PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69534958T2 31.05.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0000698666
Titel Modifiziertes Epimorphin
Anmelder Sumitomo Electric Industries, Ltd., Osaka, JP
Erfinder Hirai, c/o Yokohama Works of Sumitomo, Yohei, Yokohama-shi, Kamagawa, JP;
Koshida, c/o Yokohama Works of Sumitomo, Shogo, Yokohama-shi, Kamagawa, JP;
Oka, c/o Yokohama Works of Sumitomo, Yumiko, Yokohama-shi, Kamagawa, JP
Vertreter Habermann, Hruschka & Schnabel, 81679 München
DE-Aktenzeichen 69534958
Vertragsstaaten CH, DE, DK, FR, GB, LI, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 20.06.1995
EP-Aktenzeichen 953042702
EP-Offenlegungsdatum 28.02.1996
EP date of grant 26.04.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 31.05.2007
IPC-Hauptklasse C12N 15/18(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C07K 14/475(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 1/20(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   
IPC additional class C12R 1/19  (2006.01)  A,  L,  N,  20051017,  B,  H,  EP

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft ein modifiziertes Epimorphin, das durch Modifizieren von Epimorphin erhalten wird, das ein Polypeptid ist, das in mesenchymalen Zellen vorkommt und die Morphogenese von Epithelgewebe kontrolliert, oder ein Fragment davon und insbesondere ein modifiziertes Epimorphin, das durch Modifizieren von Epimorphin erhalten wird, das bei der Aufklärung des Angriffsmechanismus von Krankheiten, die durch die morphogenetische Anormalität von Epithelgewebe verursacht werden, und bei der Entwicklung einer Diagnose und medizinischen Behandlung für diese Krankheiten und als Heilmittel für Wunden geeignet ist, oder ein Fragment davon, während seine Aktivität beibehalten wird, und Varianten (variante modifizierte Epimorphinpolypeptide), die durch Durchführen einer partiellen Substitution, Deletion und/oder Insertion von Aminosäuren in der Aminosäuresequenz des modifizierten Epimorphins erhalten werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch DNAs, die ein solches modifiziertes Epimorphin und Varianten davon codieren, rekombinante Vektoren, die die DNAs enthalten, Transformanten, die durch Einbringen der rekombinanten Vektoren erhalten werden, und ein Herstellungsverfahren des modifizierten Epimorphins und der Varianten davon unter Verwendung der Transformanten.

In der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "modifiziertes Epimorphin" ein Fragment oder Polypeptid von Epimorphin, das durch Modifizieren des Epimorphins oder eines Fragments davon erhalten wird.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Da die normale Organisation und Morphogenese des Epithelgewebes unter einer Kontrolle eines Faktors steht, der den Mesenchymzellen entstammt, und Krankheiten, die den morphogenetischen Anormalitäten des Epithelgewebes zuschreibbar sind, oft von den um das Gewebe vorhandene mesenchymalen Zellen verursacht werden können, werden schon lange Untersuchungen über den Mechanismus der mesenchymalen Zellen, welcher die Morphogenese des Epithelgewebes unterstützt, durchgeführt. Obwohl Studien über die Isolierung, Reinigung und Strukturanalyse eines Moleküls, das die Morphogenese des Epithelgewebes kontrolliert, ausgiebig in der ganzen Welt durchgeführt wurden, ist seine Substanz unter den bisherigen Umständen kaum bekannt, da der Untersuchungsgegenstand eine Substanz ist, die unter zeitlicher und räumlicher Restriktion in einem komplizierten System exprimiert wird, und es daher schwierig ist, ein einfaches experimentelles System herzustellen.

Um die Aufklärung von Krankheiten, die durch die morphogenetische Anormalität des Epithelgewebes und dessen Angriffsmechanismus verursacht werden, durchzuführen, war die Entwicklung von medizinischen Behandlungen für diese Krankheiten eine unerlässliche Vorbedingung zur Isolierung und Reinigung eines solchen Moleküls, das die Morphogenese des Epithelgewebes kontrolliert, und zur Aufklärung von dessen Struktur. Darum bestand ein bedeutendes Problem im Fachgebiet darin, die Aufklärung der Struktur eines solchen Moleküls frühzeitig zu erreichen und dergleichen.

Unter solchen Umständen gelang es den vorliegenden Erfindern unlängst, ein Molekül (die vorliegenden Erfinder bezeichneten es als "Epimorphin") zu isolieren und zu reinigen, das die Morphogenese des Epithelgewebes kontrolliert (Offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 25295/1994). Epimorphin ist eine physiologisch aktive Substanz, die als Kernprotein ein aus 277 bis 289 Aminosäuren bestehendes Protein umfasst und hauptsächlich biosynthetisch durch Mesenchymzellen produziert wird.

Den vorliegenden Erfindern gelang die Bestimmung der Aminosäuresequenzen humaner Epimorphinmoleküle und Maus-Epimorphinmoleküle. Das Splicing ihrer Gene hat ergeben, dass mindestens drei Typen von jeweiligen Epimorphinmolekülen existieren. Die humanen Epimorphinmoleküle umfassen drei Typen, humanes Epimorphin, das durch die Sequenz SEQ ID NO: 1 dargestellt wird, humanes Epimorphin (Isoform A), das durch die SEQ ID NO: 2 dargestellt wird, und humanes Epimorphin (Isoform B), das durch die SEQ ID NO: 3 dargestellt wird, die alle in der nachstehend beschriebenen SEQUENZTABELLE aufgeführt sind. Die Maus-Epimorphinmoleküle umfassen drei Typen, Maus-Epimorphin, das durch die SEQ ID NO: 4 dargestellt wird, Maus-Epimorphin (Isoform A), das durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, und Maus-Epimorphin (Isoform B), das durch die SEQ ID NO: 6 dargestellt wird, die alle in der SEQUENZTABELLE aufgeführt sind. Die humanen Epimorphinmoleküle und die Maus-Epimorphinmoleküle weisen auf Aminosäureniveau eine gegenseitige Homologie von etwa 90 % auf. Somit sind sie auch zwischen verschiedenen Tierspezies gut konserviert.

Allerdings besteht bei diesen Epimorphinmolekülen insofern ein Problem als sie, da sie fest an eine Zellmembran über eine dem C-Terminus benachbarten Domäne (im folgend hier als "die C-terminale hydrophobe Domäne" bezeichnet), die von äußerst hydrophober Natur ist, binden, wobei im lebenden Körper eine hoch geordnete komplexe Struktur eingenommen wird, so dass unter gleichzeitiger Beibehaltung der Aktivität von Epimorphin auf hohem Niveau ihre Funktionen wahrgenommen werden können, äußerst schwer herzustellen sind. Insbesondere zeigen Epimorphin und die Isoform A eine solche Tendenz deutlich. Wenn eine Zellmembran-bindende Domäne vorhanden ist, ist es schwierig, Epimorphin, das von kultivierten tierischen Zellen produziert worden ist, in ein Medium zu sezernieren, um es zu isolieren und zu gereinigt. Die vorliegenden Erfinder schlagen die Herstellung eines löslichen modifizierten Epimorphins durch ein Verfahren der Entfernung der C-terminalen hydrophoben Domäne vor und dergleichen (Offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 25295/1994). Allerdings waren diese Verfahren bisher hinsichtlich der Vereinbarkeit der Aufrechterhaltung einer hohen Aktivität mit der Löslichkeit unzureichend, und darum besteht weiterhin ein Bedarf an der Entwicklung eines stärker verbesserten Verfahrens.

Kann ein modifiziertes Epimorphin, das leicht herzustellen und zu reinigen ist, unter Beibehaltung der physiologischen Aktivität von Epimorphin erhalten werden, ist es bei der Aufklärung des Angriffsmechanismus von Krankheiten, die durch die morphogenetische Anormalität des Epithelgewebes verursacht werden, und bei der Entwicklung von medizinischen Behandlungen für diese Krankheiten geeignet.

AUFGABE UND ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines modifizierten Epimorphins, das die Aktivität von Epimorphin stark beibehält und leicht herzustellen und zu reinigen ist.

Die vorliegenden Erfinder haben die konstitutiven Aminosäuren von Epimorphin per Computer ausgewertet. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass Epimorphin grob in 4 strukturell charakteristische Domänen eingeteilt werden kann, wie in 1 erläutert. Insbesondere kann ein Epimorphin-Polypeptid in eine coiled-coil Domäne (1), eine funktionelle Domäne (2), eine weitere coiled-coil Domäne (3) und eine hydrophobe C-terminale Domäne (4) von der N-terminalen Seite ausgehend unterteilt werden. Die beiden coiled-coil Domänen können weiterhin in einige Subdomänen (beispielsweise siebenfache Sequenzwiederholungen oder andere Domänen) unterteilt werden.

Die vorliegenden Erfinder haben auch festgestellt, dass, wenn ein aus 5 bis 99 Aminosäuren bestehendes hydrophiles Peptid an den N-Terminus und/oder C-Terminus eines Polypeptids, das die funktionelle Domäne (2) von Epimorphin enthält, addiert wird, ein modifiziertes Epimorphin, das die Aktivität von Epimorphin sehr stark beibehält und leicht gereinigt werden kann, bereitgestellt werden kann.

Weiterhin haben die vorliegenden Erfinder festgestellt, dass, wenn mindestens ein Teil der coiled-coil Domänen (1) und (3) aus einem Epimorphin-Polypeptid entfernt wird, aus dem die C-terminale hydrophobe Domäne entfernt worden ist, seine physiologische Aktivität verstärkt werden kann und folglich das Gleichgewicht zwischen der physiologischen Aktivität und der Löslichkeit nach Belieben eingestellt werden kann. Gemäß diesem Verfahren kann ein modifiziertes Epimorphin, das zur Entwicklung der Diagnose und medizinischen Behandlung von Krankheiten, die durch die morphogenetische Anormalität von Epithelzellen verursacht werden, oder zur Entwicklung von neuen Heilmitteln für Wunden und dergleichen geeignet ist, erhalten werden, ohne die hoch geordnete Struktur und die Aktivität von Epimorphin zu beeinträchtigen.

Die vorliegende Erfindung hat zur Vervollständigung auf der Grundlage dieser Feststellungen geführt.

Erfindungsgemäß wird ein Polypeptid bereitgestellt, das ein Epimorphinfragment ist, bestehend aus einer coiled-coil Domäne (1) auf der N-terminalen Seite, einer funktionellen Domäne (2) und einer coiled-coil Domäne (3) auf der C-terminalen Seite, dem jedoch im Vergleich zum vollständigen Epimorphin eine hydrophobe Domäne (4) benachbart zum C-Terminus und mindestens ein Teil des N-terminalen Teils der coiled-coil Domäne (1) fehlt, wobei das Polypeptid in physiologischen Lösungen löslich ist und den Antikörper MC-1 bindet.

Dieses modifizierte Epimorphin kann eine Variante (variantes modifiziertes Epimorphin) sein, die durch die Durchführung einer teilweisen Substitution, Deletion und/oder Insertion von Aminosäuren in der Aminosäuresequenz davon erhalten wird.

Weiterhin werden erfindungsgemäß DNAs, die die modifizierten Epimorphine codieren, rekombinanten Vektoren, die die DNAs enthalten, Transformanten, die durch Einbringen der rekombinanten Vektoren erhalten werden, und ein Herstellungsverfahren des modifizierten Epimorphins und der Varianten davon, bei denen der Transformant eingesetzt wird, bereitgestellt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 erläutert die Strukturmerkmale von Epimorphin und den Aufbau seiner Fragmente.

2 ist ein Elektrophoretogramm, das durch Herstellen der in 1 gezeigten Fragmente unter Verwendung von Escherichia coli und durch ihre Analyse durch SDS-PAGE erhalten wurde.

3 erläutert ein Ergebnis, dass funktionelle Epimorphinfragmente aus den in 2 gezeigten Fragmenten unter Verwendung eines Antikörpers nachgewiesen wurden, der an die funktionelle Stelle von Epimorphin bindet.

4 erläutert das Aufbauschema der in Beispiel 4 verwendeten Epimorphinfragmente.

5 erläutert die Strukturmerkmale eines Epimorphinfragments (1).

6 erläutert die Beziehung zwischen Aktivität und Löslichkeit von Epimorphinfragmenten.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN IM EINZELNEN

Die Merkmale der vorliegenden Erfindung werden im Folgenden ausführlich beschrieben.

Epimorphin ist ein Mesenchymzellmembran-Molekül, das für die Morphogenese von Epithelien im fötalen Stadium essentiell ist und von dem angenommen wird, dass es am Aufbau von vitalen Geweben teilnimmt. Epimorphin ist ein Membranprotein, das als Antigen-Molekül identifiziert wird, das von einem monoklonalen Antikörper MC-1 erkannt wird, der die normale Morphogenese von Epithelien in verschiedenen fötalen Geweben hemmt [Cell, Bd. 69, S. 471–481 (1992)].

Epimorphin ist ein Protein (Molekulargewicht: etwa 33 kDa), das aus etwa 280 Aminosäuren besteht. Als humane Epimorphin-Moleküle sind bereits ein Epimorphin, das durch die SEQ ID NO: 1 dargestellt wird, Epimorphin-Isoform A, die durch die SEQ ID NO: 2 dargestellt wird, und Epimorphin-Isoform B, die durch SEQ ID NO: 3 wird, bekannt, die alle in der SEQUENZTABELLE gezeigt sind. Als Maus-Epimorphinmoleküle sind bereits ein Epimorphin, das durch die SEQ ID NO: 4 dargestellt wird, Epimorphin-Isoform A, die durch die SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, und Epimorphin-Isoform B, die durch die SEQ ID NO: 6 dargestellt wird, bekannt, die alle in der SEQUENZTABELLE gezeigt sind. Das Maus-Epimorphin ist beispielsweise bei der Aufklärung des Angriffsmechanismus von Krankheiten geeignet, die durch die morphogenetische Anormalität des Epithelgewebes verursacht werden, wobei Modelltiere verwendet werden. Das humane Epimorphin ist beispielsweise bei der Diagnose und Behandlung solcher Krankheiten geeignet.

Epimorphin existiert in Mesenchymzellen um das Epithelgewebe und besitzt die Funktion der Kontrolle der Morphogenese des Epithelgewebes und dergleichen. Ein solches Epimorphin bindet fest mit seiner C-terminalen hydrophoben Domäne an eine Zellmembran, während eine komplexe Stereostruktur eingenommen wird, um seine Funktionen durchzuführen. Das vorhergesagte Produkt der Epimorphin-cDNA ist ein Molekül mit einem Molekulargewicht von etwa 33 kDa. Es wurde bereits festgestellt, dass dieses Molekül eine Vielzahl von SDS-resistenten Komplexen im lebenden Körper bildet und dass von diesen eine extrazelluläre Substanz mit einem Molekulargewicht von etwa 150 kDa von dem monoklonalen Antikörper MC-1 erkannt wird. Nach einer Computerauswertung kann Epimorphin grob in 4 Strukturdomänen, wie in 1 erläutert, eingeteilt werden. Außer der C-terminalen hydrophoben Domäne (Transmembrandomäne), bestehen die Domänen aus Fragmenten [coiled-coil Domäne (1) und (3)] auf der N-terminalen und C-terminalen Seite, die leicht die so genannte coiled-coil Struktur einnehmen, wobei die hydrophoben Aminosäuren regelmäßige Anordnungen (siebenfache Sequenzwiederholungen) bilden, mit einem zentralen Fragment (2) zwischen ihnen, das im Wesentlichen die gleiche Größe wie die vorhergehenden Fragmente aufweist. Die coiled-coil Domänen (1) und (3) können jeweils in 4 Subfragmente aufgeteilt werden, die zwei siebenfache Sequenzwiederholungen enthalten. Verwiesen wird auf die ausführliche Struktur des Fragments (1), das eine coiled-coil Domäne ist, die in 5 dargestellt wird.

Gemäß den Ergebnissen der von den vorliegenden Erfindern durchgeführten Untersuchung wurde festgestellt, dass das zentrale Fragment (2) eine funktionelle Domäne ist. Die Tatsache, dass das zentrale Fragment (2) von Epimorphin die funktionelle Domäne ist, kann auf Grund seiner Reaktivität mit dem monoklonalen Antikörper MC-1 und der zellulären Haftfähigkeit beurteilt werden. Wie in 1 erläutert, wurden die Fragmente (1), (2), (3), (12), (13), (23), (123) und (123C: das vollständige Epimorphin) getrennt mit Escherichia coli gemäß dem aus der Technik per se bekannten Verfahren hergestellt, um ihre Reaktivität mit dem monoklonalen Antikörper MC-1 zu bestimmen, der an die funktionelle Stelle des Epimorphin bindet. Insbesondere zeigten die Fragmente (2) und (23) eine starke Reaktivität (siehe Referenzbeispiel 1). Da der monoklonale Antikörper die Aktivität des extrazellulären Epimorphins im lebenden Körper hemmt, wird davon ausgegangen, dass dieses zentrale Fragment mit der Aktivität von Epimorphin zusammenhängt. Die Zell-Haftfähigkeit kann beispielsweise bestimmt werden durch Beschichten von Schalen (die keiner Zellkulturbehandlung unterzogen wurden) mit Lösungen der jeweiligen Fragmente in 8 M Harnstoff, sorgfältiges Waschen der Schalen mit 8 M Harnstoff und PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung), um die Fragmente dünn und gleichmäßig auf den Schalen auszustreichen, und durch anschließendes Animpfen der Epithelzellen auf den Schalen, um ihre Reaktion gegenüber den Fragmenten zu bestimmen. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die Epithelzellen nur an der Schale schnell haften, die mit dem zentralen Fragment 2 beschichtet ist. Zusätzlich wurde festgestellt, dass das Haftungsphänomen des zentralen Fragments 2 an den Epithelzellen durch die Zugabe des monoklonalen Antikörpers MC-1 gehemmt wird. Insbesondere wurde festgestellt, dass die Domäne des zentralen Fragments 2 direkt auf die Zellen wirkt.

Demnach ist es offensichtlich, dass das zentrale Fragment 2 die funktionelle Domäne von Epimorphin ist. Epimorphin und Fragmente (Polypeptide), die die funktionelle Domäne enthalten, werden erwartungsgemäß bei verschiedenen Anwendungen eingesetzt, bei denen deren Epimorphin-Aktivität ausgenutzt wird. Allerdings können einige der Epimorphine und Fragmente, die die funktionelle Domäne enthalten, in physiologischen Salzlösungen wenig löslich oder unlöslich sein. Wenn ein Polypeptid, das die funktionelle Domäne von Epimorphin enthält, in physiologischen Lösungen kaum löslich oder unlöslich ist, ist es beispielsweise schwer, ein solches Polypeptid, das von kultivierten tierischen Zellen produziert wird, in ein Medium zu sezernieren, um es zu isolieren und zu reinigen, und seine Handhabung und Verarbeitung für verschiedene Anwendungsmöglichkeiten wird ebenfalls erschwert.

Nach den Ergebnissen der Auswertung der Aminosäuresequenz von Epimorphin mit einem Computer, wurde im Falle des humanen Epimorphins, wurde festgestellt, dass die funktionelle Domäne von Epimorphin eine Domäne ist, die eine Aminosäuresequenz enthält, die von der 99. Aminosäure (Phenylalanin) bis zur 189. Aminosäure (Glutamin) vom N-Terminus reicht, die dem Epimorphin, der Epimorphin-Isoform A und der Epimorphin-Isoform B gemeinsam ist. Später haben die Ergebnisse einer weiteren Untersuchung bezüglich des humanen Epimorphins ergeben, dass auch eine Domäne, die eine Aminosäuresequenz enthält, die von der 104. Aminosäure bis zur 187. Aminosäure vom N-Terminus reicht, die Epimorphin-Aktivität aufweist. Daher ist die funktionelle Domäne im humanen Epimorphin eine Domäne, die eine Aminosäuresequenz enthält, die von der 99. Aminosäure bis zur 189. Aminosäure, vorzugsweise von der 104. Aminosäure bis zur 187. Aminosäure vom N-Terminus des vollständigen Epimorphins reicht.

Im Falle des Maus-Epimorphins wurde festgestellt, dass die funktionelle Domäne des Epimorphins eine Domäne ist, die eine Aminosäuresequenz enthält, die von der 100. Aminosäure (Cystein) bis zur 190. Aminosäure (Glutamin) vom N-Terminus reicht, die dem Epimorphin, der Epimorphin-Isoform A und der Epimorphin-Isoform B gemeinsam ist. Später haben die Ergebnisse einer weiteren Untersuchung hinsichtlich des Maus-Epimorphins ergeben, dass auch eine Domäne, die eine Aminosäuresequenz enthält, die von der 105. Aminosäure bis zur 188. Aminosäure des N-Terminus reicht, die Epimorphin-Aktivität zeigt. Daher ist die funktionelle Domäne im Maus-Epimorphin eine Domäne, die eine Aminosäuresequenz enthält, die von der 100. Aminosäure bis zur 190. Aminosäure, vorzugsweise von der 105. Aminosäure bis zur 188. Aminosäure vom N-Terminus des vollständigen Epimorphins reicht.

<Modifiziertes Epimorphin, bestehend aus einem Polypeptid mit einer Struktur, bei der mindestens ein Teil von Aminosäuren von der terminalen Seite von mindestens einer der coiled-coil Domänen (1) und (3) deletiert worden ist.>

Das zentrale Fragment (2) von Epimorphin ist eine funktionelle Domäne von Epimorphin. Fragmente, die die funktionelle Domäne (2) enthalten, werden erwartungsgemäß bei verschiedenen Anwendungen eingesetzt, die deren Epimorphin-Aktivität ausnutzen. Allerdings können die Polypeptide, die die funktionelle Domäne enthalten, in physiologischen Salzlösungen unlöslich oder kaum löslich oder von geringer Aktivität sein. Wenn die C-terminale hydrophobe Domäne aus dem vollständigen Epimorphin entfernt wird, kann ein in den physiologischen Lösungen lösliches Polypeptid erhalten werden. Allerdings besitzt ein solches Polypeptid eine niedrige Aktivität.

Als Ergebnis einer ausführlichen Analyse der Aktivität und Löslichkeit der Fragmente von Epimorphin wurde festgestellt, dass das Fragment (123) löslich, dessen Aktivität allerdings äußerst gering ist und dass das Fragment (23) unlöslich, allerdings in der Aktivität im Gegensatz dazu hoch ist. Hieraus haben die vorliegenden Erfinder hinsichtlich der Wirkung des Fragments (1) die folgende Hypothese entwickelt. Fragment (1) wirkt nämlich negativ auf die Aktivität aufgrund der Wirkung, die funktionelle Domäne zu maskieren, bewirkt allerdings eine erhöhte Löslichkeit, aufgrund der Wirkung, die hoch geordnete Struktur des Fragments (23) zu ändern.

Somit haben die vorliegenden Erfinder ein 2M-Fragment, erhalten durch Deletion von 28 Aminosäuren (im Falle von humanem Epimorphin) oder 29 Aminosäuren (im Falle von Maus-Epimorphin) von der N-terminalen Seite des Fragments (123), ein 3M-Fragment, erhalten durch Deletion von 77 Aminosäuren (im Falle von humanem Epimorphin) oder 78 Aminosäuren (im Falle von Maus-Epimorphin) von der N-terminalen Seite des Fragments (123), und ein Fragment (23), wie in 6 erläutert, hergestellt, um ihre Eigenschaften zu analysieren. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die Epimorphin-Fragmente eine Beziehung aufweisen, dass die Aktivität zunimmt, allerdings andererseits die Löslichkeit abnimmt, wenn die Anzahl von Aminosäuren, die von der N-terminalen Seite entfernt werden, erhöht wird, was in 6 gezeigt wird (siehe auch rechte Seite der Zeichnung). Es wurde daher festgestellt, dass die Aktivität und Löslichkeit von Epimorphin-Polypeptiden durch Erhöhung oder Erniedrigung der Anzahl von Aminosäuren, die von der N-terminalen Seite entfernt werden, kontrolliert werden kann.

Erfindungsgemäß können, wie vorstehend beschrieben, modifizierte Epimorphin-Polypeptide bereitgestellt werden, deren Aktivität und Löslichkeit zum Zwecke der Entwicklung einer Diagnostik und medizinischen Behandlung von Erkrankungen, die von der morphogenetischen Anormalität von Epithelgeweben verursacht werden, oder neuer Heilmittel für Wunden und dergleichen, kontrolliert werden können.

Insbesondere wenn der Aktivität eine große Bedeutung beigemessen wird, ist es lediglich erforderlich, ein Fragment herzustellen, bei dem die Anzahl von Aminosäuren, die von der N-terminalen Seite entfernt werden, erhöht ist. Im Falle von humanem Epimorphin ist es lediglich erforderlich, ein Polypeptid mit einer Struktur herzustellen, bei dem 78–103 Aminosäuren, vorzugsweise 91–103 Aminosäuren von der N-terminalen Seite entfernt werden, um ein modifiziertes hoch aktives Epimorphin zu erhalten. Im Falle von Maus-Epimorphin ist es lediglich erforderlich, ein Polypeptid mit einer Struktur herzustellen, bei dem 79–104 Aminosäuren, vorzugsweise 92–104 Aminosäuren, von der N-terminalen Seite entfernt werden, um ein hoch aktives modifiziertes Epimorphin zu erhalten. Beispielsweise kann vorzugsweise das Fragment (23) verwendet werden.

Falls der Löslichkeit eine große Bedeutung beigemessen wird, ist es lediglich erforderlich, ein Fragment herzustellen, bei dem die Anzahl der von der N-terminalen Seite entfernten Aminosäuren vermindert ist. Im Falle des humanen Epimorphins ist es lediglich erforderlich, ein Polypeptid mit einer Struktur herzustellen, bei dem 1–28, vorzugsweise 14–28 Aminosäuren von der N-terminalen Seite entfernt werden, um ein modifiziertes Epimorphin mit hoher Löslichkeit zu erhalten. Im Falle des Maus-Epimorphins ist es lediglich erforderlich, ein Polypeptid mit einer Struktur herzustellen, bei dem 1–29, vorzugsweise 14–29 Aminosäuren von der N-terminalen Seite entfernt werden, um ein modifiziertes hoch aktives Epimorphin zu erhalten. Beispielsweise kann vorzugsweise das Fragment (2M) verwendet werden.

Falls die Verwendung eines Fragments mit ausgeglichener Aktivität und Löslichkeit beabsichtigt ist, ist es lediglich erforderlich, ein Fragment herzustellen, bei dem die Anzahl der Aminosäuren, die von der N-terminalen Seite entfernt werde, zwischen den obigen Bereichen liegt. Im Falle des humanen Epimorphins ist es lediglich erforderlich, ein Polypeptid mit einer Struktur herzustellen, bei dem 29–77, vorzugsweise 61–77 Aminosäuren von der N-terminalen Seite entfernt werden. Im Falle des Maus-Epimorphins ist es lediglich erforderlich, ein Polypeptid mit einer Struktur herzustellen, bei dem 30–78, vorzugsweise 62–78 Aminosäuren von der N-terminalen Seite entfernt werden. Beispielsweise kann vorzugsweise das Fragment entfernt werden. Beispielsweise kann vorzugsweise das Fragment (3M) verwendet werden.

Wie vorstehend beschrieben, kann das erfindungsgemäße modifizierte Epimorphin in geeigneter Weise verwendet werden, indem seine Struktur je nach Zweck und beabsichtigter Anwendung verändert wird. Darum gestattet die Verwendung des modifizierten erfindungsgemäßen Epimorphins die Entwicklung der Diagnostik und medizinischen Behandlung von Erkrankungen, die durch die morphogenetische Anormalität von Epithelgewebe verursacht werden, oder die Entwicklung von neuen Heilmitteln für Wunden und dergleichen für einen wirksameren Fortschritt. Epimorphin ist ein aus etwa 280 Aminosäuren bestehendes Protein. Das Maus-Epimorphin ist beispielsweise bei der Aufklärung des Angriffsmechanismus von Krankheiten geeignet, die durch die morphogenetische Anormalität des Epithelgewebes verursacht werden, wobei Tiermodelle verwendet werden. Das humane Epimorphin ist beispielsweise bei der Diagnose und Behandlung solcher Krankheiten geeignet. Diese Moleküle existieren in den Mesenchymzellen um das Epithelgewebe und dienen unter Anderem der Funktion der Kontrolle der Morphogenese des Epithelgewebes.

Für das Verfahren zur Deletion von Aminosäuren von der N-terminalen Seite von Epimorphin können verschiedene Techniken wie biochemische Techniken und gentechnische Verfahren angewandt werden. Als Beispiel für ein Verfahren unter Anwendung der biochemische Technik kann ein Verfahren erwähnt werden, bei dem ein Epimorphinmolekül chemisch oder physikalisch gespalten wird, um die oben beschriebenen Fragmente zu erhalten. Als Beispiel für ein Verfahren, das eine Methode aus der Gentechnik einsetzt, kann ein Verfahren angewandt werden, bei dem eine cDNA, die jeweils die Fragmente von Epimorphin codiert, in einen geeigneten Vektor zur Expression des Fragments in einem Wirt integriert wird. Als spezielle Technik kann beispielsweise die folgende einfache Technik angewandt werden.

cDNA (A), die das gesamte Epimorphin codiert, wird zuerst durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) synthetisiert. Andererseits werden einzelsträngige DNAs (B und C), wobei 10–20 Basen auf der N- bzw. C-terminalen Seite des herzustellenden Epimorphin-Fragments miteinander verknüpft sind, getrennt mit einem DNA-Synthesegerät hergestellt. Sodann wird durch eine PCR, bei der die cDNA (A) als Templat eingesetzt wird und die DNAs (B) und (C) als Primer verwendet werden, eine doppelsträngige DNA, die das beabsichtigte modifizierte Epimorphin codiert, erhalten.

Die so erhaltene doppelsträngige DNA wird in einen Vektor, beispielsweise pET3C (RIKEN DNA Bank RDB519), mit einer Struktur, die in der Lage ist, die DNA zu exprimieren, integriert, um einen rekombinanten Vektor herzustellen. Anschließend wird dieser rekombinante Vektor in einen geeigneten Wirt, beispielsweise BL21 (RIKEN DNA Bank RDB022), eingebracht, um eine Transformante zu erhalten. Nach Propagation dieser Transformante in einer großen Menge wird eine Behandlung zur Auslösung der Expression, beispielsweise die Zugabe von IPTG in ein Medium, so dass sich eine Endkonzentration von 1 mM ergibt, vorgenommen, um das beabsichtigte modifizierte Epimorphin zu erhalten.

DNA-Sequenzen, die die Fragmente (2M), (3M), (23) und (123) des humanen Epimorphins codieren, sind in der SEQUENZTABELLE gezeigt. Die SEQ ID NOs. 7, 8, 9 und 10 sind DNA-Sequenzen der Fragmente (2M), (3M), (23) bzw. (123) des humanen Epimorphins.

In der SEQUENZTABELLE sind DNA-Sequenzen gezeigt, die die Fragmente (2M), (3M), (23) und (123) des Maus-Epimorphins codieren. Die SEQ ID NOs. 11, 12, 13 und 14 sind die DNA-Sequenzen der Fragmente (2M), (3M), (23) bzw. (123) des Maus-Epimorphins.

Die Aminosäureseqenzen der Fragmente (2M), (3M) und (23) des humanen Epimorphins sind in der Sequenztabelle gezeigt. Die SEQ ID NOs. 15, 16 und 17 sind die Aminosäuresequenzen der Fragmente (2M), (3M) bzw. (23) des humanen Epimorphins.

Die Aminosäuresequenzen der Fragmente (2M), (3M) und (23) des Maus-Epimorphins sind in der SEQUENZTABELLE gezeigt. Die SEQ ID NOs. 18, 19 und 20 sind die Aminosäuresequenzen der Fragmente (2M), (3M) bzw. (23) des Maus-Epimorphins.

Das erfindungsgemäße modifizierte Epimorphin behält die von Natur aus im Epimorphin vorhandene Aktivität in hohem Maße bei und wird daher direkt bei verschiedenen Anwendungen, einschließlich medizinischer Versorgung, beispielsweise Behandlungen verschiedener Gewebe bei Verbrennungen oder Verbrühungen, oder nach einer Operation, und künstlicher Organe, eingesetzt. Daneben kann es auch in niedriger Konzentration als Bestandteil für Kosmetika, Haarwuchsmittel und dergleichen als solches verwendet werden.

Das erfindungsgemäße modifizierte Epimorphin kann eine Variante sein, die durch Vornehmen von partieller Substitution, Deletion und/oder Insertion von Aminosäuren in die Aminosäuresequenz des modifizierten Epimorphin, soweit es im wesentlichen die Epimorphin-Aktivität beibehält, erhalten werden. Die teilweise Substitution, Deletion und Insertion von Aminosäuren kann entweder einzeln oder in einer Kombination davon erfolgen. Die Stelle der Aminosäuresequenz (die variable Stelle), an der die partielle Substitution, Deletion oder Insertion von Aminosäuren erfolgt, liegt im Allgemeinen in der Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das die funktionelle Domäne (2) des Epimorphins enthält. Diese variable Stelle kann in der Aminosäuresequenz der funktionellen Domäne (2) von Epimorphin vorhanden sein. Eine solche Variante selbst kann leicht durch das per se im Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt werden. Die Technik an sich, mit der eine partielle Substitution, Deletion oder Insertion in der Aminosäuresequenz eines Proteins durchgeführt wird, um eine Variante des Proteins zu erhalten, ist nämlich allgemein bekannt. Beispielsweise rekombinante PCR ("PCR Protocols" 155–160, Harcourt Brace Javanovich Japan Inc. 1991) oder Herstellungsverfahren eines rekombinanten Gens mit PCR ("Experimental Medicine" Bd. 8, Nr. 9, 63–67, Yodosha Co., Ltd. 1990). Die modifizierte erfindungsgemäße Epimorphin-Variante kann vorzugsweise im Wesentlichen die von Natur aus in dem modifizierten Epimorphin vorhandenen Funktionen, wie eine gute zelluläre Haftfähigkeit, beibehalten.

VORTEILE DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäß wird das modifizierte Epimorphin, das sowohl in der Aktivität als auch Löslichkeit hervorragend ist, durch Deletion von mindestens einem Teil von Aminosäuren von der terminalen Seite von mindestens einer der coiled-coil Domänen (1) und (3) bereitgestellt. Insbesondere wird das modifizierte Epimorphin, das löslich ist und eine hervorragende Aktivität aufweist, oder das modifizierte Epimorphin, das aktiv ist und eine ausgezeichnete Löslichkeit aufweist, bereitgestellt. Erfindungsgemäß werden weiterhin Varianten bereitgestellt, die durch die Durchführung einer partiellen Substitution, Deletion und/oder Insertion von Aminosäuren in der Aminosäuresequenz des modifizierten Epimorphins erhalten werden. Das erfindungsgemäße modifizierte Epimorphin und Varianten davon sind in physiologischen Lösungen löslich und können daher in Masse produziert werden und sind leicht zu reinigen. Das modifizierte erfindungsgemäße Epimorphin und Varianten davon behalten die natürliche Aktivität des Epimorphins in hohem Maße bzw. im Wesentlichen bei und werden daher direkt bei verschiedenen Anwendungen, einschließlich der medizinischen Versorgung, beispielsweise Behandlungen von verschiedenen Geweben bei Verbrennungen oder Verbrühungen oder nach einer Operation und bei künstlichen Organe, verwendet. Daneben sind sie als ein Bestandteil für Kosmetika, Haarwuchsmittel und dergleichen geeignet.

Die ordnungsgemäße Verwendung des modifizierten Epimorphins und dessen Varianten, entsprechend der beabsichtigten Anwendung in der Forschung und auf medizinischen Gebieten, gestattet die Entwicklung von Diagnose und medizinischer Behandlung von Erkrankungen, die durch die morphogenetische Anormalität von Epithelgewebe verursacht werden, oder die Entwicklung von neuen Heilmitteln für Wunden und dergleichen für einen wirksameren Fortschritt.

AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend ausführlicher durch die folgenden Beispiele beschrieben.

Beispiel 1:

Die Computeranalyse ergab, dass die konstitutiven Aminosäuren von Epimorphin in 4 strukturell charakteristische Domänen aufgeteilt sind, wie in 1 erläutert wird. Gegebenenfalls können die Coiled-coil-Domänen (1) und (3) jeweils weiter in 4 Subfragmente unterteilt werden.

Somit wurden bezüglich des Maus-Epimorphins (Polypeptid in voller Länge, bestehend aus 289 Aminosäuren), dargestellt durch die SEQ ID NO: 4 der SEQUENZTABELLE, zuerst den jeweiligen Domänen entsprechende Peptidfragmente entworfen, wie in 1 erläutert wird (mit 1, 2, 3, 12, 13, 23, 123, und 123C bezeichnete Fragmente in der unteren Reihe in 1).

Die jeiweiligen cDNAs, die die Peptidfragmente codieren, wurden durch PCR unter Verwendung der vollständigen cDNA des Maus-Epimorphins als Templat getrennt hergestellt und getrennt in die Ndel-BamHI-Stelle eines Expressionsvektors PET3C [Gene, Bd. 56, 125–135 (1987)] insertiert. Die so erhaltenen Vektor/Fragment-cDNAs wurden getrennt in Escherichia coli eingebracht, um sie mit IPTG (1 mM, 2 h) zu induzieren, wodurch die jeweiligen Epimorphinfragmente in Escherichia coli produziert wurden. Die Gesamtproteine in Escherichia coli wurden durch SDS-PAGE analysiert. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass sämtliche Epimorphinfragmente in im Wesentlichen gleichen Mengen produziert wurden (siehe 2). Diese Fragmente wurden anschließend durch Strom auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, um die funktionelle Stelle des Epimorphins mit einem an die funktionelle Stelle bindenden monoklonalen Antikörper MC-1 zu bestimmen [Cell, Bd. 69, 471–481 (1992)]. Es wurde festgestellt, dass die im Zentrum des Epimorphinmoleküls liegende Domäne der funktionellen Stelle entspricht (siehe 3).

Auch in denjenigen Fragmenten, die die funktionelle Domäne enthielten, wurde gleichzeitig festgestellt, dass diejenigen, die eine Sequenz auf der N-terminalen Seite oder eine hydrophobe Domäne, bestehend aus 23 bis 24 Aminosäuren benachbart zum C-Terminus enthielten, nur eine geringe Reaktivität gegenüber dem Antikörper aufwiesen (die funktionelle Stelle war nämlich maskiert). Darum war die Funktion nicht geeignet exponiert (vergleiche die Fragmente 12 bzw. 123 mit dem Fragment 2 bzw. 123C in 3). Das mit 23 in 3 bezeichnete Fragment wurde aus Escherichia coli extrahiert, um es zu reinigen. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass, wenn Aminosäuren bis zur 99. Aminosäure vom C-Terminus aus einem solchen Fragment entfernt werden, die Löslichkeit des Epimorphins in einer physiologischen Lösung (PBS) wesentlich verringert ist (die Löslichkeit von mindestens 95 % sank auf 40 %). Das Fragment 23 ist nämlich im Vergleich mit dem Fragment 2 kaum löslich. Allerdings wird seine Löslichkeit durch Deletion des Fragments 3 erhöht.

Auf der Grundlage der so erhaltenen Ergebnisse wurde festgestellt, dass es lediglich erforderlich ist, dass eine Aminosäuresequenz, die von der 100. Aminosäure bis zur 190. Aminosäure vom N-Terminus reicht, enthalten ist, um die Funktion des Epimorphins aufzuweisen, und dass seine Funktion nach und nach durch schrittweise Deletion von 30–99 Aminosäuren von der N-terminalen Seite verbessert wird und dass seine Löslichkeit nach und nach durch schrittweise Deletion von 25–99 Aminosäuren von der C-terminalen Seite verbessert wird.

Herstellung des modifizierten Epimorphins (1) Zelle:

Ein mesenchymaler Zellstamm, der Epimorphin exprimiert, beispielsweise CH3/10T1/2-Klon 8(Code Nr. 08-226, Produkt von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), wurde käuflich erworben, um ihn gemäß der Beschreibung des Herstellers zu kultivieren.

(2) Herstellung von RNA:

Ein TRIzol-Reagens (Kat. Nr. 15596-026), hergestellt von Lifetec Oriental K.K., wurde zur Herstellung von RNA verwendet. Die RNA wurde nach einem dem Produkt beigefügten Protokoll hergestellt.

Nach der Herstellung wurde die RNA mit DnaseI (Kat. Nr.8068SA, Amplifikationsqualität), hergestellt von Lifetec Oriental K.K., nach einem dem Produkt beigefügten Protokoll behandelt.

(3) Herstellung der Epimorphin-cDNA durch RT-PCR:

Auf der Grundlage der so hergestellten RNA wurde eine reverse Transkription mit einem RNA-PCR-Kit (Kat. Nr. R012), erhältlich von Takara Shuzo Co., Ltd., nach einem dem Produkt beigefügten Protokoll durchgeführt.

Um ausschließlich die Epimorphin-cDNA zu amplifizieren, wurden anschließend sowohl stromaufwärts liegende Primer als auch stromabwärts liegende Primer (5'ATGCGGGACCGGCTG3' und 5'TCATTTGCCAACCGA3'), die spezifisch für Epimorphin sind, nach einem dem Produkt beigefügten Protokoll zur Durchführung der PCR verwendet, wodurch die Epimorphin-cDNA erhalten wurde. Die Herstellung der für Epimorphin spezifischen stromaufwärts und stromabwärts liegenden Primer wurde von Bex K.K. vorgenommen.

(4) Herstellung der Fragmente:

Bezüglich cDNAs, die die Fragmente (2M), (3M), (23) und (123) von humanem Epimorphin codieren, wurden die Basensequenzen von Primern, die für die jeweiligen Fragmente spezifisch sind, aus der Sequenz SEQ ID NO: 7 (humanes 2M), der SEQ ID NO: 8 (humanes 3M), der SEQ ID NO: 9 (humanes 23), der SEQ ID NO: 10 (humanes 123) bestimmt, und Primer mit einer Restriktionsenzym-Ndel-Schnittstelle (5'CATATG3') und einer Restriktionsenzym-Nhel-Schnittstelle (5'GCTAGC3'), die an der 5'-Seite des stromaufwärts liegenden Primers bzw. an der 5'-Seite des stromabwärts liegenden Primers als Marker angeknüpft waren, wurden von Bex K.K. käuflich erworben.

Gleichermaßen wurde bezüglich der cDNAs, die die Fragmente (2M), (3M), (23) und (123) des Maus-Epimorphins codieren, die Basensequenzen von Primern, die für die jeweiligen Fragmente spezifisch sind, aus der Sequenz SEQ ID NO: 11 (Maus 2M), SEQ ID NO: 12 (Maus 3M), SEQ ID NO: 13 (Maus 23), SEQ ID NO: 14 (Maus 123) bestimmt, und Primer mit einer Restriktionsenzym-Ndel-Schnittstelle (5'CATATG3') und einer Restriktionsenzym-Nhel-Schnittstelle (5'GCTAGC3'), die als Marker auf der 5'-Seite des stromaufwärts liegenden Primers bzw. auf der 5'-Seite des stromabwärts liegenden Primers angeknüpft waren, wurden von Bex K.K. käuflich erworben.

Die jeweiligen Fragmente wurden durch PCR unter Verwendung der entsprechenden Primerpaare erhalten. Die PCR wurde mit einer Takara-Taq (Kat. Nr. R001A), erhältlich von Takara Shuzo Co., Ltd., nach einem dem Produkt beigefügten Protokoll durchgeführt.

(5) Subklonierung:

Jede der so erhaltenen doppelsträngigen DNAs wurde in einen Expressionsvektor, beispielsweise einen Vektor, der von pET3C (RIKEN DNA Bank RDB519) abgeleitet ist, durch Deletion einer Domäne, die zwischen 2 darin vorhandenen EcoRV-Schnittstellen liegt, nach dem Verfahren, das in "Laboratory-Manual Gene Engineering", 111–114 (1988), veröffentlicht von Maruzen Co., Ltd., beschrieben ist, integriert, wodurch ein rekombinanter Vektor hergestellt wurde.

Anschließend wurde dieser rekombinante Vektor in einen Wirt, BL21 (RIKEN DNA Bank RDB022), nach der Hanahan-Methode, beschrieben in "Laboratory-Manual Gene Engineering", 108–109, eingebracht, wodurch Transformanten erhalten wurden.

(6) Screening:

Kolonien, die auf einer LB-Platte (1 % Bacto-Trypton, 0,5 Bacto-Hefeextrakt, 1 % NaCl, 1,5 % Bacto-Agar), enthaltend 50 &mgr;g/ml Ampicillin, gezüchtet wurden, wurden selektiert, um das primäre Screening der Transformanten durchzuführen.

Um schließlich die den rekombinanten Vektor aufweisenden Transformanten zu identifizieren, wurde der in den Transformanten enthaltene Vektor als Templat zur Durchführung der PCR unter Verwendung der stromaufwärts und stromabwärts liegenden Primer, die für das modifizierte Epimorphin spezifisch waren und sicherstellen sollten, dass Epimorphin-cDNA vorhanden war oder nicht (zu diesem Zeitpunkt enthielten 9 von 10 Klonen die cDNAs), verwendet.

Nachdem die so erhaltenen Transformanten in großen Mengen durch Schüttelkultur bei 37 °C in einem LB-Flüssigmedium (1 Bacto-Trypton, 0,5 % Bacto-Hefeextrakt, 1 % NaCl), enthaltend 50 &mgr;g/ml Ampicillin, gezüchtet wurden, wurde dem Medium die Substanz IPTG zur Auslösung der Expression zugesetzt, so dass sich eine Endkonzentration von 1 mM ergab. Anschließend wurde die Schüttelkultur 2 h bei 37 °C weiter geführt, wodurch verschiedene modifizierte humane und Maus-Epimorphin-Polypeptide in Escherichia coli produziert wurden.

Das Gesamtprotein in dem Escherichia coli-Stamm wurde durch SDS-PAGE analysiert. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass sämtliche modifizierten Epimorphinfragmente in im Wesentlichen gleichen Mengen produziert wurden.

Beispiel 3: Untersuchung hinsichtlich der Löslichkeit der jeweiligen modifizierten Epimorphin-Polypeptide

Jede der in Beispiel 2 hergestellten Transformanten, die getrennt die modifizierten humanen und Maus-Epimorphin-Polypeptide exprimierten, wurde in einem Lysispuffer [50 mM Tris-HC1 (pH: 8,0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl] suspendiert, um sie zu waschen. Mit den so gewaschenen Transformanten wurde eine Zentrifugation durchgeführt, um die Bakterien zu präzipitieren. Nachdem die so präzipitierten Bakterien in einem Lysispuffer suspendiert wurden, wurde der Suspension Lysozym (SIGMA L-6876)zugesetzt, um eine Konzentration von 1 mg/ml zu ergeben. Das Gemisch wurde dreimal wiederholt eingefroren und aufgetaut, gefolgt von seiner Ultraschall-Behandlung, um den Escherichia coli-Stamm zu lysieren.

Anschließend wurde der Überstand durch Zentrifugation entfernt, und der resultierende Niederschlag wurde viermal mit 2 M Harnstoff/Lysispuffer gewaschen. Der so gewaschene Niederschlag wurde wiederum in 8 M Harnstoff/Lysispuffer suspendiert und anschließend zentrifugiert, um eine Überstandsfraktion zu erhalten.

Die so erhaltene Überstandsfraktion wurde gegen eine Überschussmenge eines PBS-Puffers dialysiert und weiterhin zentrifugiert, wodurch sie in eine Überstandsfraktion und eine Präzipitatfraktion aufgetrennt wurde. Die so erhaltenen Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert, um die Löslichkeit jedes modifizierten Epimorphins durch die in den jeweiligen Fraktionen vorhandenen Anteile des modifizierten Epimorphins zu bestimmen.

Als Ergebnis wurde, wie in 6 erläutert, für das modifizierte Epimorphin-Polypeptid eine Tendenz gezeigt, unlöslicher zu werden, wenn die Anzahl von Aminosäuren, die von des N-terminalen Seite entfernt wurden, erhöht wurde.

Beispiel 4: Untersuchung der Aktivität der jeweiligen modifizierten Epimorphin-Polypeptide

Als Index für die Aktivitätsbewertung der jeweiligen modifizierten Epimorpin-Polypeptide wurde ihr Bindungsvermögen gegenüber Kulturzellen untersucht.

Die modifizierten Epimorphin-Polypeptide (Suspensionen in 8 M Harnstoff/Lysispuffer), hergestellt in Beispiel 3, wurden getrennt auf Suspensionskulturschalen aufgebracht und anschließend getrocknet. Danach wurden die so beschichteten Schalen einmal mit 8 M Harnstoff/Lysispuffer und dann fünfmal mit PBS gewaschen. Dann wurden Kulturzellen, CH3/10T1/2-Klon 8 (hergestellt von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), suspendiert in D-MEM/F-12-Medium (SIGMA D8900), dem 20 mg/ml BSA (SIGMA-A-7030) zugesetzt wurde, auf die beschichteten Platten übergeimpft.

Nach Stehen lassen für 1 h und 1 Tag wurden die Schalen dreimal mit PBS gewaschen, und die Zellen wurden dann mit 0,5 N NaOH lysiert. Die resultierenden Lösungen wurden sodann zurückgewonnen und weiter zentrifugiert. Anschließend wurde die Menge an DNA in jeder der Lösungen durch ein Spektralphotometer gemessen, wodurch die Anzahl der Zellen bestimmt wurde, die an der Schale hafteten, um diesen Wert als Index für die Aktivitätsbewertung der jeweiligen modifizierten Epimorphin-Polypeptide zu verwenden. Wie in 6 erläutert, zeigten die Ergebnisse, dass der Aktivitätsgrad gegenüber der Löslichkeit gegenläufig veränderlich ist.

Beispiel 5: Herstellung des varianten modifizierten Epimorphins

  • (A): cDNA, die das Fragment (2) von Maus-Epimorphin codiert.
  • (B): Erhalt einzelsträngiger DNA durch Binden einer Basensequenz, die in der Lage ist, am 5'-Terminus der einzelsträngigen DNA, bestehend aus 10 bis 20 Basen von der 5'-terminalen Seite des Sense-Strangs von (A), das Restriktionsenzym NdeI zu erkennen.
  • (C): Erhalt einzelsträngiger DNA durch Binden einer Basensequenz, die in der Lage ist, am 5'-Terminus von einzelsträngiger DNA, bestehend aus 10 bis 20 Basenpaare von der 5'-terminalen Seite des Antisense-Strangs von (A), das Restriktionsenzym NheI zu erkennen.
  • (1) (B) und (C) wurden mit einem DNA-Synthesegerät produziert.
  • (2) (A) und (B) und (C) wurden als Templat bzw. Primer verwendet, um doppelsträngige DNA durch ein PCR-Verfahren zu erhalten. Dann wurde die PCR unter Bedingungen durchgeführt, die in "Technique-a journal of methods in cell and molecular biology", Bd. 1, Nr. 1, 11–15 (August 1989) beschrieben sind. Durch dieses Verfahren wurden DNAs, die entsprechende variante Epimorphin-Fragmente (2) codierten, in denen eine Substitutionsvariation in Teilen der Basesequenz von (A) auftrat, erhalten.
  • (3) Die so erhaltenen DNAs wurden in die NdeI/NheI-Schnittstelle von pET3C insertiert, der durch eine Domäne erhalten wurde, die zwischen 2 EcoRV-Schnittstellen davon liegt, wodurch ein rekombinanter Vektor hergestellt wurde. Dieser rekombinante Vektor wurde sodann in einen Wirt, Escherichia coli-Stamm BL21, gemäß dem Hanahan-Verfahren eingebracht.
  • (4) Mit dem Escherichia coli-Stamm wurde eine LB-Platte (1 % Bacto-Trypton, 0,5 % Bacto-Hefeextrakt, 1 NaCl, 1,5 % Bacto-Agar), enthaltend 50 &mgr;g/ml Ampicillin, angeimpft, um ihn über Nacht bei 37 °C zu kultivieren.
  • (5) Um die Kolonien, die als Transformanten mit dem rekombinanten Vektor gewachsen waren, zu identifizieren, wurde ein übliches PCR-Verfahren zur Amplifikation der DNAs, die die beabsichtigten varianten modifizierten Epimorphinfragmente codieren, durchgeführt. Anschließend wurden die DNAs einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterzogen, wodurch ihre Banden bestätigt wurden.
  • (6) Nachdem die so erhaltenen Transformanten in großen Mengen durch Schüttelkultur bei 37 °C auf LB-Flüssigmedium, enthaltend 50 &mgr;g/ml Ampicillin, gezüchtet wurden, wurde dem Medium die Substanz IPTG zum Auslösen der Expression zugesetzt, so dass sich eine Endkonzentration von 1 mM ergab. Anschließend wurde die Schüttelkultur 2 h fortgesetzt, wodurch verschiedene variante modifizierte Epimorphinfragmente in Escherichia coli produziert wurden.
  • (7) Der Escherichia coli-Stamm von (6) wurde in Lysispuffer suspendiert, um ihn zu waschen. Der so gewaschene Stamm wurde zum Ausfällen der Bakterien und zur Entfernung des Überstandes zentrifugiert. Nachdem die so präzipitierten Bakterien gewonnen und in Lysispuffer suspendiert wurden, wurde der Suspension Lysozym zugesetzt, um eine Konzentration von 1 mg/ml zu ergeben. Das Gemisch wurde dreimal wiederholt eingefroren und aufgetaut, gefolgt von einer Ultraschall-Behandlung, um den Escherichia coli-Stamm zu lysieren. Anschließend wurde der Überstand durch Zentrifugation entfernt, und das resultierende Präzipitat wurde viermal mit 2 M Harnstoff/Lysispuffer gewaschen. Das so gewaschene Präzipitat wurde wieder in 8 M Harnstoff/Lysispuffer suspendiert und anschließend zentrifugiert, um eine Überstandsfraktion zu erhalten.

Beispiel 6: Bestimmung der Aminosäuresequenz des varianten modifizierten Epimorphins

Plasmid-DNAs in Escherichia coli der Kolonien von (5) des Beispiels 5 wurden durch das Alkali-Verfahren ["Laboratory-Manual Gene Engineering" 51–53 (1988), veröffentlicht von Maruzen Co., Ltd.] hergestellt, um die Basensequenzen der DNAs, die die varianten modifizierten Epimorpinfragmente codieren, durch einen DNA-Sequenziergerät zu analysieren. Die von diesen Basensequenzen codierten Aminosäuresequenzen wurden bestimmt, um sie als Aminosäuresequenzen für ihre entsprechenden varianten modifizierten Epimorphinfragmente, die in Beispiel 5 erhalten wurden, heranzuziehen.

Beispiel 7: Bewertung des varianten modifizierten Epimorphins in der Zellkultur

  • (1) Die im Beispiel 10 hergestellten varianten modifizierten Epimorphinfragmente (Suspensionen in 8 M Harnstoff/Lysispuffer) wurden auf Suspensionskulturschalen ausgestrichen, um ein Beschichtungsgewicht von 10 &mgr;g/cm2 zu ergeben und anschließend getrocknet. Danach wurden die so beschichteten Schalen einmal mit 8 M Harnstoff/Lysispuffer und anschließend fünfmal mit PBS gewaschen. Kultivierte Zellen, CH3/10T1/2-Klon 8, suspendiert in einem D-MEM/F-12-Medium (SIGMA D8900), dem 20 mg/ml BSA zugesetzt wurde, wurden sodann auf die beschichteten Platten übergeimpft.
  • (2) Nach 1 h Stehen lassen wurden die Schalen dreimal mit PBS gewaschen, und die Zellen wurden sodann mit 0,5 N NaOH gewonnen. Der OD-Wert bei 260 nm, durch den die darin enthaltene Menge an DNA wiedergegeben wurde, wurde mit einem Spektralphotometer bestimmt. Die Extinktion eines invarianten modifizierten Epimorphinfragments betrug 0,33 ± 0,015. Unter den erhaltenen varianten modifizierten Epimorphinfragmenten wiesen 6 Fragmente eine Extinktion etwa innerhalb dieses Bereiches auf. Dies ergab, dass Varianten, bei denen ein Teil ihrer Aminosäuresequenzen variiert wurden, in dem modifizierten Epimorphin zulässig sind.

Die variierten Stellen der varianten modifizierten Epimorphinfragmente, die in den Beispielen 5–7 hergestellt und bewertet wurden, sind in Tabelle 2 gezeigt.


Anspruch[de]
Polypeptid, das ein Epimorphinfragment ist, bestehend aus einer Coiled-Coil-Domäne (1) auf der N-terminalen Seite, einer funktionalen Domäne (2) und einer Coiled-Coil-Domäne (3) auf der C-terminalen Seite, dem jedoch im Vergleich zum vollständigen Epimorphin eine hydrophobe Domäne (4) benachbart zum C-Terminus und mindestens ein Teil des N-terminalen Teils der Coiled-Coil-Domäne (1) fehlt, wobei das Polypetid in physiologischen Lösungen löslich ist und den Antikörper MC-1 bindet. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Epimorphin humanes Epimorphin ist. Polypeptid nach Anspruch 2, wobei das Fragment ein beliebiges der SEQ ID NOS: 15, 16 und 17 ist. Polypetid nach Anspruch 3, wobei 1 bis 28, 29 bis 77 oder 78 bis 103 Aminosäuren der N-terminalen Seite der Coiled-Coil-Domäne (1) fehlen. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Epimorphin Mausepimorphin ist. Polypeptid nach Anspruch 5, wobei 1 bis 29, 30 bis 78 oder 79 bis 104 Aminosäuren der N-terminalen Seite der Coiled-Coil-Domäne (1) fehlen. Polypeptid nach Anspruch 5, wobei das Fragment ein beliebiges der SEQ ID NOS: 18, 19 und 20 ist. Modifizierte Epimorphinvariante, umfassend eine funktionelle Domäne, die ein Epimorphinfragment ist, das die Aminosäuren 99 bis 189 des N-Terminus von humanem Epimorphin umfasst, dessen Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 1 angegeben ist, wobei die modifizierte Epimorphinvariante die in Gruppe A, B oder E angegebene Modifikation umfasst:

A: Modifizierte Epimorphinvariante, erhalten durch Substitution von Ile durch Val in Position 148 von SEQ ID NO: 1 und Substitiution von Ser durch Pro in Position in 174 von SEQ ID NO: 1,

B: Modifizierte Epimorphinvariante, erhalten durch Substitiution von Ser durch Thr in Position 174 von SEQ ID NO: 1 und

E: Modifizierte Epimorphinvariante, erhalten durch Substitution von Glu durch Val in Position von 132 von SEQ ID NO: 1,

Substitiution von Ser durch Gly in Position 144 von SEQ ID NO: 1,

Substitiution von Asn durch Ile in Position 154 von SEQ ID NO: 1,

Subsitituition von Asp durch Gly bei Aminosäure 161 von SEQ ID NO: 1,

Substitiution von Phe durch Ser in Position 176 von SEQ ID NO: 1,

wobei das Polypeptid in physiologischen Lösungen löslich ist und den Antikörper MC-1 bindet.
Modifizierte Epimorphinvariante, umfassend eine funktionelle Domäne, die ein Epimorphinfragment ist, das die Aminosäuren 100 bis 190 des N-Terminus von Mausepimorphin umfasst, dessen Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 4 angegeben ist, wobei die modifizierte Epimorphinvariante die in einer der Gruppen A, B, C, D und E gezeigte Modifikationen umfasst:

A: Modifizierte Epimorphinvariante, erhalten durch Substitution von Ile durch Val in Position 149 von SEQ ID NO: 4 und

Substitution von Ser durch Pro in Position 175 von SEQ ID NO: 4,

B: Modifizierte Epimorphinvariante, erhalten durch Substitution von Ser durch Thr in Position 175 von SEQ ID NO: 4,

C: Modifizierte Epimorphinvariante, erhalten durch Substitution von Ile durch Val in Position 115 von SEQ ID NO: 4,

Substitution von Phe durch Leu in Position 127 von SEQ ID NO: 4,

Substitution von Val durch Ala in Position 130 von SEQ ID NO: 4,

Substitution von Met durch Thr in Position 131 von SEQ ID NO: 4,

Substitution von Ile durch Val in Position 139 von SEQ ID NO: 4,

Substitution von Glu durch Asp in Position 166 von SEQ ID NO: 4 und

Substitution von Phe durch Leu in Position 177 von SEQ ID NO: 4,

D: Modifizierte Epimorphinvariante, erhalten durch

Substitution von Tyr durch Phe in Position 134 von SEQ ID NO: 4,

Substitution von Ser durch Gly in Position 171 von SEQ ID NO: 4,

Substitution von Ile durch Thr in Position 178 von SEQ ID NO: 4,

Substitution von Ser durch Pro in Position 179 von SEQ ID NO: 4 und

Substitution von Asp durch Gly in Position 180 von SEQ ID NO: 4 und

E: Modifizierte Epimorphinvariante, erhalten durch

Substitution von Glu durch Val in Position 133 von SEQ ID NO: 4,

Substitution von Ser durch Gly in Position 145 von SEQ ID NO: 4,

Substitution von Ile durch Asn in Position 155 von SEQ ID NO: 4,

Substitution von Asp durch Gly in Position 162 von SEQ ID NO: 4,

Substitution von Phe durch Ser in Position 177 von SEQ ID NO: 4.
DNA, die für das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 codiert. DNA nach Anspruch 10, die eine beliebige der SEQ ID NOS 7, 8, 9, 11, 12 und 13 codiert. Rekombinanter Vektor, der DNA nach Anspruch 10 oder Anspruch 11 enthält und der zur Expression des entsprechenden Polypeptids befähigt ist. Transformierter Organismus, z. B. E. coli, erhältlich durch Einbringen eines rekombinanten Vektors nach Anspruch 12. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Epimorphins durch Expression in einem transformierten Organismus nach Anspruch 13.






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com