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Dokumentenidentifikation DE102005048922A1 31.05.2007
Titel Verfahren und Anordnung zur Positionierung einer abzubildenden Struktur
Anmelder Carl Zeiss Jena GmbH, 07745 Jena, DE
Erfinder Schaffer, Jörg, Dr., 37085 Göttingen, DE
DE-Anmeldedatum 11.10.2005
DE-Aktenzeichen 102005048922
Offenlegungstag 31.05.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 31.05.2007
IPC-Hauptklasse G02B 21/00(2006.01)A, F, I, 20051011, B, H, DE
Zusammenfassung Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung, um Strukturen entweder in die Fokusebene des Objektivs eines Mikroskops abzubilden oder aber in die Pupille des Objektivs bzw. in die jeweils konjugierten Ebenen.
Dazu werden die optischen Daten der Abbildungssysteme und die Beleuchtungs- bzw. Fluoreszenzwellenlängen bei der Bestimmung der optimalen Position der Strukturen berücksichtigt.

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung, um Strukturen entweder in die Fokusebene des Objektivs eines Mikroskops abzubilden, oder aber in die Pupille des Objektivs bzw. in die jeweils konjugierten Ebenen.

Die zu projizierende Struktur wird im allgemeinen in der Leuchtfeldblenden- oder der Aperturblenden-Ebene als konjugierte Objekt- oder Pupillenebene positioniert. Ein Beispiel für die Abbildung einer Struktur in die Objektebene ist die „strukturierte Beleuchtung", wie sie in der EP 842 497 beschrieben ist.

Abhängig von den Korrektureigenschaften der zur Abbildung benutzten Optik insbesondere des Objektivs und seine chromatische Längsaberration ist es notwendig die abzubildende Struktur längs der optischen Achse zu verschieben, um eine scharfe Abbildung in die Fokus- oder Pupillenebene des Mikroskop in Abhängigkeit des Beleuchtungsspektrums zu gewährleisten. Eine entsprechende Lösung ist in der DE 100 38 527 A1 der Anmelderin beschrieben, auf deren gesamten Inhalt hiermit Bezug genommen wird. Bei dieser Lösung wird in Form einer Kalibrierung empirisch der Ort der besten Abbildung der Struktur auf das Objekt bestimmt und manuell oder motorisch eingestellt.

Ein besonders komplizierter Fall liegt bei fluoreszierenden Objekten vor, da bei diesen die Anregungswellenlänge (oder der Anregungswellenlängenbereich), der gleichzeitig auch Abbildungswellenlänge der Struktur ist, abweicht von der Emissionswellenlänge (oder dem Emissionswellenlängenbereich) der zu beobachtenden Probe, da die Abbildung und damit Fokussierung des Observationsstrahlengangs auf die Probe bei der Emissionswellenlänge erfolgt, die Projektion der Struktur aber bei der Anregungswellenlänge. Die Soll-Position der Struktur hängt in diesem Fall sowohl von der Anregungs- als auch von der Emissionswellenlänge der Fluoreszenz ab und muss mit dem jeweiligen fluoreszierenden Objekt oder einer angemessenen Referenzprobe kalibriert werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden und insbesondere für fluoreszierende Proben automatisch die optimale Position einer auf die Probe abzubildenden Struktur zu ermitteln und einzustellen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Verfahren nach Anspruch 1 und die Anordnung nach Anspruch 4 gelöst, vorteilhafte Weiterentwicklungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.

Dabei ist es besonders vorteilhaft, die optischen Daten der zur Abbildung der Struktur dienenden optischen Systeme bei der Bestimmung der optimalen Position der Struktur einzurechnen. Damit ist erstmalig eine automatische optimale Positionierung der Struktur im Beleuchtungsstrahlengang unter Berücksichtigung der die Abbildung wesentlich beeinflussenden Parameter möglich.

Von besonderem Vorteil ist die Berücksichtigung der Differenz zwischen der Anregungs- und der Emissionswellenlänge (sogenannte Stokes-Shift) bei der Abbildung der Struktur auf eine fluoreszierende Probe.

Die Erfindung wird im folgenden an Hand der 1 näher erläutert.

1 stellt schematisch den Strahlengang eines Fluoreszenz-Mikroskops dar. Mittels einer Lichtquelle 1 wird über eine Linse oder ein Linsensystem 2 die in der Leuchtfeldblendenebene 3 befindliche Struktur 4 beleuchtet und über die Beleuchtungsoptik 5, 6 (diese kann auch ein Objektiv enthalten, z.B. bei Auflichtbeleuchtung) auf die Präparatebene 7 abgebildet. Ein Anregungsfilter 8 lässt nur die gewünschte Wellenlänge bzw. den gewünschten Wellenlängenbereich des Beleuchtungslichtes auf das Präparat fallen. Das von dem Präparat 7 ausgehende Licht wird über das Objektiv 9 und die Tubuslinse 10 auf die Zwischenbildebene 11 abgebildet. Dieses Zwischenbild wird dann mit hier nicht dargestellten Mitteln beobachtet oder elektronisch detektiert.

Die chromatische Längsaberration der an der Abbildung beteiligten optischen Elemente führt nun dazu, dass für unterschiedliche Beleuchtungs- und/oder Emissionswellenlängen die optimale Position der abzubildenden Struktur 4 verschieden ist und diese Unterschiede durch Verschiebung der Struktur 4 entlang der optischen Achse 12 ausgeglichen werden müssen, wie dieses durch die Pfeile 13 angedeutet ist. Dabei wird die Verschiebung im Allgemeinen mit hier nicht näher dargestellten motorischen Mitteln erfolgen, welche von einem die notwendigen Berechnungen realisierenden Rechner 13 angesteuert werden.

Der Korrekturzustand und damit die chromatische Längsaberration von Objektiven und anderen optischen Systemen kann durch Kenntnis des optischen Designs parametrisiert werden. Auf diese Weise kann aus einem Parametersatz, der den Korrekturzustand beschreibt, jede Kombination aus Objektiv, Anregungswellenlänge, Emissionswellenlänge (bzw. entsprechende Spektralbereiche) Sollpositionen für eine zu projizierende Struktur bestimmt werden, damit entfällt die Notwendigkeit der Kalibration jeder dieser Kombinationen.

Am Beispiel der chromatischen Längsaberration CHL und der Abbildung einer Struktur (zum Beispiel ein Transmissionsgitter) in die Objektebene wird das erfindungsgemäße Verfahren im folgenden verdeutlicht.

Um den erwähnten Parametersatz zu bestimmen, wird über das bekannte optische Design des betrachteten optischen Systems aus Objektiv und Auflichtbeleuchtungsoptik sowie Tubuslinse die CHL für einen Satz von Wellenlängen rechnerisch bestimmt, und zwar an zwei Orten:

  • 1) Zwischenbildebene ZB und
  • 2) Leuchtfeldblendenebene LFB..

Bei Fokussierung des Objekts (Reflexion oder Fluoreszenz) bei der Emissionswellenlänge wird die CHL am ZB durch den Fokussiervorgang ausgeglichen. Der Netto-Verstellweg &Dgr; der zu positionierenden Struktur am Ort der Struktur (bzgl. der LFB-Ebene) ergibt sich dann aus:

Hierbei ist &bgr;(Beleuchtung)/&bgr;(Detektion) der Quotient aus den Abbildungsmaßstäben der jeweiligen Teiloptik.

Die folgende Tabelle stellt entsprechende Daten für ein optisches System dar

Für den Fall der Reflexion ist &lgr;Anregung gleich &lgr;Emission einzusetzen, da das von der Probe kommende Licht die gleiche Wellenlänge wie das Beleuchtungslicht hat, die Werte werden also der gleichen Zeile der Tabelle entnommen.

Für den Fall der Fluoreszenz sind entsprechend die Werte für Beleuchtung und Detektion aus unterschiedlichen Zeilen (entsprechend der jeweiligen Wellenlänge) zu entnehmen oder durch Interpolation zu ermitteln.

Um die Berechnung zu vereinfachen werden aus diesen Tabellen Kurven extrahiert, die angeben, wie die Abhängigkeit der Sollposition der Struktur von dem Unterschied zwischen Anregungswellenlänge und Emissionswellenlänge ist (Stokes-shift).

Eine solche Kurvenschar ist in 2 abgebildet..

Sie zeigt die Sollpositionen der zu projizierenden Struktur in mm in Abhängigkeit vom Stokes-shift. Die verschiedenen Kurven stellen unterschiedliche Emissionswellenlängen dar (705 nm, 644 nm und 546 nm).

Diese Kurven werden nach bekannten Verfahren auf Polynomgleichungen angepasst, um auch für Zwischenwerte der Stokes-Shift verlässliche Größen zu gewinnen.

Mit Hilfe dieser Polynomgleichungen für die jeweiligen Kurven werden für die jeweiligen der Einstellung des Mikroskops entsprechenden Kombinationen aus Wellenlängen und bekannten Objektiv-CHL die Sollpositionen der zu projizierenden Struktur bestimmt und vorzugsweise motorisch eingestellt. Damit lassen sich automatisierte Abläufe sehr einfach realisieren ohne dass aufwendige Kalibrationen notwendig sind.

Die entsprechenden Werte und Berechnungsalgorithmen sind dabei im Rechner 13 abgespeichert bzw. werden von diesem realisiert.

Ein weiteres Anwendungsbeispiel für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Positionierung von Strukturen in einer konjugierten Pupillenebene zur Beeinflussung der Beleuchtung. Hier ist es sinnvoll, die eingebrachte Optik entsprechend der auftretenden Aberrationen im Beleuchtungsstrahlengang positionieren zu können, um möglichst fehlerfreie Resultate zu gewinnen (Blenden, Ringbeleuchtung, allgemein in diesem Sinne strukturierte Beleuchtung).


Anspruch[de]
Verfahren zur Positionierung einer auf ein Objekt abzubildenden Struktur im Beleuchtungsstrahlengang eines Mikroskops, weiches die folgenden Schritte aufweist:

a) Eingabe bzw. Ermittlung optischer Daten eines zur Beobachtung verwendeten Objektivs und des zur Beleuchtung vorgesehenen optischen Systems, insbesondere der chromatischen Längsaberration CHL,

b) Eingabe bzw. Ermittlung der für die das Beleuchtungslicht vorgesehenen Wellenlänge bzw. Wellenlängenbereichs

c) Bestimmung der optimalen Position der abzubildenden Struktur aus den optischen Daten des Objektivs und des zur Beleuchtung vorgesehenen optischen Systems sowie der Wellenlänge bzw. des Wellenlängenbereichs

d) Positionierung der Struktur auf diese optimale Position
Verfahren zur Positionierung nach Anspruch 1, wobei für fluoreszierende Objekte zusätzlich die Eingabe bzw. Ermittlung der jeweiligen der Beleuchtungswellenlänge zugeordneten Emissionswellenlänge erfolgt und diese Emissionswellenlängen bei der Bestimmung der optimalen Position berücksichtigt wird. Verfahren zur Positionierung nach Anspruch 1, wobei die Berücksichtigung der Emissionswellenlängen nach der Formel Ermittelt wird, wobei &Dgr; der zusätzliche Verstellweg für die Struktur,

CHL(LFB, &lgr;Anregung) die chromatische Längsaberration für die Anregungswellenlänge &lgr;Anregung am Ort der Leuchtfeldblende

CHL(ZB, &lgr;Emission) die chromatische Längsaberration für die Emissionswellenlänge &lgr;Emission am Ort der Zwischenbildebene,

&bgr;(Beleuchtung) der Abbildungsmaßstab des zur Beleuchtung vorgesehenen optischen Systems und

&bgr;(Detektion) der Abbildungsmaßstab des zur Detektion vorgesehenen optischen Systems.
Vorrichtung zur Positionierung einer auf ein Objekt abzubildenden Struktur im Beleuchtungsstrahlengang eines Mikroskops, bei der

– Mittel zur Eingabe und/oder Ermittlung optischer Daten eines zur Abbildung verwendeten Objektivs,

– Mittel zur Eingabe und/oder Ermittlung optischer Daten eines zur Beleuchtung vorgesehenen Wellenlänge bzw. Wellenlängenbereichs,

– Mittel zur Bestimmung der optimalen Position der abzubildenden Struktur unter Berücksichtigung der optischen Daten und der zur Beleuchtung vorgesehenen Wellenlänge

– Mittel zur Positionierung der Struktur auf die optimale Position vorgesehen sind.
Vorrichtung zur Positionierung nach Anspruch 4, wobei zusätzlich Mittel zur Eingabe bzw. Ermittlung der der Beleuchtungswellenlänge zugeordneten Emissionswellenlänge vorgesehen sind, und die Mittel zur Bestimmung der optimalen Position diese Emissionswellenlänge berücksichtigen. Vorrichtung zur Positionierung nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Mittel zur Bestimmung der optimalen Position einen Rechner enthalten, welcher mit den Eingabemitteln und den Positioniermitteln verbunden ist. Mikroskop mit einer Vorrichtung zur Positionierung nach einem der Ansprüche 4 bis 6.






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