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Dokumentenidentifikation DE69737080T2 03.05.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0000819700
Titel Extraktion des basischen Myelinproteins
Anmelder Määttä, Jorma, Vanhalinna, FI;
Hinkkanen, Ari, Turku, FI
Erfinder Hinkkanen, Ari, 20720 Turku, FI;
Määttä, Jorma, 21410 Vanhalinna, FI
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69737080
Vertragsstaaten DE, ES, FI, FR, GB, IT
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 09.07.1997
EP-Aktenzeichen 976600817
EP-Offenlegungsdatum 21.01.1998
EP date of grant 13.12.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 03.05.2007
IPC-Hauptklasse C07K 1/14(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C07K 14/47(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion des basischen Myelinproteins aus Myelin-enthaltendem Gewebe, wie z. B. Gewebe des zentralen Nervensystems, wobei das Verfahren hochgereinigtes basisches Myelinprotein in kurzer Zeit liefert. Das gewonnene Proteinprodukt umfasst zusätzlich zu den Hauptisoformen des basischen Myelinproteins auch mehrere Nebenisoformen, die durch andere Verfahren im Allgemeinen nicht erhalten werden (Mastronardi, F. G. et al., J. Neurochem. (1993) 60, 153–160).

Hintergrund der Erfindung

Myelin ist eine einzigartige multilamellare Membranstruktur, die Axonen umgibt und sie elektrisch isoliert, um die Leitung von Nervenimpulsen zu erleichtern. Diese komplizierte Struktur wird von Oligodendrozyten im zentralen Nervensystem (ZNS) und von Schwannschen Zellen im peripheren Nervensystem (PNS) synthetisiert und aufgebaut (de Ferra, F. et al., Cell 43, Teil 2, (1985) 721–727; Nakajima, K. et al., I Neurochemistry, 60 (1993) 1554–1563). Bei dem basischen Myelinprotein (MBP; engl.: myelin basic protein) handelt es sich um einen der Hauptbestandteile des Myelins des zentralen Nervensystems, da es etwa 30% von dessen Myelinproteinen darstellt.

Von Maus-MBP ist bekannt, dass es mindestens vier Isoformen als translatierte Proteine aufweist (Barbarese, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 0–3364). Das Molekulargewicht dieser Proteine beträgt 21,5, 18,5, 17 bzw. 14 kDa. Kürzlich wurden einzelne mRNA für 21,5, 20,2, 18,5, 17 (zwei Isoformen), eine Isoform zwischen 17 und 14 kDa und unter 14 kDa beschrieben (siehe 3 der Literaturstelle Nakajima, K. et al., ibid.).

Die experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE) ist ein weitverbreitet verwendetes Tiermodell für Multiple Sklerose (MS), bei dem MBP als ein mögliches Autoantigen angesehen wird. EAE kann in Nagetieren durch Immunisieren der Tiere mit MBP in starkem Adjuvans ausgelöst werden. Andererseits wurde gezeigt, dass orale Verabreichung von reinem MBP bei Tieren eine Toleranz gegen MBP bewirkt, wobei das Auslösen von EAE gehemmt wird (Miller, A. et al., FASEB, 5 (1991) 2569–2566; Miller, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992) 421–425). Gegenwärtig finden in den USA Versuche statt, bei denen Rinder-MBP an MS-Patienten oral verabreicht wird (Weiner und Hafler, unveröffentlicht). Ferner kann MBP mit der Pathogenese anderer neurologischer Störungen verbunden sein (Carnegie P. R. und Moore, Proteins of the Nervous System, Raven Press (1980) 2. Auflage, Seiten 119–143).

Es sind verschiedene Verfahren zur Reinigung von MBP entwickelt worden. Die meisten davon stehen auf der Grundlage der primären Extraktion von Lipiden aus dem Hirngewebe und nachfolgendem Abtrennen der Hauptisoform des basischen Myelinproteins oder von Isoformen anderer Komponenten, die in wässrigen Puffern löslich sind (Deibler G. E. et al., Prep. Biochem., 2 (1971) 139–165; Eylar E. H. et al., Methods Enzymol., 32 (1974) 323–341; Bellini, T. et al., J. Neurochemistry, 46 (1986) 1644–1646; Giegerich, G. et al., J. Chromatogr., 528 (1990) 79–90). Es wurde auch die Extraktion unter Verwendung von Detergenzien beschrieben (Riccio, P. et al., Mol. Chem. Neuropathol., 13 (1990) 185–194). Im Allgemeinen hemmen Detergenzien immunologische Tests. Allen Verfahren ist gemein, dass sie mehrfache Schritte der Extraktion von Lipiden umfassen, gefolgt von Abtrennen des verbleibenden Proteins unter Verwendung verschiedener chromatographischer Schritte. Diese sind jedoch zeitaufwändig und setzen daher das MBP einem proteolytischen Abbau aus, der bekanntlich auf Grund der hohen Aktivitäten von neutralen und sauren Proteasen in dem Gewebe des zentralen Nervensystems stattfindet.

Die Verfahren, die am weitesten verbreitet sind (Eylar, E. H. et al., ibid.; Deibler, G. E. et al., ibid.), beginnen mit der Extraktion von MBP-enthaltendem Gewebe mit einem Chloroform/Methanol-Gemisch, durch welches das MBP wasserlöslich gemacht wird. Das MBP liegt daher gemeinsam mit verschiedenen anderen Proteinen des ZNS vor, von denen es abgetrennt werden muss.

Bei einem bekannten Reinigungsverfahren wurde das MBP aus unlöslichem Material von Chloroform/Methanol- und Aceton-behandeltem ZNS-Gewebe oder aus durch einen Sucrosegradienten isoliertem Myelin aus dem Hirn oder dem Rückenmark von Ratten gereinigt. Der Reststoff von Lösungsmittelbehandlungen oder gereinigtes Myelin wurde mit Wasser mit einem pH-Wert von 3,0 gewaschen, anschließend wurde das MBP mit 0,1 M HCl aus der Ablagerung extrahiert (Martenson, R. E., J. Biol. Chem., 244 (16) (1969) 4268–4272). Diese Untersuchung bestätigte frühere Beobachtungen, dass Ratten-MBP aus mehreren elektrophoretischen Formen besteht.

Bei einem weiteren bekannten Reinigungsverfahren von MBP wurden Extrakte von Hunde- und Schweinehirn der Reihe nach mit Chloroform/Methanol (2:1 Vol./Vol.), Aceton und entionisiertem Wasser behandelt (Pitts, O. M. et al., Prep. Biochem. (USA), 06 (04) (1976) 239–164). Dies wurde von Präzipitieren des Extrakts bei einem pH-Wert von 9,0 und Gelfiltration des Überstands in verdünnter Salzsäure gefolgt.

Keines der vorstehend genannten Verfahren resultiert in einer gleichzeitigen Reinigung von verschiedenen Isoformen des MBP im Hirn, wie es das Verfahren der vorliegenden Erfindung erzielt. Einige dieser Isoformen werden als mögliche Autoantigene mit der Multiplen Sklerose in Verbindung gebracht (Voskuhl, R. R. et al., J. Neuroimmunology, 42 (1993) 187–192; Voskuhl, R. R. et al., J. Immunology, 153 (1994) 4834–4844).

Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ein einfaches Extraktionsverfahren entwickelt, das hochgereinigtes MBP in kurzer Zeit liefert. Das Proteinprodukt gemäß dem Verfahren umfasst zusätzlich zu den MBP-Hauptisoformen auch mehrere Nebenisoformen von basischen Myelinproteinen, die im Allgemeinen von den früheren Verfahren nicht erhalten werden. Darüber hinaus können Isoformen, die auf der Grundlage des Vorhandenseins von mRNA im Gewebe des zentralen Nervensystems nur vorausgesagt worden sind (Nakajima, K. et al., J. Neurochemistry, 60 (1993) 1554–1563), in dem gemäß unserer Erfindung hergestellten basischen Myelinprotein durch Analyse mit einem spezifischen Antiserum nachgewiesen werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Extraktion von basischem Myelinprotein aus Myelin-enthaltendem Gewebe, wie z. B. Gewebe des zentralen Nervensystems, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

  • – Extrahieren des basischen Myelinproteins aus dem Myelin-enthaltenden Gewebe mit einem organischen Lösungsmittel, ausgewählt aus Chloroform und Verbindungen mit einer Polarität, die der von Chloroform ähnlich ist;
  • – Inkubieren der organischen Phase in Gegenwart eines niederaliphatischen Alkohols oder von Propylenglykol;
  • – Überführen des basischen Myelinproteins von der organischen Phase in eine wässrige Phase mit der Hilfe von Wasserstoff-Ionen (Protonen); und
  • – Gewinnen der gereinigten basischen Myelinproteine.

Verweis auf die Abbildungen

Für die anhängenden Abbildungen wurden die Coomassie-Färbungen mit 0,75 mm dickem DSD-PAGE-Minigel durchgeführt, wobei 4 &mgr;g Protein gemäß der Bradford-Analyse als Probe verwendet wurde. Zur Immunoblot-Analyse wurden ähnliche Gele verwendet. Die Proteine wurden auf Nitrocellulose-Filter elektrotransferiert. Als primärer Antikörper wurde polyklonales anti-Meerschweinchen-MBP-Serum verwendet, das in Kaninchen durch Meerschweinchen-MBP, das durch das Verfahren von Eylar et al. (1971, ibid.) gereinigt worden war, erzeugt wurde. Als sekundärer Antikörper wurde das Konjugat von mit Meerrettich-Peroxidase konjugierter Ziegen-anti-Kaninchen-IgG verwendet. Die Immunoreaktionen wurden durch verstärkte Chemolumineszenz (Amersham) sichtbar gemacht.

1 zeigt A) eine Coomassie-Färbung des basischen Myelinprotein-Endprodukts von verschiedenen Spezies, und B) und C) Immunoblots von ähnlichen Gelen (15 Sekunden bzw. 40 Sekunden Exposition bei der verstärkten Chemolumineszenz). Bahn 1: Promega-Marker mit niedrigem Molekulargewicht; Bahn 2: Rinder-MBP; Bahn 3: menschliches MBP; Bahn 4: Schweine-MBP; Bahn 5: Kaninchen-MBP; Bahn 6: Hühner-MBP; Bahn 7: Meerschweinchen-MBP; Bahn 8: Ratten-MBP; Bahn 9: Mäuse-MBP; Bahn 10: Fisch (Lota lota)-MBP.

2: MBP-Isoformen, die durch Coomassie-Färbung sichtbar gemacht (A) oder durch Immunoblot mit verstärkter Chemolumineszenz nachgewiesen worden sind (B). Bahn st: Promega-Marker für den mittleren Molekulargewichtsbereich; Bahn 1: Homogenisat aus Mäusehirn (500 &mgr;g); Bahn 2: MBP aus Mäusehirn (8 &mgr;g); Bahn 3, Homogenisat aus Rückenmark (500 &mgr;g); Bahn 4: MBP aus Mäuse-Rückenmark (5 &mgr;g). Die exonischen mRNA-Elemente, die den einzelnen Isoformen entsprechen, sind gemäß Nakajima et al. (1993) dargestellt. Es ist zu beachten, dass die relative Beweglichkeit der MBP im Vergleich zu Standardproteinen ähnlicher Größe verringert ist.

In 3 werden Ergebnisse einer matrixunterstützten Laserdesorptions-Massenspektrometrie (LASERMAT) von A) Mäuse-MBP und B) menschlichem MBP dargestellt. Die Untersuchung wurde in einem Finnigan-MAT-Gerät unter Verwendung einer 100 pmol-Proteinprobe, die in Sinapinsäure gemischt war, durchgeführt. Bei dem menschlichen MBP ist auch der m + 2H+ – Peak (9,3 kDa) erkennbar.

4 zeigt eine Peptidgrad-SDS-PAGE-Analyse des Produkts. Die Analyse wurde mit menschlichem MBP und Mäuse-MBP mittels eines Pharmacia Phast System-Geräts durchgeführt. A: Coomassie-Färbung, B: Immunoblot-Analyse. Bahn 1: menschliches MBP; Bahn 2: Mäuse-MBP; Bahn 3: durch Thrombin teilweise verdautes Meerschweinchen-MBP. Die beiden Hauptbanden des Thrombin-Aufschlussprodukts weisen Molekulargewichte von 10,5 kDa und 8 kDa auf. Unter Verwendung einer Belichtung von 3 min bei dem Nachweis der Chemolumineszenzreaktion (Amersham) können keine anfärbbaren oder immunoreaktiven Abbauprodukte mit niedrigem Molekulargewicht beobachtet werden.

5. Ergebnis des Waschens der organischen Phase mit neutralem Wasser. A: Coomassie-Färbung; B: Immunoblot-Analyse. Bahn 1: Wasserphase zum Waschen; Bahn 2: Endprodukt nach dem Waschen der organischen Phase mit neutralem Wasser; Bahn 3: Endprodukt ohne Waschen. Die gewaschenen Proteine stellen etwa 2 bis 5% der Proteine in der organischen Phase dar.

6: Stabilität des Produkts. Bahn 1: gefrorenes gefriergetrocknetes Produkt; Bahn 2: Produkt, das eine Woche lang in einer Wasserlösung bei Raumtemperatur aufbewahrt worden ist; Bahn 3: Produkt, das eine Woche lang bei +4°C aufbewahrt worden ist. Alle MBP-Proben waren aus Schweinehirn hergestellt.

7. Aus Mäusehirn, das post mortem bei +4°C gehalten worden ist, hergestellte MBP-Produkte. Bahn 1: frisches Hirn; Bahn 2: 4 h Inkubation; Bahn 3: 1 Tag Inkubation; Bahn 4: 4 Tage Inkubation; Bahn 5: 8 Tage Inkubation.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Das Verfahren gemäß der Erfindung basiert auf der Extraktion von Myelin-enthaltendem Gewebe, wie z. B. Hirngewebe, mit einem Überschuss eines organischen Lösungsmittels. Dadurch werden die Isoformen des basischen Myelinproteins beinahe ausschließlich in das organische Lösungsmittel überführt.

Mit dem Begriff „Myelin-enthaltendes Gewebe" ist solches im zentralen Nervensystems und solches im peripheren Nervensystem gemeint. Das Gewebe kann frisch oder gefroren sein.

Der Begriff „organisches Lösungsmittel" bezeichnet in diesem Zusammenhang ein organisches Lösungsmittel mit einer Polarität, die der von Chloroform ähnlich ist (E2: Al2O3 = 0,38 – 0,42), wie z. B. Chloroform, Methylenchlorid und Diethylether.

Das Mengenverhältnis von organischem Lösungsmittel zu Gewebe ist nicht kritisch, ein bevorzugter Bereich beträgt jedoch 3 bis 8 ml organisches Lösungsmittel pro 1 g Myelinenthaltendes Gewebe. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird Chloroform in einem Verhältnis von insgesamt 7,5 ml Lösungsmittel – in Einzelmengen von 5 ml und 2,5 ml – pro 1 g Myelin-enthaltendes Gewebe verwendet. Das bedeutet, dass pro mg reinem basischen Myelinprotein etwa 1,5 ml (Rückenmark) bis 5 ml (gefrorenes Hirn) organisches Lösungsmittel verwendet wird. Eine vorläufige Untersuchung zeigt, dass das organische Lösungsmittel wieder verwendet werden kann, d. h. dass die organische Lösungmittelfraktion, die bereits zum Extrahieren von basischen Myelinproteinen verwendet worden ist, zum Extrahieren von weiteren davon aus einer weiteren Probe von Myelin-enthaltendem Gewebe verwendet werden kann. Nach der Extraktion wird die organische Phase vorzugsweise mit neutralem Wasser gewaschen, um die bei neutralem pH-Wert löslichen Proteine zu entfernen. Solche Proteine stellen im Allgemeinen etwa 2 bis 5% der in der organischen Phase enthaltenen Proteine dar.

Im nächsten Schritt des Verfahrens werden die in das organische Lösungsmittel extrahierten Isoformen des basischen Myelinproteins wasserlöslich gemacht. Dies wird unter Verwendung eines niederaliphatischen Alkohols oder von Pyopylenglycol und von Wasserstoff-Ionen durchgeführt. Die organische Phase wird in Gegenwart eines niederaliphatischen Alkohols oder von Propylenglycol bei Raumtemperatur inkubiert. Der bevorzugte Bereich des niederaliphatischen Alkohols oder von Propylenglycol beträgt 1 ml pro 2 ml des basisches Myelinprotein-enthaltenden organischen Lösungsmittels. Dieser Schritt ist notwendig, um das basische Myelinprotein in der organischen Phase in die wässrige Phase überführbar zu machen.

In diesem Zusammenhang sind mit dem Begriff „niederaliphatischer Alkohol" folgende Alkohole gemeint: Alkohol Ausbeute Methanol +++ Ethanol +++ Propanol +++ 2-Propanol +++ Butanol ++ 2-Butanol ++ iso-Amylalkohol + tert-Amylalkohol ++

Ferner ist die Ausbeute, die mit Propylenglycol erhalten wird, mit der Ausbeute vergleichbar, die mit Methanol erhalten wird.

Nach der Inkubation mit einem niederaliphatischen Alkohol/Propylenglycol werden die Isoformen des basischen Myelinproteins aus dem Gemisch aus dem organischen Lösungsmittel und dem niederaliphatischen Alkohol/Propylenglycol quantitativ in saures Wasser, das vorzugsweise in einem Verhältnis von 1 ml Wasser pro 6 ml des Gemischs aus organischem Lösungsmittel und niederaliphatischem Alkohol/Propylenglycol verwendet wird, überführt.

Wasserstoff-Ionen (Protonen) werden verwendet, um durch Ansäuern der wässrigen Phase mit beispielsweise Salzsäure die basischen Myelinproteine in die wässrige Phase zu überführen.

Solange das Lösungsmittel, das basisches Myelinprotein enthält, ein Puffervermögen aufweist, so dass der pH-Wert der angesäuerten wässrigen Phase ansteigt, wenn sie mit dem Gemisch aus organischem Lösungsmittel und niederaliphatischem Alkohol/Propylenglycol gemischt wird, kann mehr basisches Myelinprotein aus dem Gemisch aus organischem Lösungsmittel und niederaliphatischem Alkohol/Propylenglycol in die wässrige Phase überführt werden. Der pH-Wert wird vorzugsweise bei einem Wert von etwa 2 gehalten. Die basischen Myelinproteine werden aus der so erhaltenen wässrigen Phase gewonnen. Dies kann beispielsweise durch zweifach durchgeführtes Gefriertrocknen des Produkts oder durch Gelfiltration und Gefriertrocknen durchgeführt werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Produkt gelfiltriert und gefriergetrocknet.

Bei dem Reinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung geht das basische Myelinprotein sehr wahrscheinlich umgehend in die organische Phase über. Dies führt dazu, dass das Ausmaß einer möglichen Proteolyse des basischen Myelinproteins minimiert wird.

Obwohl noch nicht bekannt ist, ob das basische Myelinprotein in dem organischen Lösungsmittel in löslicher Form oder in der Form von Lipid-assoziierten Micellen vorliegt, haben wir durch Dünnschicht-Chromatographie gezeigt, dass das basische Myelinprotein in dem gefriergetrockneten Präparat Lipid-gebunden vorliegt. Die Beschaffenheit dieses Lipids bzw. dieser Lipide ist nicht bekannt.

Die Erfindung wird nachstehend anhand eines Beispiels ausführlicher beschrieben.

Beispiel Präparation des basischen Myelinprotein-Produkts

3,08 g gefrorenes Mäusehirn wurden bei Raumtemperatur (RT) in 15 ml Chloroform mittels eines Sorvall Omni-Mixer 17220-Homogenisators homogenisiert, wobei vier 30 Sekunden-Stöße mit voller Geschwindigkeit verwendet wurden, die von 30 Sekunden-Pausen unterbrochen waren, um eine Überhitzung zu vermeiden. Die organische Phase wurde durch 5 min Zentrifugieren bei RT mit 4500 Rcf unter Verwendung eines Sorvall SA 600-Rotors von den Gewebetrümmern und der intrazellulären/zytosolischen Flüssigkeit getrennt. Die intrazelluläre/zytosolische Flüssigkeit wurde verworfen und die Trümmer mit 7,5 ml Chloroform erneut extrahiert, wobei zwei Stöße in dem Homogenisator verwendet wurden und die organische Phase wie vorstehend beschrieben abgetrennt wurde. Die Chloroformfraktionen wurden vereinigt und das Volumen zu 18,2 ml gemessen.

Die organische Phase wurde durch Zusetzen von 4,5 ml neutralem Wasser und 15 Sekunden behutsames Verwirbeln in einem konischen 50 ml-Röhrchen gewaschen. Die Wasserphase wurde durch 5 Minuten Zentrifugieren mit 2000 Upm bei RT unter Verwendung eines Sorvall H5094-Rotors abgetrennt. Die Wasserphase wurde sorgfältig vom oberen Ende der organischen Phase abgetrennt.

Der Chloroformphase wurden 9 ml Methanol zugesetzt und das Gemisch 30 Sekunden verwirbelt. Anschließend wurden 4,5 ml Wasser und 120 &mgr;l 1 M HCl zugesetzt. Das Gemisch wurde verwirbelt, wobei der pH-Wert der abgetrennten wässrigen Phase regelmäßig durch Acilit (Merck) pH-Wert-Papier überprüft wurde. So lange der pH-Wert während des Verwirbelns zunahm, wurde weitere 1 M HCl zugesetzt. Nach dem Zusetzen von 140 &mgr;l 1 M HCl blieb der pH-Wert der wässrigen Phase bei einem Wert von 1,5–2,0.

Die saure wässrige Phase wurde durch 10 min Zentrifugieren mit 2000 Upm bei RT unter Verwendung eines Sorvall H5094-Rotors von der organischen Phase abgetrennt. Es wurden insgesamt 9 ml saure wässrige Phase gewonnen, in einem Büchi Rotavapor-Vakuumkonzentrator auf 3 ml konzentriert, in einer Pharmacia PD 10-Säule gelfiltriert und anschließend gefriergetrocknet. Das Endprodukt erschien als ein weißes Pulver, wobei die Gesamtausbeute an Protein gemäß einer Bradford-Analyse 4,3 mg betrug.

Analyse der durch das Verfahren erhaltenen basischen Myelinproteine

Bei Verwendung von 4 &mgr;g-Proteinproben aus verschiedenen Spezies setzen sich alle Proteine, die in dem 0,75 mm dicken, Coomassie-gefärbten SDS-PAGE sichtbar sind, mit dem polyklonalen für basisches Myelinprotein spezifischen Antiserum um. Das Serum wurde in Kaninchen durch Immunisieren mit basischem Myelinprotein aus Meerschweinchen, das durch das Verfahren von Eylar et al. (1974) gereinigt worden war, erzeugt.

In allen untersuchten Proben des basischen Myelinproteins aus Säugern konnten immunoreaktive Banden nachgewiesen werden, die beinahe allen Isoformen entsprachen, die durch mRNA-Analyse für Mäuse vorhergesagt aber für andere Spezies nicht untersucht worden waren (siehe 1A, B und C, sowie Tabelle 1). Darüber hinaus wurden auch immunoreaktive Banden nachgewiesen, die bei der Coomassie-Färbung nicht sichtbar sind, deren Größe jedoch mit der Größe der durch mRNA-Analyse vorhergesagten Isoformen des basischen Myelinproteins übereinstimmt (siehe 1 und Tabelle 1).

Alle MBP-Isoformen, die in Hirn- und Rückenmarkshomogenisaten nachgewiesen wurden, waren auch in dem Endprodukt vorhanden (2).

Reinheit und Löslichkeit des Produkts

Das fertige Präparat des basischen Myelinproteins ist in wässrigen Lösungsmitteln, wie z. B. destilliertem Wasser und Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung(PBS) leicht löslich. Nach zwei Schritten der Gefriertrocknung oder nach Gelfiltration und Gefriertrocknung erscheint das Protein als ein weißes Pulver. Durch Coomassie-Färbung, Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie(RP-HPLC) oder Immunoblot-Analyse wurden keine verunreinigenden Proteine nachgewiesen. Die Molekulargewichtsanalyse durch matrixunterstützte Laserdesorptions-Massenspektrometrie(LASERMAT) der Präparate des basischen Myelinproteins des Menschen und der Maus zeigten, dass wenigstens die Molekulargewichte der Hauptisoformen (nur die Gewichte der Hauptisoformen waren durch LASERMAT messbar) den aus den mRNA vorhergesagten Molekulargewichten entsprachen, wodurch bestätigt wurde, dass wenigstens diese Isoformen nicht abgebaut waren (siehe 3). Eine Peptidgrad-SDS-PAGE-Analyse durch ein Pharmacia Phast-System zeigte keine Banden unterhalb von etwa 10 kDa, wodurch weiter erhärtet wurde, dass die Proteinprodukte intakt sind (siehe 4). Ferner ergab ein teilweiser Verdau des basisches Myelinprotein-Präparats durch Thrombin (Law, M. J., et al., J. Neurochem., 42 (1984) 559–568) das typische Peptidmuster.

Die Bedeutung des Waschens der organischen Phase mit neutralem Wasser ist unklar, da bei gewaschener und nicht gewaschener organischer Phase kein Unterschied des Proteingehalts des Endprodukts gezeigt werden konnte. In der Wasserphase, die zum Waschen der organischen Phase verwendet worden war, konnten jedoch geringe Mengen an Proteinen, die mit den basischen Myelinproteinen nicht verwandt sind, beobachtet werden (siehe 5).

Ausbeute

Ein Gramm frisches Hirn ergibt etwa 1,5 (gefrorenes Hirn) bis 5 Milligramm (Rückenmark) eines hochgereinigten Gemischs von Isoformen des basischen Myelinproteins. Diese Ausbeute liegt im gleichen Bereich wie er bei anderen veröffentlichten Verfahren erhalten wird (siehe Tabelle 2).

Die Extraktion des basischen Myelinproteins scheint bei allen untersuchten Spezies gleich gut zu funktionieren (siehe 1 und Tabelle 1), und sowohl Hirn- als auch Rückenmarksgewebe (2) stellen geeignete Ausgangsmaterialien zur Reinigung von basischem Myelinprotein aus dem zentralen Nervensystem dar. Das Verfahren ist auch zum Reinigen von basischem Myelinprotein aus dem peripheren Nervensystem geeignet.

Isoformen

Die bezüglich der mRNA-Expression für das basische Myelinprotein am besten charakterisierte Spezies ist die Maus. Nachgewiesene Messenger-RNA von basischem Myelinprotein der Maus codieren Polypeptide mit 13,0, 14,2, 16,0, 17 (zwei Isoformen), 18,5, 20,2 und 21,5 kDa (deFerra, F. et al., 1985, ibid.; Nakajima, K. et al., 1993, ibid.). Ein Protein, das den 21,5 kDAund 16 kDa-Isoformen des basischen Myelinproteins entspricht, ist in den Präparaten aus allen Spezies mit der Ausnahme von Fisch enthalten. Beim Menschen ist die 21,5 kDa-Isoform, die nun durch Immunoreaktion in dem gereinigten Präparat nachgewiesen wurde (1C, Bahn 3), zuvor durch mRNA-Analyse von myelinisiertem und remyelinisiertem Hirngewebe lediglich vorhergesagt worden (Kamholz, J. et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4962–4966). Die in dem Präparat von menschlichem basischen Myelinprotein ebenfalls vorhandene 16 kDa-Isoform ist – gemäß der Literatur – für den Menschen durch mRNA-Analyse nicht vorhergesagt worden. Diese Isoformen umfassen eine Aminosäure-Sequenz, die von dem Exon-2 des Gens des basischen Myelinproteins codiert wird. Von diesem Bereich des MBP ist gezeigt worden, dass er von basisches Myelinprotein-spezifischen T-Zell-Linien von MS-Patienten erkannt wird (Voskuhl, R. R. et al., (1993), ibid.), weshalb ihm möglicherweise eine Schlüsselbedeutung bei der Planung der Behandlung von MS-Patienten hinsichtlich einer Toleranzbildung gegen basisches Myelinprotein zufällt. Diese Exon-2-enthaltenden Isoformen waren in Präparaten des basischen Myelinproteins aus Rind und Schwein in wesentlichen Mengen vorhanden – in Spezies, die als Quellen zur Proteinreinigung von basischem Myelinprotein in großem Maßstab geeignet sind.

Die 14,2-kDa-Bande, die das Haupt-Polypeptid des Mäuse-MBP und des Ratten-MBP darstellt, war auch bei allen anderen Spezies vorhanden. Kürzlich wurde Messenger-RNA, die eine Isoform mit etwa 13 kDa codiert, für mMBP gefunden (Mathisen, P. M., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10125–10129). Ein Protein mit einer entsprechenden Größe wurde durch das MBP-spezifische Antiserum in extrahierten Mäuse- und Rattenproben gefunden, und nach verlängerter Exposition geringfügig auch für andere Säuger-Spezies (1C).

Außerdem wurde bei rMBP und mMBP bei der Immunoreaktion ein Polypeptid mit etwa 10 kDa sichtbar (1C, Bahnen 8 und 9).

Stabilität

Das Präparat des basischen Myelinproteins ist als Pulver bei –20°C mindestens zwei Jahre lang stabil. In wässriger Lösung wurde nach einer Woche Lagerung bei Raumtemperatur oder bei +4°C durch Coomassie-Färbung oder Immunoreaktion kein Abbau beobachtet (6). Die Stabilität kann aus der hohen Selektivität der Überführung der basischen Myelinproteine in die organische Phase und weiter in die wässrige Phase, sowie aus der denaturierenden Wirkung von Chloroform und einem sauren pH-Wert für Proteasen folgen.

Wir haben gefunden, dass basische Myelinproteine aus Hirn, das eine Woche bei +4°C gelagert worden ist, noch in wesentlichen Mengen extrahiert werden können (siehe 7). Daher ist keine kostspielige Tiefkühlkette für die Handhabung und den Transport des Ausgangsmaterials notwendig. Wenn das Gewebe gefroren und wieder aufgetaut wird, sind die Myelinprotein-Ausbeuten wesentlich erniedrigt.

Zeitbetrachtungen und Übertragbarkeit

Im Labormaßstab, was in diesem Zusammenhang die Reinigung von basischem Myelinprotein aus 100 mg bis 100 g ZNS-Gewebe bedeutet, beträgt die benötigte Zeit vom Beginn der Reinigung aus Gewebe bis zu einem zum Gefriertrocknen bereiten Präparat etwa drei Stunden. Dies ist bedeutend schneller als der ganze Tag, der bei Verwendung des kürzesten publizierten Verfahrens nötig ist (Bellini et al., ibid.) und die 5 Tage, die bei den üblicherweise verwendeten Verfahren von Deibler G. E. et al., (1971) und Eylar E. H. et al., (1974) verwendet werden.

Bisher wurde gezeigt, dass das Verfahren für kleine Gewebeproben von 100 mg bis zum präparativen Labormaßstab unter Verwendung von 100 g Gewebe als Ausgangsmaterial funktioniert. Es ist keine Ursache aufgetreten, die das Übertragen des Verfahrens auf einen großen industriellen Maßstab behindern würde.

Verwendungen

Es ist gezeigt worden, dass das Myelinprotein-Produkt als Substrat für Proteinkinasen wirkt, wobei es sich um eine der möglichen Anwendungen von basischen Myelinproteinen handelt (Yang, S. D. et al., J. Biol. Chem., 269 (1994) 29855–29859; Moriyama, T., et al., FEBS Lett., 353 (1994) 305–308). Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass dieses basische Myelinprotein-Produkt in Immunospot-Tests und T-Zell-Proliferationstests zum Nachweisen des Vorhandenseins von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten verwendet werden kann. Ferner wurde gezeigt, dass das basische Myelinprotein-Produkt auch beim Auslösen von EAE in SJL-Mäusen wirksam ist.

Gemäß dem vorstehend Dargelegten kann das basische Myelinprotein-Produkt der vorliegenden Erfindung für immunologische Untersuchungen mit dem Ziel des Verständnisses der Pathogenese von entzündlichen entmyelinisierenden Erkrankungen, wie z. B. Multiple Sklerose, bei Menschen verwendet werden, und vermutlich auch bei der Entwicklung von Behandlungsverfahren dieser Erkrankungen durch orale Toleranzbildung.

Tabelle 1. Expression von MBP-Isoformen im ZNS verschiedener Spezies Molekulargewicht, kDa

  • * Die 17,2-kDa-Form besteht aus zwei eng benachbart wandernden Formen.
  • # Die 14,0 kDa-Form erschien als Dublette, und eine Bande bei etwa 10 kDa war in der Coomassie-Färbung sichtbar, nicht jedoch in dem Immunoblot (siehe 1).
  • ° Die Bande war in der Coomassie-Färbung sichtbar, wurde jedoch von dem polyklonalen anti-Meerschweinchen-MBP-Serum nicht erkannt.
  • (–) Nicht nachgewiesen; (+) im Immunoblot nach verlängerter Exposition sichtbar; (++) im Immunoblot sichtbar, jedoch nicht in der Coomassie-Färbung; (+++) sowohl in der Coomassie-Färbung als auch in der Immunofärbung sichtbar; (++++) starke Coomassie- und Immunofärbung.

Tabelle 2. MBP-Ausbeute und Zeit zum Isolieren im Labormaßstab vor der Gefriertrocknung bei Verwendung verschiedenenr Verfahren


Anspruch[de]
Verfahren zur gleichzeitigen Reinigung aller Isoformen des basischen Myelinproteins aus Myelin enthaltendem Gewebe, gekennzeichnet durch die Schritte

– Extrahieren des basischen Myelinproteins aus dem Myelin enthaltenden Gewebe mit Überschuss an einem organischen Lösungsmittel, ausgewählt aus Chloroform und organischen Lösungsmitteln mit einer Polarität ähnlich der von Chloroform in dem Polaritätsbereich von E2: Al2O3 = 0,38 – 0,42;

– Waschen der organischen Phase mit neutralem Wasser;

– Inkubieren der organischen Phase in der Gegenwart eines niederaliphatischen Alkohols oder Propylenglykols;

– Zugeben von saurem Wasser, um das basische Myelinprotein quantitativ von dem Gemisch aus dem niederaliphatischen Alkohol oder Propylenglykol und organischem Lösungsmittel in eine wässrige Phase zu überführen; und

– Gewinnen des gereinigten basischen Myelinproteins.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Myelin enthaltende Gewebe Gewebe vom zentralen Nervensystem ist. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Myelin enthaltende Gewebe frisch oder gefroren ist. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Extraktion aus dem Myelin enthaltenden Gewebe mit Diethylether oder einem chlorierten Niederalkan, vorzugsweise mit Chloroform oder Methylenchlorid, durchgeführt wird. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der niederaliphatische Alkohol Methanol oder 2-Propanol ist. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Extraktion, Inkubation und Phasentransfer bei Raumtemperatur stattfindet. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gewinnen des gereinigten basischen Myelinproteins durch Gefriertrocknen, vorzugsweise zweimal, oder durch Gelfiltration durchgeführt wird.






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