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Dokumentenidentifikation DE10256931B4 06.06.2007
Titel Verfahren zum Immobilisieren von biologisch aktiven Molekülen zu Versuchszwecken in einem mikrofluidischen Format
Anmelder Agilent Technologies, Inc. (n.d.Ges.d.Staates Delaware), Palo Alto, Calif., US
Erfinder Robotti, Karla, Mountain View, Calif., US
Vertreter Schoppe, Zimmermann, Stöckeler & Zinkler, 82049 Pullach
DE-Anmeldedatum 05.12.2002
DE-Aktenzeichen 10256931
Offenlegungstag 21.08.2003
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 06.06.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 06.06.2007
IPC-Hauptklasse C12N 11/14(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, DE
IPC-Nebenklasse C12M 1/40(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   C12Q 1/25(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   C12Q 1/68(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   G01N 33/53(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   

Beschreibung[de]

Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf ein Verfahren zum Immobilisieren von Biomolekülen, ohne ihre biologische Funktion zu beeinträchtigen. Spezieller bezieht sich die Erfindung auf die Immobilisierung von Biomolekülen in porösen, anorganischen Matrizen und auf Verfahren zur Verwendung der immobilisierten Biomoleküle in verschiedenen Kontexten. Die Erfindung bezieht sich zusätzlich auf mikrofluidische Systeme, bei denen die immobilisierten Biomoleküle beispielsweise in Mikrokanälen, Mikrosäulen oder dergleichen enthalten sind, um ein Hoch-Durchsatz-Screening in einem mikrofluidischen Format auszuführen.

Die vor einem biologischen Hintergrund ausgeführten Versuche sind häufig Teil eines sequentiellen Prozesses, der eine Probenpräparation, einen Bindungs- oder Aktivitätsversuch, ein Reinigen, Trennen und nachfolgendes Erfassen umfaßt. Auf der Suche nach neuen Anhaltspunkten für Rausch- und Arzneimittel, sieht sich die pharmazeutische Industrie mit einer Überzahl an Versuchen konfrontiert, die in möglichst kurzer Zeit abgeschlossen sein sollen. Ein HTS (HTS = high throughput screening = Hochdurchsatz-Screening) von in Frage kommenden kleinmolekularen Rausch- und Arzneimitteln ist erforderlich, um diese Anhaltspunkte für neue Rausch- und Arzneimittel zu identifizieren. Ferner besteht ein Bedarf an HTS-Verfahren, die ein Mikrovorrichtungsformat verwenden, da das mikrofluidische Format gegenüber herkömmlichen Versuchen den Vorteil hat, daß es nur kleine Mengen an Reagenzien und Lösungsmitteln erfordert und eine schneller Ausführung der Versuche ermöglicht. Das Hochdurchsatz-Screening im mikrofluidischen Format führt auch zu einer reduzierten Handhabung der Materialien durch den Menschen und der Möglichkeit einer unbeaufsichtigten Verarbeitung. Um Hochdurchsatz-Screeningverfahren zu entwickeln, müssen die Versuche „on-line" (bzw. während des Prozesses) oder auf der Vorrichtung, beispielsweise durch Immobilisieren der Biomoleküle (Antikörper, Enzyme, Rezeptorproteine und dergleichen) in einer Weise plaziert werden, in der ihre biologische Funktion dennoch erhalten bleibt. Bekannte Möglichkeiten zum Binden von Biomolekülen umfassen: a) eine physikalische Adsorption und b) eine kovalente Bindung. Die Adsorption von Molekülen führt häufig zu Laugungsproblemen und einem Bedarf, das Molekül in dynamischer Weise nachzufüllen. Die kovalente Bindung, die das Auslaugungsproblem behebt, erfordert geeignete chemische Anteile auf dem Biomolekül, bezüglich derer man das Biomolekül chemisch reagieren lassen und es an der Vorrichtung anbringen kann. Selbst wenn diese Anteile existieren, besteht eine Möglichkeit, daß die Bindung die aktive Stelle des Biomoleküls modifizieren oder interferieren kann, was es nach dem Anbringen biologisch unaktiv macht oder bewirkt, daß es eine reduzierte oder modifizierte Aktivität aufweist.

Moleküle und zellulare Strukturen wurden bisher durch Einschluß immobilisiert. Der Einschluß jedoch wurde üblicherweise unter Verwendung von organischen Polymeren wie Polyvinylalkohol oder Polyacrylsäure als Einschlußmedium erreicht. Ein solcher organischer polymerbasierter Einschluß hatte häufig schwächere Gelnetze, die auseinanderbrachen und das Biomolekül auslaugten, zur Folge.

Anorganische Silikate (Silikatglasmatrizen) sind in jüngerer Zeit verwendet worden, um Enzyme einzuschließen, wie bei Narang et al. (1994), „Glucose Biosensor Based on a Sol-Gel Derived Platform", Anal. Chem. 66(19): 3139–3144, Braun et al. (1990), „Biochemically Active Sol-Gel Glasses: The Trapping of Enzymes", Materials Lett. 10(1,2): 1–5 und Johnson et al. (1971), „On the Use of Polymerizing Silica Gel Systems for the Immobilization of Trypsin", J. Colloid and Interface Sci. 37(3): 557–563 beschrieben ist. Das Biomolekül wird durch das Wachstum oder die Polymerisation einer porösen Silikatstruktur um das Biomolekül herum eingeschlossen. Die vorstehend angeführten Referenzen berichten jedoch, daß die Enzyme, die in der Silikatmatrix eingeschlossen sind, sich nicht so gut wie lösbare Enzyme verhalten, die z. B. in einem typischen Enzymdigerierer (Digestor) verwendet werden. Obwohl die Matrix ziemlich porös ist, sind die Porengrößen in der Glasmatrix einschränkend, wenn der Reaktant der Wahl auch so groß ist wie das Enzym, das eingeschlossen ist. In einer Digerierkammer ist die Porengröße von Bedeutung, da große Proteine, die verdaut werden sollen, nicht in die Sol-Gelmatrix eintreten können.

Neben den vorstehend erwähnten Referenzen beziehen sich die folgenden auf einen oder mehrere Aspekte der vorliegenden Erfindung, und es kann auf dieselben Bezug genommen werden, um Hintergrundinformationen zu liefern, die hierin nicht explizit umfaßt sind.

Das US-Patent Nr. 5.200.334 an Dunn sagt aus, daß Enzyme in Sol-Gelen eingeschlossen sein können, wobei ein Metallalkoxid mit Wasser gemischt und einer Ultraschallenergie bei einem definierten pH ausgesetzt wird, um eine Einzelphasenlösung zu bilden, die dann auf einen pH zwischen etwa 5 und 7 gepuffert wird. Die gepufferte Lösung wird dann mit dem aktiven biologischen Material gemixt, und das resultierende Gel wird gealtert und getrocknet. Dunn sagt aus, daß das getrocknete Produkt ein transparentes poröses Glas mit im wesentlichen dem gesamten hinzugefügten aktiven biologischen Material ist, das darin eingeschlossen ist, und daß das biologische Material einen hohen Aktivitätspegel beibehielte.

Das US-Patent Nr. 5.300.564 an Avnir berichtet von einem beschriebenen Verfahren zum Erhalten einer chemischen Zusammenwirkung zwischen zumindest einem Reagenz, das in einem Sol-Gel-Glas eingeschlossen wird, indem dasselbe mit dem Reagenz dotiert wird, und diffundierbaren gelösten Stoffen oder Komponenten in einer benachbarten Flüssig- oder Gasphase, wobei die Reagenzien, die gelösten Stoffe oder die Komponenten beliebige organische oder anorganische Verbindungen oder Materialien eines biologischen Ursprungs einschließlich Enzyme sein können. Das dotierte Sol-Gel-Glas in verschiedenen Formen kann als eine analytische Test-, chromatographische Medium-, Sensor-, Katalysator- oder Biokatalysator-, Elektroden- oder Enzymelektroden- oder andere Erfassungsvorrichtung nützlich sein.

Das US-Patent Nr. 6.180.378 an Shen sagt aus, daß immobilisierte bioaktive Proteinzusammensetzungen präpariert werden können, die ein bioaktives Protein wie ein Enzym, das in Galerien eines Phyllosilikats eingelagert ist, und eine Vernetzungskomponente, die das Phyllosilikat und das bioaktive Protein vernetzt, enthalten. Das Phyllosilikat kann Natrium- oder Alkylammoniumionen enthalten und ein Montmorillonit sein kann. Das Protein kann Lipoxygenase sein, und die Vernetzungsverbindungen umfassen Tetramethyl-Orthosilikat, Tetraethoxy-Silikat, Propyltrimethoxy-Silikat, Polydimethyl-Orthosilikat und Methyltrimethoxy-Silikat. Die Zusammensetzung wird präpariert, indem ein natriumgesättigtes Phyllosilikat delaminiert wird, ein bioaktives Protein mit dem delaminierten Phyllosilikat gemischt und mit einer Vernetzungsverbindung vernetzt wird. Nach dem Vernetzen kann die Zusammensetzung vakuumgetrocknet und gemahlen werden. Die Zusammensetzung kann auch durch Delaminieren eines Montmorillonits, Sättigen des delaminierten Montmorillonits mit Natriumionen, Mischen des resultierenden Montmorrilonits mit einem Enzym, Hinzufügen von Tetramethyl-Orthosilikat, Ermöglichen einer Vernetzung und Trocknen präpariert werden. Aktivitäten von bis zu 170 von freiem Protein werden unter Verwendung der immobilisierten bioaktiven Proteinzusammensetzungen erreicht, und die Zusammensetzungen behalten bis zu 98% ihrer ursprünglichen Aktivität bei, nachdem sie zwei Wochen lang bei Raumtemperatur gelagert worden sind.

Das US-Patent Nr. 6.303.290 an Liu bezieht sich auf ein Verfahren für die Einkapselung von biologisch wichtigen Proteinen in transparente, poröse Silikamatrizen durch einen alkoholfreien, wäßrigen, kolloidalen Sol-Gel-Prozeß, und auf die biologischen Materialien, die dadurch eingeschlossen werden. Es wird von einer Konformation und folglich einer Aktivität des Biomaterials berichtet, die nach der Einkapselung, wie durch optische Charakterisierung der Moleküle demonstriert wird, selbst nach einer Langzeitlagerung erfolgreich beibehalten wird. Die beibehaltene Konformation des Biomaterials soll angeblich deutlich sowohl der Rate der Gelierung als auch der anschließenden Trocknungsgeschwindigkeit der einkapselnden Matrix entsprechen. Außerdem wird die Gelierung gemäß diesem Prozeß durch die Verwendung einer höheren kolloidalen Feststoffkonzentration und einem geringeren Synthese-pH als bei herkömmlichen Verfahren beschleunigt, wodurch die strukturelle Stabilität und die beibehaltene Konformation der Biomaterialien verbessert werden. Berichten von Liu zufolge schrumpft das Gel, während es trocknet, und härtet ferner zu einer anorganischen Matrix mit einer Porengröße aus, die sich typischerweise im Bereich von 2 bis 5 nm bewegt. Nach Lui ermöglichen die Matrixporen die Diffusion von Reaktionsmolekülen und ihre Reaktion mit den eingeschlossenen Biomolekülen, und die biomolekülhaltigen, anorganischen Monolithmaterialien verfügen über eine Fähigkeit, andere Moleküle zu erfassen und können daher als Sensoren für optische, elektrische, mechanische oder chemische Signale verwendet werden.

Wie in Altstein et al. (2001) „Immunochemical Approaches for Purfication and Detection of TNT Traces by Antibodies Entrapped in a Sol-Gel Matrix", Anal. Chem. 73(11): 2461–2467 berichtet wird, kann die Aktivität von eingeschlossenen Molekülen im Sol-Gel, relativ zu den nicht eingeschlossenen Biomolekülen verbessert werden, und kann der strukturellen Stabilität, die durch die Sol-Gel-Matrix an das eingeschlossene Biomolekül geliefert wird, zugeschrieben sein.

Die verbesserte Stabilität ist im Widerstand der eingeschlossenen Biomoleküle (IgGs) gegenüber der Denaturierung durch Lösungsmittel zu sehen.

Bei einer Probeanalyseinstrumentierung führen kleinere Abmessung allgemein zu verbesserten Verhaltenscharakteristika und gleichzeitig zu verringerten Produktions- und Analysekosten. Miniaturisierte Separationssysteme liefern z. B. ein effektiveres Systemkonzept, führen zu geringeren Gesamtkosten und ermöglichen eine erhöhte Analysegeschwindigkeit, einen verminderten Proben- und Lösungsmittelverbrauch und die Möglichkeit einer erhöhten Erfassungseffizienz.

Demzufolge sind in Verbindung mit der Miniaturisierung von Vorrichtungen zur Verwendung in der chemischen Analyse, speziell bei der Mikro-Säulen-Flüssigchromatographie (&mgr;LC) mehrere Lösungsansätze entwickelt worden, bei denen Säulen mit Durchmessern von 100 bis 200 &mgr;m in einer kapillaren Elektrophorese (CE), bei der die elektrophoretische Separation in Kapillaren in der Ordnung von 25 bis 100 &mgr;m Durchmesser durchgeführt wird, und in einer Mikrokanal-Elektrophorese (MCE) verwendet werden, bei der die Elektrophorese innerhalb eines Mikrokanals auf einem im wesentlichen planaren Substrat ausgeführt wird. Der herkömmliche Lösungsansatz der Miniaturisierungstechnologie, die auf die CE und &mgr;LC angewendet wird, involviert die Verwendung eines siliziumhaltigen Materials, d. h. eine Kapillare, die aus geschmolzenem Silika, Quarz oder Glas hergestellt ist. Bei der MCE, einem attraktiven Verfahren, das in Verbindung mit Hochdurchsatz-Anwendungen nützlich ist und die Reduktion der Gesamtsystemgröße relativ zur CE ermöglicht, sind miniaturisierte Vorrichtungen durch Silizium-Mikrobearbeitung oder lithographische Techniken, z. B. Mikrolithographie, Formen und Ätzen, hergestellt worden. Siehe beispielsweise das US-Patent Nr. 6.194.900 an Freeman et al., 6.093.362 an Kaltenbach et al., 6.033.628 an Kaltenbach et al., 5.804.022 an Kaltenbach und 5.571.410 an Swedberg et al.; Fan et al. (1994) Anal. Chem. 66(1):177–184, Manz et al. (1993) Adv. in Chrom 33: 1–66, Harrison et al. (1993) Sens. Actuators, B B10(2): 107–116, Manz et al. (1991) Trends Anal. Chem. 10(5):144–149, und Manz et al. (1990) Sensors and Actuators B (Chemical) B1(1–6): 249–255. Die Verwendung von Mikrobearbeitungstechniken, um miniaturisierte Separationssysteme in Silizium herzustellen, liefert den praktischen Vorteil, daß eine Massenproduktion solcher Systeme ermöglicht wird, und es gibt eine Anzahl von Techniken, die durch die Mikroelektronikindustrie zur Herstellung von Mikrostrukturen aus Siliziumsubstraten entwickelt worden sind. Beispiele von solchen Mikrobearbeitungstechniken, um miniaturisierte Separationsvorrichtungen auf Silizium- oder Borosilikatglas-Chips herzustellen, sind in den US-Patenten Nr. 5.194.133 an Clark et al., 5.132.012 an Miura et al., 4.908.112 an Pace und 4.891.120 an Sethi et al. zu finden.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Vorrichtungen zum Immobilisieren von biologisch aktiven Molekülen zu Probenzwecken in einem mikrofluidischen Format zu schaffen.

Diese Aufgabe wird durch Verfahren gemäß den Ansprüchen 1, 8, 29, 30 und 31 sowie eine mikroanalytische Vorrichtung Anspruch 42 gelöst.

Dementsprechend ist es ein oberstes Ziel der Erfindung, Sol-Gel-Matrizen mit eingeschlossenen Biomolekülen in einem mikrofluidischen Format zu schaffen, das für Hochdurchsatz-Screeningversuche geeignet ist.

Es ist ferner ein Ziel der Erfindung, Sol-Gel-Biomatrizen zu schaffen, die geformt werden und dann zu Partikeln einer geeigneten Größe zertrümmert werden, um Betten in einem mikrofluidischen Format zu bilden, das für ein Hochdurchsatz-Screening geeignet ist.

Es ist jedoch noch ein weiteres Ziel der Erfindung, Sol-Gel-Biomatrizen zu schaffen, die am Einsatzort innerhalb eines mikrofluidischen Formats gebildet werden.

Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, Sol-Gel-Matrizen zu schaffen, die als ein integraler Bestandteil einer mikrofluidischen Vorrichtung, z. B. eines Mikrochips, gebildet sind.

Es ist ebenfalls ein Ziel der Erfindung, Vorrichtungen zu schaffen, die mit einem biomoleküleingeschlossenen Sol-Gel über dreidimensionalen Nanostrukturen innerhalb oder als Teil einer Versuchskammer gebildet sind.

Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Sol-Gel-eingeschlossenes Enzym zu schaffen, das in einem mikrofluidischen Format enthalten ist.

Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, einen Sol-Gel-eingeschlossenen Rezeptor zu schaffen, der in einem mikrofluidischen Format enthalten ist.

Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, einen Sol-Gel-eingeschlossenen Antikörper zu schaffen, der in einem mikrofluidischen Format enthalten ist.

Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Sol-Gel-eingeschlossenes Genomfragment zu schaffen, das in einem mikrofluidischen Format enthalten ist.

Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Sol-Gel-eingeschlossenes DANN- oder RNA-Oligomer zu schaffen, das einem mikrofluidisches Format enthalten ist.

Es ist jedoch noch ein weiteres Ziel der Erfindung, eine mikrofluidische Vorrichtung unter Verwendung eines Sol-Gel-eingeschlossenen Biomoleküls zu schaffen, bei der einem oder mehreren niedermolekularen Liganden ermöglicht wird, gleichzeitig mit dem Biomolekül in dem Sol-Gel zusammenzuwirken, während dieselben über das Sol-Gel fließen, und bei der die Liganden, die aus der mikrofluidischen Vorrichtung eluieren, unter Verwendung einer Massenspektrometrie analysiert werden, und bei der die Fähigkeit der Liganden, mit dem eingeschlossenen Biomolekül zusammenzuwirken, durch die Veränderung der Konzentration des Liganden relativ zur Konzentration des Liganden, der in die mikrofluidische Vorrichtung eintritt, bestimmt wird.

Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, eine mikrofluidische Vorrichtung zu schaffen, die ein Sol-Gel-eingeschlossenes Biomolekül enthält, wobei die Poren von einer variierenden Größe in der Matrize vorhanden sind, so daß das Molekulargewicht der Liganden, die das Biomolekül kontaktieren können, gesteuert werden kann, wobei die Liganden dazu gebracht werden, auf der und/oder in die mikrofluidische Vorrichtung zu fließen.

Es ist ein Ziel der Erfindung, eine Kontrolle über Porengrößen und die Porosität der biomoleküleingeschlossenen (eingefangenen) Sol-Gel-Matrix unter Verwendung von pH- und Temperatur-Bedingungen während des Härtungsprozesses (Curingprozesses) zu schaffen, so daß das Biomolekül in Poren einer definierten Größe und Porosität, und daher einer definierten Substratgrößeneinschränkung eingeschlossen ist.

Zusätzliche Ziele, Vorteile und neuartige Merkmale der Erfindung werden teilweise in der Beschreibung, die anschließend folgt, aufgeführt, und werden Fachleuten nach Untersuchung des Nachstehenden in Teilen ersichtlich oder können durch Praktizieren der Erfindung erlernt werden.

Die Vorrichtungen und Verfahren der Erfindung, die hierin beansprucht sind, lösen die vorstehenden Probleme und schaffen ein Verfahren zum Immobilisieren von Biomolekülen durch Einschließen in ein anorganisches Silikat oder Sol-Gel zu Zwecken eines Hochdurchsatz-Screenings. Die eingeschlossenen Biomoleküle werden durch die kovalente Modifizierung nicht verändert und werden nicht bloß adsorbiert und können daher nicht aus der Matrix ausgelaugt werden. Die Biomoleküle, die in das Sol-Gel eingeschlossen sind, werden verwendet, um Bindungs- oder Enzymaktivitätsversuche auszuführen, z. B. auf einem „Chip", wobei dieselben nicht als ein „Off-Line"-Prozeß gehalten werden, bei dem eine Zuführung in eine Mikrovorrichtung erfolgt. Das unbewegliche Molekül kann in eine Kammer auf der Vorrichtung plaziert werden oder am Einsatzort als Teil der Vorrichtung gebildet sein.

Die vorliegende Erfindung schafft ferner Vorrichtungen und Verfahren zum Ausführen eines Hochdurchsatz-Screening unter Verwendung der biomolekülhaltigen Matrizen.

Die vorliegende Erfindung schafft ferner Vorrichtungen und Verfahren unter Verwendung von biomolekülhaltigen Silikatmatrizen als ein Verpackungsmaterial für Mikrokanäle und Mikrosäulen in mikrofluidischen Vorrichtungen, die bei einer Hochdurchsatz-Screening-Anwendung verwendet werden sollen.

Die vorliegende Erfindung schafft ferner Vorrichtungen und Verfahren unter Verwendung von biomolekülhaltigen Silikatmatrizen als ein Bestandteil der Struktur der mikrofluidischen Vorrichtungen, die bei einer Hochdurchsatz-Screening-Anwendung verwendet werden sollen.

Die vorliegende Erfindung schafft ferner Vorrichtungen und Verfahren zum Verwenden von biomolekülhaltigen Silikatmatrizen als eine poröse Beschichtung über dreidimensionalen Strukturen von mikrofluidischen Vorrichtungen, die bei einer Hochdurchsatz-Screening-Anwendung verwendet werden sollen.

Die vorliegende Erfindung schafft ferner Vorrichtungen und Verfahren zum Präparieren der Sol-Gel-immobilisierten Biomoleküle mit speziell aufgeführten Reaktionsparametern, z. B. Durchführen der Reaktion bei einer ausreichend niedrigen Temperatur, um eine zu schnelle Reaktion zu verhindern, und/oder Hinzufügen des Biomoleküls in einer Base zur säurehaltigen Sol-Gel-Reaktionsmischung, die auch die Steuerung der Reaktionsrate erleichtert und eine Reaktionshomogenität fördert.

Die vorliegende Erfindung schafft ferner Vorrichtungen und Verfahren zum Ausführen eines enzymatischen Digerierungsverfahrens unter Verwendung eines silikatimmobilisierten Enzyms in einem Format, das eine Entsprechung zwischen der Porengröße der Matrix und der Molekulargröße der verwendeten Reagenzien und/oder der zu testenden potentiellen Substrate sicherstellt. Speziell schafft die Erfindung Vorrichtungen und Verfahren für ein Hochdurchsatzverfahren unter Verwendung von kleinen Reaktanten einer molekularen Größe mit Molekulargewichten von weniger als etwa 3000 Da. Die beanspruchte Erfindung schafft eine Übereinstimmung zwischen der Porengröße und der Reaktantgröße, und die silikateingeschlossenen Biomoleküle sind ein ideales Medium zum Erreichen von Digerierungen am Einsatzort (In-Situ-Digerierungen) und ist auf Hochdurchsatzverfahren anpaßbar. Daher sind die Vorrichtungen und Verfahren, die hierin beschrieben sind, für Hochdurchsatz-Prozeduren, die beispielsweise in der pharmazeutischen, biotechnologischen, landwirtschaftlichen oder chemischen Industrie oder bei einem anderen Unterfangen, bei dem die eingeschlossenen Moleküle während des Vorgangs oder auf der Vorrichtung für Versuche oder zur Drogenentdeckung verwendet werden, ideal.

Die eingeschlossenen Biomoleküle sind z. B. Rezeptoren, Antikörper, Enzyme, Gene und Genomfragmente, DNA- und RNA-Oligomere, extrazellulare oder sekretierte Proteine oder Polysaccharide oder Glykoproteine oder Lipide, Pflanzenprodukte, Fermentierungsprodukte, Membranfragmente oder löslich gemachte Membranproteine und dergleichen, wobei keine Einschränkung auf dieselben besteht. Die silikateingeschlossenen Biomoleküle sind speziell zur Verwendung mit mikrofluidischen Vorrichtungen geeignet und bieten gegenüber derzeit verfügbaren Technologien zum Immobilisieren von Biomolekülen zur Verwendung in solchen Vorrichtungen und Prozessen erhebliche Vorteile.

Bevorzugte Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend, Bezug nehmend auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

1 ein schematisches Diagramm einer Proteineinschließung in einem Sol-Gel während einer Polymerisierung,

2 einen Vergleich von CE-Elektropherogrammen von Cytochrom-c-(~ 13.000 Da)-Digerierungsprodukten, wobei die Digerierungen unter Verwendung von entweder Trypsin in einer Lösung oder Trypsin-Sol-Gel ausgeführt wurden. Beide Digerierungen traten 18 Stunden lang bei 37°C auf.

3 einen Vergleich zwischen den CE-Elektropherogrammen von Bombesin, entweder intakt oder digeriert, eine Minute lang mit einem 1 mg Trypsin-Sol-Gel,

4 CE-Elektropherogramme von Bombesin Fragmenten, die aus drei Minuten langen Digerierungen unter Verwendung von 10 mg Trypsin-Sol-Gel resultierten. Der gleiche Anteil von Trypsin-Sol-Gel wurde für elf Wiederholungen verwendet und zeigt, daß die Aktivität für erweiterte Verwendungen des Sol-Gels beibehalten wird.

5 einen Vergleich von CE-Elektropherogrammen von Bombesinfragmenten, die aus drei Minuten langen Digerierungen mit 10 mg Trypsin-Sol-Gel resultierten, als das Trypsin-Sol-Gel elf mal wiederverwendet wurde im Vergleich dazu, als es 20 mal wiederverwendet wurde.

I. Definitionen und Nomenklatur:

Bevor die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben wird, wird darauf hingewiesen, daß, sofern nicht Gegenteiliges angezeigt ist, diese Erfindung nicht auf spezifische Antikörper, Rezeptoren, Enzyme oder dergleichen beschränkt ist, da diese variieren können. Es wird ebenfalls darauf hingewiesen, daß die hierin verwendete Terminologie ausschließlich zu Beschreibungszwecken spezieller Ausführungsbeispiele dient und nicht den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung einschränken soll.

Es muß beachtet werden, daß die hierin und in den Ansprüchen verwendeten Singularformen „ein", „und" und „das", plurale Entsprechungen umfassen, es sei denn, der Kontext gibt eindeutig Gegenteiliges vor. Daher umfaßt die Bezugnahme auf „einen Antikörper" zwei oder mehrere Antikörper, die Bezugnahme auf „einen Komplex" umfaßt zwei oder mehrere Komplexe usw.

Der Begriff „Matrix" oder „Matrizen" bezieht sich auf den anorganischen Wirt, der den Körper der Zusammensetzung, der die Biomoleküle enthält, bildet. Der Begriff „Bett" bezieht sich auf eine Präparation, die die zertrümmerte und zu Partikeln einer definierten Größe geformte Sol-Gel-Matrix, die beispielsweise für die proteolytischen Digerierung oder eine andere Enzym- oder Rezeptoraktivität nützlich ist, verwendet und einen zusätzlichen Oberflächenbereich zur Reaktion bereitstellt. Der Begriff „Nanostruktur" bezieht sich auf eine Struktur, die aus der Matrix und dem darin eingeschlossenen biologischen Material gebildet ist, die vorwiegend eine Größe von weniger als 100 nm aufweist. Der Begriff „Xerogel" bezieht sich auf ein getrocknetes Gel, das keine Flüssigkeit enthält und hochporös ist.

Der Begriff „Fluid", der hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Materie, die nicht-fest ist oder zumindest teilweise gasförmig und/oder flüssig. Ein Fluid kann einen Feststoff enthalten, der minimal, teilweise oder voll solvatiert, dispergiert oder suspendiert ist. Beispiele von Fluiden umfassen ohne Einschränkung wäßrige Flüssigkeiten (einschließlich Wasser per se und Salzwasser) und nichtwäßrige Flüssigkeiten wie organische Lösungsmittel und dergleichen.

Der Begriff „Gel" bezieht sich auf eine kolloidale Lösung, spezieller auf eine Flüssigkeit in einem Feststoff. Es beginnt in einer flüssigen Form und wird infolge einer schnellen Zunahme der Viskosität und Polymerisierung freistehend. Während es viskos wird, kann es gebildet, vergossen, gußgeformt, geformt, aufgeschleudert oder in gewünschte Formen gezogen werden. Bevorzugte Formen für die vorliegende Erfindung umfassen Filme, Fasern, Monolithe, Pellets, Körnchen, Tabletten, Stäbe oder Schüttgut. Speziell bevorzugte Formen umfassen Dünnfilme und Beschichtungen, weil die Gelierung verbessert ist, d. h. die dünne Schicht verstärkt die schnelle Bildung des Gelzustands (das „gealterte, wäßrige Gel" oder „feuchte Gel") aus dem flüssigen Zustand (die „viskose wäßrige Mischung"). Bei bestimmten Ausführungsbeispielen ist es wünschenswert, daß sich das Gel bildet und dann in kleine Teilchen zertrümmert wird, die zum Bilden von Betten, die in eine mikrofluidische Vorrichtung eingebaut werden sollen, geeignet ist. Die Größen der Partikel, die zum Bilden von Betten geeignet sind, bewegen sich von etwa 10 bis etwa 80 &mgr;m im Durchmesser. Alternativ kann das Gel direkt zu kleinen Partikel einer gewünschten Form und Abmessung gebildet werden, indem Tröpfchen, die einen Nebel bilden, gesprüht werden, oder durch Verwendung einer Gußform einer gewünschten Form und Abmessung, in der das Gel härtet.

Wenn das Material jedoch zu fluidisch ist, kann es die ausgewählte Form nicht beibehalten. Wenn es jedoch zu viskos ist, kann es schwierig sein, es zu Dünnfilmen oder Fasern zu bilden. Nachdem das „gealterte" Gel seine freistehenden Eigenschaften angenommen hat, wird es über einen Zeitraum unter ausgewählten Bedingungen getrocknet, um die Konformation des Gels, seiner Poren, Matrizen und Verbindungskanäle in feststehenden Positionen zu sichern und eine Langzeitlagerung zu erlauben (das „getrocknete Gel").

Der Begriff „Monolith" bezieht sich auf einen feststoffähnlichen Körper in augenscheinlich einem Stück und kann zwischen mehreren Mikrometern und zehn Millimetern und mehr groß sein. Der Begriff „Dünnfilm" steht für eine getragene oder nichtgetragene Schicht von einer Dicke von 30 nm bis 0,1 mm bei einem im wesentlichen größeren Durchschnitt, typischerweise von mehreren Millimetern und darüber hinaus.

Der Begriff „mikroanalytische Vorrichtung" bezieht sich auf eine Vorrichtung mit Merkmalen von Mikrometer- oder Submikrometerabmessungen, die bei einer beliebigen Anzahl von chemischen Prozessen verwendet werden kann, die sehr kleine Fluidbeträge involvieren. Der Begriff mikroanalytische Vorrichtung wird austauschbar mit dem Begriff mikrofluidische Vorrichtung verwendet.

Der Begriff „optional" oder „optionalerweise" bedeutet, daß der nachfolgend beschriebene Umstand auftreten oder nicht auftreten kann, so daß die Beschreibung Fälle umfaßt, wo der Umstand auftritt, und Fälle, wo er dies nicht tut. Zum Beispiel umfaßt ein Schritt, der als „optional" angeführt wird, sowohl ein Verfahren, das den Schritt umfaßt, sowie ein Verfahren, das den Schritt nicht umfaßt.

II. Sol-Gel-Technologie:

Die Vorrichtungen und Verfahren der Erfindung, die hierin beansprucht sind, schaffen ein verbessertes Verfahren zum Immobilisieren von Biomolekülen, bei dem die Biomoleküle durch Einschließen in ein anorganischen Silikat oder Sol-Gel immobilisiert werden.

Der Sol-Gel-Prozeß ist ein wichtiger Weg für weiterentwickelte Metalloxidglase und Keramikerzeugnisse. Das Verfahren wird derzeit verwendet oder ist für protektive, optische und elektronische Beschichtungen, optische Faser-Vorformen, nichtlineare optische Vorrichtungen, Dielektrika oder Superleiter, Anzeigematerialien und Strukturen von potentiellem Nutzen. Die Sol-Gel-Technik schafft ein gesteuertes Verfahren mit einer relativ niedrigen Temperatur zum Erzeugen einer großen Vielzahl von Formen, wie z. B. monodispergierte Partikel, einheitliche Beschichtungen, Fasern, dichte oder poröse Artikel und gemischte Metalloxide mit einer gesteuerten Stöchiometrie und Reinheit auf Molekularebene.

Der Sol-Gel-Prozeß stützt sich weitgehend auf die gleiche Gruppe von Ausgangsmaterialien, z. B. die Metallalkoxide, Karboxylate und Dikenotate. Diese Vorläufersubstanzen werden hydrolisiert, dann in Gegenwart einer Alkohol/Wasserlösung kondensiert, um ein Gel zu bilden, das dann getrocknet und gefeuert wird, um das Endprodukt zu ergeben. Eine chemische Steuerung der Produktbildung wird durch die Temperatur, den Typ des Katalysators und den pH sowie durch den Typ und das Verhältnis der Reaktanten in der Lösung manipuliert. Siehe z. B. C.J. Brinker et al. in „Ultrastructure Processing of Ceramics, Glasses and Composites I" (1984) auf den Seiten 43 et sequ.

So steuert die Reaktionsprozedur weitestgehend die Morphologie des Endgels und daher auch die Endkeramikmikrostruktur. Ein geringer Wassergehalt und/oder Säurebedingungen ergeben aufschleuderbare Gele, weil das Prekursorpolymer, wie vorstehend angemerkt, im wesentlichen linear ist. Ein höherer Wassergehalt ergibt leicht vernetzte, beschichtbare Gele, während ein sehr hoher Wassergehalt und/oder Grundbedingungen hochvernetzte Gelprodukte ergeben, die bei Gießverfahren und zur Pulverbildung nützlich sind. Siehe B.J.J. Zelinski et al. (1984), J. Phys. Chem. Solids 45: 1069 und L.C. Klein et al. (1985), Ann. Rev. Mat. Sci. 15: 227. Alternativ kann ein Verfahren zur Verwendung eines wäßrigen, alkoholfreien Sol-Gels verwendet werden, das keine Freisetzung von Alkohol im Verlauf der Reaktion zur Folge hat. So kann der Kontakt mit Alkohol während der Reaktion aufgehoben werden, wodurch eine alkoholverursachte Denaturierung von vielen Biopolymeren (die durch eine Kettenentfaltung oder Mokekülaggregation bewirkt wird) verhindert werden kann, die typischerweise bei herkömmlichen Einschlußverfahren zu beobachten ist. Folglich sind die Typen von Biopolymeren, die in diese Zusammensetzungen eingebaut werden können, im wesentlichen uneingeschränkt.

III. Sol-Gel-Immobilisierung von Biomolekülen:

Das Biomolekül wird in der polymerischen Matrix unter Verwendung eines Sol-Gel-Polymerisierungsprozesses immobilisiert. Der Prozeß involviert die Polymerisierung von geeigneten Monomeren bei oder nahe Raumtemperatur, um eine anorganische polymerische Matrix (z. B. Glas) zu bilden, wobei die geeigneten Monomere Alkoxide und Ester von metallischen und halbleitenden Elementen umfassen, wobei Si, Al, Ti, Zr und P als solche Elemente bevorzugt werden. Die bevorzugtesten Monomere umfassen Silizium und weisen ein Silizium-zu-Sauerstoffverhältnis von etwa 1:2 bis zu etwa 1:4 auf.

Die Biomoleküle können z. B. in Silika-Polymermatrizen durch einen Sol-Gel-Prozeß wie z. B. die Hydrolyse von Tetrametoxysilan oder einem anderen Polyalkoxysilan immobilisiert werden, das ein oder mehrere Siliziumatome enthält. Die Kondensierung des resultierenden Silanols in Gegenwart des Biomoleküls führt zu einer Einschließung des Biomoleküls. Eine Bindung der Biomoleküle in Silika oder anderen anorganischen Polymermatrizen, die aus solchen Sol-Gelen gebildet sind, kann das Enzym stabilisieren.

Die Sol-Gel-abgeleitete Verarbeitung kann bei niedrigen Temperaturen, d. h. näherungsweise 40° oder darunter, und entweder einem hohen oder niedrigen pH ausgeführt werden. Für die Zwecke dieser Anwendung ist eine niedrige pH-Verarbeitung verwendet worden. Die Bedingungen einer niedrigen Temperatur und eines niedrigen pH können zur einheitlichen Einbindung des Biomoleküls und zur Beibehaltung der Funktionalität der Biomoleküle, die in die Sol-Gel-Matrix eingebaut sind, wichtig sein. Die Vorteile der Sol-Gel-abgeleiteten Verarbeitung umfassen: 1) Ein Sol, das eine Suspension von Kolloidteilchen ist, befindet sich in flüssiger Form, bevor es geliert. 2) Die gesamte Reaktion kann bei Umgebungstemperatur ausgeführt werden. 3) De Mikroporosität von Sol-Gel-Glasen kann beispielsweise durch variierenden Wassergehalt, Zeitgebung der Protonaddition, Protonkonzentration, Alterungszeit und Trocknungszeit gesteuert werden. Die Porengrößen können auch über die Größe der Kolloidalpartikel, die in dem Gel gewählt sind, beeinflußt werden. Die Präparation von Sol-Gelen unter einem hohen pH fördert das Partikelwachstum und verzögert die Gelierschritte. Diese Präparationen erzeugen Monolithe mit dichteren und größeren Bausteinen, die größere durchschnittliche Porendurchmesser und spezifische Oberflächenbereiche erzeugen. Wenn die Verarbeitung unter Verwendung von sehr niedrigen pH-Bedingungen (< 2) ausgeführt wird, ergibt die Polykondensierung von Silikapartikeln allgemein einen Monolith mit engeren Poren. Die Porengrößen, die allgemein bei einer Sol-Gel-Verarbeitung erreichbar sind, bewegen sich im Nanometerbereich. Während der Flüssigphase der Reaktion können die Biomoleküle dem flüssigen Sol hinzugefügt werden, bevor es geliert. Die Moleküle können dann in die feststoffliche Matrix eingeschlossen werden.

Der Sol-Gel-Prozeß ist säurekatalysiert. Jedoch werden die Biomoleküle in einer Pufferlösung mit einem höheren pH hinzugefügt. Das Erhöhen des pH bei Hinzufügen der Biomoleküle trägt dazu bei, eine Reaktionssteuerung zu liefern, indem ein zu schnelles Auftreten einer Immobilisierung verhindert und die Einheitlichkeit der Reaktion verbessert wird. Das Durchführen der Reaktion bei einer niedrigeren Temperatur liefert diese Vorteile ebenso. Der End-pH der Reaktionsmischung kann ebenso gesteuert werden, so daß der pH in dem für die Stabilität von einem speziellen Biomolekül erforderlichen Bereich bleibt. Der pH sollte ein pH sein, in dem das Biomolekül seine optimale aktive Konformation beibehält, während es in das Sol-Gel eingeschlossen wird.

Die Poren können entwickelt und gesteuert werden, indem (nach der Gelierung) die Kolloidalpartikel unterschiedlicher Größe zusammengepackt werden, und die Porengröße kann in hohem Maße der Ausgangsgröße der Kolloidalpartikel entsprechen (Iler in The Chemistry of Silica, Wiley, New York, 1979, und Shafer et al. (1987) J. Appl. Phys. 61(12): 5438–5446. Der Durchmesser der Kolloidalpartikel reicht allgemein von etwa 1 nm bis etwa 30 nm. Wenn der Polymerisierungsprozeß unter sauren Bedingungen auftritt, liegt der Partikelbereich näher bei etwa 1 bis etwa 5 nm.

Es ist möglich, eine gewünschte Porengröße unter Verwendung des wäßrigen kolloidalen Prozesses unter einem konstanten Wert des Lösungs-pH zu erreichen. Der alkoxydbasierte Sol-Gel-Prozeß kann jedoch ebenfalls angewendet werden. Bei der vorliegenden Erfindung kann die Porengröße von 1 bis 100 nm oder variieren, um Biomoleküle oder Komplexe von Biomolekülen oder Fragmente von Zellen unterschiedlicher Größe zu realisieren. Die bevorzugte Größe reicht von 2 bis 50 nm. Die Porengröße ist jedoch allgemein von der Größe des Biomaterials, das eingeschlossen werden soll, abhängig. Zum Beispiel, wenn die Proteine eingeschlossen werden sollen, reicht die bevorzugtere Porengröße von ein Paar bis zu mehreren Dutzend nm. Für eine DNA ist sie von der Ordnung von 15 bis 30 nm. Für die Zellen oder Zellfragmente, kann die Porengröße sogar noch größer sein, wobei sie von 100 nm und darüber hinaus reicht. Da die Durchlässigkeit von der Porengröße abhängig ist, kann sie auch über einen weiten Bereich im kolloidalen Sol-Gel-Prozeß variiert werden, um die Reaktionsgenetik der resultierenden Zusammensetzungen zu beeinflussen.

Die Erfindung schafft ferner das Verfahren, bei dem die Größe des Solpartikels ausgewählt ist, um eine Porengröße zu erzeugen, wenn das Gel getrocknet ist, die im wesentlichen mit der Größe eines Moleküls des eingeschlossenen biologischen Materials identisch ist.

Bei einem speziellen Ausführungsbeispiel weist ein Verfahren zum Fertigen einer porösen, anorganischen Matrix, die ein biologisches Material enthält, das in derselben eingeschlossen ist, folgendes auf: a) Bilden einer wäßrigen Zusammensetzung, die ein Keramikoxid-Kolloidalsol aufweist, das mit einer versauerten Oxidsalzlösung gemischt ist, b) Hinzufügen eines Betrags des biologischen Materials zur Zusammensetzung in einer physiologischen, zulässig gepufferten Lösung, wobei die resultierende wäßrige Zusammensetzung einen pH-Wert aufweist, der von etwa 6 bis etwa 8,5 reicht, wobei die wäßrige Komposition trüb wird, wenn sie in eine polymerisierende Hydroxidlösung verwandelt wird und zu einem Gel transformiert, c) Formen des in Schritt b) erzeugten Gels in eine Endform und Altern des Gels bei einer Temperatur von etwa 4°C bis etwa 25°C, etwa zwei Wochen lang, d) Spülen des Gels während des Alterungszeitraums und e) optionales Zertrümmern des Gels in ein Pulver und Lagern unter einem geeigneten pH-Puffer bis zur Verwendung, wobei die Moleküle des biologischen Materials in den Poren des Gels eingeschlossen sind. Ein geeigneter pH ist ein pH, bei dem das Biomolekül stabil ist, jedoch nicht notwendigerweise aktiv. Zum Beispiel könnte ein geeigneter pH für Trypsin 2,5 betragen.

Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel besteht das Sol aus einem kolloidalen Silikasol und einem aufgelösten Metallsilikat, z. B. Natriumsilikat. Bei bestimmten anderen bevorzugten Ausführungsbeispielen besteht das Sol aus einer Kombination aus einem Tetraalkyl-Orthosilikat, wie z. B. Tetraethyl-Orthosilikat (TEOS) oder Tetramethyl-Orthosilikat (TMOS) mit einem Silan, das durch zumindest zwei verlassende Gruppen (normalerweise OR und halo) und eine C8-C24-Alkygruppe (z. B. C18-Silan) ersetzt wird, was ein hydrophobisches Gel zur Folge hat. Ein solches hydrophobisches Gel ist speziell als eine Komponente von einer mikrofluidischen Vorrichtung gut geeignet und kann geformt und zu Partikeln zertrümmert werden, wodurch ein Bett gebildet wird, das in eine Mikrosäule oder einen Mikrokanal eingebaut werden kann. Alternativ kann das hydrophobische Gel dazu gebracht werden, sich in eine beliebiges gewünschte Form als eine Komponente der mikrofluidischen Vorrichtung einzuformen, wie z. B. eine poröse Beschichtung über einem bestimmten Abschnitt der mikrofluidischen Vorrichtung, über dem die Analyte fließen, oder in eine dreidimensionale Nanostruktur der Vorrichtung eingebaut werden.

Die Erfindung sieht Ausführungsbeispiele vor, bei denen das wäßrige Gel geformt wird, vorzugsweise zu einem monolithischen Gel, einem Dünnfilm oder einer Faser. Die Erfindung sieht auch Ausführungsbeispiele vor, bei denen das getrocknete Gel Poren mit einem Durchschnittsdurchmesser aufweist, der von 1 nm bis 100 nm reicht, oder bevorzugt von 2 nm bis 50 nm reicht. Spezieller weisen die Poren des getrockneten Gels eine Matrix mit Poren von näherungsweise der gleichen Abmessung wie die Moleküle des biologischen Materials auf, das in derselben eingeschlossen ist. Alternativ sind bei bestimmten anderen Ausführungsbeispielen die Porengrößen im wesentlichen kleiner als die Größe des eingeschlossenen Biomoleküls.

Die Erfindung sieht ferner ein poröses, anorganisches, kolloidales Sol-Gel mit einem darin eingeschlossenen, aktiven biologischen Material vor, wobei das Sol-Gel gemäß den hierin vorgesehenen Verfahren präpariert wird. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird das Sol-Gel präpariert, wobei es ein kolloidales Silikasol und ein aufgelöstes Natriumsilikat aufweist. Das bevorzugte eingeschlossene biologische Material innerhalb des Sol-Gels ist eine RNA, DNA oder ein Protein oder ein aktives Fragment der DNA, RNA oder Proteine sowie Zellen oder Gewebe. Das bevorzugte eingeschlossene biologische Material ist ein beliebiges aktives Protein oder aktives Fragment desselben.

Bei noch weiteren Ausführungsbeispielen schafft die Erfindung ein Verfahren, bei dem die Veränderung von einer oder mehreren optischen Charakteristika des eingeschlossenen biologischen Materials qualitativ oder quantitativ durch Spektroskopie gemessen wird, wobei eine oder mehrere Techniken verwendet werden, die aus der Gruppe bestehend aus UV, IR, sichtbarem Licht, Fluoreszenz, Lumineszenz, Absorption, Emission, Erregung und Reflexion ausgewählt ist.

Zusätzlich schafft die Erfindung ein Verfahren zum Speichern von einem biologischen Molekül, oder einem Komplex von Molekülen, oder einem Protein oder einem Proteinfragment oder von Komplexen von Proteinen oder Proteinfragmenten in einer porösen anorganischen Matrix, wobei die biologische Aktivität des Materials für lange Zeiträume beibehalten wird. Die bevorzugte poröse anorganische Matrix ist ein Solgel, das ein kolloidales Silikasol und ein aufgelöstes Natriumsilikat aufweist. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen wird die Aktivität des Biomoleküls selbst unter nachteiligen Bedingungen beibehalten, die beispielsweise durch die Verwendung von Lösungsmitteln und hohen Drücken anzutreffen sind. Die Aktivität der eingeschlossenen Biomoleküle kann im Sol-Gel relativ zu den nichteingeschlossenen Biomolekülen verbessert werden, wie bei Altstein et al. (2001), oben aufgeführt, berichtet wird. Die strukturelle Stabilität, die durch die Sol-Gel-Matrix geschaffen wird, kann eine Stabilität für das eingeschlossene Biomolekül und einen Widerstand der eingeschlossenen Biomoleküle (IgGs) gegenüber der Denaturierung durch Lösungsmittel liefern.

Bei bestimmten anderen Ausführungsbeispielen, wo die Aktivität des biologischen Materials gegen die Präparations- und Lagerungsbedingungen oder die Bedingungen, die während der Verwendung des Sol-Gels angewendet werden, empfindlich ist, werden zumindest 10% der biologischen Aktivität beibehalten. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen kann die biologische Aktivität beeinträchtigt werden, wie z. B. eine Veränderung der Substratspezifität oder eine Verschiebung im KD, wo das biologische Molekül ein Enzym ist. Die Aktivität des eingeschlossenen biologischen Moleküls kann von der Referenzaktivität infolge der Präparations- und Lagerungsbedingungen im Sol-Gel abweichen. Eine beliebige Variation der Aktivität ist nicht dahingehend auszulegen, daß sie die Funktionsfähigkeit des eingeschlossenen Sol-Gels beeinträchtigt. Für bestimmte robuste biologische Moleküle wird die Aktivität sogar unter nachteiligen Bedingungen beibehalten.

IV. Biomoleküle:

Die in Verbindung mit der Erfindung nützlichen Biomoleküle können beliebige organische Moleküle sein, egal, ob diese ganz oder teilweise natürlich vorkommen, rekombinant erzeugt oder chemisch synthetisiert werden, wobei das Biomolekül ein Teil eines lebenden Organismus ist, war oder sein kann. Biologische Moleküle umfassen beispielsweise Nukleotide, Aminosäuren und Monosaccharide sowie oligomere und polymere Spezies, wie z. B. Oligonnukleoide und Polynukleotide, peptidische Moleküle, wie z. B. Oligopeptide, Polypeptide und Proteine, Saccharide, wie z. B. Disaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide, Mucopolysaccharide oder Peptidoglykane (Peptido-Polysaccharide) und dergleichen. Biomoleküle umfassen auch Antikörper, Ribosome, Enzyme, Enzykcofaktoren, extrazelluläre oder sekretierte Proteine, virale oder bakterielle Genprodukte, Pflanzenprodukte, Fermentierungsprodukte, Membranfragmente oder löslich gemachte Membranproteine, Gen- und Genom-Fragmente. Der Begriff „Biomolekül" soll auch Aggregate von biologischen Molekülen, wie z. B. Biomolekülkomplexe oder Abschnitte von Zellen oder Geweben umfassen. Beispiele von Abschnitten von Zellen umfassen beispielsweise zellulare Fragmente, intrazellulare Organellen und löslich gemachte Membranproteine, wobei die intrazellulären Organellen oder löslich gemachten Membranproteine beliebige Kofaktoren oder andere zugeordnete zelluläre Komponenten oder Membrankomponenten umfassen können, die zur vollständigen oder nativen Funktion notwendig sind. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, solche Präparierungen zu nutzen, die die zugeordneten Cofaktoren oder Komponenten ermangeln. Beispiele von Abschnitten von Geweben weisen beispielsweise exkretierte oder sekretierte Proteine oder Mucopolysaccharide, extrazelluläre Matrixproteine und Mucine auf, sind jedoch auf diese Beispiele beschränkt.

Es wird darauf hingewiesen, daß sich die hierin verwendeten Begriffe „Nucleosid" und „Nucleotid" auf Nucleoside und Nucleotide beziehen, die nicht nur die herkömmlichen Purin- und Pyrimidinbasen, d. h. Adenin (A), Thymin (T), Cytosin (C), Guanin (G) und Uracil (U), enthalten, sondern auch geschützte Formen derselben, z. B. bei denen die Base mit einer Schutzgruppe wie Acetyl, Difluoracetyl, Trifluoracetyl, Isobutyryl oder Benzol und Purin und Pyrimidinanaloge geschützt ist. Geeignete Analoge sind Fachleuten bekannt und sind in den einschlägigen Texten und Literaturen beschrieben. Übliche Analoge umfassen 1-Methyladenin, 2-Methyladenin, N6-Methyladenin, N6-Isopentyladenin, 2-Methylthio-N6-Isopentyladenin, N,N-Dimethyladenin, 8-Etromoadenin, 2-Thiocytosin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, 5-Ethylcytosin, 4-Acetylcytosin, 1-Methylguanin, 2-Methylguanin, 7-Methylguanin, 2,2-Dimethylguanin, 8-Bromoguanin, 8-Chloroguanin, 8-Aminoguanin, 8-Methylguanine, 8-Thioguanine, 5-Fluorouracil, 5-Bromouracil, 5-Chlorouracil, 5-Iodouracol, 5-Ethyluracil, 5-Propyluracil, 5-Methoxyuracil, 5-Hydroxymethyluracil, 5-(Carboxyhydroxymethyl)uracil, 5-(Methylaminomethyl)-uracil, 5-(Carboxymethylaminomethyl)-uracil, 2-Thiouracil, 5-Methyl-2-Thiouracil, 5-(2Bromovinyl)-Uracil, Uracil-5-Oxy-Ethansäure, Uracil-5-Oxy-Ethansäure-Methylester, Pseudouracil, 1-Methylpseudouracil, Queosin, Inosin, 1-Methyinosin, Hypoxanthin, Xanthin, 2-Aminopurin, 6-Hydroxyaminopurin, 6-Thiopucin und 2,6-Diaminopurin), sind jedoch nicht auf dieselben beschränkt. Zusätzlich umfassen die Begriffe „Nukleosid" und „Nucleotid" jene Anteile, die nicht nur herkömmliche Ribose- und Deoxyribosezucker, sondern auch andere Zucker enthalten. Modifizierte Nucleoside oder Nucleotide umfassen auch Modifizierungen am Zuckeranteil, z. B. wenn eine oder mehrere der Hydroxylgruppen durch Halogenatome oder aliphatische Gruppen ersetzt werden oder als Ether, Amine oder dergleichen funktionalisiert werden. Der hierin verwendete Begriff „Oligonucleotid" gilt als Oberbegriff für Polydeoxynucleotide (die 2-Deoxy-D-Ribose enthalten), für Polyribonucleotide (die D-Ribose enthalten), für einen beliebigen anderen Typ eines Polynucleotids, der ein N-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidinbase ist, und für andere Polymere, die nichtnucleotidische Hauptketten (z. B. PNAs) enthalten, unter der Voraussetzung, daß die Polymere Nucleobasen in einer Konfiguration enthalten, die eine Basenpaarung und Basenstapelung ermöglicht, wie sie bei der DNA oder RNA vorzufinden ist. Daher umfassen diese Begriffe beispielsweise bekannte Typen von Oligonucleotid-Modifizierungen, eine Ersetzung von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nucleotiden mit einem Analog, Internucleotid-Modifizierungen, wie beispielsweise jene mit ungeladenen Verknüpfungen (z. B. Methyl-Phosphonate, Phosphotriester, Phosphoramidate, Carbamate etc.), mit negativ geladenen Verknüpfungen (z. B. Phosphorothioate, Phosphorodithioate etc.) und mit positiv geladenen Verknüpfungen (z. Aminoalkylphosphoramidate, Aminoalkylphosphortriester), jene, die dazugehörige (angehängte) Anteile enthalten, wie z. B. Proteine (einschließlich Nucleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly-L-Lysine etc.), jene mit Interkalatoren (z. B. Acridin, Psoralen etc.), jene, die Chelatoren enthalten (z. B. Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxidative Metalle etc.). Es liegt keine gewollte Unterscheidung bezüglich der Länge der Begriffe „Polynucleotid" und „Oligonucleotid" vor, und diese Begriffe werden austauschbar verwendet. Diese Begriffe beziehen sich ausschließlich auf die primäre Struktur des Moleküls. Die hierin verwendeten Symbole für Nucleotide und Polynucleotide erfolgen gemäß den Empfehlungen der IUPACIUB Commission of Biochemical Nomenclature (Biochemistry 9: 4022, 1970).

Die Begriffe „Peptid", „Peptidyl" und „peptidisch", die in der gesamten Spezifikation und in den Ansprüchen verwendet werden, sollen eine beliebige Struktur umfassen, die aus zwei oder mehreren Aminosäuren besteht. Größtenteils weisen die Peptide, die in die vorliegenden Vorrichtungen eingeschlossen werden können, etwa 5 bis 10.000 Aminosäuren, vorzugsweise etwa 5 bis 1000 Aminosäuren, auf. Die Aminosäuren, die das gesamte oder einen Teil eines Peptids bilden, können eine beliebige von 20 herkömmlichen, natürlich vorkommenden Aminosäuren sein, d. h. Alanin (A), Cystein (C), Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E), Phenylalanin (F); Gylcin (G), Histidin (H), Isoleucin (I), Lysin (K), Leucin (L), Methionin (M), Asparagin (N), Prolin (P), Glutamin (Q), Arginin (R), Serin (S), Threonin (T), Valin (V), Tryptophan (W) und Tyrosin (Y). Eine beliebige der Aminosäuren in den peptidischen Molekülen, die die vorliegenden Vorrichtungen bilden, können durch eine nicht-herkömmliche Aminosäure ersetzt werden. Allgemein werden konservative Ersetzungen bevorzugt. Konservative Ersetzungen ersetzen die Originalaminosäure durch eine nicht-herkömmliche Aminosäure, die dem Original bezüglich einer oder mehrerer charakteristischer Eigenschaften ähnelt (z. B. Ladung, Hydrophobizität, sterisches Volumen; z. B. kann man Val durch Nval ersetzen). Der Begriff „nicht-herkömmliche Aminosäure" bezieht sich auf Aminosäuren mit Ausnahme von herkömmlichen Aminosäuren und umfaßt beispielsweise Isomere und Modifizierungen der herkömmlichen Aminosäuren (z. B. D-Aminosäuren), Nicht-Protein-Aminosäuren, posttranslationell modifizierte Aminosäuren, enzymatisch modifizierte Aminosäuren, Strukturelemente oder Strukturen, die für mimische Aminosäuren konzipiert sind (z. B. &agr;, &agr;-disubstituierte Aminosäuren, N-Alkyl-Aminosäuren, Milchsäure, ÿ-Alanin, Naphthylalanin, 3-Pyridalanin, 4-Hydroxyprolin, O-Phosphoserin, N-Acetylserin, N-Formylmethionin, 3-Methylhistidin, 5-Hydroxylysin und Nor-Leucin) und Peptide, die die natürlich vorkommende Amid-CONH-Verknüpfung aufweisen, die an einer oder mehreren Stellen innerhalb der Peptide-Hauptkette durch eine nicht-herkömmliche Verknüpfung, wie z. B. N-ersetztes Amid, Ester, Thioamid, Retropeptid(-NHCO-), Retrothioamid(-NHCS-), Sulfonamido(-SO2NH-) und/oder Peptoid-(N-ersetztes-Glycin-)Verknüpfungen ersetzt wurde. Dementsprechend umfassen die peptidischen Moleküle des Versuchs Pseudopeptide und Peptidomimetika. Die Peptide dieser Erfindung können a) natürlich vorkommen, b) durch chemische Synthese erzeugt werden, c) durch eine Rekombinations-DNA-Technologie erzeugt werden, d) durch biochemische oder enzymatische Fragmentierung von größeren Molekülen erzeugt werden, e) durch Verfahren infolge einer Kombination aus den Verfahren a) bis d), die vorstehend aufgelistet sind, erzeugt werden oder f) durch eine beliebige andere Einrichtung zum Erzeugen von Peptiden erzeugt werden.

Beispiele von verschiedenen Peptidylverbindungen umfassen folgende Verbindungen, sind jedoch nicht auf dieselben beschränkt:

Koagulationsmodulatoren umfassen &agr;1-Antitrypsin, &agr;2-Macroglobulin, Antithrombin-III, Faktor I (Fibrinogen), Faktor II (Gewebsprothrombin), Faktor III (Gewebs-Prothrombin), Faktor V (Proaccelerin), Faktor VII (Proconvertin), Faktor VIII (antihämophiles Globulin oder AHG), Faktor IX (Christmas-Faktor, Plasma-ThromboplastinKomponente oder PCT), Faktor X (Stuart-Prower-Faktor), Faktor XI (Plasma-Thromboplastin-Vorläufer oder PTA), Faktor XII (Hageman-Faktor), Heparin-Kofaktor-II, Kallikrein, Plasmin, Plasminogen, Prekallikrein, Protein C, Protein S, Thrombomodulin und Kombinationen aus denselben.

Zytokine umfassen transformierende Wachstumsfaktoren (TGFs), wie z. B. TGF-&bgr;1, TGF-&bgr;2 und TGF-&bgr;3, morphogenetische Knochenproteine (z. B. BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9), Heparinbindende Wachstumsfaktoren (z. B. Fibroblast-Wachstumsfaktor (FGF), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Plättchenwachstumsfaktor (PDGF), heparinbindender neutrophischer Faktor (HBNF) und insulinähnlicher Wachstumsfaktor (IGF)), bindegewebsaktivierte Peptide (CTAPs), osteogene Faktoren, den koloniestimulierenden Faktor, Interferone, einschließlich Interferon-&agr;, Interferon-&agr;2a, Interferon-&agr;2b, Interferon-&agr;-n3, Interferon-&bgr; und Interferon-y, Interleukine, einschließlich Interleukin-1, Interleukin-2, Interleukin-3, Interleukin-4, Interleukin-5, Interleukin6, Interleukin-7, Interleukin-8, Interleukin-9, Interleukin-10, Interleukin-11, Interleukin-12, Interleukin-13, Interleukin-14, Interleukin-15, Interleukin-16 und Interleukin-17, den Tumor-Nekrose-Faktor, den Tumor-Nekrose-Faktor-&agr;, den Granulozyt-koloniestimulierender-Faktor (G-CSF), den Granulozyt-Makrophagen-koloniestimulierender-Faktor (GM-CSF), den Makrophagen-koloniestimulierender-Faktor, Inhibine (z. B. Inhibin A und Inhibin B), Wachstumsdifferenzierungsfaktoren (z. B. GDF-1), Aktivine (z. B. Aktivin A, Aktivin B und Aktivin AB), Midkin (MD) und Thymopoietin, sind jedoch nicht auf dieselben beschränkt.

Endorphine sind Peptide, die Opiatrezeptoren aktivieren. Agonistische und antagonistische Derivative der natürlich vorkommenden Endorphine sind ebenfalls berücksichtigt. Repräsentative Beispiele von Endrophinen und pharmakologisch aktiven Endorphinderivativen umfassen Demorphin, Dynorphin &agr;-Endorphin, &bgr;-Endorphin, &ggr;-Endorphin, &sgr;-Endorphin [Leu5]Enkephalin, [Met5]Enkephalin, Substanz P und Kombinationen aus denselben.

Peptidylhormone umfassen Activin, Amylin, Angiotensin, Atrial-Natriuretic-Peptid (ANP), Calcitonin (gewonnen aus Hühnern, Aal, Mensch, Schwein, Ratte, Lachs etc.), calcitonin-genverwandtes Peptid, Calcitonin-N-Anschluß-flankierendes Peptid, Cholecystokinin (CCK), den ziliarneurotrophischen Faktor (CNTF), Corticotropin (Adrenocorticotropin-Hormon, ACTH), den Corticotropinfreisetzungsfaktor (CRF oder CRH), das follikelstimulierende Hormon (FSH), Gastrin, das Gastrinhemmpeptid (GIP), das gastrinfreisetzende Peptid, Glukagon, den Gonadotropinfreisetzungsfaktor (GnRF oder GNRH), den Wachstumshormonfreisetzungsfaktor (GRF, GRH), menschliches chorionisches Gonadotropin (hCH), Inhibin A, Inhibin B, Insulin (gewonnen aus Rind, Mensch, Schwein etc.), Leptin, Lipotropin (LPH), das luteinisierende Hormon (LH), luteinisierende hormonfreisetzendes Hormon (LHRH), Lypressin, das &agr;-melanocytstimulierende Hormon, das &bgr;-melanocytstimulierende Hormon, das &ggr;-melanocytstimulierende Hormon, Melatonin, Motilin, Oxytokin (Pitocin), das pankreatische Polypeptid, das Parathormon (PTH), Plazentalactogen, Prolactin (PRL), den Prolactinfreisetzungs-Hemmfaktor (PIF), den Prolactinfreisetzungsfaktor (PRF), Sekretin, Somatostatin, Somatotropin (Wachstumshormon, GH), Somatostatin (SIF, Wachstumshormonfreisetzungs-Hemmfaktor, GIF), Thyrotropin (thyreotropes Hormon, TSH), den Thyrotropinfreisetzungsfaktor (TRH oder TRF), Thyroxin, Triiodothyronin, das vasoaktive Intestinalpeptid (VIP) und Vasopressin (antidiuretisches Hormon, ADH), sind jedoch nicht auf dieselben beschränkt.

Speziell bevorzugte Analoge von LHRH umfassen Buserelin, Deslorelin, Fertirelin, Goserelin, Histrelin, Leuprolid (Leuprorelin), Lurelin, Nafarelin, Tryptorelin und Kombinationen aus denselben.

Kinine umfassen Bradykinin, Potentiator B, den Bradykinin-Potentiator C und Kallidin sowie Kombinationen aus denselben.

Enzyme umfassen Transferase, RNase, DNase, Telomerase, Ligase, Nuklease, Ribonuklease, Hydrogenase, Dehydrogenase, Aldase, Amidase, Aminotransferase, Amylase, Anhydrase, Apyrase, Arginase, Aspartase, Aspariginase, Karboxylase, Karboxypeptidase, Katalase, Zellulase, Cholinesterase, Acetylcholinesterase, Deaminase, Dextranase, Dusmutase, Elastase, Esterase, Fumarase, Glukosidase, Hexokinase, Isomerase, Invertase, Kinase, Lactase, Lipase, Lysozym, Malase, Naringinase, Oxidase, Osygenase, Papain, Pektinase, Peptidase, Pepsin, Peroxidase, Phosphodiesterase, Phosphotase, Protease, Reduktase, Transferase, Tyrosinase, Urase, Trypsin, Chymotrypsin, Hydrolasen, Isomerasen, Proteasen, Ligasen und Oxidoreduktasen such as Eserases, Phosphatasen, Glykosidasen und Peptidasen. Spezifische Beispiele von Enzymen umfassen Superoxid-Dismutase (SOD), den Gewebsplasminogen-Aktivator (TPA), Renin, Adenosin-Deaminase, Alpha-Glukocerebrosidase, Asparaginase, Dornase-Alpha, Hyaluronidase, Elastase, Trypsin, Thymidin-Kinase (TK), Tryptophan-Hydroxylase, Urokinase, Kallikrein, Bromelain, die Kathepsine B, D, G, C, Klostripain, Endoproteinase Arg C, Endoproteinase Asp N, Endoproteinase Glu C, Endoproteinase Lys C, Faktor Xa, Proteinase K, Subtilisin, Thermolysin, das Acyloaminosäurefreisetzungs-Enzym, Amonopeptidases, Carboxypeptidasen, Pyroglutamat-Aminopeptidase und Kombinationen aus denselben.

Enzyminhibitoren umfassen Leupeptin, Chymostatin, Pepstatin, Reninhemmer, Angiotensin Converting Enzyme-(ACE)-Hemmer und dergleichen.

Antikörper umfassen sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper sowie Antikörperfragmente, wie z. B. die F(af')2-, Fab-, Fv-, und Fc-Fragmente von monoklonalen Antikörpern.

Peptidyl-Arzneimittel: Peptidyl-Arzneimittel umfassen neben den vorstehend erwähnten Abarelix, Anakinra, Ancestim, Bivalirudin, Bleomycin, Bombesin, Desmopressin-Azetat, des-Q14-Ghrelin, Enterostatin, Erythropoeitin, Exendin-4, Filgrastim, Gonadorelin, Insulinotropin, Lepirudin, Magainin I, Magainin II, den Nervenwachstumsfaktor, Pentigetide, Thrombopoietin, Thymosin-&agr;-1, und Urotensin II und Kombinationen aus denselben.

V. Mikrofluidische Systeme:

Der Begriff „mikroanalytische Vorrichtung" bezieht sich auf eine Vorrichtung mit Merkmalen von Mikrometer- oder Submikrometerdimensionen, und die bei einer beliebigen Anzahl von chemischen Prozessen, die sehr geringe Beträge eines Fluids umfassen, verwendet werden können. Solche Prozesse umfassen eine Elektrophorese (z. B. CE oder MCE), eine Chromatographie (z. B. &mgr;LC), ein Sreening und eine Diagnostik (unter Verwendung von z. B. einer Hybridisierung oder anderen Bindungseinrichtungen) und eine chemische und biochemische Synthese (z. B. DNA-Verstärkung, die unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion oder „PRC" durchgeführt werden kann). Die Merkmale der mikroanalytischen Vorrichtung sind für die speziellen Verwendungszweck angepaßt. Zum Beispiel enthalten mikroanalytische Vorrichtungen, die bei Separationsprozessen, z. B. MCE, verwendet werden, Mikrokanäle (die hierin, falls vorhanden, als Mikrosäulen bezeichnet werden) in der Ordnung von 10 &mgr;m bis 80 &mgr;m im Durchmesser, typischerweise 10 &mgr;m bis 75 &mgr;m im Durchmesser, und näherungsweise 0,1 bis 50 cm in der Länge. Mikroanalytische Vorrichtungen, die in der chemischen und biochemischen Synthese verwendet werden, enthalten allgemein Reaktionszonen (die hierin, falls vorhanden, als „Reaktionskammern" bezeichnet werden, d. h. wiederum, wenn sich die Abdeckungsplatte an ihrem Platz auf der mikrokanalenthaltenden Substratoberfläche befindet), die ein Volumen von etwa 1 nl bis etwa 500 &mgr;l aufweisen, typischerweise etwa 10 &mgr;l bis etwa 200 &mgr;l, oder skaliert werden können, um Volumina von etwa 10 nl bis etwa 20 &mgr;l zu verwenden.

Der Begriff „mikrofluidische Vorrichtungen" bezieht sich auf zwei- und dreidimensionale mikroanalytische Vorrichtungen wie Mikroarrays (z. B. „Chips"), Mikrokanäle oder Mikrosäulen, die in der mitanhängigen US-Patentanmeldung Nr. 09/502.593 an Tso et al. und in den US-Patenten Nr. 6.194.900 an Freeman et al., 6.093.362 an Kaltenbach et al., 6.033.628 an Kaltenbach et al., 5.804.022 an Kaltenbach, 5.571.410 an Swedberg et al., 6.176.962 an Soane et al. und 6.103.199 an Soane et al. beschrieben sind.

Die mikrofluidische Struktur der vorliegenden Vorrichtung kann konzipiert sein, um eine Elektrophorese, Chromatographie, Elektrochromatographie, Kapillarchromatographie, Mikroreaktions-Hohlraumprozeduren, eine miniaturisierte Flüssigkeitskommunikation und Biosensorflußzellen zu nutzen, ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt. Die Reaktionshohlräume, die gemäß der Erfindung konstruiert sind, können beispielsweise für Verbindungsversuche oder für verschiedene Formen der Festphasensynthese, wie eine Peptid- oder Oligonukleotidsynthese, PCR, DNA-Festphasensequenzierungsreaktionen, um nur einige zu nennen, verwendet werden. Die Vorrichtungen können auch konzipiert sein, um mit verschiedenen analytischen Vorrichtungen und/oder Erfassungsvorrichtungen wie Massenspektrometer, Fluoreszenzdetektor, Fluoreszenzpolarisierung, Radioaktivitäts-, UV- oder sichtbare oder Infrarot-Spektroskopie oder einer beliebigen anderen Erfassungsvorrichtung schnittstellenmäßig verbunden zu sein, die bei nichtmikrofluidischen Systemen verwendet wird.

Der Begriff „Flüssigphasenanalyse" wird verwendet, um sich auf eine beliebige Analyse zu beziehen, die auf einem gelösten Stoff in der Flüssigphase ausgeführt wird. Dementsprechend umfaßt der hierin verwendete Begriff „Flüssigphasenanalyse" chromatographische Separationen, elektrophoretische Separationen und elektrochromatographische Separationen. Der allgemeine Begriff „Analyse" bezieht sich auf die Charakterisierung einer Probe oder Identifizierung von einer oder mehreren Komponenten in derselben und unterscheidet sich von einem chemischen oder biochemischen „Prozeß", bei dem ein Material chemisch oder biochemisch verändert wird, um ein gewünschtes Produkt zu erzeugen.

„Chromatographie" bezieht sich allgemein auf bevorzugte Separationen von Komponenten und umfaßt eine hydrophobische Umkehrphasenwechselwirkung, einen Ionenaustausch, eine Molekularsieb-Chromatographie und ähnliche Verfahren.

„Elektrophorese" bezieht sich auf die Migration von Partikeln oder Makromolekülen mit einer elektrischen Nettoladung, bei der die Migration durch ein elektrisches Feld beeinflußt wird. Folglich umfassen die elektrophoretischen Separationen Separationen, die in Säulen ausgeführt werden, die mit Gelen sowie Separationen bepackt sind, die in einer Lösung ausgeführt werden.

„Elektrochromatographie"-Separationen beziehen sich auf Separationen, die unter Verwendung einer Kombination aus elektrophoretischen und chromatographischen Techniken vorgenommen werden. Exemplarische elektrochromatographische Separationen umfassen bepackte Säulenseparationen unter Verwendung einer elektromotorischen Kraft (Knox et al. (1987) Chromatographia 24: 135; Knox et al. (1989) J. Liq. Chromatogr 12: 2435; Knox et al. (1991) Chromatographia 32: 317) und mizellare elektrophoretische Separationen (Terabe et al. (1985) Anal. Chem. 57: 834–841).

Zum Beispiel weist eine einfache mikrofluidische Vorrichtung folgende Merkmale auf:

ein Substrat mit ersten und zweiten im wesentlichen planar einander gegenüberliegenden Oberflächen mit einem Hohlraum und zumindest einem Mikrokanal, der in der ersten planaren Oberfläche gebildet ist, wobei der Hohlraum als eine Reaktionszone dient, die mit jedem Mikrokanal in Fluidkommunikation ist;

eine Abdeckungsplatte, die über der ersten planaren Oberfläche angeordnet ist, die in Kombination mit dem Hohlraum eine Reaktionskammer definiert, und mit jedem Mikrokanal eine Mikrosäule definiert; und

zumindest einen Einlaßport und zumindest einen Auslaßport, der direkt oder indirekt mit der Reaktionskammer kommuniziert, wodurch das Durchlaufen eines Fluids von einer externen Quelle innen durch die Reaktionskammer ermöglicht wird,

wobei das Substrat und die Abdeckungsplatte aus einem Material bestehen, das thermisch und chemisch stabil ist und gegen Bewuchs resistent ist.

Die mikrofluidischen Vorrichtungen liefern auch ein Konzept, bei dem ein Reaktionsfluid in die Reaktionskammer durch den Einlaßport eingeführt wird, entweder direkt oder indirekt (d. h. der Einlaßport kann in direkter Kommunikation mit der Reaktionskammer oder mit einem vorgeschalteten Mikrokanal, der in die Kammer einspeist, sein), wobei die gewünschte Reaktion in der Reaktionskammer durchgeführt und das Produkt der Reaktion nach dem Entfernen aus der Vorrichtung durch den Auslaßport gesammelt. Die Mikrokanäle, die bei einer Fluidkommunikation mit der Reaktionskammer vorhanden sind, können verwendet werden, und die Konzentration eines speziellen Analyts oder einer chemischen Komponente vor der Verarbeitung in der Reaktionskammer zu erhöhen, um potentiell störende Proben- oder Reaktionskomponenten zu entfernen, um eine präparative Verarbeitung vor der chemischen Verarbeitung in der Reaktionskammer durchzuführen und um das gewünschte Produkt zu isolieren und zu reinigen.

Eine Erfassungseinrichtung, d. h. eine beliebige Einrichtung, Struktur oder Konfiguration, die einem ermöglicht, eine Probe innerhalb einer mikroanalytischen Vorrichtung unter Verwendung von analytischen Erfassungstechniken abzufragen, kann auch in die mikrofluidische Vorrichtung eingebaut oder mit derselben wirksam verbunden sein. So kann eine Erfassungseinrichtung eine oder mehrere Öffnungen aufweisen, die z. B. mit einer Reaktionskammer oder einem Mikrokanal kommunizieren, und einer externen Erfassungsvorrichtung ermöglichen, mit der Kammer oder dem Mikrokanal schnittstellenmäßig verbunden sein, um darin einen Analyt zu erfassen. Durch die Anordnung von zwei Erfassungseinrichtungen entgegengesetzt zueinander, relativ zur Reaktionskammer oder dergleichen, wird ein „Erfassungsweg" gebildet, wodurch die Erfassung von Analyten, die die Reaktionskammer durchlaufen, unter Verwendung von in der Technik hinreichend bekannten Erfassungstechniken ermöglicht wird. Ein „optischer Erfassungsweg" bezieht sich auf eine Konfiguration oder Anordnung von Erfassungseinrichtungen, um einen Weg zu bilden, wodurch die elektromagnetische Strahlung von einer externen Quelle zu einer Einrichtung zum Empfangen der Strahlung gelangen kann, wobei die Strahlung die Reaktionskammer, den Mikrokanal oder dergleichen durchquert. Bei dieser Konfiguration können Analyte, die die mikroanalytische Vorrichtung durchlaufen, über eine Übertragung der Strahlung orthogonal zur Richtung des Fluidflusses erfaßt werden. Eine Vielzahl von externen optischen Erfassungstechniken kann ohne weiteres mit den vorliegenden mikroanalytischen Vorrichtungen schnittstellenmäßig verbunden werden, die UV-/sichtbare, Nah-Infrarot-, Fluoreszenz-, RI-(RI = refractive index = Brechungsindex) und Ramantechniken umfassen, jedoch nicht auf dieselben beschränkt sind.

Zusätzliche Erfassungseinrichtungen und diagnostische Einrichtungen können entweder neben den optischen Techniken, die vorstehend erörtert sind, oder als eine alternative Einrichtung zur Erfassung und Analyse eingesetzt werden.

Zum Beispiel kann eine Erfassung unter Verwendung der Massenspektrometrie oder Konduktanz oder thermischen Leitfähigkeit eingesetzt werden. Ein bestimmter Teil der Analyte kann vom Hauptflußweg zur Erfassungseinrichtung umgeleitet werden, oder der gesamte Teil der Analyte kann direkt in die Erfassungseinrichtung fließen.

Die Mikrovorrichtungen können für einen beliebigen speziellen Versuch spezifisch gefertigt werden. Es ist beispielsweise kein spezielles Enzym, Antikörper oder Rezeptor erforderlich, damit diese Vorrichtungen funktionieren. Ferner sind mehrere Wege möglich, um Versuche und Analysen parallel auszuführen und dadurch Zeit zu sparen. Zusätzlich sind die Vorrichtungen wiederverwendbar. Die Lösungsmittelbedingungen können so verändert werden, daß sie Reaktanzen aus dem Äquilibrierungsbett, falls dies gewünscht ist, freigesetzt werden, z. B. wie in Anal. Chem. (2001) Band 73, Nr. 11, Seite 2461 beschrieben ist. Daher können die Vorrichtungen verwendet werden, um Liganden zu trennen und zu erfassen, die nicht mit einem Rezeptor oder einem Enzym in Wechselwirkung treten, und zu einem späteren Zeitpunkt können die gebundenen Liganden von dem Rezeptor oder dem Enzym beispielsweise dissoziiert und analysiert werden.

VI. Anwendungsverfahren:

Die vorliegende Erfindung sieht ferner Verfahren zur Verwendung der vorstehend beschriebenen biomolekülhaltigen Silikatmatrizen als ein Verpackungsmaterial für Mikrokanäle und Mikrosäulen in mikrofluidischen Vorrichtungen vor. Das Sol-Gel kann zu einem speziellen Material gebildet werden, indem beispielsweise das Gel zertrümmert wird, was zur Bildung von Partikeln wie z. B. Perlen führt, die dann in die mikrofluidischen Vorrichtungen, die hierin beschrieben sind, eingebaut werden können. Vorzugsweise weisen die Perlen einen Durchmesser von etwa 10 &mgr;m bis etwa 80 &mgr;m auf.

Die vorliegende Erfindung sieht ferner Verfahren zum Ausführen eines Hochdurchsatz-Screenings unter Verwendung der biomolekülhaltigen Matrizen vor. Zum Beispiel kann die Erfindung in Verbindung mit Verfahren zum Ausführen einer enzymatischen Katalyse oder zum Rezeptorbinden unter Verwendung von silikatimmobilisierten Enzymen und Rezeptoren verwendet werden. Speziell schafft die vorliegende Erfindung ein Format, das die Entsprechung zwischen der Porengröße der Matrix und der Molekulargröße der verwendeten Reagenzien und/oder den potentiellen Substraten, die getestet werden sollen, sicherstellt. Die eingeschlossenen Biomoleküle werden aufgrund der Porengröße der Sol-Gel-Matrix nicht ausgelaugt. Die Substrate, Reaktanten, Liganden und dergleichen können jedoch in die Poren der Sol-Gel-Matrix diffundieren und einen Zugriff auf das eingeschlossene Biomolekül erhalten und mit den aktiven Stellen oder Ligandenbindungsstellen beispielsweise des Biomoleküls interagieren. Speziell schafft die Erfindung Verfahren für ein Hochdurchsatzverfahren unter Verwendung von kleinen Reaktanten einer Molekulargröße mit Molekulargewichten von weniger als etwa 3000 Da. Die beanspruchte Erfindung schafft eine Übereinstimmung zwischen der Porengröße und der Reaktantengröße. Die silikateingeschlossenen Biomoleküle sind ein ideales Medium zum Erreichen von Digerierungen am Einsatzort, und eine Vorrichtung, die die Biomoleküle umfaßt ist, angepaßt für Hochdurchsatzprozeduren. Daher sind die Vorrichtungen und Verfahren, die hierin beschrieben sind, für die Hochdurchsatzprozeduren ideal, die beispielsweise in der pharmazeutischen, biotechnologischen, landwirtschaftlichen und chemischen Industrie oder für ein beliebiges anderes Unterfangen verwendet werden, bei dem die eingeschlossenen Biomoleküle während des Prozesses oder auf der Vorrichtung für Versuche oder zur Rausch- und Arzneimittelentdeckung verwendet werden könnten.

Die Biomoleküle können ein beliebiges der Biomoleküle, die in Abschnitt IV beschrieben sind, umfassen. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsbeispielen ist das Protein oder Fragment derselben ein Enzym oder eine aktive Verbindung, die aus der Gruppe bestehend aus RNase, DNase, Telomerase, Ligase, Nuklease, Ribonuklease, Hydrogenase, Dehydrogenase-Aldase-Amidase, Aminotransferase, Amylase, Anhydrase, Apyrase, Arginase, Aspartase, Aspariginase, Karboxylase, Karboxypeptidase, Katalase, Cellulase, Cholinesterase, Acetylcholinesterase, Deaminase, Dextranase, Dismutase, Elastase, Esterase, Fumarase, Glukosidase, Hexokinase, Isomerase, Invertase, Kinase, Lactase, Lipase, Lysozym, Malase, Naringinase, Oxidase, Oxygenase, Papain, Pektidase, Peptidase, Pepsin, Peroxidase, Phosphodiesterase, Phosphatase, Protease, Reduktase, Transferase, Tyrosinase, Urease, Trypsin, Chymotrypsin und Kombinationen aus denselben ausgewählt sind, jedoch nicht auf dieselben beschränkt sind.

Zusätzlich berücksichtigt die Erfindung die Verwendung eines Sol-Gels, das ein aktives biologisches Material aufweist, das in demselben eingeschlossen ist, um eine Testsubstanz quantitativ oder qualitativ zu erfassen, die mit dem eingeschlossenen aktiven biologischen Material reagiert oder dessen Reaktion durch dasselbe katalysiert wird. Das Sol-Gel kann daher zum Binden von Versuchen oder als ein Sensor verwendet werden oder kann einschränkungslos bei Drogenmetabolismusuntersuchungen verwendet werden.

Es wird ebenfalls ein Verfahren für die quantitative oder qualitative Erfassung einer Testsubstanz geschaffen, die mit einem aktiven biologischen Material reagiert oder dessen Reaktion durch dasselbe katalysiert wird, wobei das biologische Material in einem Sol-Gel eingeschlossen wird, und wobei das Sol-Gel eine poröse, anorganische Matrix aufweist, die durch das folgende Verfahren präpariert wird: a) Präparieren des Sol-Gels, das das aktive biologische Molekül aufweist, das in einer porösen, anorganischen Matrix eingeschlossen ist, b) Bringen des biologisches-molekülhaltigen Sol-Gels in Kontakt mit einem Gas oder einer wäßrigen Lösung, die die Testsubstanz aufweist und c) quantitatives oder qualitatives Erfassen, Beobachten oder Messen der Veränderung bei einer oder mehreren optischen Charakteristika des biologischen Materials, das in dem Sol-Gel eingeschlossen ist.

Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Umwandlung von Versuchen in ein Mikrovorrichtungsformat, bei dem ein Biomolekül in eine anorganische Glasmatrix eingeschlossen ist und die Matrix in die Vorrichtung eingebaut ist. Bei bevorzugten Ausführungsbeispielen wird das Biomolekül, das in der anorganischen Glasmatrix eingeschlossen ist, in einer Kammer innerhalb der Vorrichtung plaziert, um Mikrokanäle oder Mikrosäulen zu erzeugen.

Bei einem Ausführungsbeispiel werden die Reaktanten von geringem Molekulargewicht gegenüber diesen Mikrokanälen oder Mikrosäulen äquilibriert, und die Reaktanten setzen dann das Verfahren durch einen chromatographischen Reinigungs- und Separationsschritt fort. Die Ausgabe des chromatographischen Schritts wird einem Massenspektrometer als der Detektor zugeführt, so daß die Erfassung relativ kleine Massen involviert. Optional kann die Entfaltungssoftware in das System eingebaut sein, um größere oder komplexere Strukturen aufzulösen. Ein Vorteil dieses Ausführungsbeispiels der Erfindung ist jedoch, daß die Reaktanten mit einem geringen Molekulargewicht keine Entfaltung erfordern, und daß die Ligandenbindung mit der größten Affinität gegenüber dem eingeschlossenen Biomolekül ohne weiteres durch seine Abwesenheit offenkundig wird. Da auch die Reaktanten mit einem geringen Molekulargewicht unter Verwendung einer Massenspektrometrie analysiert werden, können sehr kleine Differenzen im Molekulargewicht der Reaktanten erfaßt werden, und der gesamte Versuch wird daher sensitiver gemacht. Zum Beispiel können die Liganden im Massenspektrometer unterschieden werden, die Massen mit nur 1 amu Unterschied aufweisen. Schließlich kann das eingeschlossene Biomolekül den gebundenen Reaktanten oder Liganden mit geringem Molekulargewicht freigeben, und seine Identität kann direkt bestimmt werden, um die Ergebnisse zu verifizieren, die aus der Analyse der elutierten Liganden abgeleitet wurden.

Sol-Gele sind speziell zur Verwendung bei mikrofluidischen Vorrichtungen geeignet und bieten gegenüber derzeit erhältlichen Technologien zum Immobilisieren von Biomolekülen zur Verwendung in solchen Vorrichtungen und Prozessen beträchtliche Vorteile. Wenn die immobilisierten Biomoleküle für ein Mikroformat angepaßt sind, wird die Geschwindigkeit der Versuche oder Reaktionen in bezug auf herkömmliche Versuche im wesentlichen beschleunigt. Es ist nur ein minimaler Betrag von Reagenzien erforderlich, und es besteht gegenüber den Sol-Gel-Mikrokanälen und Mikrosäulen eine minimale Diffusionszeit zur Äquilibrierung. Daher ist die Kinetik aller Aspekte der Reaktion schneller, wenn sie auf die Mikroformatskala verkleinert wird.

Beim Praktizieren der vorliegenden Erfindung werden, wenn nichts Gegenteiliges angegeben ist, herkömmliche Techniken der organischen Chemie, Polymerchemie, Silikatchemie, Biochemie und dergleichen angewendet, die sich im Rahmen der Fachkenntnisse der Technik bewegen. Solche Techniken sind in der Fachliteratur ausführlich erörtert. Alle Patente, Patentanmeldungen und Veröffentlichungen, die hierin, vorstehend als auch nachstehend, erwähnt sind, werden hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.

Es wird darauf hingewiesen, daß, obwohl die Erfindung in Verbindung mit den bevorzugten spezifischen Ausführungsbeispielen derselben beschrieben worden ist, die vorstehende Beschreibung sowie das Beispiel, das nun folgt, den Schutzbereich der Erfindung veranschaulichen und nicht einschränken soll. Andere Aspekte, Vorteile und Modifizierungen innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung werden Fachleuten für die Technik, auf die sich die Erfindung bezieht, offenkundig.

Im nachstehenden Beispiel sind Versuche unternommen worden, um eine Genauigkeit im Hinblick auf die Zahlen, die verwendet wurden (z. B. Mengen, Temperatur etc.), sicherzustellen, jedoch sollte gewisse experimentelle Fehler und Abweichungen berücksichtigt werden. Wenn nichts Gegenteiliges angegeben ist, ist die Temperatur in Grad Celsius und der Druck bei oder nahe atmosphärischem Druck angegeben. Alle Lösungsmittel wurden als HPLC-Grad erworben, und alle Reaktionen wurden routinemäßig unter einer inerten Atmosphäre aus Argon durchgeführt, es sei denn es ist Gegenteiliges angegeben. Alle kapillaren Elektrophoresen wurden mit einem Laufpuffer von 50 mM Phosphat, pH 2,5 durchgeführt. Alle chromatographischen Separationen wurden unter Verwendung einer Umkehrphasen-HPLC gegenüber einer C-18 stationären Phase und bei einer mobilen Phase von zunehmenden Prozentsätzen von Acetonitril oder Methanol in Wasser mit 0,1%-iger Trifluor-acetischen Säure durchgeführt, es sei denn es ist Gegenteiliges angegeben. Wenn nichts Gegenteiliges angegeben ist, wurden die verwendeten Reagenzien aus den folgenden Quellen erworben: Silane von Petrarch Systems, Inc., Bristol, Pa „ organische Reagenzien einschließlich Amine von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis., Gase von Matheson, Seacaucus, N.J.

BEISPIEL

Die Konzentrationsangaben "mM und M" beziehen sich auf mMolle und Molle.

(a) Präparation von Sol-Gel mit eingeschlossenen Trypsin:

Deionisiertes Wasser (,169 g), 0,110 ml 0,04 M HCl und 7,39 ml (7,6 g) Tetramethylorthosilikat (TMOS) wurden in einem verschließbaren Reagenzglas kombiniert und in einem Eisbad für 30 Minuten beschallt. Aliquote Anteile dieser Lösung (1,5 ml) wurden mit 1 ml Trypsin (2 mM in Ammoniumbikarbonat-Puffer, pH 8,1) gemischt und in Wegwerfküvetten plaziert, um zu altern und auszuheilen. Die Lösung wurde mit der Zugabe milchig und wurde innerhalb von 30 bis 40 Sekunden zu einem Gel. Ein kontinuierliches Altern trat bei 4°C für zwei Wochen auf. Das Gel wurde zweimal täglich mit der Pufferlösung während der zweiwöchigen Alterungsperiode gespült. Nach dem Alterungsprozeß wurde das Gel zu einem Pulver zermahlen und unter einem Phosphatpuffer (pH 2,5) bis zur Verwendung im Kühlschrank gelagert.

Das eingeschlossene Trypsin-Sol-Gel wurde auf Trypsinaktivität unter Verwendung von verschiedenen Proteinen als Substrate getestet. Die folgenden wurden vollständig unter Verwendung von 10 mg des im Sol-Gel eingeschlossenen Trypsins digeriert: Bombesin (Molekulargewicht 1619 Da), 1 Minute bei Raumtemperatur, Insulin B-Kette (Molekulargewicht 3500 Da) 10 Minuten bei Raumtemperatur, Neurotensin (Molekulargewicht 1700 Da) 1 Stunde bei 37°C, Calcitonin (Molekulargewicht 3000 Da) 18 Stunden bei 37°C und Cytochrom C (Molekulargewicht 13000 Da), 18 Stunden, 37°C.

Wie in 2 gezeigt ist, waren sich die chromatographischen Muster für Cytochrom C, das mit dem Trypsin-Sol-Gel und Trypsin in einer Lösung bei 37°C einen identischen Zeitraum lang digeriert wurde, sehr ähnlich, was andeutet, daß das eingeschlossene Trypsin seine Aktivität und Substratspezifität beibehalten hat.

Desgleichen zeigt 3, daß selbst eine einminütige Exposition mit Trypsin-Sol-Gel ausreichend lang war, um Bombesin, wie durch die CE-Elektrophoregramme vor und nach der Exposition gezeigt ist, zu digerieren.

4 und 5 zeigen, daß das Trypsin-Sol-Gel stabil ist und viele Male ohne einen offensichtlichen Verlust der Enzymaktivität wiederverwendet werden kann: zumindest 85% der Aktivität wird nach 20-maliger Wiederverwendung des Trypsin-Sol-Gels beibehalten.

(b) Mikrovorrichtungskonzept:

Die Entwürfe für ein typisches Mikroversuchgerät sind in der mitanhängigen US-Patentanmeldung Seriennr. 09/502.593 an Tso et al. und in der US-Patentanmeldung Nr. 6.194.900 an Freeman et al., 6.903.362 an Kaltenbach et al., 6.033.628 an Kaltenbach et al., 5.804.022 an Kaltenbach und 5.571.410 an Swedberg et al. gezeigt und beschrieben. Die Mikrokanäle, Mikrosäulen und/oder Mikrokammern einer beliebigen dieser Vorrichtungen sind mit einem wäßrigen Schlamm aus Partikeln des Sol-Gel-Materials, das das Trypsin enthält, gefüllt. Musteranalyten dürfen durch die Sol-Gel-Kammer fließen und unter Verwendung eines Massenspektrometers bei einer Probeneinführung durch Elektrospray analysiert werden.


Anspruch[de]
Verfahren zum Immobilisieren eines biologischen Moleküls in einer porösen anorganischen Matrix, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:

Bilden einer wäßrigen Zusammensetzung, die ein Keramikoxid-Kolloidsol aufweist, das mit einer gesäuerten Oxidsalzlösung gemischt ist;

Hinzufügen einer Menge des biologischen Moleküls in einer physiologisch akzeptablen gepufferten Lösung zu der Komposition, wobei die wäßrige Komposition bei einer Umwandlung in eine polymerisierende Hydroxidlösung dickflüssig wird und sich in ein Gel verwandelt;

Formen des Gels in eine endgültigen Form;

Altern des Gels;

wobei das biologische Molekül in Poren des Gels eingeschlossen wird, und die Aktivität des biologischen Moleküls beibehalten wird;

Zertrümmern des gealterten Gels in Partikel mit einem Durchmesser zwischen etwa 10 &mgr;m und etwa 80 &mgr;m; und

Einbauen des zertrümmerten gealterten Gels in eine mikroanalytische Vorrichtung.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Gel etwa zwei Wochen lang gealtert wird. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem das Gel bei einer Temperatur von etwa 4°C bis etwa 40°C gealtert wird. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der pH-Wert der Mischung nach dem Hinzufügen des biologischen Moleküls etwa zwischen 6,0 und etwa 8,5 ist. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem der pH-Wert der Mischung nach dem Hinzufügen des biologischen Moleküls zwischen etwa 4,0 und etwa 7,0 ist. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der pH-Wert der Mischung nach dem Hinzufügen des biologischen Moleküls zwischen etwa 7,0 und 9,0 ist. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem die wässrige Zusammensetzung das Keramikoxid-Kolloidsol und ein aufgelöstes Metallsilikat aufweist. Verfahren zum Immobilisieren eines biologischen Moleküls in einer porösen anorganischen Matrix, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: B

ilden einer wäßrigen Zusammensetzung, die ein Tetraalkyl-Orthosilikat und ein Silan, das durch eine C8-C24-Alkylgruppe und durch zumindest zwei verlassende Gruppen ersetzt wird, die aus der Gruppe bestehend aus OR und Halo ausgewählt werden, gemischt mit einer gesäuerten Oxidsalzlösung, aufweist;

Hinzufügen einer Menge des biologischen Materials in einer physiologisch akzeptablen gepufferten Lösung zu der Zusammensetzung, wobei die resultierende wäßrige Zusammensetzung einen pH-Wert aufweist, der von etwa 6 bis etwa 8,5 reicht, wobei die wäßrige Zusammensetzung bei einer Umwandlung in eine polymerisierende Hydroxidlösung dickflüssig wird und sich in ein Gel umwandelt;

Formen des Gels in eine endgültige Form; und

Altern des Gels;

wobei das biologische Molekül in den Poren des Gels eingeschlossen ist und die Aktivität des biologischen Moleküls beibehalten wird, wobei die anorganische poröse Matrix an Ort und Stelle in oder auf der mikroanalytischen Vorrichtung gebildet wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem das Gel aus einem Kolloid-Silikasol und einem aufgelösten Metallsilikat besteht. Verfahren gemäß Anspruch 9, bei dem das Metallsilikat ein Natriumsilikat ist. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10, bei dem das Sol ein Tetraalkyl-Orthosilikat und ein Silan aufweist, das durch zumindest zwei verlassende Gruppen ersetzt wird, die aus der Gruppe bestehend aus OR und Halo ausgewählt werden. Verfahren gemäß Anspruch 11, bei dem das Silan durch eine C8-C24-Alkylgruppe ersetzt wird. Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem die Alkylgruppe C18 ist. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 und 11 bis 13, bei dem das Tetraalkyl-Orthosilikat aus der Gruppe bestehend aus einem Tetra-Ethyl-Orthosilikat (TEOS), einem Tetra-Methyl-Orthosilikat (TMOS) und Kombinationen aus denselben ausgewählt wird. Verfahren gemäß Anspruch 8, das ferner ein Zertrümmern des Gels in Partikel aufweist. Verfahren gemäß Anspruch 15, bei dem die zertrümmerten Gelpartikel zwischen etwa 10 &mgr;m und etwa 80 &mgr;m Durchmesser aufweisen. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, bei dem die Partikelgröße des Keramikoxid-Kolloidsols ausgewählt wird, um Poren zu erzeugen, wenn das Gel gealtert wird, wobei die Poren einen Durchmesser aufweisen, der näherungsweise mit dem Durchmesser des biologischen Moleküls, das eingeschlossen werden soll, identisch ist. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, bei dem das erzeugte Gel in Formen geformt wird, die aus der Gruppe bestehend aus einem monolithischen Gel, einem Dünnfilm oder einer Faser ausgewählt werden. Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18, bei dem die Poren einen Durchschnittsdurchmesser aufweisen, der von etwa 1 nm bis etwa 100 nm reicht. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19, bei dem die Poren einen Durchschnittsdurchmesser aufweisen, der von etwa 2 nm bis etwa 50 nm reicht. Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18, bei dem der Durchmesser der Poren kleiner als der Durchmesser des eingeschlossenen Biomoleküls ist. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 21, bei dem Moleküle, die eine Masse von 3000 Da oder weniger aufweisen, durch die Poren diffundieren können. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 21, bei dem Moleküle, die eine Masse von 5000 Da oder weniger aufweisen, durch die Poren diffundieren können. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 21, bei dem Moleküle, die eine Masse von 10000 Da oder weniger aufweisen, durch die Poren diffundieren können. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 21, bei dem die Moleküle, die eine Masse von 15000 Da oder weniger aufweisen, durch die Poren diffundieren können. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 25, bei dem das biologische Molekül aus der Gruppe bestehend aus Polynucleotiden, Enzymen, Antikörpern, Koagulationsmodulatoren, Cytokinen, Endorphinen, Peptidylhormonen, Kininen, Rezeptoren, Genen, Genfragmenten, Zellfragmenten, Membranfragmenten und löslich gemachten Membranproteinen ausgewählt wird. Verfahren gemäß Anspruch 26, bei dem das biologische Molekül ein Enzym ist, wobei das Enzym aus der Gruppe bestehend aus RNase, DNase, Tolomerase, Lipase, Nuklease, Ribonuklease, Hydrogenase, Dehydrogenase, Aldase, Amidase, Aminotransferase, Amylase, Anhydrase, Apyrase, Arginase, Aspartase, Aspariginase, Karboxylase, Karboxypeptidase, Katalase, Cellulase, Cholinesterase, Acetylcholinesterase, Deaminase, Dextranase, Dismutase, Elastase, Esterase, Fumarase, Glukosidase, Hexokinase, Isomerase, Invertase, Kinase, Laktase, Lipase, Lysozym, Malase, Naringinase, Oxidase, Oxygenase, Papain, Pektinase, Peptidase, Pepsin, Peroxidase, Phosphodiesterase, Phosphotase, Protease, Reduktase, Transferase, Tyrosinase, Urase, Trypsin, Chymotrypsin, Hydrolasen, Isomerasen, Proteasen, Ligasen und Oxidoreduktasen insbesondere Esterasen, Phosphatasen, Glykosidasen and Peptidasen, Superoxid-Dismutase (SOD), Gewebsplasminogen-Aktivator (TPA), Renin, Adenosin-Deaminase, Alpha-Glucocerebrosidase, Asparaginase, Dornase-Alpha, Hyaluronidase, Elastase, Trypsin, Thymidin-Kinase (TK), Tryptophan-Hydroxylase, Urokinase, Kallikrein, Bromelain, Cathepsine B, D, G, C, Klostripain, Endoproteinase Arg C, Endoproteinase Asp N, Endoproteinase Glu C, Endoproteinase Lys C, Faktor Xa, Proteinase K, Subtilisin, Thermolysin, Acyloaminosäurefreisetzungsenzym, Aminopeptidasen, Karboxypeptidasen und Pyroglutamat-Aminopeptidasn ausgewählt wird. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27, bei dem die Partikelgröße des Kolloid-Sols etwa 1 nm bis etwa 30 nm ist. Verfahren zum Präparieren einer mikroanalytischen Vorrichtung, das ein Bilden eines Sol-Gels, das ein eingeschlossenes biologisches Molekül aufweist, ein Zertrümmern des Sol-Gels in Partikel mit einem Durchmesser von etwa 10 &mgr;m zu etwa 80 &mgr;m und ein Bilden der Sol-Gel-Partikel in ein Bett in der mikroanalytischen Vorrichtung oder auf der Oberfläche der mikroanalytischen Vorrichtung aufweist. Verfahren zum Präparieren einer mikroanalytischen Vorrichtung, das ein Bilden eines Sol-Gels aufweist, das ein eingeschlossenes biologisches Molekül aufweist, wobei die Form des Sol-Gels aus der Gruppe bestehend aus einem monolithischen Gel, einem Dünnfilm oder einer Faser ausgewählt wird und wobei das Sol-Gel gealtert und in Partikel mit einem Durchmesser zwischen etwa 10 &mgr;m und etwa 80 &mgr;m zertrümmert wird und in die oder auf die mikroanalytische Vorrichtung plaziert wird. Verfahren zum Verwenden einer mikroanalytischen Vorrichtung, die ein Sol-Gel aufweist, das ein eingeschlossenes biologisches Molekül aufweist, wobei das Sol-Gel gealtert und in Partikel mit einem Durchmesser zwischen etwa 10 &mgr;m und etwa 80 &mgr;m zertrümmert ist, und das das Bilden des Sol-Gels in ein Bett in der mikroanalytischen Vorrichtung, ein Anwenden einer Analytenprobe auf das Bett und ein Analysieren des Eluenten von dem Bett aufweist. Verfahren nach Anspruch 31, das ferner ein Anwenden einer zusätzlichen Pufferlösung auf das Bett zwischen dem Anwenden einer Analytenprobe und dem Analysieren des Eluenten aufweist. Verfahren gemäß Anspruch 29 oder 30, bei dem das Bett auf der mikroanalytischen Vorrichtung in der Form einer Mikrosäule oder eines Mikrokanals ist. Verfahren gemäß Anspruch 29 oder 30, bei dem das Bett auf der mikroanalytischen Vorrichtung in der Form eines Mikroarrays ist. Verfahren gemäß Anspruch 31 oder 32, bei dem der Eluent unter Verwendung einer Massenspektrometrie analysiert wird. Verfahren gemäß Anspruch 31 oder 32, bei dem der Eluent unter Verwendung einer Mikro- oder Kapillar-Elektrophorese analysiert wird. Verfahren gemäß Anspruch 31 oder 32, bei dem die Interaktion von einer beliebigen Komponente in der Probe mit dem eingeschlossenen biologischen Molekül in dem Sol-Gel unter Verwendung eines Verfahrens gemessen wird, das aus der Gruppe bestehend aus UV-/Sichtbar-, Nah-Infrarot-, Fluoreszenz-, Brechungsindex-(RI-) und Raman-Spektroskopien ausgewählt wird. Verfahren gemäß Anspruch 31 oder 32, das ferner ein Waschen des Sol-Gels mit einer Lösung aufweist, um die Analyten aus dem Sol-Gel zu eluieren und die Analyten zu analysieren. Verfahren gemäß Anspruch 38, bei dem die Analyten unter Verwendung einer Massenspektrometrie analysiert werden. Verfahren gemäß Anspruch 38, bei dem die Analyten unter Verwendung eines Verfahrens analysiert werden, das aus der Gruppe bestehend aus UV-/Sichtbar-, Nah-Infrarot-, Fluoreszenz-, Brechungsindex-(RI-) und Raman-Spektroskopie ausgewählt wird. Verfahren gemäß Anspruch 29, bei dem die mikroanalytische Vorrichtung durch ein Verfahren hergestellt wird, das aus der Gruppe bestehend aus einer Siliziummikrobearbeitung, einer Mikrolithographie, einem Formen und einem Ätzen ausgewählt wird. Mikroanalytische Vorrichtung, die aus einem Substrat und zumindest einem Merkmal besteht, das aus Mikrokanälen, Mikrosäulen und Kombinationen aus denselben ausgewählt wird, bei der zertrümmerte Partikel aus Sol-Gel mit einem biologischen Molekül, das in demselben eingeschlossen ist, mit einem Durchmesser von etwa 10 &mgr;m bis etwa 80 &mgr;m in das zumindest eine Merkmal eingebaut sind. Mikroanalytische Vorrichtung gemäß Anspruch 42, die zum Ausführen eines Hochdurchsatz-Screenings von Proben angepaßt ist.






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