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Dokumentenidentifikation DE60029229T2 28.06.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001210373
Titel ARTVERWANDTE-UNABHÄNGIGER NACHWEIS VON MICROCYSTIN- UND NODULARIN-ARTVERWANDTEN
Anmelder The Regents of the University of California, Oakland, Calif., US;
New Zealand Agricultural Research Institute Ltd., Hamilton, NZ;
Dietrich, Daniel R., Neuwilen, CH
Erfinder DIETRICH, R., Daniel, CH-8566 Neuwilen, CH;
FISCHER, Werner, CH-1066 Epalinges, CH;
CHAMBERLIN, Richard, A., Irvine, CA 92612, US;
AGGEN, B., James, San Francisco, CA 94109, US;
GARTHWAITE, Ian, Hamilton, NZ;
MILES, Christopher O., 0495 Oslo, NO;
ROSS, M., Kathryn, Hamilton, NZ;
TOWERS, R, Neale, Hillcrest, Hamilton, NZ
Vertreter Müller-Boré & Partner, Patentanwälte, European Patent Attorneys, 81671 München
DE-Aktenzeichen 60029229
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 06.09.2000
EP-Aktenzeichen 009565193
WO-Anmeldetag 06.09.2000
PCT-Aktenzeichen PCT/EP00/08711
WO-Veröffentlichungsnummer 2001018059
WO-Veröffentlichungsdatum 15.03.2001
EP-Offenlegungsdatum 05.06.2002
EP date of grant 05.07.2006
Veröffentlichungstag der Übersetzung europäischer Ansprüche 26.06.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 28.06.2007
IPC-Hauptklasse C07K 16/12(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse G01N 33/577(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   G01N 33/68(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07K 17/02(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07K 1/22(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der an alle Kongenere von cyanobakteriellen Hepatotoxinen bindet, umfassend die Schritte des Herstellens eines ADDA-Haptens, bestehend aus Formel (I) welches Teil einer Gruppe von Giften ist, die von verschiedenen Cyanobakterien stammen, einen Antikörper, der durch Immunisieren eines nicht-menschlichen Tieres mit einem ADDA-Hapten mit der Formel (I) erhalten wird, und ein diagnostischer Kit, der den Antikörper enthält.

Aufgrund zunehmender Besiedlung, Industrialisierung und intensiver Landwirtschaft sind weit verbreitete Probleme durch Wasserverschmutzung entstanden. Diese Wasserverschmutzung und die nachfolgende Eutrophierung führten in vielen Fällen zur Entwicklung von Blaugrünalgenblüten (das heißt, Cyanobakterien). Die Umweltfaktoren, die für die Entwicklung derartiger Blüten von Cyanobakterien verantwortlich sind, sind bis jetzt beinahe unbekannt. Im Allgemeinen können Blüten von Cyanobakterien in eutrophen Gewässern, zum Beispiel unter solchen Bedingungen, wie relativ hohe Nährstoffgehalte (Phosphat und Nitrat), Wassertemperaturen zwischen 15 bis 30°C und pH-Werten zwischen 6 und 9 oder höher (Wicks et al., 1990) gefunden werden.

Ein ernsthaftes Problem bei der Entwicklung von Cyanobakterienblüten besteht darin, dass Cyanobakterien eine große Vielfalt an giftigen Substanzen erzeugen. Dementsprechend gab es seit dem Ende des letzten Jahrhunderts eine zunehmende Zahl an Fällen von Vergiftungen und sogar Todesfällen von Menschen, Tieren, insbesondere Vögel und Fische, von denen gezeigt werden konnte, dass sie durch die Verwendung von Wasser, das nach Chlorierung und Filtrierung für medizinische Zwecke mit Cyanobakterien verunreinigt war (Todesfälle in den Dialysezentren von Caruaru, Brasilien, 1996 und Evora, Portugal, 1995), durch den Konsum von verunreinigtem Trinkwasser oder sogar von Cyanobakterienklumpen selbst verursacht wurden (Francis, 1878; Falconer et al., 1983; Carmichael, 1984; Beasley et al., 1989; Mahmod et al., 1988; Skolberg et al. 1984).

Die Gift-erzeugenden Cyanobakterien können in Spezies unterteilt werden, die größtenteils hepatotoxische Peptide synthetisieren, wie zum Beispiel Microcystis sp., Nodularia sp. und Oszillatoria sp., und andere Gattungen, die größtenteils neurotoxische Alkaloide erzeugen, wie zum Beispiel Anabaena und Aphanizomenon (Carmichael et al., 1990). Untersuchungen verschiedener Stämme von M. aeruginosa offenbarten, dass in Abhängigkeit vom Stamm und Lebensraum, die Cyanobakterien unterschiedliche Kongenere und Mengen eines Giftes erzeugen (Sivonen et al., 1992 a–c).

Cyanobakterien können die intrazellulär erzeugten Gifte in das umgebende Wasser ausscheiden (Watanabe et al., 1992a, b). Weitere Untersuchungen zeigten, dass das Mycrocystin-Kongenere Mycrocystin-LR lichtbeständig ist, jedoch kann es mikrobiell abgebaut werden (Watanabe et al., 1992a; Tsuji et al., 1994; Cousins et al., 1996). Unter aeroben Bedingungen und in Kulturmedien, die mit Bakterien geimpft wurden, betrugen die Halbwertszeiten von Mycrocystin-LR und -YR mehr als 45 Tage (Watanabe et al., 1992a). Im Gegensatz dazu wurden im Meerwasser Halbwertszeiten von weniger als 5 Tagen bestimmt (Cousins et al., 1996). Unter ungünstigen Bedingungen (das heißt, kalte Temperaturen und minimale Anwesenheit spezifischer Populationen an Mikroben) können Mycrocystine mehrere Tage bis sogar mehrere Monate bestehen und daher können sie über die Trinkwasserversorgung eine potentielle Gefahr für Menschen darstellen.

Dementsprechend kann das erhöhte Auftreten von Magen-Darm-Entzündung und Leberkarzinomen in Menschen auf den Verbrauch von Trinkwasser zurückgeführt werden, das in mehreren Untersuchungen mit cyanobakteriellen Hepatoxinen (insbesondere Mycrocystin-LR) verunreinigt war, obwohl eine direkte Beziehung zwischen chronischer Mycrocystin-LR-Aussetzung und der Entwicklung von Leberkarzinomen noch nicht bewiesen worden ist (Tisdale, 1931; Keleti et al., 1981; Billings, 1981). Klinische Anzeichen von Mycrocystin-Toxikosen in Säugern sind durch Schwäche, Appetitlosigkeit, Blässe der Mukosa, Muskelzittern, gequältes Ausatmen und Tod durch hypovolämischen Schock, der durch intrahepatische Hämorrhagie und/oder Leberversagen verursacht wird, charakterisiert (Theiss et al., 1988; Jackson et al., 1984).

Säuger scheinen Mycrocystin oral aufzunehmen und das Gift erreicht die Leber mit dem Blut über einen hochspezifischen Transportmechanismus (organischer Anionträger) (Eriksson et al, 1990; Hooser et al., 1990; Runnegar et al., 1991). Ein molekularer Mechanismus für die ernsten Wirkungen von Mycrocystin scheint dessen Bindung an die katalytische Untereinheit der Proteinphosphatasen 1 und 2A zu sein, die zu der Inhibierung führt (Eriksson et al., 1990; Yoshezawa et al., 1990; Matsushima et al., 1990; Honkanen et al., 1990; McKintosh et al., 1990; McKintosh et al., 1995; Runnegar et al., 1996). Nach akuter Vergiftung mit hohen Mycrocystinkonzentrationen führt die Inhibierung von Proteinphosphatasen zu einer Hyperphosphorylierung intermediärer Filamente, der wiederum der Kollaps des Zellskeletts, der Verlust der Zellstruktur, eine beträchtliche intrahepatische Hämorrhagie und eine Nekrose der Hepatozyten folgt (Eriksson et al., 1990; Falconer et al., 1981, 1992). Ähnlich zu anderen Proteinphosphataseinhibitoren (zum Beispiel Calyculin-A, Okadasäure) führt die chronische Aussetzung von Mäusen gegenüber Mycrocystin-LR zur Förderung von Lebertumoren (Falconer, 1991; Nishiwaki-Matsushima et al., 1992).

Aufgrund der hohen Toxizität und Karzinogenität von hepatotoxischen Cyanobakteriengiften und der möglichen chronischen Aussetzung von Organismen (Menschen sowie auch Tiere) gegenüber diesen Giften über das Trinkwasser, besteht ein dringender Bedarf, giftige Cyanobakterienblüten nachzuweisen und die Konzentration von Cyanobakteriengiften im Trinkwasser zu senken.

Huang et al. (1996) Abstracts of the General Meeting of the American Society for Microbiology 96, 380, beschreibt die Erzeugung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen Mycrocystin. Die Antikörper wurden durch Verschmelzung muriner Myelomzellen mit Milzzellen aus einer BALB/c-Maus erhalten, die mit Mycrocystin-LR-Proteinkonjugaten immunisiert worden war. Nagata et al. (1995) Nat. Toxins 3, 78–86, beschreibt die Erzeugung von sechs monoklonalen Antikörpern (MAbs) gegen Mycrocystin-LR (MC-LR). Es wird berichtet, dass die Antikörper Schutzwirkungen gegen eine Hepatotoxizität von MC-LR in vitro und in vivo sowie auch gegen die Inhibierung von Proteinphosphatase durch MC-LR zeigen. Nagata et al. (1997) J. AOAC Int: 80(2), 408–417 offenbart einen ELISA zur direkten Bestimmung mehrerer Mycrocystine in natürlichem Gewässer. Metcalf et al. (2000) Water Res. 34(10), 2761–2769, beschreibt die Erzeugung polyklonaler Antikörper, die gegen Mycrocystin-LR gerichtet sind. Chu et al. (1989) Appl. and Environ. Microbiology 55(8), 1928–1933 beschreibt die Verwendung der Mycrocystin-Leucin-Arginin-Variante (MCYST-LR) für immunogene Präparate (vergleiche zum Beispiel Seite 1928, rechte Spalte, Zeilen 7 bis 10). Der Annual Report 1996/1997 des Cooperative Research Centre for Water Quality and Treatment (CRC) Australien gibt einen Überblick über Forschungsprojekte am CRC Australien in den Jahren 1996 und 1997 und offenbart, dass die Synthese von synthetischem ADDA geplant ist, um Antikörper gegen Mycrocystine zu erzeugen (vergleiche Seite 16, linke Spalte, erster Abschnitt). Weiterhin gibt der Annual Report 1997/1998 des Cooperative Research Centre for Water Quality and Treatment (CRC) Australien einen Überblick über Forschungsprojekte am CRC Australien in den Jahren 1997 und 1998 und offenbart, dass synthetisches ADDA erhalten worden ist und, dass die Erzeugung von Antikörpern geplant ist, die spezifisch für das ADDA sind.

Da es schwierig war, die verschiedenen Mycrocystin- und Nodularin-Kongenere mit der erforderlichen Empfindlichkeit nachzuweisen (Kenefick et al., 1993; Lawton et al., 1994), konzentrierten sich Untersuchungen aus dem Stand der Technik auf die Zerstörung der Cyanobakteriengifte während des Trinkwasserreinigungsverfahrens. Es wurden größtenteils Durchlaufverfahren untersucht, die unter Routinebedingungen ausgeführt werden können, wie zum Beispiel Sandfiltration, Binden an Aktivkohle und Zerstörung durch Chlorierung (James et al., 1994). Jedoch offenbarten diese Untersuchungen, dass weder Sandfiltration noch Chlorierung, UV-Bestrahlung, Behandlung mit Wasserstoffperoxid oder Kaliumpermanganat noch Filtration über Aktivkohle die Cyanobakteriengifte wesentlich aus dem Trinkwasser entfernen konnten. In diesem Fall scheint ein weiteres Problem die Behandlung des Rohwassers zu sein, das mit Cyanobakterien verunreinigt ist. Die Chlorierung oder die Behandlung der Cyanobakterien mit Kupfersulfat führt zu der Freisetzung der Cyanobakteriengifte, die im Cytosol vorhanden sind, ohne dass die Gifte selbst im geringsten Grad zerstört werden. Die Chlorierung von sandfiltriertem Wasser ist ebenfalls unwirksam. Nur die Filtration über Aktivkohle scheint zur Entfernung einer beträchtlichen Menge (ungefähr 60% bis 80%) der Gifte geeignet zu sein. Jedoch wurde diese Reinigungswirksamkeit aufgrund einer relativ schnellen Sättigung der Aktivkohleteilchen nur für eine begrenzte Zeitdauer erreicht. Daher wurden nach ungefähr 10.000 Bettvolumina (1 Bettvolumen = Volumen der Aktivkohle) die Filter durchlässig.

Daher besteht die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Aufgabe darin, ein neues System für den zuverlässigen Nachweis von hepatotoxischen Cyanobakteriengiften, wie zum Beispiel Mycrocystin- und Nodularin-Kongenere, insbesondere in und aus Trinkwasser und anderen Quellen bereitzustellen.

Die Lösung der vorstehenden Aufgabe wird durch die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wie sie in den Ansprüchen charakterisiert sind, bereitgestellt.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der an alle Kongenere von cyanobakteriellen Hepatotoxinen bindet, umfassend die Schritte

  • (a) des Herstellens eines ADDA-Haptens, bestehend aus Formel (I) welches Teil eines Giftes ist, das von einem Cyanobacterium stammt, wobei der Rest

    R1 ein Halogenatom, vorzugsweise Br, -OSO3, -OR' oder -NR'2 darstellt und der Rest

    R2 Wasserstoff, (C1-C4)Alkyl, (C1-C4)Alkoxy, (C1-C4)Acyl, (C1-C4)Aminoacyl oder (C1-C4)Carboxyaminoacyl darstellt,

    oder die Reste R1 und R2 so miteinander verbunden sind, dass sie eine cyclische Verbindung bilden, die Reste R3, die gleich oder unterschiedlich sein können, jeweils unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und (C1-C4)Alkyl, ausgewählt sind,

    der Rest R4 (C1-C4)Alkoxy darstellt,

    und wobei die Phenylgruppe substituiert oder unsubstituiert sein kann,
  • (b) des Koppelns der Verbindung von Schritt (a) an einen Träger,
  • (c) des Immunisierens eines nicht-menschlichen Tieres mit dem in Schritt (b) erhaltenen Konjugat und
  • (d) des Isolierens des Blutes, Blutserums und/oder der Milzzellen des Tieres.

Die Gruppe R' in Formel (I) stellt vorzugsweise unabhängig voneinander Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes (C1-C4)Alkyl oder (C1-C4)Acyl dar, wenn sie an Stickstoff gebunden sind. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens, wie vorstehend definiert ist, stellen die Reste R3 in der vorstehenden Formel (I) jeweils Methyl und der Rest R4 Methoxy dar.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung stellt der Rest R1 Aminoacyl und der Rest R2 (C1-C4)Acyl dar, oder der Rest R1 stellt Glycyl beziehungsweise D-Alanyl dar und der Rest R2 stellt Acetyl dar, oder der Rest R1 stellt -NH2 dar und der Rest R2 stellt Glutamidyl beziehungsweise 2-Aminopropionamidyl dar.

Das durch die vorstehende Formel (I) dargestellte Hapten ist vorzugsweise Teil eines Giftes, das aus der Gruppe, bestehend aus Mycrocystin- und Nodularin-Kongeneren, ausgewählt ist. Mycrocystin-(MC) und Nodularin-Kongenere werden nachstehend als Mycrocystin-XY und Nodularin-XY bezeichnet.

Die chemischen Strukturen von M. aeruginosa- und Nodularia sp.-Hepatotoxinen (das heißt, Mycrocystin-XY und Nodularin-XY) sind in mehreren Untersuchungen aus dem Stand der Technik beschrieben (Botes et al., 1982a, d, 1994, 1985; Rinehard et al., 1988). Mycrocystin-XY und Nodularin-XY sind cyclische Peptide, die aus sieben beziehungsweise fünf Aminosäuren bestehen. Die folgende Formel stellt Mycrocystin-LR dar.

Nodularin-XY und Mycrocystin-XY haben dieselbe charakteristische Aminosäure (ADDA) gemeinsam. Die Grundstruktur von Mycrocystin-XY-Kongeneren besteht aus fünf nicht variablen Aminosäuren: &bgr;-Methylasparaginsäure, Alanin, N-Methyldehydroalanin, Glutamat und 3-Amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4,6-diensäure (ADDA). Die Unterschiede zwischen einzelnen Mycrocystin-Kongeneren basieren auf den zwei variablen L-Aminosäuren, die zum Beispiel L-Arginin und L-Leucin in Mycrocystin-LR beziehungsweise zweimal L-Arginin in Mycrocystin-RR sind. Normalerweise erzeugen Cyanobakterien eine Mischung aus verschiedenen Formen der Gifte. Die Isolierung von Mycrocystin-XY aus natürlichen Blaugrünalgenblüten führte zu bis zu sechs verschiedenen Mycrocystin-Kongeneren, und Giftkonzentrationen von bis zu 10 mg pro g Trockenmasse Algen wurden bestimmt (Wicks et al., 1990; Tsuji et al., 1984; Tencallar et al., 1994, 1995).

Ein besonders bevorzugtes Beispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Verfahren zur Herstellung eines polyklonalen, monoklonalen oder rekombinanten Antikörpers. Der rekombinante Antikörper kann durch die Translation und Expression von jedem Teil der Gene, die für polyklonale oder monoklonale Antikörper kodieren, und/oder Auswahl durch Screening der Anzeige einer Phagenbibliothek unter Verwendung des durch die vorstehende Formel (I) dargestellten Haptens, erzeugt werden.

Der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene Antikörper, zum Beispiel ein polyklonaler, monoklonaler oder rekombinanter Antikörper, weist den Vorteil auf, dass er zum Binden an alle Kongenere der cyanobakteriellen Hepatotoxine, zum Beispiel Mycrocystin- und Nodularin-Kongenere, die als Teil ihrer Struktur die ADDA-Einheit enthalten, in der Lage ist.

Der „Träger" ist nicht sonderlich auf eine spezifische Ausführungsform beschränkt und kann zum Beispiel jede polymere Substanz sein. Träger, die für das vorstehende Verfahren geeignet sind, können zum Beispiel aus der Gruppe, bestehend aus Polyethylenglykol, Proteinen, Polypeptiden, Polysacchariden und Festphasenträgern, wie zum Beispiel Kunststoffträger, ausgewählt werden. Der Proteinträger wird vorzugsweise aus Rinderserumalbumin (BSA), Ovalbumin (OVA), kationisiertes Rinderserumalbumin (cBSA) und Meerrettichperoxidase (HRP) ausgewählt.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft einen Antikörper, wie vorstehend definiert ist, der durch Immunisieren eines nicht-menschlichen Tieres mit einem ADDA-Hapten, das die Formel (I) aufweist, erhalten wird.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft einen diagnostischen Kit, der den Antikörper, wie vorstehend definiert ist, enthält.

Die Figuren zeigen:

1 ist ein Diagramm, das ein Flussdiagramm für die Strategie der Herstellung eines erfindungsgemäßen Anti-ADDA-Antikörpers zeigt.

2 ist ein Diagramm, das bevorzugte Strategien für die Kopplung eines ADDA-Haptens an ein Protein zeigt.

3 zeigt mehrere ADDA-Derivate, die für die Erzeugung des Antikörpers synthetisiert wurden, der für einen Kongener-unabhängigen Nachweis von Mycrocystin- und Nodularin-Kongeneren verwendbar ist.

4 ist ein Diagramm, das das allgemeine Prinzip des indirekten kompetitiven Mycrocystin enzymgekoppelten Immunadsorptionsassays (MA-ELISA) zeigt.

5 ist ein Diagramm, das die Kreuzreaktivität in Bezug auf verschiedene Mycrocystin-Kongenere (MC-LR, -RR und -YR) und Nodularin des in Schafen hervorgerufenen Anti-ADDA-Antikörpers (ADDA-824neu, das heißt 26/06/00) zeigt, der direkt gegen ADDA-HG gekoppelt an Ovalbumin gerichtet ist.

6 ist ein Diagramm, das das direkte ELISA-Verfahren und dessen Empfindlichkeit zum Nachweis von MC-YR zeigt. Der Anti-ADDA-Antikörper (ADDA-825-bleed,14/12/98) wurde in Schafen hervorgerufen und war gegen ADDA-HG gekoppelt an Ovalbumin gerichtet.

7 ist ein Diagramm, das das indirekte ELISA-Verfahren unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers und dessen Empfindlichkeit zum Nachweis von MC-YR zeigt. Der Anti-ADDA-Antikörper (ADDA-3G10B10) wurde in Mäusen hervorgerufen und war gegen ADDA-HG gekoppelt an Ovalbumin gerichtet.

Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden nicht beschränkenden Beispiele erläutert.

BEISPIEL ADDA-Hapten-Synthese

Das Ausgangsmaterial N-Boc-ADDA-Me (35) wurde durch den veröffentlichten Syntheseweg hergestellt: Humphrey, J. M.; Aggen, J; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 11759–11770. „Synthesis of the Serine-threonine Phosphatase Inhibitor Microcystin LA."

N-Ac-ADDA-OMe. Zu 31 mg (0,70 mmol) Boc-ADDA-OMe in einem Kolben wurde 2 ml TFA gegeben. Nach einer Stunde wurde das TFA unter Vakuum entfernt und der Rückstand wurde dreimal aus Toluol zur Entfernung des TFA eingeengt. Das resultierende Öl wurde in 2,5 ml frisch destilliertem CH2Cl2 gelöst und dieses wurde auf 0°C abgekühlt. 28 mg (0,28 mmol) wasserfreies Triethylamin, gefolgt von 0,141 g (1,39 mmol) frisch destilliertem Essigsäureanhydrid, wurde zu der Lösung gegeben. Eine Stunde später wurden 5 ml gesättigte NH4Cl-Lösung zugegeben und die Mischung wurde während 20 Minuten bei 0°C gerührt. Die Mischung wurde zwischen Wasser und EtOAc verteilt und die Phasen wurden getrennt. Die wässrige Phase wurde zweimal mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden jeweils einmal mit 50% gesättigter NH4Cl-Lösung, 50% gesättigter NaHCO3-Lösung und Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet, filtriert und unter Vakuum eingeengt, woraus sich ein weißer Feststoff ergab. Der Feststoff wurde über Flashchromatographie (1/1 EtOAc/Hexane) gereinigt, woraus sich 25 mg (93%) eines weißen Feststoffs ergaben; Rf 0,23 (40:60) EtOAc-Hexane); IR (Dünnfilm) 3330, 2919, 1731, 1654, 1454 cm–1; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) ‰ 0,99 (d, J = 6,5, 3H), 1,20 (d, J = 7, 3H), 1,57 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 2,58 (ddq, J = 6, 6,5, 10 Hz, 1H), 2,67 (dd J = 7,5, 14 Hz, 1H), 2,78 (undeutliches Multiplett, 3H), 2,79 (dd, J = 5, 13,5 Hz, 1H), 3,17 (ddd, J = 5, 6, 7 Hz, 1H), 3,21 (s, 3H), 3,65 (s, 3H), 4,71 (ddd, J = 4,5, 5, 5,5 Hz, 1H), 5,37 (d, J = 9,5 Hz. 1H), 5,42 (dd, J = 15,5, 6,5 Hz, 1H), 6,18 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 6,40 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,25–7,15 (m, 5H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) ‰ 175,8, 169,5, 139,5, 136,6, 136,3, 132,4, 129,5, 128,2, 126,0, 124,9, 87,1, 58,6, 3,0, 51,7, 43,6, 38,4, 36,8, 23,5, 16,2, 14,9, 12,7; HRMS berechnet für C23H34NO4 (M + H)+: 388,2488. Gefunden: 388,2505.

N-Ac-ADDA-ON. Zu 22 mg (0,057 mmol) des geschützten ADDA-Derivats in 2 ml THF wurden 0,57 ml (0,57 mmol) 1 M LiOH gegeben. Nach 22 Stunden wurde die Mischung klar und sie wurde zwischen Hexanen und Wasser verteilt. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase wurde einmal mit Hexanen gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden dreimal mit Wasser nachextrahiert. Die vereinigten wässrigen Phasen wurden mit 1 M NaHSO4 angesäuert und dreimal mit CH2Cl2 extrahiert. Die vereinigten CH2Cl2-Phasen wurden einmal mit Kochsalzlösung gewaschen, durch Baumwolle filtriert und eingeengt, woraus sich 23 mg von 83 als ein Öl ergab, das ohne Reinigung genommen wurde: Rf 0,34 (1:49:50 HOAc:EtOAc:Hexane); IR (Dünnfilm) 3295 br, 2923, 1713, 1640 cm–1; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) ‰ 0,99 (d, J = 6,5, 3H), 1,25 (d, J = 7, 3H), 1,58 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 2,57 (ddq, J = 6,5, 6,5, 9,5 Hz, 1H), 2,65 (dd J = 7,5, 14 Hz, 1H), 2,76 (teilweise undeutlich m, 3H), 2,77 (dd, J = 5, 13 Hz, 1H), 3,17 (ddd, J = 5, 6,5, 6,5 Hz, 1H), 3,21 (s, 3H), 4,71 (ddd, J = 5, 6, 10 Hz, 1H), 5,37 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,45 (dd, J = 15,5, 6,5 Hz, 1H), 6,18 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 6,37 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 7,25–7,15 (m, 5H), HRMS berechnet für C22H32NO4 (M + H)+: 374,2331. Gefunden: 374,2325.

N-Ac-ADDA-D-Ala-OMe. Zu 17 mg (0,12 mmol) D-Ala-OMe-hydrochlorid und 14 mg (0,036 mmol) HATU in einem Kolben wurden 9 mg (0,024 mmol) 83 in 0,6 ml DMF gegeben. Die resultierende Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und 41 mg (0,34 mmol) Collidin wurden zugegeben. Die Lösung wurde während 2 Stunden bei 0°C gerührt, gefolgt von Aufwärmen auf Raumtemperatur und Rühren über Nacht. Die Mischung wurde zwischen Wasser und EtOAc verteilt und die Phasen wurden getrennt. Die wässrige Phase wurde einmal mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden jeweils einmal mit gesättigter NaHCO3-Lösung, Wasser, 1 M NaHSO4, Wasser, Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet, filtriert und unter Vakuum zu einem schmutzig weißen Feststoff eingeengt. Eine Chromatographie (80:20 EtOAc:Hexane) ergab 8 mg (73%) eines weißen Feststoffs: Rf 0,17 (60:40 EtOAc:Hexane); IR (Dünnfilm) 3284, 3067, 2923, 1743, 1650, 1542 cm–1; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) ‰ 0,99 (d, J = 6,5, 3H), 1,23 (d, J = 7, 3H), 1,35 (d, J = 7 Hz, 3H), 158 (s, 3H), 2,04 (s, 3H), 2,52 (dq, J = 4, 7 Hz, 1H), 2,59 (ddq, J = 6,5, 7, 9,5 Hz, 1H), 2,68 (dd J = 7,5, 14 Hz, 1H), 2,81 (dd, J = 4,5, 14 Hz, 1H), 3,19 (ddd, J = 5, 7, 7 Hz, 1H), 3,22 (s, 3H), 3,75 (s, 3H), 4,55 (dq, J = 7, 7 Hz, 1H), 4,62 (m, 1H), 5,39 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,45 (dd, J = 15,5, 6,5 Hz, 1H), 6,18 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 6,23 (d, J = 7 Hz, 1H), 7,05 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,27–7,17 (m, 5H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) ‰ 12,7, 15,4, 16,2, 18,4, 23,5, 36,7, 38,2, 44,4, 47,9, 52,6, 53,7, 58,6, 86,9, 125,2, 125,9, 128,2, 129,4, 132,2, 136,2, 139,4, 169,9, 173,2, 174,6; HRMS berechnet für C26H39N2O5 (M + H)+: 459,2859. Gefunden 459,2869.

N-Ac-ADDA-D-Ala-OH. Zu 5 mg (0,011 mmol) N-Ac-ADDA-D-Ala-OMe in 1,75 ml THF wurden 0,10 ml (0,10 mmol) 1 M LiOH gegeben. Nach 50 Minuten wurde die Mischung zwischen Ether und Wasser verteilt und die Phasen wurden getrennt. Die wässrige Phase wurde einmal mit Ether gewaschen. Die vereinigten Etherphasen wurde dreimal mit Wasser nachextrahiert und die vereinigten wässrigen Phasen wurden mit gesättigter Zitronensäure auf pH = 3 angesäuert. Dann wurden die wässrigen Phasen zweimal mit EtOAc extrahiert und die vereinigten EtOAc-Phasen wurden zweimal mit Wasser, einmal mit Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der resultierende Feststoff wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, Retentionszeit des Produkts = 15,7 Minuten (70 MeOH/30 0,2% wässriges TFA), woraus sich 4 mg (85%) der Titelverbindung als weißer Feststoff ergab: Rf 0,36 (1 HOAc/10 MeOH/89 CH2Cl2); IR (Dünnfilm) 3288 br, 2937, 1720, 1658, 1632 cm–1; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) ‰ 0,94 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 0,96 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,19 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,52 (s, 3H), 1,82 (s, 3H), 2,63 (dd, J = 7,0, 14,0 Hz, 1H), 2,73 (dd, J = 5,0, 14,0 Hz, 1H), 3,16 (s, 3H), 3,22 (ddd, J = 5,5, 5,5, 6,5 Hz, 1H), 4,19 (dq, J = 7,0, 7,5 Hz, 1H), 4,40 (m, 1H), 5,38 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 5,44 (dd, J = 6,5, 16,0 Hz, 1H), 6,05 (d, J = 16,0 Hz, 1H), 7,17 (d, J = 7,5 Hz, 3H), 7,25 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,60 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 8,01 (d, J = 7,0 Hz, 1H); FAB MS berechnet für C25H37N2O5 (M + H)+: 445,2702. Gefunden: 445,2695.

Kopplung von Hapten an Proteine Herstellung von BSA-, cBSA- und OVA-N-AcADDA-AlaOH.

BSA (10,6 mg), kationisiertes BSA (cBSA) (10,0 mg) und OVA (8,3 mg) wurden jeweils in PBS (1000 &mgr;l) gelöst. Carbonyldiimidazol (19,81 mg, 0,12 mmol) wurde in trockenem DMF (500 &mgr;l) gelöst und ein Teil der Lösung (100 &mgr;l) wurde zu N-Acetyl-ADDA-D-Ala-OH (1,0 mg, 2,2 &mgr;mol) gegeben und während 90 min stehen gelassen. DMF (BSA, 260 &mgr;l; cBSA, 260 &mgr;l; OVA, 280 &mgr;l) wurde zu den Proteinlösungen unmittelbar vor der Zugabe des aktivierten ADDA-Derivats gegeben. Die Lösung des aktivierten ADDA-Derivats (40 &mgr;l jeweils zu der BSA- und cBSA-Lösung, 20 &mgr;l zu der OVA-Lösung) wurde dann zu den Proteinlösungen gegeben, und man ließ die Reaktion während ungefähr 16 h bei 4°C fortschreiten. Die resultierenden Konjugate wurden wiederholt verdünnt und dann durch Ultrafiltration (Filtron Zentrifugen-Ultrafiltrationsröhrchen, 10K Grenze) eingeengt bis die berechnete Verdünnung der nicht zurückbehaltenen Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht > 106 betrug.

Herstellung von HRP-MC-YR und AminoHRP.

Meerrettichperoxidase (HRP) wurde durch das Verfahren von Hermanson oxidiert. HRP (19,73 mg, Boehringer) wurde in PBS gelöst und auf 4°C abgekühlt. NaIO4 (36,7 mg) wurde in Wasser (2 ml) gelöst und 100 &mgr;l davon wurden zu der HRP-Lösung gegeben, die schnell grün wurde. Die Reaktion wurde im Dunkeln während 20 min bei 4°C gehalten, dann wurde das HRP von Material mit niedrigem Molekulargewicht durch Elution mit PBS durch eine Entsalzungssäule (Bio-Rad Econo-Pac 10DG) getrennt.

Zur Hälfte des oxidierten HRP wurde MC-YR-Cysteamin (51 &mgr;g, siehe unten) in MeOH (50 &mgr;l) gegeben. Zu der anderen Hälfte wurde Diaminoethanhydrochlorid (500 mg) in PBS (500 &mgr;l) gegeben. NaBH3CN (16,4 mg) wurde in PBS (500 &mgr;l) gelöst und 100 &mgr;l davon wurden zu jeder HRP-Reaktion gegeben (die sofort karminrot wurde). Nach Stehenlassen bei 4°C im Dunkeln während ungefähr 16 h wurden die Reaktionen durch Zugabe von Diethanolamin in PBS (50 &mgr;l von 300 &mgr;l Diethanolamin in 5 ml PBS) gequencht und bei 4°C im Dunkeln während 2 h stehen gelassen. Die HRP-Lösungen wurden dann gereinigt, indem man sie durch Entsalzungssäulen laufen ließ (siehe oben). Das Diaminethankonjugat (das fortan als AminoHRP bezeichnet wird) und MC-YR-Konjugate wurden weiter durch Ultrafiltration bis zu einer Verdünnung > 104 gereinigt (wie vorstehend).

Herstellung von HRP-, AminoHRP- und OVA-ADDA-HG.

HRP, AminoHRP und OVA wurden jeweils in PBS (1 ml) gelöst. Zu Me-ADDA-HG (0,67 mg) wurde CDI (1,16 mg) in trockenem DMF (100 &mgr;l) gegeben und man ließ die Reaktion bei Umgebungstemperatur 1,5 h fortschreiten, worauf trockenes DMF (150 &mgr;l) zugegeben wurde. Ein Teil dieser Lösung wurde zu den Lösungen der Proteine (50 &mgr;l zu AminoHRP, 100 &mgr;l zu HRP und OVA) gegeben. DMSO (200 &mgr;l) wurde dann zur Unterstützung der Solubilisierung der Reaktanden zu den HRP- und OVA-Reaktionen gegeben und die drei Reaktionen wurden im Dunkeln während ungefähr 16 h bei 4°C bewahrt. Dann wurden die Konjugate auf der Entsalzungssäule gereinigt und dann weiter durch wiederholte Ultrazentrifugation auf eine Verdünnung > 3 × 104 gereinigt (wie vorstehend).

Das Verfahren basiert auf denjenigen von Kondo et al. (1992) und Sherlock et al. (1998). Cysteamin (15,6 mg) wurde in Wasser (500 &mgr;l) gelöst und MC-YR (500 &mgr;g) wurde in 5% K2CO3 (500 &mgr;l) gelöst. Die Cysteaminlösung (50 &mgr;l, gefolgt von 100 &mgr;l bei 30 min) wurde zu der MC-YR-Lösung in Teilen zugegeben. Nach ungefähr 2 h wurde die Reaktion auf pH 3 bis 4 angesäuert und auf eine Umkehrphasen-Flashsäule (4 × 1 cm) gegeben. Die Säule wurde nacheinander mit Wasser (10 ml), 10% MeOH (10 ml), 20% MeOH (10 ml), 30% MeOH (10 ml), 50% MeOH (2 × 10 ml), 70% MeOH (2 × 10 ml) und MeOH (3 × 10 ml) eluiert. Eine HPLC-Analyse wies darauf hin, dass das Produkt in den 50% MeOH und der ersten der 70% MeOH-Fraktionen war. Diese Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um MC-YR-Cysteamin als farblosen Feststoff (204 &mgr;g) zu ergeben. ESI-MS m/z 1121,9 (M – H); 1H, COSY und HMBC NMR Spektren stimmten mit dem erwünschten Produkt überein.

Immunisierung von Schafen und Mäusen mit ADDA-Proteinkonjugaten Neun Schafe und neun Mäuse wurden mit den vorstehenden BSA-ADDA-, cBSA-ADDA- und OVA-ADDA-Konjugaten (drei Tiere für jedes Konjugat) immunisiert. Ein mg von jedem Konjugat wurde im Falle der primären Injektion in einem Volumen von 1 ml Phosphatpuffer-Salzlösung zu freundschen vollständigen Adjuvantien gegeben und zur Bildung einer Emulsion homogenisiert, und im Falle von Injektionen zur Auffrischung zu freundschen unvollständigen Adjuvantien gegeben. Die Tiere erhielten mindestens drei Auffrischungen im Falle von Schafen und sechs Auffrischungen im Falle von Mäusen in Zeitabständen von näherungsweise 4 Wochen.

ELISA Indirekter ELISA unter Verwendung des polyklonalen Antikörpers #824

ELISA-Platten (NUNC MaxiSorp 1 #439454, Dänemark) wurden mit OVA-N-acetyl-D-alanyl-ADDA-Konjugat (OVA-ADDA-HG3/99') in 0,05 M Natriumbicarbonatpuffer pH 9,6 (75 &mgr;l, 2,5 &mgr;l/ml) über Nacht bei 22°C (RT) beschichtet. Nach Waschen mit PBS wurden zusätzliche Bindungsstellen durch Inkubation mit OVA (1% w/v, 300 &mgr;l, 1 h, 20–25°C) blockiert. Die Platten wurden zweimal mit PBS gewaschen und sofort verwendet oder bei 4°C bis zu 7 Tage gelagert. In dem Assay wurde die Probe oder ein Standard (50 &mgr;l) zusammen mit Antiserum (50 &mgr;l) mit der geeigneten Verdünnung (zum Beispiel Schaf-Serum #82426/6/00 mit 1/200000; vergleiche 5) zu den Vertiefungen gegeben. Nach Inkubation bei 20–25°C während 2 h wurden die Vertiefungen zweimal mit PBS + 0,05% Tween® 20 (PBST) und zweimal mit PBS gewaschen. Dann wurde ein sekundärer Antikörper, Meerrettichperoxidase konjugierter Antispezies-Antikörper, zum Beispiel ICN/Cappel Anti-Schaf-HRP (100 &mgr;l, 1/6000) zu den Vertiefungen gegeben und während 2 h inkubiert. Danach wurden die Vertiefungen abgesaugt, zweimal mit PBST und zweimal mit PBS gewaschen. Dann wurde eine TMB-Lösung, hergestellt durch Zugabe von 110 &mgr;l TMB-Stammlösung (10 mg/ml in DMSO) zu 11 ml Natriumacetatpuffer (0,1 M, pH 5,5), der 0,005% H2O2 enthielt, zugegeben und während 15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von H2SO4 (50 &mgr;l, 2 M) gestoppt und die Extinktion bei 450 nm wurde mit einem Mikroplatten-Spektralphotometer bestimmt. Standards und Proben wurden für den ELISA durch Verdünnen in den folgenden Verdünnungsmitteln hergestellt: (i) Methanol in PBS auf eine maximale Methanolkonzentration von 10% (v/v); (ii) PBS; (iii) Seewasser (Bodensee, Deutschland); (iv) Leitungswasser; (v) Flusswasser, Waikato River, Neuseeland. Alle Proben wurden mindestens in zweifacher Ausführung und über einen Bereich von Verdünnungen analysiert.

Ausführliche Beschreibung des ELISA-Verfahrens unter Verwendung des Antikörpers ADDA-#824226/6/00

Das Prinzip des verwendeten indirekten kompetitiven Mycrocystin-ELISA (MC-ELISA) ist in 4 gezeigt. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

  • 1. Stelle das Antigen (OVA-ADDA-HG3/99) in Bicarbonatpuffer, pH 9,6 mit 2,5 &mgr;g/ml (5 ml +/Platte) her.
  • 2. Trage das Antigen auf eine Mikrotiterplatte mit 75 &mgr;g/Vertiefung auf, klopfe leicht zum Mischen und Bedecken, inkubiere über Nacht bei Raumtemperatur (RT, 22°C)
  • 3. Wasche zweimal in PBS, sauge ab.
  • 4. Blockiere die Platte mit 1% OVA (Nr. A-5503 von Sigma) (300 &mgr;l für 1 Stunde bei RT (22°C))
  • 5. Wasche zweimal in PBS, sauge ab und verwende sofort oder gib 2–300 &mgr;l PBS zur Lagerung dazu.

    Die Platten können in diesem Stadium in PBS (bei 4°C) für bis zu 7 Tage gelagert werden.
  • 6. Gib 50 &mgr;l Probe oder Standard in PBS;

    und 50 &mgr;l des Antikörpers ADDA-#82426/6/00 (entwickelt in Schafen) mit einer Verdünnung von 1/200000 in einem OVA-Inhibitor dazu und inkubiere während 2 Stunden bei RT (22°C).

    Standardkurve: Anfänglich 5000 ng/ml, dann neun aufeinanderfolgende Verdünnungen mit 1:8 (1 + 7) in 10% MeON/PBS.
  • 7. Wasche zweimal in PBS/Tween, zweimal in PBS.
  • 8. Gib 100 &mgr;l des in OVA (Peroxidase-konjugierter Kaninchen-Anti-Schaf IgG (ICN #55814)) mit einer Endverdünnung von 1/6000 dazu und inkubiere während 2 Stunden bei RT (22°C).
  • 9. Wasche zweimal in PBST, zweimal in PBS, sauge ab.
  • 10. Schalte den Plattenleser an – vor dem Lesen bei Schritt 13 werden 15 Minuten zum Aufwärmen benötigt.
  • 11. Gib 100 &mgr;l Substrat dazu. Inkubiere während 15 Minuten bei RT (22°C) bis sich eine Färbung entwickelt.
  • 12. Gib 50 &mgr;l Stopplösung dazu (2 M H2SO4).
  • 13. Lese die Extinktion bei 450 nm ab. Beachte, dass die Extinktion bei 655 nm vor der Zugabe der Stopplösung gemessen werden kann, falls das erforderlich ist.

Direkter ELISA unter Verwendung des polyklonalen Antikörpers #825

ELISA-Platten (NUNC MXISORP 1 #439454, Dänemark) wurden mit dem geeigneten Antiserum (#82514/12/98) in 0,5 M Natriumbicarbonatpuffer, pH 9,6 (50 &mgr;l, 1/20000) über Nacht bei 20°C beschichtet. Nach 2 × Waschen mit PBS wurden zusätzliche Bindungsstellen durch Inkubation mit BSA (1% w/v, 300 &mgr;l, 1 h, 20–25°C) blockiert. Die Platten wurden zweimal mit PBS gewaschen und sofort verwendet oder bei 4°C für bis zu 7 Tage gelagert. In dem Assay wurde die Probe oder ein Standard (50 &mgr;l) zusammen mit dem geeigneten Hapten-Enzym-Konjugat (50 &mgr;l, NH2-ADDA-HRP3/99, 200 ng/ml) zu den Vertiefungen gegeben. Nach Inkubation bei 20–25°C während 3 Stunden wurden die Vertiefungen zweimal mit PBST und zweimal mit PBS gewaschen. Dann wurde die TMB-Substratlösung, hergestellt durch Zugabe von 110 &mgr;l TMB-Stammlösung (10 ng/ml DMSO) zu 11 ml Natriumacetatpuffer (0,1 M pH 5,5), der 0,005% H2O2 enthielt, zugegeben und anschließend während 15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von H2SO4 (50 &mgr;l, 2 M) gestoppt und die Extinktion wurde mit einem Mikroplatten-Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 450 nm bestimmt. Standardlösungen und Proben wurden für den ELISA durch Verdünnen in den folgenden Verdünnungsmitteln hergestellt: (i) Methanol in PBS auf eine maximale Methanolkonzentration von 10% (w/v); (ii) PBS; (iii) Seewasser (Bodensee, Deutschland); (iv) Leitungswasser; (v) Flusswasser (Waikato River, Neuseeland). Alle Proben wurden mindestens in zweifacher Ausführung und über einen Bereich von Verdünnungen analysiert.

Ausführliche Beschreibung des direkten ELISA-Verfahrens (Beispiel 99153005)

  • 1. Stelle Antiserum (#825, entwickelt in Schafen) in Bicarbonatpuffer pH 9,6 mit 1/20000 (5 ml/Platte) her. Beschichte eine Mikrotiterplatte mit 50 &mgr;l Antiserum pro Vertiefung, klopfe leicht zum Mischen und Bedecken, inkubiere über Nacht bei Raumtemperatur (RT, 22°C).
  • 2. Wasche 2 × PBS, sauge ab.
  • 3. Blockiere die Platte mit 1% BSA (300 &mgr;l für 1 Stunde bei RT (22°C)).
  • 4. Wasche 2 × PBS, sauge ab und verwende oder gib 200–300 &mgr;l PBS zur Lagerung dazu.

    Die Platten können in diesem Stadium in PBS (bei 4°C) für bis zu 7 Tage gelagert werden.
  • 5. Gib 50 &mgr;l Probe oder Standard in PBS und 50 &mgr;l des Hapten-Enzym-Konjugats (NH2-ADDA-HRP) 200 ng/ml in einem BSA-Inhibitor dazu und inkubiere während 3 Stunden bei Raumtemperatur RT (22°C).

    Standardkurve: Anfänglich 2000 ng/ml, dann neun aufeinanderfolgende Verdünnungen mit 1:6 in PBS.
  • 6. Wasche 2 × PBST/, 2 × PBS. Sauge ab.
  • 7. Schalte den Plattenleser an – vor dem Lesen bei Schritt 10 werden 15 Minuten zum Aufwärmen benötigt.
  • 8. Gib 100 &mgr;l Substrat dazu. Inkubiere während 15 Minuten bei RT (22°C).
  • 9. Gib 50 &mgr;l Stopplösung dazu (2 M H2SO4).
  • 10. Lese die Extinktion bei 450 nm ab. Beachte, dass die Extinktion bei 655 nm vor der Zugabe der Stopplösung gemessen werden kann, falls das erforderlich ist.

Die Ergebnisse des vorstehend beschriebenen Tests sind in 6 erläutert.

Indirekter ELISA unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers #3G10B10 (ASSAY 9910n001)

ELISA-Platten (NUNC MXISORP 1 #439454, Dänemark) wurden mit OVA-ADDA-HG-Konjugat in 0,05 M Natriumbicarbonatpuffer pH 9,6 (50 &mgr;l, 2,5 &mgr;g/ml) über Nacht bei 20°C beschichtet. Nach einem Waschen mit PBS wurden zusätzliche Bindungsstellen durch Inkubation mit BSA (1% w/v, 300 &mgr;l, 1 h, 20–25°C) blockiert. Die Platten wurden zweimal mit PBS gewaschen und sofort verwendet oder bei 4°C für bis zu 7 Tage gelagert. In dem Assay wurde die Probe oder ein Standard (50 &mgr;l) zusammen mit dem monoklonalen Antikörper (50 &mgr;l) mit der geeigneten Verdünnung (zum Beispiel #3G10B10 mit 1/750) zu den Vertiefungen gegeben. Nach Inkubation bei 20–25°C während 2 Stunden wurden die Vertiefungen zweimal mit PBS + 0,05% Tween® 20 (PBST) und zweimal mit PBS gewaschen. Nach Inkubation bei 20–25°C während 2 h wurden die Vertiefungen zweimal mit PBS + 0,05% Tween® 20 (PBST) und zweimal mit PBS gewaschen. Dann wurde der sekundäre Antikörper, Meerrettichperoxidase-konjugierter Antispezies-Antikörper, zum Beispiel Silenus DAH Anti-Maus-HRP (100 &mgr;l, 1/2000) zu den Vertiefungen gegeben und während 2 h inkubiert. Dann wurde die TMB-Substratlösung, hergestellt durch Zugabe von 110 &mgr;l TMB-Stammlösung (10 ng/ml DMSO) zu 11 ml Natriumacetatpuffer (0,1 M, pH 5,5), der 0,005% H2O2 enthielt, zugegeben und anschließend während 15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von H2SO4 (50 &mgr;l, 2 M) gestoppt und die Extinktion wurde mit einem Mikroplatten-Spektralphotometer bei 450 nm bestimmt. Standards wurden für den ELISA durch Verdünnen in dem Methanol in PBS auf eine maximale Methanolkonzentration von 10% (v/v) hergestellt. Alle Proben wurden mindestens in zweifacher Ausführung und über einen Bereich von Verdünnungen analysiert.

Die Ergebnisse des vorstehend beschriebenen Tests sind in 7 erläutert.

Ausführliche Beschreibung des ELISA-Verfahrens unter Verwendung des Antikörpers #3G10B10

Das Prinzip des verwendeten indirekten kompetitiven Mycrocystin-ELISA (MC-ELISA) ist in 4 gezeigt. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

  • 1. Stelle das Antigen (OVA-ADDA-HG3199) in Bicarbonatpuffer, pH 9,6 mit 2,5 &mgr;g/ml (5 ml/Platte) her.
  • 2. Trage das Antigen auf eine Mikrotiterplatte mit 50 &mgr;g/Vertiefung auf, klopfe leicht zum Mischen und Bedecken, inkubiere über Nacht bei Raumtemperatur (RT, 22°C)
  • 3. Wasche zweimal in PBS, sauge ab.
  • 4. Blockiere die Platte mit 1% BSA – (300 &mgr;l für 1 Stunde bei RT (22°C)).
  • 5. Wasche zweimal in PBS, sauge ab und verwende sofort oder gib 2–300 &mgr;l PBS zur Lagerung dazu.

    Die Platten können in diesem Stadium in PBS (bei 4°C) für bis zu 7 Tage gelagert werden.
  • 6. Gib 50 &mgr;l Probe oder Standard in PBS;

    und 50 &mgr;l des Antikörpers #3G10B10 mit einer Verdünnung von 1:750 in einem BSA-Inhibitor dazu und inkubiere während 2 Stunden bei RT (22°C).

    Standardkurve: Anfänglich 1000 ng/ml, dann neun aufeinanderfolgende Verdünnungen mit 1:4 (1 + 3) in PBS.
  • 7. Wasche zweimal in PBS/Tween, zweimal in PBS.
  • 8. Gib 100 &mgr;l des sekundären Antikörper-Konjugats, verdünnt in OVA (Meerrettichperoxidase-konjugierter Kaninchen-Anti-Maus IgG (Silenus DAH)), mit einer Endverdünnung von 1/2000 dazu und inkubiere während 2 Stunden bei RT (22°C).
  • 9. Wasche zweimal in PBST, zweimal in PBS, sauge ab.
  • 10. Schalte den Plattenleser an – vor dem Lesen bei Schritt 13 werden 15 Minuten zum Aufwärmen benötigt.
  • 11. Gib 100 &mgr;l Substrat dazu. Inkubiere während 15 Minuten bei RT (22°C) bis sich eine Färbung entwickelt.
  • 12. Gib 50 &mgr;l Stopplösung dazu (2 M H2SO4).
  • 13. Lese die Extinktion bei 450 nm ab. Beachte, dass die Extinktion bei 655 nm vor der Zugabe der Stopplösung gemessen werden kann, falls das erforderlich ist.

Herstellung von Puffern: Bicarbonatpuffer zum Beschichten

Löse 0,85 g Na2CO3 (oder 2,15 g Na2CO3·2H2O) und 1,47 g NaHCO3 in 500 ml destilliertem Wasser, stelle den pH-Wert auf 9,6 ein (ergibt 0,05 M Bicarbonat). NaH2PO4·2H2O 2,897 g (oder NaH2PO4 wasserfrei 2,06 g) NaH2PO4 wasserfrei 11,938 g NaCl 87,660 g
Wiege die Phosphate ab, gib auf 800 ml Wasser dazu, stelle einen pH-Wert von 7,4 ein, gib dann Salz dazu.

Gib auf 1 l Wasser dazu und überprüfe den pH-Wert (er soll 7,2 bis 7,6 betragen). Verdünne auf 1/10 zum Gebrauch: ergibt 0,01 M wrt Phosphat und 0,15 M NaCl.

Verweisstelle: Mishell et al. (1980)

PBS/Tween

  • Suspendiere Tween-20 mit 0,05% in PBS (0,5 ml/l);
  • Verwende die vorstehend beschriebenen Schritte zum Waschen.

OVA-Inhibitorpuffer

  • Löse OVA (Sigma A-5503) in PBS mit 1% (2 g/200 ml).
  • Verwende dies zum Blockieren der Platten und als Verdünnungsmittel für Ab und Ab''.

Sekundärer Antikörper

  • Er wird hierin ebenfalls als Ab'', HRP-Konjugat und zweiter Ab bezeichnet. Die Verdünnung hängt von der verwendeten Charge ab, näherungsweise Verdünnungen sind jedoch folgende:

ICN HRP-konjugierter Kaninchen-Anti-Schaf-IgG #55814

  • Verwende mit einer praktischen Verdünnung von 1/3000. Die Stammlösung wird mit 1/10 in PBS Thiomersal (0,02%) gelagert.

TMB-Substrat Stelle Stammlösungen her von:

  • 1) Natriumacetatpuffer 0,1 M, pH 5,5 (1,315 g/200 ml) (prüfe auf einen Niederschlag vor Gebrauch).
  • 2) TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin) mit 10 mg/ml DMSO; [lagere im Dunkeln bei RT (22°C)].

Unmittelbar vor Verwendung:

  • Löse 110 &mgr;l TMB-Lösung (2) in 11 ml Natriumacetatpuffer (1) und gib 165 &mgr;l H2O2 dazu (frisch hergestellt durch Verdünnen von 38 &mgr;l 30% H2O2 (handelsübliche Konzentration) in 2,5 ml destilliertem H2O).

ELISA-Platten

  • Platten mit 96 Vertiefungen waren von NUNC (Maxisorp I Platten, Katalog #439454).

Charakterisierung des in Schafen entwickelten polyklonalen Anti-ADDA-Antikörpers

Die optimalen Konzentrationen der Assayreagenzien wurden empirisch durch schachbrettartige Titrationen bestimmt. Assaystandardkurven wurden unter Verwendung von Microsoft Excel berechnet. Grenzwerte von 20 bis 80% der maximalen Extinktion wurden zur Bestimmung des Arbeitsbereichs verwendet. Die Kreuzreaktivität des Assays wurde gegen die Kongenere von MC-LR, -RR, -YR, -LW, -LF, Desmethyl-MC-LR, Desmethyl-MC-RR und Nodularin bestimmt und aus der Analogkonzentration berechnet, woraus sich die 50% Inhibierung (I50) der Bindung an die Protein-ADDA-Festphase, ausgedrückt bezüglich des I50 für freies Mycrocystin-LR, ergab. Die Berechnung der Kreuzreaktivität zeigt, dass für Probenkonzentrationen im Bereich zwischen 0,01 und 1 ng/ml die tatsächlichen Toxinkonzentrationen im schlechtesten Fall um 5% unterschätzt wurden. Bei einer Probenkonzentration im Bereich zwischen 1 ng/ml und 1 &mgr;g/l werden die meisten getesteten Kongenere mit gleicher Empfindlichkeit nachgewiesen, das heißt, 100% Kreuzreaktivität (vergleiche 5), während die Konzentrationen von MC-RR und Nodularin leicht überschätzt (< 5%) sind. Dies zeigt, dass Mycrocystin- und Nodularin-Kongenere zuverlässig über einen Konzentrationsbereich nachgewiesen werden können, der um das zehnfache niedriger ist, als der durch die WHO vorgeschlagene sichere Grenzwert.

Verweisstellen

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Anspruch[de]
Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der an alle Kongenere von cyanobakteriellen Hepatotoxinen bindet, umfassend die Schritte

(a) des Herstellens eines ADDA-Haptens, bestehend aus Formel (I) welches Teil eines Giftes ist, das von einem Cyanobacterium stammt, wobei der Rest R1 ein Halogenatom, -OSO3, -OR' oder -NR'2 darstellt und der Rest R2 Wasserstoff, (C1-C4)Alkyl, (C1-C4)Alkoxy, (C1-C4)Acyl, (C1-C4)Aminoacyl oder (C1-C4)Carboxyaminoacyl darstellt,

oder die Reste R1 und R2 so miteinander verbunden sind, daß sie eine cyclische Einheit bilden, die Reste R3, die gleich oder unterschiedlich sein können, jeweils unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und (C1-C4)Alkyl, ausgewählt sind,

der Rest R4 (C1-C4)Alkoxy darstellt,

und wobei die Phenylgruppe substituiert oder unsubstituiert sein kann,

(b) des Koppelns der Verbindung von Schritt (a) an einen Träger,

(c) des Immunisierens eines nicht-menschlichen Tieres mit dem in Schritt (b) erhaltenen Konjugat und

(d) des Isolierens des Blutes, Blutserums und/oder der Milzzellen des Tieres.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Reste R' unabhängig voneinander Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes (C1-C4)Alkyl oder (C1-C4)Acyl darstellen, wenn an Stickstoff gebunden. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Reste R3 jeweils Methyl darstellen und der Rest R4 Methoxy darstellt. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Rest R1 Aminoacyl darstellt und der Rest R2 (C1-C4)Acyl darstellt. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Rest R1 Glycyl oder D-Alanyl darstellt und der Rest R2 Acetyl darstellt. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Rest R1 -NH2 darstellt und der Rest R2 Glutamidyl oder 2-Aminopropionamidyl darstellt. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Gift aus der Gruppe, bestehend aus Mycrocystin- und Nodularin-Kongeneren, ausgewählt ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Antikörper ein polyklonaler, monoklonaler oder rekombinanter Antikörper oder ein funktionell aktives Derivat oder Fragment davon ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Träger eine polymere Substanz ist. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der polymere Träger aus der Gruppe, bestehend aus Polyethylenglykol, Polypeptiden, Proteinen, Polysacchariden oder Kunststoffträgern, ausgewählt ist. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Proteinträger aus Rinderserumalbumin, Ovalbumin, kationisiertem Rinderserumalbumin oder Meerrettichperoxidase ausgewählt ist. Antikörper, wie in einem der Ansprüche 1 bis 11 definiert, erhalten durch das Immunisieren eines nicht-menschlichen Tieres mit einem ADDA-Hapten, das die Formel (I) aufweist. Diagnostischer Kit, enthaltend den Antikörper nach Anspruch 12.






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