% auf der Ebene der Aminosäuresequenz. Alle menschlichen Sequenzen wurden als Abfragesequenzen zur Suche nach Homologien in öffentlichen Datenbanken (Genbank, Swissprot, EST) verwendet. Dabei wurden keine identischen Sequenzen nachgewiesen. Die größten Übereinstimmungen gab es mit Mitgliedern der Mas-Oncogenfamilie von Proteinen. Die Aminosäuresequenzgesamthomologie zwischen DRR-1 der Ratte und einem der isolierten menschlichen Gene schwankte zwischen 47 und 50%. Allerdings zeigen manche Abschnitte ein wesentlich höheres Sequenzhomologieniveau, insbesondere die Bereiche, die für die putative Transmembrandomäne III und VII (TM3 und TM7) sowie die intrazellulären Schleifen 2 und 3 codieren, wo die Homologie zwischen der Rattensequenz und ihrem menschlichen Homolog um 80% beträgt.

Beispiel 3: In-situ-Hybridisierungsexperimente

Gewebepräparation: Erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten (-300 g: Charles River, St-Constant, Quebec) wurden durch Enthaupten getötet. Gehirn und Rückenmark mit daran befindlichen dorsalen Wurzelganglien wurden entfernt, in Isopentan 20 s bei –40°C schockgefroren und bei –80°C gelagert. Gefrorenes menschliches Gehirn, Rückenmark sowie dorsale Wurzelganglien wurden aus der Brain and Tissue Bank for Developmental Disorders, University of Maryland at Baltimore, nach den strengsten ethischen Richtlinien erhalten. Das gefrorene Gewebe wurde bei 14 m im Microm HM 500 M-Cryostat (Deutschland) geschnitten und unter Auftauen auf ProbeOn Plus-Objektträgern (Fisher Scientific, Montreal, Quebec) aufgezogen. Die Schnitte wurden vor der in-situ-Hybridisierung bei –80°C gelagert.

Synthese von Riboprobes: Das Plasmid pGemT-3b32 GPCR wurde mit einem der Restriktionsenzyme SacII und Not I linearisiert. Sense- und Antisense-DRR-Riboprobes wurden in vitro unter Verwendung von entweder T7- oder SP6-RNA-Polymerase (Pharmacia Biotech) jeweils in Gegenwart von [35S]UTP (-800 Ci/mmol; Amersham, Oakville, Ontario) transkribiert. Das Plasmid pGemT-Clone 36 GPCR wurde mit den Restriktionsenzymen SacII und Pst 1 linearisiert. Sense- und Antisense-Clon36-Riboprobes wurden in vitro unter Verwendung von entweder SP6- oder T7-RNA-Polymerase (Pharmacia Biotech) jeweils in Gegenwart von [35S]UTP transkribiert. Nach der Transkription wurde die DNA-Matrize mit DNAse I (Pharmacia) verdaut Riboprobes wurden durch Extraktion mit Phenol/Chloroform/Isoamyl-Alkohol gereinigt und in 70% Ethanol mit Ammoniumacetat und tRNA gefällt. Die Qualität der markierten Riboprobes wurde durch Polyacrylamid-Harnstoffgelelektrophorese verifiziert.

In-situ-Hybridisierung: Die Schnitte wurden in 4% Paraformaldehyd (BDH, Poole, England) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) 10 min bei Raumtemperatur (RT) nachfixiert und bei drei Wechseln von 2X Standard-Natriumcitratpuffer (SSC: 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0) gespült. Die Schnitte wurden dann in 0,1 M Triethanolamin äquilibriert, mit 0,25% Essigsäureanhydrid in Triethanolamin versetzt, in 2X SSC gespült und in einer Ethanolreihe (60–100%) dehydratisiert. Die Hybridisierung wurde in einem Puffer mit 75% Formamid (Sigma, St-Louis, Mo), 600 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 7,5), 1 mM EDTA, 1 X Denhardt-Lösung (Sigma), 50 (g/ml denaturierte Lachssperma-DNA (Sigma), 50 (g/ml Hefe-tRNA (Sigma), 10% Dextransulfat (Sigma), 20 mM Dithiothreitol und [35S]UTP-markierte cRNA-Sonden (10 X 106 cpm/ml) 18 h in luftbefeuchteten Kammern bei 55°C durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurden die Objektträger in 2X SSC bei RT gespült, mit 20 (g/ml RNase IA (Pharmacia) in RNase-Puffer (10 mM Tris, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) 45 min bei RT behandelt und bis zu einer endgültigen Stringenz von 0,1X SSC bei 65°C gewaschen. Die Schnitte wurden dann dehydratisiert und 21 Tage auf Kodak Biomax MR-Film exponiert und/oder in 1:1 mit destilliertem Wasser verdünnte Kodak NTB2-Emulsion getaucht und 4–6 Wochen bei 4°C exponiert, bevor die Entwicklung sowie Gegenfärbung mit Cresylviolett-Acetat (Sigma) durchgeführt wurde.

Ergebnisse: Von allen untersuchten Bereichen innerhalb des Neuraxons der Ratte wurde DRR-1-mRNA ausschließlich in dorsalen Wurzelganglien exprimiert. Die hochauflösende Emulsionsautoradiographie zeigte Anhäufungen von Silberkörnchen ausschließlich über kleinen und einigen mittelgroßen Neuronen. Dieses einzigartige und hochrestriktive Verteilungsmuster für DRR-1 wurde im Rattenembryo bestätigt. Ein Sagittal-Schnitt eines E17-Rattenfötus zeigte, daß die DRR-1-mRNA auf DRGs begrenzt ist. Allen anderen Strukturen des Rattenembryos fehlte jegliches spezifisches Hybridisierungssignal, was die hochselektive Art der DRR-1-Expression untermauert.

Die Expression des menschlichen Clone 36-Rezeptors war in menschlichen fötalen dorsalen Wurzelganglien, jedoch nicht im Rückenmark vorhanden. Ein spezifisches Hybridisierungssignal für Clone 36 konnte bislang in keinem der untersuchten menschlichen erwachsenen ZNS-Gewebe nachgewiesen werden. Dazu gehören das Rückenmark, die Hirnrinde, der Hippocampus, der Thalamus, die Substantia nigra und das Griseum centrale (Daten nicht gezeigt). Das Vorhandensein von Clone 36-mRNA in Adulten DRGs muß noch untersucht werden. Standardkontrollen, bei denen zusätzliches Rückenmark mit DRG-Abschnitten mit 35S markierten Ratte-DRR-1-Antisense- oder Clone-36-Sense-Sonden hybridisiert wurden, zeigten kein spezifisches Hybridisierungssignal.

Beispiel 4: Northern Blots

Mehrere jeweils 2 g polyA-RNA aus verschiedenen Geweben enthaltende kommerzielle Northern-Blots der Ratte und des Menschen (Clontech) wurden zur Bestimmung der Expression und Verteilung der Ratte-DRR-1-Message und seiner menschlichen Homologen verwendet. Radioaktiv markierte Sonden wurden dabei wie folgt hergestellt: fünfundzwanzig ng eines 650 bp großen 3b-32-PCR-Fragments, abgeleitet von Ratte-DRR-1 (siehe Beispiel 1) oder menschlichem Clone 36, wurden in einem „Random Priming" unter Verwendung des Ready-to-Go-DNA-Markierungskits (Pharmacia Biotech) sowie [32P]CTP (3000 Ci/mmol/Amersham) markiert. Der Blot wurde 1 Stunde bei 68°C unter Verwendung von Expresshyb (Clontech) vorhybridisiert und anschließend eine Stunde bei den gleichen Bedingungen hybridisiert (2X 106 cpm/ml Sonde). Die Blots wurden bei Raumtemperatur in 2X SSC, 0,05% SDS 30 min lang gewaschen und anschließend 3X in 0,2X SSC, 1% SDS bei 50°C jeweils 60 min lang gewaschen und 6 Tage bei –80°C auf Kodak Biomax-Film exponiert.

Expression und Verteilung von Ratte-DRR-1: Alle untersuchten Rattengewebe (Herz, Hirn, Milz, Lunge, Skelettmuskel, Niere und Testis) waren nach 2 Wochen Exposition hinsichtlich der Expression von DRR-1 negativ, wohingegen eine Southern-Analyse des Rattengenoms eine 1,1 kb große Bande bei Verwendung des gleichen cDNA-Fragments als Sonde zeigte.

Expression und Verteilung des menschlichen Clone 36: Northern-Blots mit RNA aus verschiedenen menschlichen Geweben wurden mit einem radioaktiv markierten DNA-Fragment von Clone 36 als Sonde behandelt. Alle untersuchten menschlichen Gewebe (menschliches fötales Gehirn, fötale Lunge, Leber und Niere sowie menschliches adultes Kleinhirn, Großhirnrinde, Medulla, Polus occipitalis, Vorderlappen, Schläfenlappen, Putamen, Rückenmark, Amygdala, Nucleus caudatus, Corpus callosum, Hippocampus, Gesamthirn, Corpus Luys und Thalamus) waren nach 2 Wochen Exposition negativ hinsichtlich der Expression dieses Rezeptors.

Beispiel 5: Calciumsignalgebung als Antwort auf Angiotensin I-III

Die codierende Sequenz des menschlichen Klons 24 wurde in einen pcDNA3-Vektor überführt und so modifiziert, daß ein Hämaglutinin-Tag am C-Terminus der Rezeptorsequenz angefügt wurde. Dieser Klon mit der Bezeichnung pcDNA3-HML-HA24 wurde in HEK293-Zellen unter Verwendung eines modifizierten CaCl2-Verfahrens (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) transfiziert. Die Zellen wurden bei 37°C, 5% CO2 im Kulturmedium gehalten und alle 3 Tage 10fach verdünnt.

Die Zellen wurden in 90-mm-Gewebekulturschalen (5 × 105 Zellen pro Kolben) in DMEM (Dulbecco's Modified Essential Medium, Gibco BRL) supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 U/ml Penicillin, 100 &mgr;g/ml Streptomycin und 0,25 &mgr;g/ml Fungizon, inokuliert. Einen Tag nach der Inokulation wurden die Zellen mit 30 &mgr;g Plasmid-DNA pro Schale transient transfiziert. Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Transfektion zur Analyse geerntet.

Die Expression des Gens wurde zunächst durch Immunpräzipitation und Western-Blotting mit einem Anti-Hämaglutinin-Antikörper überprüft. Dabei wurde ein Protein mit einer Größe von ungefähr 43 KD sowohl in stabil als auch transient transfizierten HEK293-Zellen, jedoch nicht in Kontrollzellen nachgewiesen.

Stabil transfizierte HEK293-Zellen wurden nach ungefähr 21 Tagen Selektion in Kulturmedium mit 800 &mgr;g/ml G418 erhalten. Die Calciumsignalgebungsmessung wurde mit einer dieser stabil transfizierten Zellinien, 293/pcDNA3-HML-HA24, durchgeführt. Die Zellen wurden auf 24-mm-runden Glasobjektträgern bis 50–70% Konfluenz angezogen. Nach dem Spülen der Zellen mit 1,8 NBS-Puffer (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM Glucose und 10 mM HEPES, pH 7,3) wurden diese eine Stunde bei Raumtemperatur in Gegenwart von 0,5 ml 3,5 &mgr;M FURA-2 AM (Molecular Probe, F-1221) verdünnt in 1.8 NBS, inkubiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit 1.8 NBS gespült und weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Calciumverdrängung wurde an einem mit einem Mehrfachwellenlängenilluminator PTI Delta RAM High Speed, einem PTI SC500 Shutter-Kontrollgerät, einer PTI LPS220 ARC-Lampenvorrichtung sowie der PTI FELIX-Software, v. 1.2 ausgestatteten Photometer D104 von PTI (Photon Technology International) gemessen. Dabei wurden Gruppen von 2 bis 8 Zellen gewählt und über die Photometerblende isoliert. Die Zellen wurden Licht von 340 und 380 nm ausgesetzt, wobei das von den Zellen emittierte Licht von 510 nm aufgezeichnet wurde. Angiotensin I, II und III wurden nacheinander – in unterschiedlicher Reihenfolge von einem Experiment zum nächsten – zugegeben, und anschließend wurde als positive Kontrolle Bradykinin zugegeben. Nach Stimulierung mit Angiotensin II und Angiotensin III wurde eine signifikante Reaktion erhalten. Die Zugabe von Angiotensin I führte zu keiner Reaktion.


Anspruch[de]
Weitgehend reines Protein, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:1. Weitgehend reines Polynukleotid, codierend für ein die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:1 umfassendes Protein. Polynukleotid nach Anspruch 2, wobei das Polynukleotid die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:2 umfaßt. Weitgehend reines Protein, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3. Weitgehend reines Polynukleotid, codierend für ein die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3 umfassendes Protein. Polynukleotid nach Anspruch 5, wobei das Polynukleotid die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:4 umfaßt. Weitgehend reines Protein, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:5. Weitgehend reines Polynukleotid, codierend für ein die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:5 umfassendes Protein. Polynukleotid nach Anspruch 8, wobei das Polynukleotid die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:6 umfaßt. Weitgehend reines Protein, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:7. Weitgehend reines Polynukleotid, codierend für ein die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:7 umfassendes Protein. Polynukleotid nach Anspruch 11, wobei das Polynukleotid die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:8 umfaßt. Weitgehend reines Protein, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:9. Weitgehend reines Polynukleotid, codierend für ein die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:9 umfassendes Protein. Polynukleotid nach Anspruch 14, wobei das Polynukleotid die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:10 umfaßt. Weitgehend reines Protein, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:11. Weitgehend reines Polynukleotid, codierend für ein die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:11 umfassendes Protein. Polynukleotid nach Anspruch 17, wobei das Polynukleotid die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:12 umfaßt. Weitgehend reines Protein, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:13. Weitgehend reines Polynukleotid, codierend für ein die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:13 umfassendes Protein. Polynukleotid nach Anspruch 20, wobei das Polynukleotid die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:14 umfaßt. Expressionsvektor zur Expression des DRR-1 (Dorsal Root Receptor-1) der Ratte, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 2 oder 3. Expressionsvektor zur Expression eines der folgenden:

i. menschlicher DRR-1, wobei der Vektor das Polynukleotid nach Anspruch 5 oder 6 umfaßt;

ii. menschlicher DRR-2, wobei der Vektor das Polynukleotid nach Anspruch 8 oder 9 umfaßt;

iii. menschlicher DRR-3, wobei der Vektor das Polynukleotid nach Anspruch 11 oder 12 umfaßt;

iv. menschlicher DRR-4, wobei der Vektor das Polynukleotid nach Anspruch 14 oder 15 umfaßt;

v. menschlicher DRR-5, wobei der Vektor das Polynukleotid nach Anspruch 17 oder 18 umfaßt;

vi. menschlicher DRR-6, wobei der Vektor das Polynukleotid nach Anspruch 20 oder 21 umfaßt.
Wirtszelle, transformiert mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 22 oder 23. Rekombinanter DRR-1 der Ratte, menschlicher DRR-1, menschlicher DRR-2, menschlicher DRR-3, menschlicher DRR-4, menschlicher DRR-5, menschlicher DRR-6, produziert von der Wirtszelle nach Anspruch 24. Verfahren zum Testen einer Testverbindung auf ihre Fähigkeit zur Bindung eines DRR (Dorsal Root Receptor), wobei man in dem Verfahren:

a) eine DRR gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 oder SEQ ID NO:13 enthaltende Quelle, die jedoch weitgehend frei von anderen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren ist, mit

i) Angiotensin II und

ii) der Testverbindung

inkubiert und

b) das Ausmaß, in dem die Bindung des Liganden durch die Testverbindung verdrängt wird, bestimmt.
Verfahren zur Bestimmung, ob es sich bei einer Testverbindung um einen Agonisten eines DRR handelt, wobei man in dem Verfahren

a) eine einen DRR gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 oder SEQ ID NO:13 exprimierende Zelle mit der Testverbindung inkubiert und

b) bestimmt, ob die Testverbindung einen statistisch signifikanten Anstieg entweder der intrazellulären Adenylcyclaseaktivität oder der intrazellulären Calciumkonzentration verursacht.
Verfahren zur Bestimmung, ob es sich bei einer Testverbindung um einen Antagonisten eines DRR handelt, wobei man in dem Verfahren

a) ein für einen DRR gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 oder SEQ ID NO:13 codierendes DNA-Molekül in einen Expressionsvektor einbaut, so daß es mit einem Promotor operativ verknüpft ist,

b) den Expressionsvektor in eine Wirtszelle transfiziert,

c) in Schritt b) transfizierte Zellen, die konstitutiv aktivierten DRR aufweisen, wie entweder anhand

i) eines statistisch signifikanten Anstiegs der intrazellulären Adenylcyclaseaktivität oder

ii) eines statistisch signifikanten Anstiegs der intrazellulären Calciumkonzentration ersichtlich ist, selektioniert,

d) die in Schritt c) selektionierten Zellen mit der Testverbindung in Kontakt bringt und

e) bestimmt, ob die Testverbindung gegenüber Kontrollzellen, die nicht mit der Testverbindung in Kontakt gebracht wurden, einen statistisch signifikanten Anstieg entweder der Adenylcyclaseaktivität oder der Calciumkonzentration verursacht.






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com