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Dokumentenidentifikation DE69835834T2 12.04.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001054933
Titel CHEMIELUMINESZIERENDE REAKTIONEN UNTER VERWENDUNG VON DIHYDROXYLIERTEN AROMATEN UND HETEROCYCLISCHEN ENOLPHOSPHATEN
Anmelder Lumigen, Inc., Southfield, Mich., US
Erfinder AKHAVAN-TAFTI, Hashem, Howell, MI 48843, US
Vertreter Müller-Boré & Partner, Patentanwälte, European Patent Attorneys, 81671 München
DE-Aktenzeichen 69835834
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 12.06.1998
EP-Aktenzeichen 989288824
WO-Anmeldetag 12.06.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/US98/11489
WO-Veröffentlichungsnummer 1999040161
WO-Veröffentlichungsdatum 12.08.1999
EP-Offenlegungsdatum 29.11.2000
EP date of grant 06.09.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.04.2007
IPC-Hauptklasse C09K 3/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12Q 1/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07F 9/06(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C09K 11/06(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft chemolumineszente Verfahren und Zusammensetzungen zur Erzeugung von Chemolumineszenz. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Erzeugung von Chemolumineszenz, die das Umsetzen einer dihydroxyaromatischen Verbindung und einer heterozyklischen Enolphosphatverbindung in der Anwesenheit von Sauerstoff umfassen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch chemolumineszente Verfahren und Zusammensetzungen zur Erzeugung von Chemolumineszenz durch die Wirkung einer Hydrolase. Die Verfahren zur Erzeugung von Chemolumineszenz umfassen das Umsetzen der Hydrolase mit einer geschützten dihydroxyaromatischen Verbindung, in der eine der Hydroxylgruppen mit einer Enzym-spaltbaren Gruppe geschützt ist, um die dihydroxyaromatische Verbindung zur Reaktion mit einer heterozyklischen Enolphosphatverbindung freizusetzen, um Chemolumineszenz zu erzeugen. Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der erfindungsgemäßen chemolumineszenten Verfahren in Assays zur Detektion von Analyten, die Hydrolasen und Enzym-markierte, spezifische Bindungspartner in spezifischen Bindungspaar-Assays, die Immun-Assays und Nukleinsäure-Sonden-Assays einschließen, einschließen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG 1. Chemolumineszente Detektion von Hydrolasen

Hydrolasen, wie alkalische Phosphatase und &bgr;-Galaktosidase werden häufig als Marker oder Markierungen in Enzym-gekoppelten Assays für biologische Moleküle oder andere Analyten von Interesse, wie Medikamente, Hormone, Steroide und Krebsmarker verwendet. Außerdem sind Phosphataseenzyme, z. B. alkalische Phosphatase (AP) und saure Phosphatase (= Säurephosphatase) (AcP), selber in Human- und Veterinärdiagnostik klinisch signifikant. Die chemolumineszente Detektion dieser Enzyme bietet ein sicheres, bequemes und sensitives Hilfsmittel, um ein quantitatives Maß für die Enzym-Menge in einer Probe oder für die Menge an Enzym-markiertem Analyten oder markiertem spezifischen Bindungspartner für einen Analyten bereitzustellen. Zahlreiche chemolumineszente Reaktionsschemata sind im Stand der Technik zur Quantifizierung der Menge von bestimmten Hydrolasen bekannt. Viele dieser Schemata sind komplex und teuer, und sie benötigen mehrere Enzyme oder verschiedene Reagenzien. Die kommerzielle Akzeptanz solcher Verfahren zur Testung großer Mengen ist gering.

a. Chemolumineszente Reaktion von Acridanverbindungen mit alkalischer Phosphatase.

Die WO-A-9726245 beschreibt eine chemolumineszente Reaktion zwischen einem Phosphataseenzym und einer Verbindung, die eine heterozyklische Ringgruppe und eine Enolphosphatgruppe umfasst. Außerdem ist die Verbesserung beschrieben, die durch das Einbeziehen einer kationischen aromatischen Verbindung in die chemolumineszente Reaktion zwischen einer Phosphatase und der heterozyklischen Enolphosphatverbindung ermöglicht wird. Im Gegensatz zu den Verfahren des Standes der Technik, beruhen die Verfahren, die in diesen Anmeldungen offenbart werden, auf der Reaktion eines Phosphataseenzyms mit dieser heterozyklischen Enolphosphatverbindung zur Spaltung der Phosphatgruppe. In den vorliegenden Verfahren wird kein Enzym zur Spaltung der Phosphatgruppe verwendet.

b. Reaktionen die die Erzeugung reduzierender Agentien einschließen.

Chemolumineszente Verfahren, die die Erzeugung eines reduzierenden Agens aus einem Phosphatester, katalysiert durch alkalische Phosphatase, einschließen, wurden beschrieben. (M. Maeda, A. Tsuji, K.H. Yang, S. Kamada, Biolum. and Chemilum. Current Status, 119–22 (1991); M. Kitamura, M. Maeda, A. Tsuji, J. Biolumin. Chemilumin., 10, 1–7 (1995); H. Sasamoto, M. Maeda, A. Tsuji, Anal. Chim. Acta, 306, 161–6 (1995)). Das reduzierende Agens reagiert mit Sauerstoff und Lucigenin, um Licht herzustellen. Repräsentative reduzierende Agentien schließen Ascorbinsäure, Glycerin, NADH, Dihydroxyaceton, Cortisol und Phenacylalkohol ein. Eine PCT-Anmeldung, die WO 96/04400, und eine Veröffentlichung (H. Arakawa, M. Maeda, A. Tsuji, Anal. Biochem., 199, 238–242 (1991)) beschreiben ebenfalls Analysen von alkalischer Phosphatase, die Indoxylphosphatverbindungen und andere verwandte Phosphatverbindungen verwenden, die bei Dephosphorylierung reduzierende Formen herstellen. Chemolumineszenz wird in der Anwesenheit von Lucigenin oder anderen Lumineszenzverstärkenden Agentien aufgrund ihrer Reaktion mit H2O2 oder dem Superoxidion hergestellt.

Das U.S.-Patent 5,589,328 von Mahant offenbart eine chemolumineszente Reaktion, bei der Indoxylester, Thioindoxylester und Benzofuranester durch ein Enzym hydrolysiert werden und dadurch Superoxid erzeugen. Die Lumineszenz wird durch das Hinzufügen eines Chemolumineszenz-erzeugenden Reagenz, wie Lucigenin, verstärkt. Lucigenin erzeugt durch die Reaktion mit Superoxid Chemolumineszenz.

c. Enzymatisch triggerbare Dioxetane.

Stabile 1,2-Dioxetane, die eine geschützte Phenol-Trigger-Gruppe tragen, durchlaufen bei der Entfernung der Schutzgruppe einen chemolumineszenten Abbau (A. P. Schaap, T.S. Chen, R.S. Handley, R. DeSilva, und B.P. Giri, Tetrahedron Lett., 1155 (1987); A.P. Schaap, R.S. Handley, und B.P. Giri, Tetrahedron Lett., 935 (1987); A.P. Schaap, M.D. Sandison, und R.S. Handley, Tetrahedron Lett., 1159 (1987); und A.P. Schaap, Photochem. Photobiol., 47S, 50S (1988)). Solche enzymatisch triggerbaren Dioxetane werden durch die Reaktion mit einer Hydrolase getriggert, um dadurch die chemolumineszente Abbaurate des Dioxetans um ein Vielfaches zu beschleunigen. Zahlreiche Beispiele für solche triggerbaren Dioxetane sind im Stand der Technik bekannt. Ein innewohnender Nachteil der meisten triggerbaren Dioxetane ist jedoch ihre Tendenz, Hintergrund-Chemolumineszenz in Abwesenheit von Enzym durch langsamen, thermischen Abbau oder nicht-enzymatische Hydrolyse zu erzeugen.

d. Luciferin-Derivate.

Phosphat- und Galactosid-Derivate des Glühwürmchen-Luciferins sind bekannt (N. Ugarova, Y. Vosny, G. Kutuzova, I. Dementieva, Biolum. and Chemilum. New Perspectives, P. Stanley und L.J. Kricka, Hrsg., Wiley Chichester, 511–4 (1981); W. Miska, R. Geiger, J. Biolumin. Chemilumin., 4, 119–28 (1989)). Die Behandlung des Glühwürmchen-Luciferin-Derivats mit dem angemessenen Enzym setzt das Glühwürmchen-Luciferin frei, welches in einem zweiten Schritt mit Luciferase und ATP umgesetzt wird, um Licht herzustellen.

e. Luminol-Derivate.

Ein Phosphat und ein NAG-Derivat des Luminol sind bekannt (K. Sasamoto, Y. Ohkura, Chem. Pharm. Bull., 38, 1323–5 (1991); M. Nakazono, H. Nohta, K. Sasamoto, Y. Ohkura, Anal. Sci., 8, 779–83 (1992)). Die Behandlung des Luminol-Derivats mit dem angemessenen Enzym setzt Luminol frei, welches in einem nachfolgenden Schritt mit Ferricyanid umgesetzt wird, um Licht herzustellen.

f. Gekoppelte Enzymverfahren.

Die PCT-Anmeldung WO 96/07911 der Anmelder offenbart die enzymatische Erzeugung eines phenolischen Verstärkers aus einer geschützten Phenolverbindung unter Verwendung von Hydrolase. Die Phenolverbindung verstärkt die chemolumineszente Oxidation der Acridancarboxylsäure-Derivate mit einem Peroxidaseenzym. Das U.S.-Patent 5,306,621 offenbart eine ähnliche gekoppelte Enzymreaktion, in der ein Dihydrophthalazindion als chemolumineszentes Peroxidasesubstrat verwendet wird. Geschützte dihydroxyaromatische Verbindungen, in denen eine der Hydroxylgruppen mit einer Gruppe geschützt ist, die durch eine Hydrolase spaltbar ist, sind nicht in diesen Verfahren verwendbar, da dihydroxyaromatische Verbindungen keine Peroxidase-Verstärker sind. Zahlreiche andere chemolumineszente Verfahren und Assays zur Bestimmung von Hydrolasen, wie Phosphataseenzyme durch gekoppelte Enzymreaktionen, sind bekannt. Eine Zusammenstellung solcher Verfahren befindet sich in A. Tsuji, M. Maeda, H. Arakawa, Anal. Sci., 5, 497–506 (1989). Alle diese gekoppelten Enzymverfahren benötigen zwei oder mehr Enzyme und verwenden entweder Luminol oder ein Luminolanalog, Lucigenin oder bakterielles Luciferin als die chemolumineszente Form.

Viele der zuvor erwähnten Verfahren haben den Nachteil, dass sie zur Erzeugung des lumineszenten Signals mehrere Reagenzien oder Enzyme benötigen. Die zusätzlichen Kosten oder die Komplexität der Handhabung haben die kommerzielle Akzeptanz dieser Verfahren trotz ihrer gezeigten außergewöhnlichen Detektionssensitivität behindert. Chemolumineszente-Verfahren zur Detektion und Quantifizierung von Hydrolasen, die diesen Grad an Sensitivität erreichen, aber keine zusätzlichen Enzyme oder Hilfsreagenzien zusätzlich zum Enzymsubstrat benötigen, wären vorteilhaft. Die vorliegende Erfindung stellt solche Verfahren und Verbindungen bereit.

2. Enzymatische Freisetzung von Elektronentransfer-Agentien (ETA) a. Colorimetrische und fluorimetrische Detektion

Das U.S.-Patent 4,952,495 offenbart und beansprucht Verfahren zur Bestimmung von Hydrolasen durch die enzymatische Bildung einer Substanz, die in der Lage ist, eine Elektronentransfer-Reaktion zu vermitteln, die zur Herstellung einer detektierbaren Form führt. In einer Ausführungsform kann das ETA eine reduzierende Substanz, wie eine substituierte Hydrochinonverbindung, umfassen. Die detektierbaren Formen bilden ein farbiges oder fluoreszentes Produkt. Es wird weiterhin gelehrt, dass die detektierbare Form eine shiftbare, detektierbare Form sein kann, die ein Chinon umfasst, das durch eine Verbindungsgruppe an eine chromogene, fluorogene oder chemoluminogene Form gebunden ist. Es gibt keine Lehre oder keinen Hinweis auf irgendeine andere chemoluminogene, detektierbare Form, als auf die shiftbare Verbindung. Es gibt keinen Hinweis oder keine Lehre über die erfindungsgemäß beschriebenen heterozyklischen Enolphosphatverbindungen.

b. Amperometrische Detektion von alkalischer Phosphatase (AP)

Es ist ein Verfahren für die amperometrische Detektion von alkalischer Phosphatase bekannt, welches die enzymatische Erzeugung von Hydrochinon aus seinem Monophosphat durch AP, die Oxidation des Hydrochinons an der Oberfläche einer Elektrode, um Benzochinon herzustellen, und die Regeneration des Hydrochinons durch das zweite Enzym Glucoseoxidase, welche Elektronen von seinem Substrat Glucose transferiert, umfasst. Die AP-Menge wird als Zunahme der elektrischen Stromstärke detektiert.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Erzeugung von Chemolumineszenz durch das Umsetzen einer dihydroxyaromatischen Verbindung mit einer zweiten Verbindung bereitzustellen, die eine heterozyklische Ringgruppe und eine Enolphosphatgruppe enthält, die in Anwesenheit von Sauerstoff eine Reaktion durchläuft, um Chemolumineszenz zu erzeugen. Das erfindungsgemäße Verfahren wird in Anspruch 15 definiert.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Erzeugung von Chemolumineszenz durch die Wirkung einer Hydrolase bereitzustellen, welches

  • a) das Umsetzen der Hydrolase mit einer geschützten dihydroxyaromatischen Verbindung, in der eine der Hydroxylgruppen durch eine durch die Hydrolase spaltbare Gruppe geschützt ist, um eine dihydroxyaromatische Verbindung herzustellen; und
  • b) das Umsetzen der dihydroxyaromatischen Verbindung mit einer heterozyklischen Enolphosphatverbindung zur Herstellung von Chemolumineszenz, umfasst.

Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, chemolumineszente Zusammensetzungen bereitzustellen, die eine dihydroxyaromatische Verbindung und eine heterozyklische Enolphosphatverbindung enthalten. Die Zusammensetzungen werden in Anspruch 1 definiert.

Ein noch weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist, Zusammensetzungen bereitzustellen, die Chemolumineszenz durch die Reaktion mit einer Hydrolase erzeugen, wobei die Zusammensetzung eine geschützte dihydroxyaromatische Verbindung, in der eine der Hydroxylgruppen durch eine Gruppe geschützt ist, die durch eine Hydrolase spaltbar ist, und eine heterozyklische Enolphosphatverbindung umfasst.

Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist, Verfahren zur Durchführung von Assays eines Analyten bereitzustellen, die das Umsetzen einer dihydroxyaromatischen Verbindung mit einer heterozyklischen Enolphosphatverbindung zur Erzeugung von Chemolumineszenz, das Messen der Chemolumineszenz und das Inbeziehungsetzen der Chemolumineszenz zur Menge des Analyten umfassen. Dieses Verfahren wird in Anspruch 32 definiert.

Ein weiteres Ziel ist, ein Verfahren zur Durchführung eines Assays eines Analyten bereitzustellen, welches das Umsetzen einer dihydroxyaromatischen Verbindung und einer heterozyklischen Enolphosphatverbindung zur Chemolumineszenz-Erzeugung, das Messen der Chemolumineszenz und das Inbeziehungsetzen der Chemolumineszenz zur Menge des Analyten umfasst, wobei die heterozyklische Enolphosphatverbindung als Markierung an einem spezifischen Bindungspaarelement bereitgestellt wird.

Ein weiteres Ziel ist, ein Verfahren zur Durchführung eines Assays eines Analyten bereitzustellen, welches das Umsetzen einer Hydrolase, einer geschützten dihydroxyaromatischen Verbindung und einer heterozyklischen Enolphosphatverbindung zur Erzeugung von Chemolumineszenz, das Messen der Chemolumineszenz und das Inbeziehungsetzen der Chemolumineszenz zur Menge des Analyten umfasst.

Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Detektion einer Hydrolase in einer Probe bereitzustellen, welches das Umsetzen der Probe, die die Hydrolase enthält oder vermeintlich enthält, in Anwesenheit einer heterozyklischen Enolphosphatverbindung mit einer geschützten dihydroxyaromatischen Verbindung, in der eine der Hydroxylgruppen durch eine Enzym-spaltbare Gruppe geschützt ist, um Chemolumineszenz herzustellen und das Inbeziehungsetzen der Chemolumineszenz zur Menge der Hydrolase in der Probe, umfasst.

Ein noch weiteres Ziel ist, ein Verfahren zur Durchführung eines Assays eines Analyten bereitzustellen, welches das Umsetzen einer Hydrolase, einer geschützten dihydroxyaromatischen Verbindung und einer heterozyklischen Enolphosphatverbindung zur Erzeugung von Chemolumineszenz, das Messen der Chemolumineszenz und das Inbeziehungsetzen der Chemolumineszenz zur Menge des Analyten umfasst, wobei die Hydrolase als Markierung eines spezifischen Bindungspaarelementes bereitgestellt wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 ist ein Diagramm, das die schnelle Erzeugung von Chemolumineszenz aus der Reaktion von Acridanphosphat 1 mit Hydrochinon bei Raumtemperatur zeigt. Das Reaktionsgemisch umfasste 0,66 mM Acridanphosphat 1 und 4 &mgr;M Hydrochinon in 2-Mehyl-2-amino-1-propanol-(221)-Puffer, 0,2 M, pH-Wert 9,6, mit ebenfalls 0,88 mM MgCl2.

2 ist ein Graph, der die Intensität der Chemolumineszenz zur Menge des Acridanphosphat 2 in Beziehung setzt. Die durch die Reaktion von 100 &mgr;l einer Reagenzzusammensetzung, die aus unterschiedlichen Mengen Acridanphosphat 2 (Verdünnungen enthielten zwischen 6,6 × 10–11 und 6,6 × 10–17 mol) in 0,2 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6, 0,88 mM MgCl2, 0,1 % SDS bestand, mit 100 &mgr;l einer 0,01 mM 2-Chlorhydrochinon-(DHA-1)-Lösung in Wasser, emittierte Chemolumineszenz, wurde nach 2,5 min gemessen.

3 ist ein Diagramm, das das Zeitprofil der Chemolumineszenz-Intensität zeigt, welches von 100 &mgr;l eines Reagenz emittiert wurde, welches aus einer 0,33 mM Acridanphosphat-1-Lösung und 1 mM 4-Hydroxyphenylphosphat in 0,1 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6 bestand und durch die Zugabe von 8 × 10–17 mol alkalischer Phosphatase (AP) bei 25 °C getriggert wurde.

4 ist ein Diagramm, das das Zeitprofil der Chemolumineszenz-Emission als eine Funktion der 4-Hydroxyphenylphosphat-Konzentration zeigt. Eine Reagenz-Zusammensetzung, die aus einer 0,33 mM Acridanphosphat-1-Lösung und 0,88 mM MgCl2 in 0,2 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6 bestand, und verschiedene 4-Hydroxyphenylphosphat-Konzentrationen enthielt (in mg/ml a, 1; b, 3,3; c, 0,66; d, 0,83; e, 10; f, 0,1; g, 0) wurde mit 8 × 10–17 mol AP bei 25 °C umgesetzt.

5 ist ein Graph, der die AP-Menge in Beziehung zur Chemolumineszenz-Intensität setzt, die durch 100 &mgr;l einer Reagenz-Zusammensetzung emittiert wurde, die 0,66 mM Acridanphosphat 1, 0,66 mM 4-Hydroxyphenylphosphat und 0,88 mM MgCl2 in 0,2 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6, umfasst. Die Zusammensetzung (100 &mgr;l), wurde bei Umgebungstemperatur in den Vertiefungen einer schwarzen Mikroplatte mit 10 &mgr;l einer AP-Lösung umgesetzt, die zwischen 8 × 10–15 und 8 × 10–20 mol des Enzyms oder 10 &mgr;l Wasser als Blindprobe enthielt. Die Lichtintensität wurde nach 25 min gemessen. Weniger als 0,1 amol AP wurde detektiert.

6 ist ein Graph, der die &bgr;-Galactosidase-Menge zur Chemolumineszenz-Intensität in Beziehung setzt. Lösungen aus 4-Hydroxyphenyl-&bgr;-galactosid (1 mM) in 0,05 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5, 0,01 M NaCl, 3 mM MgCl2, wurden bei 37 °C für 35 min mit Verdünnungen von &bgr;-Galactosidase inkubiert. Teile wurden mit gleichem Volumen einer Acridanphosphat-3-Lösung, die die folgenden Zusammensetzung aufwies, umgesetzt: 0,2 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6, 0,88 mM MgCl2, 0,66 mM Acridanphosphat 3 und 0,1 % SDS. Die Enzymmenge in den Vertiefungen betrug zwischen 4,9 × 10–15 bis 1,6 × 10–18 mol &bgr;-Galactosidase. Die Chemolumineszenz-Intensität wurde nach 5 min gemessen.

7 ist ein Graph, der die Menge an &bgr;-Glucuronidase zur Chemolumineszenz-Intensität in Beziehung setzt. Lösungen aus 4-Hydroxyphenyl-&bgr;-glucuronid (1 mM) in 0,05 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, 0,01 M NaCl, wurden bei 37 °C für 30 min mit Verdünnungen von &bgr;-Glucuronidase inkubiert. Teile wurden mit einem gleichen Volumen einer Acridanphosphat-4-Lösung, die die folgenden Zusammensetzung aufwies, umgesetzt: 0,2 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6, 0,88 mM MgCl2, 0,66 mM Acridanphosphat-4 und 0,1 % SDS. Die Enzymmenge in den Vertiefungen betrug zwischen 3,3 × 10–14 bis 3,3 × 10–18 mol &bgr;-Glucuronidase. Die Chemolumineszenz-Intensität wurde nach 11 min gemessen.

8 ist ein Bild einer Dot-Blot-Analyse von DNA-Verdünnungen, die eine Reagenz-Zusammenfassung verwendet, die 0,66 mM Acridanphosphat 4, 0,66 mM 4-Hydroxyphenylphosphat, 0,1 % SDS und 0,88 mM MgCl2 in 0,1 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6, enthält. Das Bild ist das Ergebnis einer 1 min Exponierung, aufgenommen 3 h nach Kontaktieren der Membran mit dem DetektionsReagenz.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN Definitionen:

Alkyl – eine verzweigte, geradkettige oder zyklische Kohlenwasserstoffgruppe, die 1-20 Kohlenstoffe enthält. So wie hier verwendet, bezeichnet niedrigwertiges Alkyl jene Alkylgruppen, die bis zu 8 Kohlenstoffe enthalten.

Alkenyl – eine verzweigte, geradkettige oder zyklische Kohlenwasserstoffgruppe, die mindestens eine C-C-Doppelbindung enthält und 2-20 Kohlenstoffe enthält. So wie hier verwendet, bezeichnet niedrigwertiges Alkenyl jene Alkenylgruppen, die bis zu 8 Kohlenstoffe enthalten.

Alkinyl – eine verzweigte oder geradkettige Kohlenwasserstoffgruppe, die mindestens eine C-C-Dreifachbindung enthält und 2-20 Kohlenstoffe enthält. So wie hier verwendet, bezeichnet niedrigwertiges Alkinyl jene Alkinylgruppen, die bis zu 8 Kohlenstoffe enthalten.

Analyt – eine Substanz, deren Anwesenheit oder Menge in einer Probe durch einen Assay gemessen werden soll. Analyten schließen organische und biologische Moleküle, zu denen ein spezifischer Bindungspartner mit einer spezifischen Bindungsaffinität existiert, ein. Exemplarische Analyten schließen, ohne Einschränkung, einzelsträngige oder doppelsträngige DNA, RNA, DNA-RNA-Komplexe, Oligonukleotide, Antikörper, Antikörperfragmente, Antikörper-DNA-Chimäre, Antigene, Haptene, Proteine, Lectine, Avidin, Streptavidin und Biotin ein. Weitere exemplarische Analyten schließen Hydrolasen, Hydrolase-Inhibitoren und dihydroxyaromatische Verbindungen ein.

Aryl – eine aromatische Ring-enthaltende Gruppe, die 1 bis 5 carbozyklische aromatische Ringe enthält, die mit einem oder mehreren Substituenten, die nicht H sind, substituiert werden können.

Biomedizinische Analyse – Analysen von Proben biologischen Ursprungs auf Analyten von Interesse. Die Analysen können Immunassays, Western Blots, Northern Blots, Southern Blots, DNA-Hybridisierungsassays, DNA-Sequenzanalyse, Kolonie-Hybridisierungen, Genexpressionsanalyse, High throughput-Arzneimittel-Screening oder Detektion von infektiösen Agentien oder Pathogenen sein.

Dihydroxyaromatische Verbindung – eine aromatische Ringverbindung, die ein aromatisches Ringsystem umfasst, welches wiederum mindestens einen carbozyklischen Ring und bis zu fünf Ringe umfasst, und welches mit zwei Hydroxylgruppen substituiert ist, die durch eine gerade Anzahl von Ringkohlenstoffatomen getrennt sind. Dieses Substitutionsmuster wird durch das Ortho- und Parasubstitutionsmuster an einem Benzolring und durch z. B. das 1,2-, 1,4- oder 2,6-Substitutionsmuster an einem Naphthalinring dargestellt. Dihydroxysubstituierte Biaryl-Ringsysteme wie Biphenyl und Binaphthyl werden als im Schutzumfang der Definition liegend erachtet, mit der Einschränkung, dass eine gerade Zahl an Ringkohlenstoffatomen vorhanden ist, die die beiden Hydroxylgruppen trennt. Eine dihydroxyaromatische Verbindung kann mit zusätzlichen Hydroxylgruppen, d.h. Trihydroxyl, Tetrahydroxyl, usw. substituiert sein und weiterhin im Schutzumfang der Definition liegen, vorausgesetzt, dass mindestens ein Hydroxylgruppen-Paar durch eine gerade Anzahl an Ringkohlenstoffatomen getrennt ist.

Halogen – Fluor-, Chlor-, Brom- oder Iodatome.

Probe – eine Flüssigkeit, die einen oder mehrere zu analysierende Analyten enthält oder vermutlich enthält. Typische Proben, die mit dem chemolumineszenten Reaktionsverfahren analysiert werden, sind biologische Proben, die Körperflüssigkeiten wie Blut, Plasma, Serum, Urin, Samen, Speichel, Zelllysate und Gewebeextrakte einschließen. Andere Probentypen schließen Nahrungsmittelproben und Umweltproben wie Boden oder Wasser ein.

Spezifisches Bindungspaar – zwei Substanzen, die eine wechselseitige Bindungsaffinität besitzen. Beispiele schließen Antigen-Antikörper, Hapten-Antikörper oder Antikörper-Antikörperpaare, komplementäre Oligonukleotide oder Polynukleotide, Avidin-Biotin, Streptavidin-Biotin, Hormon-Rezeptor, Lectin-Kohlenhydrat, IgG-Protein A, Nukleinsäure-Nukleinsäure-Bindungsprotein und Nukleinsäure-Antinukleinsäuren-Antikörper ein.

Es sollte erwähnt werden, dass bei Bezugnahme auf „eine heterozyklische Enolphosphatverbindung" oder „eine dihydroxyaromatische Verbindung" oder „eine geschützte dihydroxyaromatische Verbindung" gemeint ist, dass mehr als eine der beschriebenen Formen eingeschlossen ist, außer es ist eindeutig nur der Einzelfall bezeichnet.

Unenrwarteterweise wurde herausgefunden, dass bestimmte dihydroxyaromatische Verbindungen, die ein aromatisches Ringsystem umfassen, welches mit mindestens zwei Hydroxylgruppen substituiert ist, die durch eine gerade Anzahl an Ringkohlenstoffatomen getrennt sind, in der Anwesenheit von Sauerstoff mit einer zweiten Verbindung reagieren, die eine heterozyklische Enolphosphatverbindung ist, die eine heterozyklische Ringgruppe und eine Enolphosphatgruppe enthält, um einfach detektierbare Chemolumineszenz zu erzeugen. Exemplarische aromatische Ringsysteme, die in den erfindungsgemäßen dihydroxyaromatischen Verbindungen enthalten sind, umfassen Benzol-, Biphenyl-, Naphthalin-, Anthracen-, Phenanthren-, Pyren-, Benzopyren- und Naphthacen-Ringsysteme.

Eine bevorzugte Gruppe dihydroxyaromatischer Verbindungen weist die Formel I, auf, wobei mindestens eines von R1 und R3 eine OH-Gruppe ist, das andere von R1 oder R3 und R2, R4 und R5 jeweils unabhängig aus Wasserstoff-, Alkyl-, Alkoxy-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl-, Amino-, Aminoalkyl-, Carboxyl- -C(=O)OH, Carboxylester- -C(=O)OR6, Formyl- -C(=O)H, Alkylcarboxy- -OC(=O)R6, Arylcarboxy- -OC(=O)R9 und Halogengruppen ausgewählt sind, wobei Paare benachbarter Gruppen, wenn zusammengenommen, einen fünf- oder sechsgliedrigen aliphatischen oder aromatischen Ring vervollständigen können, und wobei R6 eine niedrigwertige Alkylgruppe ist, wobei R7 und R8 jeweils H oder eine niedrigwertige Alkylgruppe sind und wobei R9 eine Arylringgruppe ist.

Weiter bevorzugte Verbindungen der Formel I sind diejenigen Verbindungen, in denen R3 die OH-Gruppe ist, und R1, R2, R4 und R5 unabhängig aus Wasserstoff-, Alkyl-, Alkoxy-, Halogen-, Aryl- und Aralkylgruppen ausgewählt sind. Noch weiter bevorzugt sind R2, R4 und R5 jeweils Wasserstoff, und R1 ist ausgewählt aus Wasserstoff-, Alkyl-, Alkoxy-, Halogen-, Aryl- und Aralkylgruppen.

Es wird erkannt, dass andere dihydroxyaromatische Verbindungen zusätzlich zu denen mit den am selben sechsgliedrigen Ring substituierten zwei Hydroxylgruppen innerhalb des Schutzumfangs der dihydroxyaromatischen Verbindungen liegen und in den erfindungsgemäßen Verfahren wirksam sind. Dihydroxyaromatische Verbindungen, die ein biaromatisches Ringsystem enthalten, in dem die Hydroxylgruppen an verschiedenen sechsgliedrigen Ringen liegen, sind exemplarisch. Einige bestimmte Beispiele dihydroxyaromatischer Verbindungen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind in Tabelle 1 zum Zweck der Darstellung und nicht zur Definition des Schutzumfangs der Erfindung aufgelistet.

Heterozyklische Enolphosphatverbindungen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, und Zusammensetzungen zur Herstellung von Chemolumineszenz, weisen die Formel auf, wobei R10 eine organische Gruppe ist, die bis zu 50 Nicht-Wasserstoffatome, ausgewählt aus C-, N-, O-, S-, P- und Halogenatomen, enthält, jedes von R11–R18unabhängig aus Wasserstoff, Alkyl-, substituierten Alkyl-, Aryl-, substituierten Aryl-, Aralkyl-, substituierten Aralkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Halogen, Amino-, substituierten Amino-, Carboxyl-, Carboalkoxy-, Carboxamid-, Cyano- und Sulfonatgruppen ausgewählt ist, und wobei Paare benachbarter Gruppen einen benzo-kondensierten Ring vervollständigen können, R19 eine organische Gruppe ist, die bis zu 50 Nicht-Wasserstoffatome, ausgewählt aus C-, N-, O-, S-, P- und Halogenatomen, enthält, Z aus O- und S-Atomen ausgewählt ist, jedes M unabhängig aus H und einem kationischen Zentrum ausgewählt ist und n eine Zahl ist, die Elektroneutralität genügt, und mit der Maßgabe, dass jegliches von R11–R18 oder ein Substituent an jeglichem von R10–R19 eine Gruppe -A-Q sein kann, wobei A eine Spacergruppe, ausgewählt aus C1-C10 Alkylen- und C2-C10 Oxyalkylengruppen ist, und Q eine zur Bildung einer kovalenten Bindung fähige Verbindungsgruppe, ausgewählt aus Halogen, Diazo-, -NCO-, -NCS-, -CHO-, Säureanhydrid-, Oxiranyl-, Succinimidoxycarbonyl-, Maleimid-, Cyano-, Triazol-, Tetrazol-, Hydroxyl-, -COOH-, Thiol-, primären Amino- und sekundären Aminogruppen ist. In Verbindungen der Formel III können, dort wo Doppelbindungsisomere möglich sind, Gemische der Doppelbindungsisomere verwendet werden.

Unter erneuter Bezugnahme auf Formel III, schließen exemplarische Ringstrukturen die unten aufgeführten Strukturen ein, in denen der Stern die Position der exozyklischen Doppelbindung markiert. Ohne explizit alle möglichen Substitutionsmuster zu zeigen, ist es so zu verstehen, dass jede Ringposition andere Substituenten als Wasserstoff enthalten kann.

Die Gruppe R19 ist vorzugsweise aus Alkyl-, substituierten Alkyl-, Aryl-, substituierten Aryl-, Aralkyl- und substituierten Aralkylgruppen ausgewählt. Weiter bevorzugte Gruppen für R19 schließen substituierte und unsubstituierte niedrigwertige Alkylgruppen und substituierte und unsubstituierte Benzylgruppen ein.

In allen der oben genannten Verbindungen, sind die Gruppen R11–R18 jeweils unabhängig H oder eine Substituentengruppe, die die Lichtherstellung erlaubt und allgemein 1 bis 50 Atome, ausgewählt aus C-, N-, O-, S-, P- und Halogenatomen, enthalten. Repräsentative Substituentengruppen, die vorhanden sein können, schließen, ohne Einschränkungen, Alkyl-, substituierte Alkyl-, Aryl-, substituierte Aryl-, Aralkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Halogen-, Amino-, substituierte Amino-, Carboxyl-, Carboalkoxy-, Carboxamid-, Cyano- und Sulfonatgruppen ein. Paare von benachbarten Gruppen, z.B. R11–R12, können zusammengefügt werden, um einen benzo-kondensierten Ring zu bilden. Spezifische Substituenen und ihre Wirkungen sind in den unten aufgeführten, spezifischen Beispielen dargestellt, die aber nicht dahingehend erachtet werden, den Schutzumfang der Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.

Jede der Gruppen M ist unabhängig ein Wasserstoffatom oder ein kationisches Zentrum. Ein kationisches Zentrum bedeutet ein positiv geladenes Atom, wie ein Natriumion Na+, eine Gruppe von Atomen, wie ein Ammoniumion NH4 + oder ein Teil eines Moleküls mit einer oder mehreren positiv geladenen Stellen. Beispiele zu Letzterem schließen die kationischen Verbindungen, die in dem U.S.-Patent 5,451,347 des Anmelders beschrieben sind und polymerische Verbindungen mit multiplen kationischen Gruppen, wie im U.S.-Patent 5,393,469 des Anmelders beschrieben, ein. Die positive Ladung eines kationischen Zentrums kann jeden Einheitswert annehmen, d.h. 1, 2, 3, usw. Exemplarische kationische Zentren schließen, ohne Einschränkung, Alkalimetallionen, Erdalkaliionen, vierwertige Ammoniumionen und vierwertige Phosphoniumionen ein, und sie sind in der Zahl anwesend, die bei ihrer Valenz benötigt wird. Wenn zur Elektroneutralität in der Verbindung von Formel I zwei Gruppen anwesend sein müssen, können sie gleich oder verschieden sein. Bevorzugte Gegenionen sind die Alkalimetallionen. Weiter bevorzugt sind Natrium- und Kaliumionen.

Die organische Gruppe R10 kann jede Gruppe sein, die Lichtherstellung erlaubt. Das bedeutet, dass die Anwesenheit jeder Gruppe als R10-Gruppe nicht die Fähigkeit der Verbindung aus Formel III verhindert, letztendlich Chemolumineszenz herzustellen. Letzteres bedeutet, dass, wenn eine Verbindung der Formel III mit der dihydroxyaromatischen Verbindung in Anwesenheit von Sauerstoff umgesetzt wird, sofort Chemolumineszenz hergestellt wird, und diese die Herstellung von einem oder mehreren chemolumineszenten Intermediaten einschließen kann.

Die Gruppe R10 enthält 1 bis 50 Atome, die aus C-, N-, O-, S-, P- und Halogenatomen ausgewählt sind, ohne die nötige Zahl an Wasserstoffatomen, die benötigt werden, um den Valenzen der Atome in der Gruppe zu entsprechen. Gruppen, die eine Funktion als R10-Gruppe haben können, schließen, ohne Einschränkungen, Alkyl-, substituierte Alkyl-, Aryl-, substituierte Aryl-, Aralkyl- und substituierte Aralkylgruppen ein. Substituenten-Gruppen, anders als H-Atome, wie ionische Gruppen oder polare Gruppen, können in verschiedener Zahl und an ausgewählten Positionen in die Kohlenstoffkette oder den Ring von R10 eingefügt werden, um die Eigenschaften der Verbindung zu modifizieren, oder um eine Erleichterung der Synthese der endgültigen Phosphatverbindung bereitzustellen. Solche Eigenschaften schließen zum Beispiel die chemolumineszente Quantenausbeute, die Reaktionsgeschwindigkeit mit dem Enzym, die maximale Intensität der Lichtemission, die Dauer der Lichtemission, die Wellenlänge der Lichtemission und die Löslichkeit im Reaktionsmedium ein. Spezifische Substituenten und ihre Wirkungen sind in den spezifischen Beispielen unten dargestellt, die in keiner Art und Weise gedacht sind, den Schutzumfang der Erfindung einzuschränken.

Eine bevorzugte Klasse von Verbindungen weist die unten gezeigte Formel IIIa auf, wobei Z ein O- oder S-Atom ist, wobei R19 eine niedrigwertige Alkylgruppe ist und wobei Ar eine Arylringgruppe ist, die mindestens einen carbozyklischen aromatischen Ring enthält und die weiter substituiert werden kann.

Die Gruppen R11 bis R18, die gleich oder verschieden sein können, sind jeweils ein Substituent, der 1 bis 50 Atome enthalten kann, ausgewählt aus C-, H-, N-, O-, S-, P- und Halogenatomen und welcher die Lichtherstellung erlaubt und Alkyl-, substituierte Alkyl-, Aryl-, substituierte Aryl-, Aralkyl- wie Benzyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Halogen-, Amino-, substituierte Aminogruppen, Carboxyl-, Carboalkoxy-, Carboxamid-, Cyano- und Sulfonatgruppen einschließt. In einem bevorzugten Satz von Verbindungen sind die Gruppen R11 bis R18 aus Wasserstoff und niedrigwertigen Alkoxygruppen wie Methoxy, Ethoxy und t-Butoxy ausgewählt. Andere bevorzugte Verbindungen weisen die Formel IIIb auf, wobei Z O oder S ist und Ar aus einer Phenylgruppe, einer substituierten Phenylgruppe oder einer Naphthylgruppe ausgewählt ist.

Ein anderer bevorzugter Satz heterozyklischer Enolphosphatverbindungen enthält eine Gruppe -A-Q, die die Verwendung der Verbindung als Markierung erlaubt. Bevorzugte Markierungsverbindungen enthalten die Gruppe -A-Q als Substituent an R10 oder R19 oder an irgendeiner der Positionen R11–R18. Beispiele von heterozyklischen Enolphosphat-Markierungs-Verbindungen weisen die Formeln IIIc, d oder e auf.

In der Gruppe -A-Q ist A eine Spacer-Gruppe, ausgewählt aus C1-C10-Alkylengruppen und C2-C10-Oxalkylengruppen, und Q ist eine Verbindungsgruppe, die fähig ist, eine kovalente Bindung mit einem Molekül, das wie ein Analyt oder ein spezifischer Bindungspartner konjugiert werden kann, zu bilden. Die Verbindungsgruppen Q können elektrophile Reste, wie Halogen, Diazo-, -NCO-, -NCS-, -CHO-, Säureanhydrid-, Oxiranyl-, Succinimidoxycarbonyl-, Maleimid-, Cyano-, Triazol- und Tetrazolgruppen sein, wie sie allgemein im Stand der Technik bekannt sind. Alternativ können die Verbindungsgruppen Q nukleophile Reste, wie Hydroxyl-, -COOH-, Thiol-, primäre Amino-, sekundäre Aminogruppen sein. Es ist beabsichtigt, dass in einer Verbindung der Formel IIIe die Gruppe A-Q auf jeder der beiden Benzolringe anwesend sein kann.

Die folgenden spezifischen Verbindungen sind besonders bevorzugt zur Verwendung in den hier beschriebenen, neuen, chemolumineszenten Verfahren:

Die Umsetzung einer Verbindung der Formel III mit einer dihydroxyaromatischen Verbindung einer wässrigen Pufferlösung stellt helle Chemolumineszenz her, die bei Raumtemperatur schnell die maximale Intensität erreicht.

Da wir an dieser Stelle nicht wünschen, eine spezifische, mechanistische Erklärung für diese Erfindung einzubringen, wird angenommen, dass die Chemolumineszenz von dem elektronisch angeregten Zustand einer Ketonverbindung IV emittiert wird, der formal aus der Oxidation der Doppelbindung der heterozyklischen Enolphosphatverbindung abgeleitet wurde. Eine für die Herstellung von Chemolumineszenz nötige Bedingung ist, dass die Reaktion ausreichend Energie erzeugt, um den angeregten Zustand von IV zu erzeugen, und dass IV fluoreszent ist. Das aktive Oxidationsmittel kann Sauerstoff sein, eine reduzierte Form des Sauerstoffs wie das Superoxidion, das Peroxidion oder ein Peroxidradikal, oder das aktive Oxidationsmittel kann ein oxidiertes Produkt der dihydroxyaromatischen Verbindung sein, wie die Chinon- oder Semichinon-Form.

Chemolumineszenz-Emission durch die erfindungsgemäßen Reaktionen und Verfahren wird typischerweise als ein 100–200 nm breites Emissionsband hergestellt und zeigt ein maximale Intensität bei Wellenlängen des nahen Ultravioletts bis zur sichtbaren Region des elektromagnetischen Spektrums. Typische Wellenlängen der maximalen Intensität, &lgr;max, liegen im Bereich von 350–500 nm. Es wird in Betracht gezogen, dass Phosphatverbindungen der Formel III, die ein kovalent verbundenes Fluorphor tragen, einen intramolekularen Energietransfer durchlaufen könnten, der in der Emission bei längeren Wellenlängen aus dem angeregten Zustand des Fluorphors resultiert.

Chemolumineszentes Licht, das durch die vorliegenden Verfahren emittiert wird, kann visuell oder mit jedem anderen bekannten, geeigneten Hilfsmittel, wie mit einem Luminometer, einem Röntgenfilm, einem photographischen Hochgeschwindigkeitsfilm, einer CCD-Kamera, einem Szintillationszähler oder einem chemischen Aktionometer detektiert werden. Jedes Detektionshilfsmittel weist eine unterschiedliche spektrale Sensitivität auf. Das menschliche Auge ist optimal sensitiv für grünes Licht, CCD-Kameras zeigen maximale Sensitivität für rotes Licht, Röntgenfilme sind mit einer maximalen Antwort auf entweder UV-, blaues Licht oder grünes Licht verfügbar. Die Wahl des Detektionsapparates wird durch die Anwendung und Kostenüberlegungen, Bequemlichkeit, und die Tatsache, ob eine permanente Aufzeichnung benötigt wird, bestimmt.

Die erfindungsgemäßen chemolumineszenten Reaktionen, die die Reaktion von Verbindungen der Formel I und III in der Anwesenheit von Sauerstoff umfassen, können Verwendung als chemische Lichtquellen finden, ein Beispiel dafür ist der bekannte Leuchtstab und verwandte Neuheiten, oder Notfallbeleuchtung. Eine andere Verwendung liegt in Verfahren zur Detektion einer Verbindung der Formel I in einer Probe in einer biomedizinischen Analyse, einer Nahrungsmittelanalyse oder einer Umweltanalyse auf Schadstoffe.

Die erfindungsgemäßen chemolumineszenten Reaktionen können auch in einem Verfahren zur Durchführung eines Assays eines Analyten in einer Probe mit dem Hilfsmittel detektierbarer, markierter, spezifischer Bindungspaare, verwendet werden. In einer Ausführungsform eines solchen Assay-Verfahrens wird entweder Verbindung I oder Verbindung III als Markierungsverbindung bereitgestellt. Die Markierungsverbindung enthält einen Substituenten, der eine reaktive Markierungsgruppe trägt, wobei die reaktive Gruppe fähig ist, eine kovalente Bindung zu einem Element eines spezifischen Bindungspaares zu bilden, um ein detektierbares, markiertes, spezifisches Bindungspaarelement zu bilden. Das Assay-Verfahren umfasst außerdem das Umsetzen des markierten, spezifischen Bindungspaarelementes und seines Partners zur Detektion des Analyten, um ein markiertes, spezifisches Bindungspaar zu bilden und das markierte spezifische Bindungspaar, je nach dem wie benötigt, mit entweder Verbindung I oder Verbindung III umzusetzen, um Chemolumineszenz zur Detektion des Analyten zu erzeugen. Vorzugsweise wird das heterozyklische Enolphosphat als Markierung bereitgestellt. In einer anderen Ausführungsform eines Assay-Verfahrens wird entweder Verbindung I oder Verbindung III als detektierbare Form, eingeschlossen in ein Liposom, welches an ein spezifisches Bindungspaarelement konjugiert ist, bereitgestellt. Verfahren zur Herstellung von Liposomen, die detektierbare Formen enthalten und ihre Verwendung als detektierbare Markierungen in chemolumineszenten Assays werden im U.S.-Patent Nr. 5,595,875 beschrieben.

In einer anderen Ausführungsform eines Assayverfahrens werden sowohl Verbindung I als auch Verbindung III, jeweils eingeschlossen in separate Latex-Teilchen, an denen komplementäre, spezifische Bindungspaarelemente befestigt sind, bereitgestellt. Verfahren zur Herstellung von Latex-Teilchen, die detektierbare Formen enthalten und ihre Verwendung als detektierbare Markierungen in chemolumineszenten Assays, werden im U.S.-Patent Nr. 5,578, 498 beschrieben.

Wenn Chemolumineszenz in einem Assayverfahren gemessen wird, kann die Messung das Messen der Lichtintensität zu einem festen Zeitpunkt relativ zum Ereignis in dem Assayverfahren, oder das Messen in einer Serie von Zeitpunkten oder das Messen der maximalen, unmittelbaren Intensität oder das Messen der Gesamtmenge des Lichts oder des Zeitraums, bis eine spezifizierte Lichtintensität erreicht ist, umfassen.

Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren wird Sauerstoff typischerweise gelöst in einer Lösung aus Reaktionspartnern in Gleichgewicht mit der Atmosphäre bereitgestellt. Die Atmosphäre über der Lösung kann mit Sauerstoff angereichert oder durch Sauerstoff ersetzt werden, um die Konzentration gelösten Sauerstoffs zu erhöhen. Die Lösung kann auch in ein geschlossenes Gefäß gebracht werden, welches unter Druck gesetzt werden kann, und der Gasraum in dem Gefäß kann mit Sauerstoff unter Druck gesetzt werden. Andere Arten der Sauerstoffbereitstellung, zum Beispiel Durchblasen von Luft oder Sauerstoff, oder Sauerstofferzeugung durch chemische Reaktionen, werden als in den Schutzumfang der hier beschriebenen und beanspruchten Verfahren fallend erachtet.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Reagenzzusammensetzungen zur Herstellung von Chemolumineszenz, die einen wässrigen Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 7–10,5, eine Verbindung der Formel I in einer Konzentration von 0,001–20 mM und eine Verbindung der Formel III in einer Konzentration von 0,001–20 mM umfassen. Vorzugsweise liegt der pH-Wert im Bereich von 8–10 und weiter bevorzugt liegt der pH-Wert im Bereich von 9–10.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfassst die Zusammensetzung zusätzlich ein anionisches, grenzflächenaktives Mittel in einer bevorzugten Konzentration zwischen 0,001 und 5 mg/ml in der endgültigen Reaktionslösung, weiter bevorzugt zwischen 0,01 und 2,5 mg/ml.

Eine bevorzugte Reagenzzusammensetzung zur Herstellung von Chemolumineszenz umfasst einen wässrigen Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 8–10, eine dihydroxyaromatische Verbindung der Formel I in einer Konzentration von ungefähr 0,05–5 mM, ein Acridanphosphat der Formel IIIc in einer Konzentration von ungefähr 0,05–5 mM und gegebenenfalls, ein anionisches, grenzflächenaktives Mittel in einer Konzentration von vorzugsweise zwischen 0,01 und 2,5 mg/ml. In einer weiter bevorzugten Zusammensetzung wird die dihydroxyaromatische Verbindung der Formel I aus Hydrochinon, 2-Chlorhydrochinon, 2-Phenylhydrochinon und 2,3,5,6-Tetrafluorhydrochinon ausgewählt.

Chemolumineszente Detektion von Hydrolasen

Die erfindungsgemäße chemolumineszente Reaktion kann als Basis für eine enzymatische chemolumineszente Reaktion dienen, wobei eine dihydroxyaromatische Verbindung durch die Reaktion einer Hydrolase mit einer geschützten dihydroxyaromatischen Verbindung, in der eine der Hydroxylgruppen mit einer Enzym-spaltbaren Gruppe geschützt ist, um die Enzym-spaltbare Gruppe zu entfernen, hergestellt wird. Die dihydroxyaromatische Verbindung durchläuft in Anwesenheit von Sauerstoff eine Reaktion mit einer heterozyklischen Enolphosphatverbindung, um Chemolumineszenz zu erzeugen.

Bevorzugte, geschützte dihydroxyaromatische Verbindungen weisen die Formel II auf, wobei eine der Hydroxylgruppen einer dihydroxyaromatischen Verbindung, I, mit einer Hydrolase-spaltbaren Gruppe geschützt ist. Geschützte dihydroxyaromatische Verbindungen, die in diesen Verfahren geeignet sind, umfassen Verbindungen der Formel II: wobei eines von R1 oder R3 eine OX-Gruppe ist, wobei X eine Gruppe ist, die durch eine Hydrolase entfernbar ist, die anderen von R1 oder R3 und R2, R4 und R5 sind jeweils unabhängig aus Wasserstoff, Alkyl-, Alkoxy-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl-, Amino-, Aminoalkyl-, Carboxyl- -C(=O)OH, Carboxylester- -C(=O)OR6, Formyl- -C(=O)H, Alkylcarboxy- -OC(=O)R6, Arylcarboxy- -OC(=O)R9 und Halogengruppen ausgewählt, wobei Paare benachbarter Gruppen, wenn zusammengenommen, einen fünf- oder sechsgliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Ring vervollständigen können, und wobei R6 eine niedrigwertige Alkylgruppe ist, wobei R7 und R8 jeweils H oder eine niedrigwertige Alkylgruppe sind und wobei R9 eine Arylringgruppe ist.

Die X-Gruppe in den erfindungsgemäßen geschützten dihydroxyaromatischen Verbindungen, kann jede Gruppe sein, die durch eine Hydrolase gespalten werden kann. Hydrolasen sind jene Enzyme, die in der Klasse E.C. 3.1 oder 3.2 des Enzymklassifikationssystems klassifiziert sind, und schließen allgemein Phosphatase-, Phosphodiesterase-, Nuklease-, Glycosidase-, Lipase- und Esteraseenzyme ein. Spezifische Beispiele schließen saure Phosphatase, alkalische Phosphatase, Phosphodiesterase, Phospholipase, &bgr;-D-Galactosidase, &bgr;-Glucuronidase, &bgr;-Glucosidase, Lactase, Carboxylesterase und Acetylcholinesterase ein. Mögliche O-X-Gruppen schließen jede chemische Spaltungsgruppe, die unter den verwendeten Bedingungen stabil ist und durch die Reaktion mit einem Enzym, einschließlich ohne Einschränkungen Alkyl- oder Arylcarboxyester-, anorganisches Oxyacidsalz-, Phosphate und Sulfate, und einschließlich Sauerstoffpyranosid-, &agr;- und &bgr;-D-Galactosid-, &agr;- und &bgr;-Glucuronid- und &agr;- und &bgr;-Glucosidgruppen, gespalten werden kann, ein. Bevorzugte Hydrolasen sind alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, &bgr;-D-Galactosidase, &bgr;-Glucuronidase und &bgr;-Glucosidase.

Die Bildung der dihydroxyaromatischen Verbindung durch die Reaktion der Verbindung aus Formel II mit einer Hydrolase, kann in der Anwesenheit oder Abwesenheit der heterozyklischen Enolphosphatverbindung (III) durchgeführt werden, so dass die Bildung von I und die Erzeugung der Chemolumineszenz gleichzeitig oder nacheinander ablaufen können.

In einem Verfahren zur Herstellung von Chemolumineszenz wird die geschützte dihydroxyaromatische Verbindung mit einer geeigneten Hydrolase in Anwesenheit einer heterozyklischen Enolphosphatverbindung in einem Puffer umgesetzt. Der pH-Wert wird bei einem Wert gehalten, der förderlich für die Enzymaktivität und die chemolumineszente Reaktion ist, gewöhnlich zwischen ungefähr pH-Wert 8 und 10 und bevorzugt zwischen ungefähr pH-Wert 9 und 10. Die Durchführung der Reaktion in dieser Art und Weise ergibt ein kontinuierliches Chemolumineszenz-Signal.

In einer alternativen Art der Durchführung der erfindungsgemäßen chemolumineszenten Reaktionen, wird die geschützte dihydroxyaromatische Verbindung mit einer Hydrolase in einem Puffer oder an einer festen Oberfläche umgesetzt, bei einem ersten pH-Wert vorzugsweise im Bereich 5,0–9,5, für einen ersten Zeitraum, vorzugsweise im Bereich von wenigen Sekunden bis mehreren Minuten. Anschließend wird diese Lösung oder ein abgemessener Teil davon mit einer zweiten Lösung, die die heterozyklische Enolphosphatverbindung und optional ein anionisches, grenzflächenaktives Mittel enthält, umgesetzt, und das Licht wird entweder durch Messung der Scheitelpunkt-Intensität oder durch Integration über einen festgesetzten Zeitraum oder bis die Lichtemission verschwunden ist, gemessen. Der pH-Wert der zweiten Lösung sollte ≥ 8 und vorzugsweise zwischen 9 und 10 betragen, und ist typischerweise eine Pufferlösung.

Diese Art der Chemolumineszenz-Erzeugung kann vorteilhaft in Assays sein, in denen eine große Probenzahl gleichzeitig bearbeitet wird, zur Messung zu einem späteren Zeitpunkt. Diese Zweischrittart ist auch geeignet, um Hydrolasen mit einem Aktivitätsoptimum bei saurem bis neutralem pH-Wert (5-8) wie &bgr;-Galactosidase oder saure Phosphatase zu messen. Ein optionaler Schritt, der auch in solch eine chemolumineszente Reaktion oder einen Assay eingefügt werden kann, ist das Hinzufügen eines Enzyminhibitors zum Reaktionssystem nach dem ersten Zeitraum, um alle weiteren Enzymwirkungen zu stoppen.

Es wird erwartet, dass die Auswahl zwischen diesen beiden Reaktionsarten durch verschiedene Faktoren und die bestimmte Verwendung oder Anwendung bestimmt wird. Nichtsdestotrotz sind beide Arten wirksam. Für Enzyme mit einem sauren pH-Optimum kann es vorteilhaft sein, die Reaktion in zwei getrennten Schritten auszuführen, jeden bei einem/r Optimal-pH-Wert, -Temperatur, -Ionenkonzentration, -Puffersalz, usw.

Bei der Herstellung von Chemolumineszenz durch die Reaktion von Verbindung II mit einer Hydrolase in der Anwesenheit eines heterozyklischen Enolphosphats, wird die Reaktion allgemein bei einer Temperatur zwischen 5 °C und 50 °C, vorzugsweise zwischen 20 °C und 40 °C in einer wässrigen Pufferlösung bei einem pH-Wert zwischen 7 und 10,5, vorzugsweise zwischen 8,5 und 10, durchgeführt. Die Verbindung III wird bei einer Konzentration zwischen 1 &mgr;M und 20 mM, vorzugsweise zwischen 50 &mgr;M und 5 mM verwendet. Die Verbindung II wird bei einer Konzentration zwischen 1 &mgr;M und 20 mM, vorzugsweise zwischen 50 &mgr;M und 5 mM verwendet.

Ein anionisches, grenzflächenaktives Mittel kann ebenfalls in der erfindungsgemäßen chemolumineszenten Reaktion eingesetzt werden. Anionische, grenzflächenaktive Mittel wirken, indem sie die Hintergrundchemolumineszenz des heterozyklischen Enolphosphats in Abwesenheit der dihydroxyaromatischen Verbindung verringern. Wenn sie verwendet werden, werden anionische, grenzflächenaktive Mittel in einer Menge zwischen 0,01 und 5 mg/ml in der endgültigen Reaktionslösung eingesetzt, weiter bevorzugt zwischen 0,1 und 2,5 mg/ml. Verstärker von anionischen, grenzflächenaktiven Mitteln umfassen Alkylsulfate und Alkylsulfonate. Ausführlichere Listen exemplarischer Strukturen jeder Kategorie von grenzflächenaktiven Mitteln können in jeder Standardabhandlung über grenzflächenaktive Mittel gefunden werden. Bevorzugte grenzflächenaktive Mittel sind C10-C20-Alkylsulfate wie Natriumdodecylsulfat, SDS.

Eine wichtige Verwendung der enzymatischen, chemolumineszenten Verfahren ist die Detektion der Anwesenheit oder der Menge eines Analyten durch eine chemolumineszente Reaktion in einem Assay-Verfahren. Das Verfahren umfasst die Schritte des Inkontaktbringens einer Probe, die voraussichtlich den Analyten enthält, mit einer erfindungsgemäßen chemolumineszenten Verbindung und einer Hydrolase, die Detektion des hergestellten Lichts in einem qualitativen Verfahren, und, wenn Quantifizierung gewünscht ist, das Inbeziehungsetzen der hergestellten Lichtmenge zur Menge des Analyten. Die Beziehung zwischen Lichtintensität und Menge des Analyten kann einfach durch die Erstellung einer Eichkurve mit bekannten Mengen des Analyten erkannt werden. Die chemolumineszente Verbindung wird typischerweise in einer Konzentration von ungefähr 10–5 M bis ungefähr 10–2 M, vorzugsweise zwischen ungefähr 10–4 M und ungefähr 10–3 M verwendet. Die Hydrolase liegt vorzugsweise unter ungefähr 10–9 M, wenn sie in einer Lösung detektiert wird.

Es gibt verschiedene Kategorien von Analyten, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren analysiert werden können. Diese umfassen Hydrolasen, in deren Fall es unnötig wäre, zusätzliche Hydrolase hinzuzufügen. Wenn die Hydrolase zum Beispiel eine alkalische Phosphatase ist, kann so eine Bestimmung Verwendung z. B. bei der Messung der Menge an alkalischer Phosphatase im Blutserum als eine Indikation des Status der Leberfunktion eines Patienten oder als ein Index bestimmter Erkrankungsbedingungen finden. Die Messung von sauren Phosphatasen der Prostata ist ebenfalls als ein klinischer Diagnostikindex für Prostatakrebs geeignet.

Die Detektion und Messung von Enzymaktivität durch einen erfindungsgemäßen chemolumineszenten Assay wird Verwendung in Genexpressionsassays finden. &bgr;-Galactosidase, &bgr;-Glucuronidase und alkalische Phosphatase, besonders ein in der Plazenta produziertes Isozym, welches ausgeschieden wird, sind als Reportergene geeignet (J. Alam, J. Cook, Anal. Biochem. 188, 245–54 (1990). In diesem Assay-Typ wird ein für die Expression eines Reporterenzyms verantwortliches Gen über ein Plasmid in das genetische Material eines Organismus in die Nähe einer Promotor- oder Verstärkersequenz kloniert. Die Wirkung der Promotor- oder Verstärkersequenz auf die Transkriptionsaktivität wird durch die Messung der hergestellten Reporterenzymmenge gemessen.

Ein in diesem Zusammenhang verwendeter Analyt schließt ebenfalls Hydrolaseinhibitoren ein. Inhibitoren schließen Verbindungen, die reversibel durch die Konkurrenz mit einem zweiten Substrat, wie einer geschützten dihydroxyaromatischen Verbindung wirken, genauso wie jene Inhibitoren, die irreversibel durch Deaktivierung des Enzyms wirken, ein. Zum Beispiel schließen Inhibitoren der alkalischen Phosphatase anorganisches Phosphat, Levamisol, Tetramisol und andere Imidazo[1,2-b]thiazole, L-Phenylalanin und L-Homoarginin ein und sind in R.B. McComb, G.N. Bowers, S. Posen in Alkaline Phosphatase, Plenum Press, New York 1979, Seiten 268–275, 332–334, 394–397, 410–413 beschrieben. Inhibitoren anderer Hydrolasen sind dem Fachmann von Enzymassays allgemein bekannt. Wenn zur Detektion eines Enzyminhibitors die erfindungsgemäße chemolumineszente Reaktion verwendet wird, wird die geeignete Hydrolase mit einer Verbindung der Formel II umgesetzt, um eine dihydroxyaromatische Verbindung I zu bilden, die mit einem heterozyklischen Enolphosphat III in der Anwesenheit und Abwesenheit der Inhibitorsubstanz umgesetzt wird, und die Ergebnisse werden verglichen, um die Anwesenheit oder die Menge der Inhibitorsubstanz zu bestimmen. Die Differenz der emittierten Chemolumineszenz weist auf die Anwesenheit des Inhibitors hin.

Ein in diesem Zusammenhang verwendeter Analyt schließt weiterhin verschiedene Klassen von organischen und biologischen Molekülen, die mit einer Hydrolase markiert werden können, oder die spezifisch mit Enzym-markierten spezifischen Bindungspartnern detektiert werden können, ein. Das Enzym kann direkt als Markierung an der Analyten-Bindungsverbindung eingefügt werden. Alternativ kann die Analyten-Bindungsverbindung an mindestens eine Enzym-markierte, spezifische Bindungssubstanz für die Analyten-Bindungsverbindung gebunden werden. Exemplarisch für dieses Format würde ein Nukleinsäure-Hybridisationsassay sein, der ein Enzym-markiertes Detektions-Oligonukleotid verwendet. Alternativ kann die Analyten-Bindungsverbindung mit mindestens einer zweiten spezifischen Bindungssubstanz markiert werden, z. B. Biotin, welches dann an einen Enzymmarkierten Bindungspartner für die zweite spezifische Bindungssubstanz, z. B. Avidin, gebunden wird.

Biologische Moleküle, die mit einem oder mehreren Hydrolase-Molekülen konjugiert werden können, schließen DNA, RNA, Oligonukleotide, Antikörper, Antikörperfragmente, Antikörper-DNA-Chimäre, Antigene, Haptene, Proteine, Lectine, Avidin, Streptavidin und Biotin ein. Komplexe, die Hydrolasen einschließen oder enthalten, wie Liposomen, Micellen, Vesikel und Polymere, die zur Anheftung biologischer Moleküle funktionalisiert sind, können ebenfalls in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.

Techniken zur Durchführung von Enzymassays sind gut bekannt. Mit der hier gelehrten, durch die Beispiele bereitgestellten Anleitung, wird es für den Fachmann im Rahmen der Fähigkeiten liegen, als eine Angelegenheit des routinemäßigen Experimentierens, Variationen der Herstellungsverfahren von Proben, die Bestimmung geeigneter Mengen und Anteile von Reagenzien und Reaktionszeiten und die Erstellung von Eichkurven zu entwickeln.

Da die Reaktion durch die Hydrolase katalysiert wird, sind äußerst kleine Enzymmengen ausreichend, um eine detektierbare Lichtmenge herzustellen. Sensitivitäten von < 1 amol (1 × 10–18 mol) wurden erreicht. Die Fähigkeit, solche kleinen Mengen Hydrolase zu detektieren, macht die vorliegende chemolumineszente Technologie, durch Verwendung Enzym-gekoppelter Assays, geeignet für Analysen von vielen Analytentypen. Solche Analysen und Assays erfordern aufgrund geringen Vorkommens des Analyten in der Probe, die zu analysieren ist, oder aufgrund der begrenzten Probenmenge die Fähigkeit, kleine Mengen Hydrolase zu detektieren. In diesem Assaytyp wird alkalische Phosphatase an ein Element eines spezifischen Bindungspaares konjugiert. Ein Beispiel sind chemolumineszente, Enzym-gekoppelte Immunassays, wie der so genannte Enzym-gekoppelte Immunadsorptionsassay oder ELISA. Solche Assays werden üblicherweise sowohl bei manueller Anwendung, als auch in automatisierten Multitest-Immunassay-Systemen verwendet. In einem typischen Immunassay wird der Hapten-, Antigen- oder Antikörperanalyt durch die Detektion der Anwesenheit oder der Menge eines Enzym-markierten, spezifischen Bindungspartners des Analyten oder eines Enzym-markierten Analogen des Analyten analysiert. Verschiedene Assayformate und die Protokolle zur Durchführung der immunchemischen Schritte sind im Stand der Technik gut bekannt. Diese Assays fallen allgemein in zwei Kategorien. Kompetitive Assays weisen eine immunologische Bindung eines spezifischen Antikörpers mit dem Analyten und einem Analytenanalogen, z. B. einem detektierbaren, markierten Analytenmolekül auf. Sandwichassays ergeben sich aus der sequenziellen oder simultanen Bindung zweier Antikörper mit dem Analyten, wobei einer davon detektierbar markiert ist. Das so gebildete, detektierbare, Enzym-markierte Bindungspaar kann mit den erfindungsgemäßen Verbindungen und Verfahren analysiert werden. Die Messung kann mit Enzym-markierten Formen durchgeführt werden, die auf eine feste Oberfläche oder auf einen Träger, der Perlen bzw. Kügelchen, Röhren, Mikrovertiefungen, magnetische Teilchen, Teststreifen, Membranen und Filter einschließt, aufgebracht wurden, wie sie im Stand der Technik allgemein verwendet werden. Die detektierbaren, Enzymmarkierten Formen können auch frei in Lösung oder eingeschlossen in einer organisierten Anordnung, wie einem Liposom, in dessen Fall ein lytisches Agens zur Lyse des Liposoms und zur Freisetzung des detektierbaren Enzyms verwendet wird, vorliegen.

Eine andere exemplarische Verwendung ist die Detektion von Proteinen mit der Technik des Western Blottens. Eine Probe, die ein Protein von Interesse als Analyt enthält, ist Gegenstand elektrophoretischer Trennung. Die getrennten Proteine werden durch Kapillarwirkung oder mit Hilfe eines elektrischen Feldes auf die Blot-Membran übertragen. So transferiertes Protein wird typischerweise mit einem spezifischen primären Antikörper und einem Enzym-markierten sekundären Antikörper, der den primären Antikörper erkennt und an ihn bindet, detektiert.

Die Sichtbarmachung der Markerenzym-Aktivität spiegelt die Anwesenheit des Analyten-Proteins wider. Um die erfindungsgemäßen Verfahren an das Western Blotten anzupassen, kann ein sekundärer Antikörper, der an eine Hydrolase, wie eine alkalische Phoshatase oder &bgr;-Galactosidase konjugiert ist, sowie die Messung der Enzymaktivität mit Chemolumineszenz unter Verwendung einer Verbindung der Formel II als Enzymsubstrat und einer Verbindung der Formel III als chemolumineszentes Reagenz, eingesetzt werden. Variationen dieser Technik, wie die Verwendung von biotinylierten Antikörpern und Avidin-Enzym-Konjugaten, werden als innerhalb des Schutzumfangs der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren durchführbaren Assays liegend erachtet.

Zusätzlich zu den vorher genannten Antigen-Antikörper-, Hapten-Antikörper- oder Antikörper-Antikörperpaaren, können spezifische Bindungspaare auch komplementäre Oligonukleotide oder Polynukleotide, Avidin-Biotin, Streptavidin-Biotin, Hormon-Rezeptor, Lectin-Kohlenhydrat, IgG-Protein A, Nukleinsäure-Nukleinsäuren-Bindungsprotein und Nukleinsäure-Anti-Nukleinsäuren-Antikörper einschließen.

Eine besonders geeignete Anwendung der erfindungsgemäßen Detektionsverfahren ist die Detektion von Nukleinsäuren durch die Verwendung von Enzymmarkierten Nukleinsäuresonden. Verfahren zur Analyse und chemolumineszenten Detektion von Nukleinsäuren unter Verwendung von Enzym-Markierungen, zum Beispiel Lösungshybridisations-Assays, DNA-Detektion durch Southern Blotten, RNA durch Northern Blotten, DNA-Sequenzierung, DNA-Fingerprinting, Koloniehybridisierungen und Plaque-Lifts sind alles gut bewährte Techniken. Die Enzym-Markierung (z. B. AP oder &bgr;-gal) kann als direktes Konjugat mit einem Sonden-Oligonukleotid oder Fänger-Oligonukleotid vorliegen, oder sie kann über indirekte Kopplungshilfsmittel, unter Verwendung von Verfahren des Standes der Technik, eingebracht werden. Beispiele indirekter Kopplungshilfsmittel schließen die Verwendung von Hapten-markierten Oligonukleotiden und Antihapten-Enzymkonjugaten oder biotinylierten Oligonukleotiden oder Avidin-Enzymkonjugaten ein. Solche Nukleinsäureassays können auf einer Blot-Membran oder in Lösung durchgeführt werden, unter Verwendung von Oligonukleotiden, die auf feste Oberflächen, einschließlich Perlen, Röhren, Mikrovertiefungen, magnetische Teilchen und Teststreifen, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, aufgebracht wurden.

In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Reagenzzusammensetzung zur Herstellung von Chemolumineszenz durch die Reaktion mit einer Hydrolase, die eine geschützte dihydroxyaromatische Verbindung der Formel II umfasst, um die dihydroxyaromatische Verbindung der Formel I herzustellen, die in der Anwesenheit einer Verbindung der Formel III und Sauerstoff Chemolumineszenz herstellt. Die Reagenzzusammensetzung umfasst einen wässrigen Puffer mit einem pH-Wert im Bereich 7–10,5, eine Verbindung der Formel II in einer Konzentration von 0,001–20 mM und eine Verbindung der Formel III in einer Konzentration von 0,001–20 mM. Formulierungen für chemolumineszente Reaktionen mit einer Hydrolase können außerdem ein Metallsalz wie ein Magnesium oder Zink in einer Konzentration von 0,01–10 mM umfassen, um die Enzymaktivität zu verstärken oder zu unterstützen.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung zusätzlich ein grenzflächenaktives Mittel in einer Konzentration von vorzugsweise zwischen 0,01 und 5 mg/ml in der endgültigen Reaktionslösung, weiter bevorzugt zwischen 0,1 und 2,5 mg/ml.

Eine bevorzugte Reagenzzusammensetzung zur Herstellung von Chemolumineszenz in einem Einschrittverfahren durch die Reaktion mit einer Hydrolase umfasst einen wässrigen Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 8-10, eine geschützte dihydroxyaromatische Verbindung der Formel II in einer Konzentration von ungefähr 0,05–5 mM, ein Acridanphosphat der Formel IIIc in einer Konzentration von ungefähr 0,05–5 mM und gegebenenfalls, ein anionisches, grenzflächenaktives Mittel in einer Konzentration von vorzugsweise zwischen 0,1 und 2,5 mg/ml. In einer weiter bevorzugten Zusammensetzung weist die geschützte dihydroxyaromatische Verbindung der Formel II die Formel auf, wobei X die Gruppe ist, die durch die Hydrolase entfernbar ist.

Um die verschiedenen erfindungsgemäßen Aspekte ausführlicher zu beschreiben, werden die folgenden Beispiele, die Verbindungen, Verfahren zur Herstellung, Zusammensetzungen und verwendete Verfahren beschreiben, aufgeführt. Die Beispiele werden als darstellend angesehen und beschränken den Schutzumfang der Erfindung nicht.

BEISPIELE

a. Phenylacridin-9-carboxylat.

Acridin-9-carboxylsäure (1 g, 4,1 mmol) wurde in Thionylchlorid suspendiert (5 ml), und das Reaktionsgemisch wurde 3 h unter Rückflusskühlung erhitzt. Nach Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck blieb ein gelber Feststoff zurück, der unter Argon in CH2Cl2 und Pyridin (350 &mgr;l) gelöst wurde. Diese Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, und eine Lösung aus Phenol (0,78 g, 8,2 mmol) in CH2Cl2 wurde tropfenweise hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Verdampfung des Lösungsmittels wurde der Rest in Ethylacetat wieder gelöst und mit Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde über MgSO4 getrocknet und konzentriert, um ein Rohmaterial zu erhalten, das mit einem Kieselsäuregel (30 % Ethylacetat/Hexan) chromatographiert wurde, um das reine Produkt als gelben Feststoff zu erhalten. 1H NMR (CDCl3) &dgr; 7,35-7,57 (m, 5H), 7,63-8,37 (m, 8H).

b. Phenyl-10-methylacridinium-9-carboxylattrifluormethansulfonat.

Phenylacridin-9-carboxylat (530 mg, 1,7 mmol) wurde unter Argon in CH2Cl2 (5 ml) gelöst, und Methyltrifluormethansulfonat (1 ml, 8,8 mmol) wurde hinzugefügt. Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, um einen dicken, gelben Niederschlag zu erhalten. Dieser Niederschlag wurde gefiltert, mit Ether gewaschen und getrocknet, um das Produkt in Form gelber Kristalle zu erhalten. 1H NMR (Aceton- d6) &dgr; 5,22 (s, 3H), 7,47-7,71 (m, 5H), 8,23-9,07 (m, 8H).

c. Phenyl-10-methylacridan-9-carboxylat.

Phenyl-10-methylacridinium-9-carboxylat-trifluormethansulfonat (10 mg, 0,0216 mmol) wurde in absolutem Ethanol (10 ml) suspendiert, und das Gemisch wurde für 15 min unter Rückflusskühlung erhitzt, um eine klare Lösung zu erhalten. Ammoniumchlorid (88 mg, 1,6 mmol) wurde portionsweise zur Lösung hinzugefügt, gefolgt von Zink (108 mg, 1,6 mmol). Das Hinzugeben von Zink bewirkte ein sofortiges Verschwinden der gelben Farbe der Lösung. Die farblose Lösung wurde für 2 h unter Rückflusskühlung erhitzt. Eine TLC des Reaktionsgemisches zeigte eine vollständige Konversion in ein nicht-polares Material. Die Lösung wurde gefiltert, und der Niederschlag wurde mit Ethanol (3 × 20 ml) gewaschen. Das Filtrat wurde konzentriert, um einen cremefarbenen Feststoff zu erhalten, der in CH2Cl2 wieder gelöst und mit Wasser gewaschen wurde (2 × 15 ml). Die organische Schicht wurde über Na2SO4 getrocknet und konzentriert, um das Rohprodukt zu erhalten, welches durch präparative TLC unter Verwendung von (30 % Ethylacetat:Hexan) gereinigt wurde. Das reine Produkt wurde als cremefarbener Feststoff erhalten. 1H NMR (CDCl3) &dgr; 3,38 (s, 3H), 5,16 (s, 1H), 6,89-7,37 (m, 13H); 13C NMR (CDCl3) &dgr; 33,29, 49,72, 112,93, 120,19, 121,36, 125,73, 128,67, 129,16, 129,26, 142,37, 151,04, 170,22.

d. 9-(Phenoxyphosphoryloxymethyliden)-10-methylacridan, Bis(cyanoethyl)ester.

Ein dreihalsiger Kolben wurde mit Argon durchspült und mit 5 ml wasserfreiem THF und Diisopropylamin (0,04 ml, 0,29 mmol) beladen. Der Kolben wurde in einem Trockeneis-Aceton-Bad gekühlt. Zu dieser Lösung wurde n-Butyllithium (0,116 ml, 0,29 mmol) hinzugefügt. Nach 20 min wurde zu dieser Lösung eine Lösung des Acridanesters aus Schritt (c) (70 mg, 0,22 mmol) in 5 ml THF hinzugefügt und für 30 min bei –78 °C weitergerührt. Schließlich wurde eine Lösung aus POCl3 (0,027 ml, 0,29 mmol) und Pyridin (0,023 ml, 0,29 mmol) in 3 ml THF hinzugefügt, und das Trockeneisbad wurde entfernt. Nach 45 min wurden Pyridin (0,039 ml, 0,58 mmol) und 3-Hydroxypropionitril (0,094 ml, 1,16 mmol) hinzugefügt und über Nacht gerührt. Anschließend wurde es gefiltert, und das Lösungsmittel wurde aus dem Filtrat entfernt. Der Rest wurde einer präparativen TLC (80 % Ethylacetat/Hexan) unterzogen, um das reine Produkt zu erhalten; 1H NMR (CDCl3) &dgr; 2,35-2,54 (m, 4H), 3,47 (s, 3H), 3,79-3,90 (m, 2H), 3,98-4,08 (m, 2H), 6,825-7,45 (m, 12H), 7,80-7,83 (dd, 1H); 13C NMR (CDCl3) &dgr; 19,12, 19,24, 33,63, 62,19, 62,49, 88,72, 92,82, 112,40, 112,52, 115,83, 116,07, 119,68, 120,44, 120,71, 123,81, 126,69, 128,03, 128,27, 128,58, 130,09, 142,39, 143,06, 165,73, 202,09.

e. 9-(Phenoxyphosphoryloxymethyliden)-10-methyl-acridan, Dinatriumsalz (1).

Eine Lösung der Bis(cyanoethyl)phosphat-Verbindung (2,897 g, 5,77 mmol) in 50 ml Aceton wurde mit Ar für 30 min durchspült. Eine Ar-durchspülte Lösung aus 479 mg (12 mmol) NaOH in 7,5 ml Wasser wurde tropfenweise hinzugefügt, und die Lösung wurde über Nacht gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde gefiltert, mit 50 ml Ar-durchspültem Aceton gewaschen und luftgetrocknet. Die Ausbeute betrug 3,473 g 1 als ein weißer Feststoff, der etwas Wasser enthielt. 1H NMR (D2O) &dgr; 3,326 (s, 3H), 6,825-7,45 (m, 13H), 7,80-7,83 (d, 1H); 13C NMR (D2O) &dgr; 32,95, 102,86, 102,92, 112,30, 115,85, 120,68, 121,01, 122,35, 122,41, 122,62, 127,48, 127,66, 128,23, 129,66, 143,17, 143,32, 144,66, 156,01; 31P NMR (D2O) &dgr; 0,581 (rel. zu ext. H3PO4).

a. 9-(Phenylthiophosphoryloxymethyliden)-10-methyl-acridan, Bis(cyanoethyl)ester.

Wie in der PCT-Anmeldung WO 95/28495 des Anmelders beschrieben hergestelltes Phenyl-10-methylacridan-9-thiocarboxylat (70, mg, 0,2 mmol) wurde zu einer Lösung aus LDA (0,24 mmol) in THF hinzugefügt. Nach 30 min Rühren bei –78 °C wurde eine Lösung aus POCl3 (25 &mgr;l) und Pyridin (21 &mgr;l) in 4 ml THF hinzugefügt. Das Trockeneisbad wurde entfernt und das Rühren für 30 min fortgesetzt. Die TLC (30 % Ethylacetat/Hexan) zeigte, dass das Ausgangsmaterial vollständig umgesetzt war. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt und mit Pyridin (210 &mgr;l) und 3-Hydroxypropionitril (44 &mgr;l) in 4 ml THF behandelt. Nach dem über Nacht Rühren bei Raumtemperatur wurde das ausgefallene Pyridin-HCL abgefiltert, und das Reaktionslösungsmittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rest wurde einer präparativen TLC (Ethylacetat) unterzogen, aus der das Produkt isoliert wurde; 1H NMR (CDCl3) &dgr; 2,4-2,6 (m, 4H), 3,521 (s, 3H), 3,8-4 (m, 2H), 4,0-4,1 (m, 2H), 6,9-7,2 (m, 4H), 7,22-7,5 (m, 7H), 7,75-8 (dd, 2H).

b. 9-(Phenylthiophosphoryloxymethyliden)-10-methyl-acridan, Dinatriumsalz (5)

Eine Lösung der Bis(cyanoethyl)phosphat-Verbindung (0,59 g, 1,21 mmol) in 50 ml Aceton wurde für 30 min mit Argon durchspült. Eine Ar-durchspülte Lösung aus 104 mg (2,6 mmol) NaOH in 10 ml Wasser wurde tropfenweise hinzugefügt, und die Lösung wurde über Nacht unter Argon gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde mit Unterdruck gefiltert, mit 50 ml Ar-durchspültem Aceton gewaschen und luftgetrocknet. Die Ausbeute betrug 0,50 g 5 als ein leicht gelber Niederschlag, der eine geringe Menge Aceton enthielt. 1H NMR (D2O) &dgr; 3,36 (s, 3H), 6,9-7,4 (m, 11H), 7,75-7,8 (d, 1H), 8,2-8,22 (d, 1H); 31P NMR (D2O) &dgr; 1,85.

a. 4'-Chlorphenylacridin-9-thiocarboxylat.

4-Chlorthiophenol (4,75 g) und 7,2 g Acridin-9-carbonylchlorid wurden in 100 ml CH2Cl2, gefolgt von 12,1 ml Pyridin, gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde orange-braun. Das Gemisch wurde unter Argon über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Verdampfung des Lösungsmittels wurden die Feststoffe mit 100 ml Hexan gewaschen, gefiltert, mit weiteren 100 ml Hexan gewaschen, gefiltert, und anschließend mit 500 ml Wasser gefiltert und luftgetrocknet. Der Thioester (8,71 g) wurde als leicht bräunlich-gelber Feststoff erhalten. 1H NMR (CDCl3) &dgr; 7,47-7,50 (m, 2H), 7,58-7,67 (m, 4H), 7,81-7,86 (m, 2H), 8,12 (d, 2H), 8,29 (d, 2H).

b. 4'-Chlorphenylacridan-9-thiocarboxylat.

4'-Chlorphenylacridin-9-thiocarboxylat (2,0 g) wurde in CH2Cl2 (25 ml) gelöst. Die Lösung wurde mit Argon durchspült, und anschließend wurden 3,72 g Zinkpulver, gefolgt von 0,45 ml Essigsäure hinzugefügt. Die TLC zeigte, dass das Ausgangsmaterial in 20 min verbraucht war. Das Gemisch wurde gefiltert, und die Feststoffe wurden mit CH2Cl2 gewaschen. Die kombinierten CH2Cl2-Lösungen wurden mit Wasser gewaschen (3 × 50 ml) und getrocknet. Eine kleine Menge des Produktes wurde mit einer präparativen TLC zur analytischen Charakterisierung aufgereinigt. Das übrige Produkt wurde ohne weitere Aufreinigung verwendet. 1H NMR (CDCl3) &dgr; 5,22 (s, 1H), 6,28 (s, 1H), 6,79-7,31 (m, 12H).

c. 4'-Chlorphenol-10-methylacridan-9-thiocarboxylat.

4'-Chlorphenylacridan-9-thiocarboxylat (2,0 g) wurde unter Argon in CH2Cl2 (30 ml) gelöst, und Methyltriflat (6,5 g) wurde hinzugefügt und über Nacht gerührt. Die braune Lösung wurde verdampft und das Rohmaterial über eine Säulenchromatographie unter Verwendung von 30 % Ethylacetat/Hexan aufgereinigt. Dadurch wurde das reine Produkt (1,8 g) erhalten. 1H NMR (CDCl3) &dgr; 3,47 (s, 3H), 5,09 (s, 1H), 7,02-7,39 (m, 12H).

d. 9-(4-Chlorphenylthiophosphoryloxymethyliden)-10-methylacridan, Bis(cyanoethyl)ester.

4-Chlorphenyl-10-methylacridan-9-thiocarboxylat (0,70 g) in 10 ml wasserfreiem THF wurden tropfenweise zu einer Lösung aus LDA (1,4 äq.) in THF bei –78 °C hinzugefügt. Nach 60 min Rühren bei –78 °C wurde die gelbe Lösung mit einer Lösung aus POCl3 (0,517 g) und Pyridin (1,52 ml) in 4 ml THF langsam behandelt. Das Trockeneisbad wurde nach 30 min entfernt und das Rühren für 1 h fortgesetzt. Die Lösung wurde gelb und bildete einen Niederschlag.

Das Gemisch wurde in einem Eisbad gekühlt und mit 3-Hydroxypropionitril (0,89 g) und 1,0 ml Pyridin behandelt. Nach vollständiger Zugabe wurde das Eisbad entfernt. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde das ausgefallene Pyridin-HCl abgefiltert und mit THF gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden in einem Vakuum verdampft, und das erhaltene braune Material wurde in Ethylacetat gelöst und mit 4 × 25 ml Wasser gewaschen. Die Ethylacetatlösung wurde getrocknet und konzentriert. Der Rest, aus dem die 0,325 g des Produkts isoliert wurden, wurde über eine Säulenchromatographie unter Verwendung von 80–100 % Ethylacetat/Hexan getrennt; 1H NMR (CDCl3) &dgr; 2,48-2,64 (m, 4H), 3,53 (s, 3H), 3,86-4,16 (m, 4H), 6,94-7,94 (m, 12H), 31P NMR (D2O) &dgr; – 9,48 (p).

e. 9-(4-Chlorphenylthiophosphoryloxymethyliden)-10-methylacridan, Dinatriumsalz (3).

Eine Lösung der Bis(cyanoethyl)phosphat-Verbindung (0,325 g) in 10 ml Aceton wurde mit Argon durchspült. Eine 2,5 M NaOH-Lösung (473 &mgr;l) wurde hinzugefügt, gefolgt von weiteren 500 &mgr;l Wasser. Die Lösung wurde unter Argon über Nacht gerührt. Der Niederschlag, der sich gebildet hatte, wurde mit Unterdruck gefiltert und luftgetrocknet. Es wurde gefunden, dass die Stammlauge die mono(cyanoethyl)-geschützte Verbindung (140 mg) enthielt. Ein zweiter Ertrag des Dinatriumsalzes wurde durch die Wiederholung der NaOH-Entschützung erhalten. 1H NMR (D2O) &dgr; 3,35 (s, 3H), 6,92-7,36 (m, 10H), 7,78 (d, 1H), 8,20 (d, 1H); 31P NMR (D2O) &dgr; 1,22 (s).

a. Naphthylacridin-9-thiocarboxylat.

2-Naphthalinthiol (48,81 g) und das Acridin-9-carbonylchlorid, das aus 65,17 g Acridin-9-carboxylsäure hergestellt wurde, wurden in 100 ml CH2Cl2 gelöst, gefolgt von der Zugabe von 120 ml Pyridin. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur unter Argon über Nacht gerührt. Nach Verdampfung des Lösungsmittels wurden die Feststoffe mit 500 ml Hexanen gewaschen, gefiltert, mit weiteren 500 ml Hexanen gewaschen, gefiltert, und anschließend mit 600 ml Wasser gewaschen, gefiltert und über Nacht luftgetrocknet. Der Thioester wurde in 1500 ml CH2Cl2 gelöst, über Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und in einem Vakuum getrocknet. Der Thioester wurde in Form eines braunen Feststoffes erhalten (94,67 g). 1H NMR (CDCl3) &dgr; 7,54-8,00 (m, 11H), 8,17-8,31 (m, 4H).

b. Naphthyl-10-methylacridinium-9-thiocarboxylattriflat.

Naphthylacridin-9-thiocarboxylat (26,38 g) wurde in CH2Cl2 (200 ml) suspendiert. Methyltrifluormethansulfonat (24,5 ml) wurde hinzugefügt, und das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde gefiltert, und die Feststoffe wurden mit CH2Cl2 (300 ml) und Hexanen (500 ml) gewaschen. Nach Lufttrocknung wurde das Produkt (28,83 g) in Form eines gelben Feststoffes erhalten. 1H NMR (Aceton-d6) &dgr; 5,20 (s, 3H), 7,66-7,75 (m, 2H), 7,88-7,92 (m, 1H), 8,03-8,09 (m, 2H), 8,15 (d, 1H), 8,26 (t, 2H), 8,48 (s, 1H), 8,61-8,68 (m, 2H), 8,80 (d, 2H), 9,03 (d, 2H).

c. Naphthyl-10-methylacridan-9-thiocarboxylat.

Naphthyl-10-methylacridinium-9-thiocarboxylattriflat (65,50 g) wurde in CH2Cl2 (1000 ml) unter Argon suspendiert, und Eisessig (21,2 ml) und Zink (40,43 g) wurden hinzugefügt. Nach Rühren über Nacht zeigte die TLC das Verschwinden des Ausgangsmaterials und die Bildung eines neuen Produkts. Das Reaktionsgemisch wurde durch ein Kieselsäuregelbett gefiltert, und das CH2Cl2 wurde in einem Vakuum entfernt. Der so erhaltene, leicht gelbe Feststoff wurde in Isopropanol (500 ml) eingerührt, gefiltert, mit weiteren 500 ml Isopropanol gewaschen und zum Lufttrocknen stehengelassen. Dadurch wurde das reine Produkt erhalten (46,36 g). 1H NMR (CDCl3) &dgr; 3,47 (s, 3H), 5,13 (s, 1H), 7,00-7,06 (m, 4H), 7,25-7,49 (m, 7H), 7,70-7,79 (m, 4H).

d. 9-(Naphthylthiophosphoryloxymethyliden)-10-methylacridan, Bis(cyanoethyl)ester.

Naphthyl-10-methylacridan-9-thiocarboxylat (17,32 g) in 600 ml wasserfreiem THF wurde tropfenweise zu einer Lösung aus LDA (1,25 äq.) in THF bei –78 °C hinzugegeben. Nach 90 min Rühren bei –78 °C wurde die orange-braune Lösung mit einer Lösung aus POCl3 (20,80 g) und Pyridin (50 ml) in 150 ml THF langsam behandelt. Das Trockeneisbad wurde nach 60 min entfernt und das Rühren für 1 h fortgesetzt. Die Lösung. wurde braun und bildete einen Niederschlag.

Das Gemisch wurde mit 3-Hydroxypropionitril (27,8 ml) behandelt. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde das ausgefallene Pyridin-HCl abgefiltert und mit THF gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden in einem Vakuum verdampft, und das erhaltene, braune Öl wurde über eine Säulenchromatographie unter Verwendung von 50–100 % Ethylacetat/Hexane getrennt, wovon das Produkt isoliert wurde. Das gelbe Öl wurde in CH2Cl2 (300 ml) gelöst, mit Wasser (450 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und in einem Vakuum getrocknet. Dies ergab das Produkt (17,76 g) in Form eines gelben Feststoffes. 1H NMR (CDCl3) &dgr; 2,33-2,53 (m, 4H), 3,53 (s, 3H), 3,82-4,06 (m, 4H), 6,93 (t, 1H), 7,03 (d, 1H), 7,10-7,18 (m, 2H), 7,25-7,55 (m, 5H), 7,79-7,92 (m, 5H), 8,02 (d, 1H); 31P NMR (CDCl3) &dgr; -9,69(p) (rel. zu ext. H3PO4).

e. 9-(Naphthylthiophosphoryloxymethyliden)-10-methylacridan, Dinatriumsalz (4).

Eine Lösung der Bis(cyanoethyl)phosphat-Verbindung (17,28 g) in 200 ml Aceton wurde mit Argon durchspült. Eine Lösung aus NaOH (2,76 g) in 50 ml Wasser wurde hinzugefügt, und die Lösung wurde unter Argon über Nacht gerührt. Der Niederschlag, der sich gebildet hatte, wurde mit Unterdruck gefiltert, mit 20 % Wasser in Aceton (300 ml) gewaschen und in einem Vakuum getrocknet. Das Produkt (15,07 g) wurde in Form eines leicht gelben Feststoffes erhalten. 1H NMR (D2O) &dgr; 3,22 (s, 3H), 6,67 (d, 1H), 6,87 (t, 1H), 7,01 (t, 1H), 7,08-7,15 (m, 2H), 7,23 (d, 1H), 7,31-44 (m, 3H), 7,51 (s, 1H), 7,59 (d, 2H), 7,73 (d, 1H), 7,86 (d, 1H), 8,25 (d, 1H); 31P NMR (D2O) &dgr; 1,30 (s).

Beispiel 5. Weitere, hergestellte heterozyklische Enolphosphate.

Die folgenden Verbindungen der Formel IV wurden ebenfalls hergestellt und erfüllen ihre Funktion in den erfindungsgemäßen chemolumineszenten Reaktionen.

R11-R18 sind H, wenn nicht anders angegeben. Die Verbindungen 6–8 werden als ein Gemisch aus Doppelbindungsisomeren erhalten. Jede der Verbindungen 5–14 wurden entsprechend der allgemeinen Syntheseverfahren, die in den Beispielen 1–4 beschrieben sind, hergestellt. Zusätzlich wurden sowohl Verbindungen mit den Formeln: wobei V t-Butyl, CH3, OCH3, F, Cl, Br, I, COCH3, CN und NO2 ist, als auch Verbindungen mit der Formel: wobei U p-I, p-CH3, m-OCH3, o-Cl, m-Cl, o-Br, m-Br, p-Br und p-NO2 ist, genauso wie Verbindungen dieser Formel, die eine 3,4-Dichlor-, 2,5-Dichlor- und 2,6-Dichlorphenylgruppe aufweisen, hergestellt, und sie stellen Chemolumineszenz her, wenn sie mit einer dihydroxyaromatischen Verbindung umgesetzt werden.

Beispiel 6. Herstellung der geschützten dihydroxyaromatischen Verbindung 4-Hydroxyphenylphosphat, Dinatriumsalz.

Hydrochinon wurde als Monobenzoatester mit 62 % Ausbeute durch das Umsetzen mit Benzoylchlorid und Pyridin in CH2Cl2 bei 0 °C geschützt. Der Ester wurde mit überschüssigem POCl3 in Pyridin bei 0 °C phosphoryliert. Das Dichlorphosphat-Derivat wurde mit 10 äq. 3-Hydroxypropionitril umgesetzt, um das Bis(cyanoethyl)phosphat mit einer Ausbeute von 89 % herzustellen. Die Cyanoethyl- und Benzoyl-Schutzgruppen wurden bei Raumtemperatur über Nacht mit wässrigem NaOH/Aceton hydrolysiert. Das ausgefallene Produkt wurde in Methanol gelöst und mit Aceton gefällt, um 4-Hydroxyphenylphosphat als Dinatriumsalz herzustellen. 1H NMR (D2O) &dgr; 6,56 (d, 1H), 6,92 (t, 1H).

Beispiel 7. Herstellung der geschützten dihydroxyaromatischen Verbindung 2-Hydroxyphenylphosphat, Dinatriumsalz.

Catechin wurde als Monobenzoatester mit einer Ausbeute von 62 % durch das Umsetzen mit Benzoylchlorid und Pyridin in CH2Cl2 bei 0 °C geschützt. Der Ester wurde mit überschüssigem POCl3 und Pyridin in CH2Cl2 bei 0 °C phosphoryliert. Das Dichlorphosphat-Derivat wurde mit 10 äq. 3-Hydroxypropionitril umgesetzt, um das Bis(cyanoethyl)phosphat mit einer Ausbeute von 90 % herzustellen. Die Cyanoethyl- und Benzoyl-Schutzgruppen wurden bei Raumtemperatur über Nacht mit wässrigem NaOH/Aceton hydrolysiert. Das ausgefallene Produkt wurde in Methanol gelöst, mit Aceton gefällt, und der Feststoff wurde erneut mit Methanol gewaschen, um 2-Hydroxyphenylphosphat als Dinatriumsalz herzustellen. 1H NMR (D2O) &dgr; 6,56-6,61 (m, 1H), 6,68-6,71 (d, 1H), 6,82-6,87 (m, 1H), 7,19-7,22 (d, 1H).

Beispiel 8. Herstellung der geschützen dihydroxyaromatischen Verbindung 4-Hydroxy-2,3,5,6-tetrafluorphenylphosphat, Dinatriumsalz.

2,3,5,6-Tetrafluorhydrochinon wurde als der Mono(t-butyldimethylsilyl)ether mit einer Ausbeute von 46 % durch das Umsetzen mit t-Butyldimethylsilylchlorid und Imidazol in DMF über Nacht bei Raumtemperatur geschützt. Nach chromatographischer Aufreinigung (10 % Ethylacetat/Hexan) wurde der Silylether mit überschüssigem POCl3 in Pyridin bei 0 °C phosphoryliert. Das Dichlorphosphat-Derivat wurde mit 10 äq. 3-Hydroxypropionitril umgesetzt, um das Bis(cyanoethyl)phosphat-Derivat herzustellen, das ebenfalls in einer Ausbeute von 55 % nach Säulenchromatographie (75–100 % Ethylacetat in Hexan) desilyliert wurde. Die Cyanoethyl-Schutzgruppe wurde mit wassrigem NaOH/Aceton bei Raumtemperatur für 2 Tage hydrolysiert. Das ausgefallene Produkt wurde in Methanol gelöst und mit Aceton ausgefällt, um das Dinatriumphosphatsalz herzustellen. 31P NMR (CD3OD) &dgr; 4,244; 19F MNR (CD3OD) &dgr; -169,02 (d, 2F), -161,16 (d, 2F).

Beispiel 9. Herstellung der geschützten dihydroxyaromatischen Verbindungen 2- und 3-Chlor-4-hydroxyphenylphosphat, Dinatriumsalz.

20 g (Aldrich, Milwaukee, Wisconsin) 2-Chlorhydrochinon wurden durch Lösen in 350 ml warmem 10 % Ethylacetat/CH2Cl2 umkristallisiert, gefiltert und zu 1,5 l Hexan hinzugefügt. Nach Kühlung bei 4 °C über Nacht wurden 11 g eines cremefarbenen Feststoffes gesammelt. Das gereinigte 2-Chlorhydrochinon wurde mit Acetylchlorid/Pyridin in CH2Cl2 bei Eistemperatur monoacetyliert, um ein Gemisch aus den isomeren Monoacetaten und dem Diacetat herzustellen. Das Gemisch wurde mit überschüssigem POCl3 in Pyridin bei 0 °C phosphoryliert. Das Reaktionsprodukt wurde mit überschüssigem 2-Cyanoethanol umgesetzt, um ein 4:1-Gemisch aus isomeren Bis(cyanoethyl)phosphat-Derivaten herzustellen, die durch Säulenchromatographie (30 % Ethylacetat/Hexan) von dem Diacetat getrennt wurden. Die Acetat- und Cyanoethyl-Schutzgruppen wurden mit wässrigem NaOH/Aceton (3 äq. von NaOH) bei 0 °C für 19 h hydrolysiert. Das ausgefallene Produkt wurde in Methanol gelöst und mit Aceton ausgefällt, um die isomeren Dinatriumphosphatsalze herzustellen. 1H NMR (D2O) &dgr; 6,56-7,19 (m, 3H); 31P NMR (D2O) &dgr; 1,36, 1,39.

Beispiel 10. Herstellung der geschützten dihydroxyaromatischen Verbindung 4-Hydroxyphenyl-&bgr;-D-galactopyranosid.

Hydrochinon wurde mit &agr;-Bromgalactosetetraacetat (1,5 äq.) in Ethanol/wässriges NaOH bei Raumtemperatur für 2 Tage in einem lichtgeschützten Behälter umgesetzt. Natriumethoxid (5 äq.) wurde hinzugefügt, und die Lösung wurde nach 1 Stunde konzentriert. Der Rest wurde zwischen Wasser und Ethylacetat aufgeteilt. Die wässrige Schicht wurde verdampft, und das Produkt wurde auf Kieselgel chromatographisch gereinigt (30 % Methanol/CH2Cl2). 1H NMR (CD2OD) &dgr; 3,57-3,88 (m, 6H), 4,68 (d, 1H), 6,68 (d, 2H), 6,96 (d, 2H).

Beispiel 11. Herstellung der geschützten dihydroxyaromatischen Verbindung 4-Hydroxyphenyl-&bgr;-D-glucuronid.

Hydrochinon (10 g) wurde in den Monobenzoatester durch das Umsetzen mit Benzoylchlorid und Pyridin in CH2Cl2 umgewandelt. Die Ausbeute betrug 7 g Ester. 1H NMR (CDCl3) &dgr; 4,880 (s, 1H), 6,87 (d, 2H), 7,08 (d, 2H), 7,52 (t, 2H), 7,64 (t, 1H), 8,20 (d, 2H).

Der Letztere (200 mg) wurde mit wässrigem NaOH in Aceton deprotoniert und durch das Umsetzen mit Ethyl-&agr;-D-Bromglucuronat in absolutem Ethanol in das &bgr;-Glucuronidethylester-Derivat umgewandelt. Die Reinigung durch präparative TLC erforderte 50 mg der doppelt geschützten Verbindung. 1H NMR (CD3OD) &dgr; 1,290 (t, 3H), 3,601-3,780 (m, 3H), 4,146-4,258 (m, 3H), 4,64 (br s, 2H), 4,86 (br s, 1H), 5,192 (d, 1H), 7,187-7,285 (m, 4H), 7,635 (t, 2H), 7,767 (t, 1H), 8,208 (d, 2H).

Eine 50 mg Probe der letzteren Verbindung wurde mit wässriger NaOH in Aceton hydrolysiert, um den Benzoatester und die Ethylestergruppen zu verseifen. Das ausgefallene Produkt (16 mg) wurde gefiltert und getrocknet. 1H NMR (CD3OD) &dgr; 3,4-3,5 (m, 3H), 3,64 (d, 1H), 4,65 (d, 1H), 6,53 (d, 2H), 6,87 (d, 2H).

Beispiel 12. Bewertung der dihydroxyaromatischen Verbindungen.

Verschiedene dihydroxyaromatische Verbindungen wurden gescreent, um ihre allgemeine Wirksamkeit bei der Induzierung der chemolumineszenten Reaktion von 1 zu bestimmen. Es wurden Stammlösungen der Testverbindungen (2 × 10–4 M in Ethanol/10 % DMSO oder DMSO) hergestellt. Ein 5 &mgr;l Aliquot von jeder wurde in eine Vertiefung einer 96-Vertiefungsmikroplatte gegeben. Zu jeder Vertiefung wurden 95 &mgr;l einer Lösung, die 0,66 mM der Verbindung 1, in 0,2 M 2-Methyl-2-amino-1-propanol-Puffer, pH-Wert 9,6, 0,88 mM Mg2+ und 0,1 % SDS enthielt, hinzugefügt. Die Lichtintensität wurde für 30 min in allen Vertiefungen gescannt. Für jede Testvertiefung wurden die maximale Intensität und die Zeit bis zum Maximum bestimmt.

Beispiel 13. Kinetisches Profil der Chemolumineszenz-Intensität.

Die schnelle Erzeugung von Chemolumineszenz aus einer Zusammensetzung, die Acridanphosphat 1 und Hydrochinon (DHA-2) enthält, wird in 1 gezeigt. Das Reaktionsgemisch umfasste 0,66 mM Acridanphosphat 1 und 4 &mgr;M Hydrochinon in 2-Methyl-2-amino-1-propanol-(221)-Puffer, 0,2 M, pH-Wert 9,6, der auch 0,88 mM MgCl2 enthielt.

Beispiel 14: Chemolumineszenz Detektion von Acridanphosphat 2 mit DHA-1.

Das folgende Beispiel stellt die Fähigkeit dar, sehr kleine Mengen einer heterozyklischen Enolphosphatverbindung durch die Verwendung der chemolumineszenten Reaktion mit einer dihydroxyaromatischen Verbindung zu detektieren.

In jede von 3 weißen Mikrovertiefungen wurde ein 100 &mgr;l Aliquot einer Lösung aus Acridanphosphat 2 (Verdünnungen enthielten zwischen 6,6 × 10–11 und 6,6 × 10–17 mol) in 0,2 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6, 0,88 mM MgCl2, 0,1 % SDS gebracht. Ein 100 &mgr;l Aliquot einer 0,01 mM Lösung aus 2-Chlorhydrochinon (DHA-1) in Wasser wurde in jede Vertiefung injiziert, und die Lichtintensität wurde nach 2,5 min gemessen. Die Ergebnisse, die in 2 gezeigt werden, zeigen, dass die Lichtintensität eine direkte Funktion der Menge der Phosphatverbindung über den gesamten, getesteten Bereich ist.

Dieses Beispiel demonstriert, dass das heterozyklische Enolphosphat bei Konzentrationen detektiert werden kann, die niedrig genug sind, dass ein geeignet funktionalisiertes Derivat mit einer koppelbaren Gruppe als eine signalerzeugende Markierung in einem spezifischen Bindungs-Assay wirken kann.

Beispiel 15. Reagenz zur chemolumineszenten Detektion von alkalischer Phosphatase.

Eine wirksame Reagenzzusammensetzung für die chemolumineszente Detektion von alkalischer Phosphatase umfasste 0,2 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6, 0,88 mM MgCl2, 0,33 mM Acridanphosphat 1 und 1 mM 4-Hydroxyphenylphosphat. Das Umsetzen von 100 &mgr;l dieser Zusammensetzung mit 8 × 10–17 mol AP bei 25 °C in einem Reagenzglas, das in einem Turner TD-20e Luminometer platziert wurde, stellte einfach messbare, blaue Chemolumineszenz her. Das Zeitprofil einer typischen Reaktion wird in 3 gezeigt.

Beispiel 16. Chemoluminineszente Detektion mit anderen heterozyklischen Enolphosphatverbindungen.

In der Art und Weise des vorigen Beispiels wurden Zusammensetzungen, die jedes der Acridanphosphate 2-4 anstelle von Verbindung 1 enthielten, mit AP bei 25 °C umgesetzt. Jede stellte einfach messbare Chemolumineszenz, erkennbar über dem Hintergrund in Abwesenheit von AP, her.

Beispiel 17. Wirkung der Konzentration der geschützten dihydroxyaromatischen Verbindung.

Es wurde eine Studie durchgeführt, um den Bereich der Konzentrationen der geschützten dihydroxyaromatischen Verbindung zu bestimmen, die für chemolumineszente Assays einer Hydrolase geeignet sind. Ein Reagenz, bestehend aus einer 0,33 mM Lösung Acridanphosphat 1 und 0,88 mM MgCl2 in 0,2 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6, die 4-Hydroxyphenylphosphat-Konzentrationen, die von 0 bis 10 mM variierten, enthielt, wurde mit 8 × 10–17 mol AP bei 25 °C (in mg/ml: a, 1; b, 3,3; c, 0,66; d, 0,83; e, 10; f, 0,1; g, 0) umgesetzt. 4 stellt die verschiedenen kinetischen Profile der Chemolumineszenz-Emission dar. Die Tatsache, dass die Lösung, die kein 4-Hydroxyphenylphosphat enthält, annähernd keine Chemolumineszenz herstellt, demonstriert, dass die Lichtemission nicht einfach aufgrund des Entfernens der Phosphat-Schutzgruppe von 1 durch AP, gefolgt durch Autooxidation des Enolats, erfolgt.

Beispiel 18. Linearität der AP-Detektion mit Acridanphosphat 1 in einem Einschritt-Assay.

Ein chemolumineszentes Assay von AP wurde durch das Umsetzen verschiedener AP-Mengen mit 100 &mgr;l Anteilen einer Reagenzzusammensetzung, die 0,66 mM Acridanphosphat 1, 0,66 mM 4-Hydroxyphenylphosphat und 0,88 mM MgCl2 in 0,2 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6 umfasste, platziert in einer 96-Vertiefungsplatte, die in einem Labsystems Luminoskan Luminometer untergebracht war, bei 25 °C durchgeführt. Die bei 25 min gemessene Lichtintensität korrelierte mit der Enzymmenge im Bereich von 8 × 10–17–8 × 10–20 mol, wie in 5 gezeigt wird.

Beispiel 19. Chemolumineszente Detektion von &bgr;-Galactosidase.

Eine &bgr;-Galactosidase-Stammlösung (Grade VIII, Kat. Nr. G 5635, Sigma Chemical Co.) wurde in 0,01 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, 0,01 M NaCl, 0,01 M MgCl2 in einer Reihe verdünnt, um zwischen 4,9 × 10–15 und 1,6 × 10–18 mol Enzym/&mgr;l zu enthalten. 130 &mgr;l Aliquots einer 1 mM Lösung von 4-Hydroxyphenyl-&bgr;-D-galactosid in 0,05 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5, 0,01 M NaCl, 3 mM MgCl2 wurden bei 37 °C für 35 min mit 2,6 &mgr;l jeder der Enzymverdünnungen inkubiert. Doppelte 50 &mgr;l-Anteile wurden in schwarze Mikrovertiefungsstreifen übertragen und auf Raumtemperatur gekühlt. Ein 50 &mgr;l-Anteil einer Acridanphosphat-3-Lösung, die die folgende Zusammensetzung aufwies: 0,2 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6, 0,88 mM MgCl2, 0,66 mM Acridanphosphat 3 und 0,1 % SDS, wurde in jede Vertiefung injiziert. Die Enzymmenge in den Vertiefungen reichte von 4,9 × 10–15 und 1,6 × 10–18 mol &bgr;-Galactosidase.

Die Chemolumineszenz-Intensität, gemessen bei 5 min im Vergleich zur &bgr;-Galactosidase-Menge, wird in 6 gezeigt.

Beispiel 20. Chemolumineszente Detektion von &bgr;-Glucuronidase.

Eine &bgr;-Glucuronidase-Stammlösung (Typ X-A, Kat. Nr. G 7896, Sigma Chemical Co., MW = 290.000) wurde in einer Reihe in 0,01 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, 0,15 M NaCl verdünnt, um zwischen 3,3 × 10–14 und 3,3 × 10–18 mol Enzym/&mgr;l zu enthalten. 130 &mgr;l Aliquots einer 1 mM Lösung von 4-Hydroxyphenyl-&bgr;-D-glucuronid in 0,05 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, 0,01 M NaCl, wurden mit 2,6 &mgr;l jeder der Enzymverdünnungen bei 37 °C für 30 min inkubiert. Doppelte 50 &mgr;l-Anteile wurden in schwarze Mikrovertiefungsstreifen übertragen und auf Raumtemperatur gekühlt. Ein 50 &mgr;l-Anteil einer Acridanphosphat-4-Lösung, die die folgende Zusammensetzung aufwies: 0,2 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6, 0,88 mM MgCl2, 0,66 mM Acridanphosphat 4 und 0,1 % SDS wurde in jede Vertiefung injiziert. Die Chemolumineszenz-Intensität, gemessenen bei 11 min im Vergleich zur &bgr;-Glucuronidase-Menge, wird in 7 gezeigt.

Beispiel 21. Western-Blot-Assay mit Verwendung eines alkalischen Phosphatase-Konjugats.

Erfindungsgemäße Zusammensetzungen wurden verwendet, um ein Proteinantigen, &bgr;-Galactosidase in einem Western Blot mit einem AP-markierten Antikörper auf einer Nitrocellulose-Membran zu detektieren und zu quantifizieren. &bgr;-Galactosidase-Verdünnungen, die jeweils 5.000, 1.000, 180, 30 und 5 pg Protein enthielten, wurden einer Elektrophorese unterzogen und auf Nitrocellulose-Membranen (Hybond ECL, Amersham, Arlington Heights, Illinois) übertragen. Die Membranen wurden für 1 h bei Raumtemperatur mit 1 % fettfreier Milch (NFM) in T-TBS (0,05 % Tween 20 in TBS; TBS ist 50 mmol/l Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 0,15 mol/l NaCl) blockiert und dann nacheinander mit einer 1:1.500-Verdünnung einer 3,3 &mgr;g/ml-Lösung Maus-anti-&bgr;-Galactosidase in Blockierungs-Puffer, T-TBS-Waschpuffer und anschließend einer 1:600-Verdünnung einer 416 mU/ml-Lösung eines Schaf-anti-Maus-IgG-AP-Konjugats behandelt. Nach dem Waschen mit T-TBS, wurden die Membranen kurz mit einem Detektionsreagenz eingeweicht, das 0,2 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6, der 0,88 mM MgCl2, 0,66 mM Hydrochinonphosphatdinatriumsalz, 0,66 mM Acridanphosphat 3 und 0,1 % SDS enthielt, umfasste. Die Membranen wurden zwischen transparente Plastikfolien gebracht und auf einen Röntgenfilm exponiert. Alle fünf Banden der &bgr;-Galactosidase wurden nach 15 min mit einer 1 min-Exponierung detektiert. Das unter Verwendung dieser Zusammensetzungen hergestellte Licht führte zu starker Emission, die für mindestens 1 Tag abgebildet werden konnte.

Beispiel 22. Dot-Blot-Assay.

Ein repräsentatives Beispiel der Verwendung eines erfindungsgemäßen Reagenz in einem Dot-Blot-Assay wird in dem folgenden Beispiel demonstriert.

Digoxigenin-markierte DNA (pBR328), Anti-Digoxigenin-AP-Konjugat wurden als Kit zur Verfügung gestellt (Genius 3, Boehringer-Mannheim, Indianapolis, Indiana), Blockierungs-Puffer und positiv geladene Nylonmembran wurden von Boehringer-Mannheim bezogen. Der Waschpuffer bestand aus 0,1 M Maleinsäure, pH-Wert 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05 % SDS. Das Detektionsreagenz umfasste 0,66 mM Acridanphosphat 2, 0,66 mM 4-Hydroxyphenylphosphat, 0,88 mM MgCl2, 0,1 % SDS in 0,2 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6.

DNA-Verdünnungen (10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01 pg) wurden auf Nylonmembranen gedotblottet, blockiert, gewaschen und gemäß des Herstellerprotokolls mit Antikörper-AP-Konjugat umgesetzt. Überschüssiger Puffer wurde abgegossen, und die Blots wurden in einem beschriebenen Detektionsreagenz für 3 min eingeweicht. Überschüssiges Reagenz wurde abgegossen, und die Blots wurden zwischen transparente Folien gebracht und auf einen Röntgenfilm für verschiedene Zeiträume exponiert. Eine sofortige 1 min-Exponierung detektierte die 10 pg-0,3 pg Punkte. Nach 30 min, wurden alle 7 Punkte mit einer 20 min-Exponierung detektiert. Mehrfache Exponierungen konnten für einige Tage durchgeführt werden. Zum Beispiel wurden nach 5 Tagen alle 7 Punkte mit einer 1-5 min-Exponierung detektiert. Detektionsreagentien, die 0,66 mM Acridanphosphat 3, oder 0,66 mM Lösung eines Gemisches von 2- und 3-Chlor-4-hydroxyphenylphosphat enthielten, stellten vergleichbare Ergebnisse her.

Die vorangehende Beschreibung und die Beispiele sind nur darstellend und dürfen nicht als restriktiv angesehen werden. Es wird erkannt, dass Modifikationen der spezifischen Verbindungen und Verfahren, die nicht spezifisch offenbart wurden, gemacht werden können, ohne den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung zu verlassen, der nur durch die beigefügten Ansprüche beschränkt wird.


Anspruch[de]
Zusammensetzung zur Erzeugung von Chemolumineszenz in der Gegenwart von Sauerstoff, umfassend

a) eine dihydroxyaromatische Verbindung, die von 1 bis 5 carbozyklische aromatische Ringe umfasst und die mit zwei Hydroxylgruppen substituiert ist, die durch eine gerade Zahl von Ringkohlenstoffatomen getrennt sind, und

b) eine heterozyklische Enolphosphatverbindung mit der Formel wobei R10 eine organische Gruppe ist, die bis zu 50 Nicht-Wasserstoffatome, ausgewählt aus C-, N-, O-, S-, P- und Halogenatomen, enthält, jedes von R11 bis R18 unabhängig aus Wasserstoff, Alkyl-, substituierten Alkyl-, Aryl-, substituierten Aryl-, Aralkyl-, substituierten Aralkyl-, Alkenyl-, Alkynyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Halogen, Amino-, substituierten Amino-, Carboxyl-, Carboalkoxy-, Carboxamid-, Cyano- und Sulfonatgruppen ausgewählt ist, und wobei Paare benachbarter Gruppen einen benzo-kondensierten Ring vervollständigen können, R19 eine organische Gruppe ist, die bis zu 50 Nicht-Wasserstoffatome, ausgewählt aus C-, N-, O-, S-, P- und Halogenatomen, enthält, Z aus O- und S-Atomen ausgewählt ist, jedes M unabhängig aus H und einem kationischen Zentrum ausgewählt ist und n eine Zahl ist, die Elektroneutralität genügt, und mit der Maßgabe, dass jegliches von R11 bis R18 oder ein Substituent an jeglichem von R10 bis R19 eine Gruppe -A-Q sein kann, wobei A eine Spacergruppe, ausgewählt aus C1-C10 Alkylen- und C2-C10 Oxyalkylengruppen, ist und Q eine zur Bildung einer kovalenten Bindung fähige Verbindungsgruppe, ausgewählt aus Halogen, Diazo-, -NCO, -NCS, -CHO, Säureanhydrid-, Oxiranyl-, Succinimidooxycarbonyl-, Maleimid-, Cyano-, Triazol-, Tetrazol-, Hydroxyl-, -COOOH, Thiol-, primären Amino- und sekundären Aminogruppen, ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die dihydroxyaromatische Verbindung ein aromatisches Ringsystem, ausgewählt aus Benzol-, Biphenyl-, Naphthalin- und Anthracenringen, umfasst. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die dihydroxyaromatische Verbindung die Formel I aufweist, wobei mindestens eines von R1 und R3 eine OH-Gruppe ist, das andere von R1 oder R3 und R2, R4 und R5 jeweils unabhängig aus Wasserstoff, Alkyl-, Alkoxy-, Alkenyl-, Alkynyl-, Aryl-, Aralkyl-, Amino-, Aminoalkyl-, Carboxyl- -C(=O)OH, Carboxylester- -C(=O)OR6, Formyl- -C(=O)H, Alkylcarboxy- -OC(=O)R6, Arylcarboxy- -OC(=O)R9 und Halogengruppen ausgewählt sind, Paare von benachbarten Gruppen, wenn zusammengenommen, einen fünf- oder sechsgliedrigen aliphatischen oder aromatischen Ring vervollständigen können, R6 eine C1-8 Alkylgruppe ist, R7 und R8 jeweils Wasserstoff oder eine C1-8 Alkylgruppe sind und R9 eine Arylringgruppe ist. Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei R3 in der Verbindung der Formel I die OH-Gruppe ist und R1, R2, R4 und R5 unabhängig aus Wasserstoff, Alkyl-, Alkoxy-, Halogen, Aryl- und Aralkylgruppen ausgewählt sind. Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die Gruppe R3 in der Verbindung der Formel I die OH-Gruppe ist, R2, R4 und R5 jeweils Wasserstoff sind und R1 aus Wasserstoff, Alkyl-, Alkoxy-, Halogen, Aryl- und Aralkylgruppen ausgewählt ist. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe R19 in der heterozyklischen Enolphosphatverbindung aus substituierten und unsubstituierten C1-8 Alkylgruppen und substituierten und unsubstituierten Benzylgruppen ausgewählt ist. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe R10 in der heterozyklischen Enolphosphatverbindung aus Alkyl-, substituierten Alkyl-, Aryl-, substituierten Aryl-, Aralkyl- und substituierten Aralkylgruppen ausgewählt ist. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die heterozyklische Enolphosphatverbindung die Formel aufweist, wobei Z O oder S ist, wobei Ar aus einer Phenylgruppe, einer substituierten Phenylgruppe und einer Naphthylgruppe ausgewählt ist, wobei R19 eine C1-8 Alkylgruppe ist und wobei jedes von R11 bis R18 unabhängig aus Wasserstoff und C1-8 Alkoxygruppen ausgewählt ist. Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei das heterozyklische Enolphosphat eine der folgenden Formeln aufweist: Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei die heterozyklische Enolphosphatverbindung die in Anspruch 8 beanspruchte Formel aufweist. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die heterozyklische Enolphosphatverbindung die Gruppe -A-Q enthält, bevorzugt als ein Substituent in R10 oder R19 oder an jeglicher der R11- bis R18-Positionen. Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend einen wässrigen Puffer mit einem pH in dem Bereich von 7 bis 10,5, enthaltend die dihydroxyaromatische Verbindung mit einer Konzentration von 0,001 bis 20 mM und die heterozyklische Enolphosphatverbindung mit einer Konzentration von 0,001 bis 20 mM. Zusammensetzung nach Anspruch 10, in welcher der Puffer einen pH in dem Bereich von 8 bis 10 aufweist und die dihydroxyaromatische Verbindung mit einer Konzentration von etwa 0,05 bis 5 mM und die heterozyklische Enolphosphatverbindung mit einer Konzentration von etwa 0,05 bis 5 mM enthält. Zusammensetzung zur Erzeugung von Chemolumineszenz durch Reaktion mit einer Hydrolase, umfassend die Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Gruppen R11 bis R18 oder die Substituenten in R10 oder R19 die Gruppe -A-Q nicht umfassen. Zusammensetzung nach Anspruch 14, umfassend die in einem der Ansprüche 2 bis 8 beanspruchten zusätzlichen Merkmale. Zusammensetzung nach Anspruch 14, umfassend ein in Anspruch 12 oder Anspruch 13 beanspruchtes wässriges Gemisch. Zusammensetzung nach Anspruch 16, zusätzlich umfassend ein anionisches grenzflächenaktives Mittel. Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei das anionische grenzflächenaktive Mittel ein C10-C20 Alkylsulfat ist. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei das anionische grenzflächenaktive Mittel Natriumdodecylsulfat ist. Verfahren zur Erzeugung von Chemolumineszenz, umfassend das Umsetzen in der Gegenwart von Sauerstoff

a) einer dihydroxyaromatischen Verbindung, die von 1 bis 5 carbozyklische aromatische Ringe umfasst und die mit zwei Hydroxylgruppen substituiert ist, die durch eine gerade Zahl von Ringkohlenstoffatomen getrennt sind, und

b) einer heterozyklischen Enolphosphatverbindung mit der Formel wobei R10 eine organische Gruppe ist, die bis zu 50 Nicht-Wasserstoffatome, ausgewählt aus C-, N-, O-, S-, P- und Halogenatomen, enthält, jedes von R11 bis R18 unabhängig aus Wasserstoff, Alkyl-, substituierten Alkyl-, Aryl-, substituierten Aryl-, Aralkyl-, substituierten Aralkyl-, Alkenyl-, Alkynyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Halogen, Amino-, substituierten Amino-, Carboxyl-, Carboalkoxy-, Carboxamid-, Cyano- und Sulfonatgruppen ausgewählt ist, und wobei Paare benachbarter Gruppen einen benzo-kondensierten Ring vervollständigen können, R19 eine organische Gruppe ist, die bis zu 50 Nicht-Wasserstoffatome, ausgewählt aus C-, N-, O-, S-, P- und Halogenatomen, enthält, Z aus O- und S-Atomen ausgewählt ist, jedes M unabhängig aus H und einem kationischen Zentrum ausgewählt ist und n eine Zahl ist, die Elektroneutralität genügt, und mit der Maßgabe, dass jegliches von R11 bis R18 oder ein Substituent an jeglichem von R10 bis R19 eine Gruppe -A-Q sein kann, wobei A eine Spacergruppe, ausgewählt aus C1-C10 Alkylen- und C2-C10 Oxyalkylengruppen, ist und Q eine zur Bildung einer kovalenten Bindung fähige Verbindungsgruppe, ausgewählt aus Halogen, Diazo-, -NCO, -NCS, -CHO, Säureanhydrid-, Oxiranyl-, Succinimidooxycarbonyl-, Maleimid-, Cyano-, Triazol-, Tetrazol-, Hydroxyl-, -COOH, Thiol-, primären Amino- und sekundären Aminogruppen, ist.
Verfahren nach Anspruch 20, welches die zusätzlichen Merkmale von einem der Ansprüche 2 bis 11 umfasst. Verfahren nach Anspruch 20, wobei Sauerstoff aufgelöst in einer Lösung, welche die dihydroxyaromatische Verbindung und die heterozyklische Enolphosphatverbindung enthält, im Gleichgewicht mit der Atmosphäre zugeführt wird. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die dihydroxyaromatische Verbindung und die heterozyklische Enolphosphatverbindung in einer Lösung vorliegen, umfassend einen wässrigen Puffer mit einem pH zwischen etwa 7 und etwa 10,5, wobei die dihydroxyaromatische Verbindung mit einer Konzentration von 0,001 bis 20 mM vorliegt und die heterozyklische Enolphosphatverbindung mit einer Konzentration von 0,001 bis 20 mM vorliegt. Verfahren nach Anspruch 20, weiter umfassend den Schritt des Herstellens der dihydroxyaromatischen Verbindung durch das Umsetzen einer geschützten dihydroxyaromatischen Verbindung, in welcher eine Hydroxylgruppe einer dihydroxaromatischen Verbindung durch eine mit einer Hydrolase Enzym-spaltbare Gruppe X, um die Enzym-spaltbare Gruppe zu entfernen, geschützt ist. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Reaktion der Hydrolase mit der geschützten dihydroxyaromatischen Verbindung in der Abwesenheit des heterozyklischen Enolphosphats durchgeführt wird. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Reaktion der Hydrolase mit der geschützten dihydroxyaromatischen Verbindung in der Gegenwart des heterozyklischen Enolphosphats durchgeführt wird. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Hydrolase aus alkalischer Phosphatase, Säurephosphatase, &bgr;-Galactosidase, &bgr;-Glucuronidase, und &bgr;-Glucosidase ausgewählt ist und die Enzym-spaltbare Gruppe aus Phosphat-, &bgr;-Galactosid-, &bgr;-Glucuronid- und &bgr;-Glucosidgruppen ausgewählt ist. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die geschützte dihydroxyaromatische Verbindung die Formel aufweist, wobei eines von R1 und R3 eine OX-Gruppe ist, wobei X die Enzym-spaltbare Gruppe ist, das andere von R1 oder R3 und R2, R4 und R5 jeweils unabhängig aus Wasserstoff, Alkyl-, Alkoxy-, Alkenyl-, Alkynyl-, Aryl-, Aralkyl-, Amino-, Aminoalkyl-, Carboxyl- -C(=O)OH, Carboxylester- -C(=O)OR6, Formyl- -C(=O)H, Alkylcarboxy- -OC(=O)R6, Arylcarboxy- -OC(=O)R9 und Halogengruppen ausgewählt sind, Paare von benachbarten Gruppen, wenn zusammengenommen, einen Benzo-kondensierten Ring vervollständigen können, R6 eine C1-8 Alkylgruppe ist, R7 und R8 jeweils Wasserstoff oder eine C1-8 Alkylgruppe sind und R9 eine Arylringgruppe ist. Verfahren nach Anspruch 28, wobei R3 die OX-Gruppe ist, R2, R4 und R5 jeweils Wasserstoff sind und R1 aus Wasserstoff, Alkyl-, Alkoxy-, Halogen, Aryl- und Aralkylgruppen ausgewählt ist. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die geschützte dihydroxyaromatische Verbindung aus 3-Chlor-4-hydroxyphenylphosphatdinatriumsalz, 2-Chlor-4-hydroxyphenylphosphatdinatriumsalz und 2,3,5,6-Tetrafluoro-4-hydroxyphenylphosphatdinatriumsalz ausgewählt ist. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die heterozyklische Enolphosphatverbindung die in Anspruch 8 definierte Formel aufweist. Verfahren zur Durchführung einer Analyse eines Analyten, umfassend

a) das Umsetzen der in Anspruch 1 beanspruchten Zusammensetzung in der Gegenwart von Sauerstoff,

b) das Messen der Chemolumineszenz und

c) das Inbeziehungsetzen der Chemolumineszenz zu der Menge des Analyten.
Verfahren nach Anspuch 32, in welchem die Zusamensetzung wie in einem der Ansprüche 2 bis 8 beansprucht ist. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die heterozyklische Enolphosphatverbindung die Gruppe A–Q enthält und weiter umfassend

das Umsetzen der heterozyklischen Enolphosphatverbindung mit einem spezifischen Bindungspaarelement, um ein nachweisbares markiertes spezifisches Bindungspaarelement zu bilden,

das Inkontaktbringen des markierten spezifischen Bindungspaarelements mit seinem spezifischen Bindungspartner, um ein markiertes spezifisches Bindungspaar zu bilden, und

das Inkontaktbringen des markierten spezifischen Bindungspaars mit der dihydroxyaromatischen Verbindung, um Chemolumineszenz zum Nachweis des Analyten zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei die heterozyklische Enolphosphatverbindung wie in Anspruch 11 definiert ist. Verfahren nach Anspruch 32, weiter umfassend die in einem der Ansprüche 24 bis 27 definierte geschützte dihydroxaromatische Verbindung. Verfahren nach Anspruch 36, wobei der Analyt die Hydrolase ist. Verfahren nach Anspruch 36, wobei die Hydrolase als eine Markierung an einem spezifischen Bindungspaarelement bereitgestellt ist.






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