Die Erfindung betrifft rieselfähige Tierfuttermittel-Additive auf Fermentationsbrühe-Basis, die D-Pantothensäure und/oder eines ihrer Salze enthalten, und ein Verfahren zur Herstellung dieser Additive.

Pantothensäure wird weltweit in einer Größenordnung von mehreren tausend Tonnen pro Jahr produziert. Ein großer Teil der produzierten Pantothensäure wird für die Ernährung von Nutztieren wie Geflügel und Schweinen verwendet. Der Bedarf steigt.

Pantothensäure kann durch chemische Synthese oder biotechnisch durch Fermentation geeigneter Mikroorganismen in geeigneten Nährlösungen hergestellt werden. Bei der chemischen Synthese ist das DL-Pantolacton eine wichtige Vorstufe. Es wird in einem mehrstufigen Verfahren aus Formaldehyd, Isobutylaldehyd und Cyanid hergestellt; in weiteren Verfahrensschritten wird das racemische Gemisch aufgetrennt und das D-Pantolacton mit &bgr;-Alanin zu D-Pantothensäure kondensiert.

Die typische Handelsform ist das Calciumsalz der D-Pantothensäure. Das Calciumsalz des racemischen Gemischs der D,L-Pantothensäure ist ebenfalls gebräuchlich.

Der Vorteil der fermentativen Herstellung durch Mikroorganismen liegt in der direkten Bildung der gewünschten stereoisomeren Form, nämlich der D-Form, die frei von L-Pantothensäure ist.

Verschiedene Arten von Bakterien, wie zum Beispiel Escherichia coli, Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes, und auch Hefen, wie zum Beispiel Debaromyces castellii, können, wie in EP-A-0 493 060, EP-A-0 590 857 und WO 97/10340 gezeigt, unter geeigneten Fermentationsbedingungen D-Pantothensäure produzieren. Besonders gut geeignete Mikroorganismen sind die dort beschriebenen Derivate von Escherichia coli IFO3547 wie zum Beispiel die Stämme FV5069/pFV31 oder FV5069/pFV202.

Bei der fermentativen Herstellung der D-Pantothensäure, wie sie in EP-A-0 493 060, EP-A-0 590 857 und WO 97/10340 beschrieben ist, wird ein zur Produktion von D-Pantothensäure befähigter Mikroorganismus in einem geeigneten Nährmedium kultiviert und die gebildete D-Pantothensäure anschließend in aufwendiger Weise isoliert, gereinigt und als Calciumsalz dargestellt.

Geeignete Nährmedien enthalten eine Kohlenstoffquelle wie zum Beispiel Glucose oder Stärkemehlhydrolysat oder Sucrose oder Melasse, Vorstufen wie zum Beispiel &bgr;-Alanin, D,L-Pantoinsäure oder D,L-Pantolacton, eine Stickstoffquelle wie zum Beispiel Ammoniumsulfat, eine Phosphorquelle wie zum Beispiel Kaliumphosphat und weitere Salze, Spurenelemente und Vitamine und gegebenenfalls komplexe Medienzusätze wie zum Beispiel Hefeextrakt. Die Mikroorganismen werden dann in diesem Medium bei einem geeignetem pH-Wert unter entsprechender Belüftung und Rührung inkubiert, wobei sie dann D-Pantothensäure ausscheiden.

Nach dem derzeitigen Stand der Technik, der in WO 96/33283 und EP-A-0 590857 dargestellt ist, wird das Calciumsalz der D-Pantothensäure durch eine aufwendige Isolierung und Reinigung aus der Pantothensäure-haltigen Fermentationsbrühe gewonnen. Nach einer ersten Abtrennung der Biomasse durch Filtration oder Zentrifugation erfolgt die weitere Aufarbeitung des Filtrats durch Reinigung mittels Aktivkohle oder durch Säulenchromatographie. Nach der Umsetzung der so erhaltenen Lösungen mit Calciumhydroxid lässt man das gewünschte Ca-Salz auskristallisieren.

Gemäß der WO 96/33283 entfärbt man das Filtrat mit Aktivkohle in der ersten Säule. Mit konzentrierter Salzsäure wird ein pH-Wert von 3,0 eingestellt und die Flüssigkeit anschließend kontinuierlich über zwei weitere mit Aktivkohle gepackte Säulen gereinigt. Die Elution der D-Pantothensäure erfolgt mit Hilfe von Methylalkohol. Nach der sich anschließenden Neutralisation mit Ca(OH)₂-Pulver erhält man eine Lösung, aus der man das Calcium-D-pantothenat durch Kristallisation bei 5°C gewinnt.

Bei der in EP-A-0 590 857 beschriebenen Methode reinigt man das Filtrat zunächst mit Hilfe von Kationen- und Anionenaustauschersäulen. Die Elution erfolgt mit Salzsäure. Die eluierte Fraktion wird anschließend mit Ca(OH)₂ neutralisiert, mit Aktivkohle versetzt und abfiltriert. Das gewonnene Filtrat wird dann in einem niedermolekularen Alkohol (Methanol, Ethanol, Isopropanol) extrahiert und das Calcium-D-pantothenat durch Kristallisation gewonnen.

Das auf die beschriebene Weise hergestellte Calcium-D-pantothenat wird als Zusatz in Futtermitteln für die Tierernährung verwendet.

Gegenstand der EP-A-1 050 219 (Stand der Technik gemäß Artikel 54(3) EPÜ) ist ein Tierfuttermittel-Additiv, das D-Pantothensäure und deren Salze und 0 bis 100% der während der Fermentation der D-Pantothensäure produzierenden Mikroorganismen gebildeten Biomasse enthält. In dieser Anmeldung finden sich keinerlei Angaben zum Chloridgehalt des Additivs. Aus der GB 598,177 ist ein Verfahren bekannt, bei dem Bakterien aus der Gruppe Aerobacter aerogens als Hauptprodukt 2,3-Butylenglykol und als Nebenprodukt eine sehr kleine Menge D-Pantothensäure produzieren.

Das isolierte Produkt enthält D-Pantothensäure in einer Menge von weniger als 1%. Der Chloridgehalt wird nicht beachtet.

In der JP 58-205461 wird ein Futtermittel für die Aufzucht von Fisch beschrieben, das beschichtete Vitamine, die unter Ascorbinsäure, Pantothensäure, Folsäure und deren Salzen ausgewählt sind, enthält. Die US 2,864,701 richtet sich auf stabilisierte Pantothensäurezusammensetzungen, die einen eßbaren Träger und ein Alkalimetallcarbonat enthalten. Diese Zusammensetzungen werden durch Mischen des eßbaren organischen Trägers, der Pantothensäure und weiterer Komponenten hergestellt und basieren nicht auf Fermentationsbrühen.

Nach dem Stand der Technik werden Salze der D-Pantothensäure oder D,L-Pantothensäure durch chemische Synthese oder aus Fermentationsbrühen gewonnen und dann in reiner Form Futtermitteln zugesetzt.

Aufgabe der Erfindung ist, leichter zu verarbeitende Zubereitungsformen der D-Pantothensäure und ihrer Salze mit geringem Chloridgehalt und Verfahren zu deren Herstellung für Futtermittel zur Verfügung zu stellen.

Gegenstand der Erfindung sind rieselfähige D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltende Tierfuttermittel-Additive auf Fermentationsbrühe-Basis, dadurch gekennzeichnet, daß sie:

• a) D-Pantothensäure und/oder eines ihrer Salze in einer Menge von 20 bis 80 Gew.-% (Trockenmasse);
• b) einen Gehalt an chloridhaltigen Bestandteilen von < 3 mg/g des Additivs;
• c) die während der Fermentation gebildete Biomasse in einer Menge von ≥ 0 bis 100% und
• d) zumindest den überwiegenden Teil der weiteren Bestandteile der Fermentationsbrühe enthalten und
• e) in fester Form, in einer Korngrößenverteilung von 20 bis 2000 &mgr;m, insbesondere 50 bis 800 &mgr;m, speziell 150 bis 600 &mgr;m, und rieselfähig vorliegen.

In einer bevorzugten Ausführungsweise der Erfindung ist das rieselfähige D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltende Tierfuttermittel-Additiv auf Fermentationsbrühe-Basis dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich, in fester Form, einen Anteil an chloridhaltigen Bestandteilen in einer Konzentration < 2 mg pro g Additiv und insbesondere < 1,5 mg pro g Additiv enthält.

Die Additive liegen im allgemeinen je nach Anforderung in kompaktierter, granulierter, feinkörniger, aber in jedem Fall in rieselfähiger Form vor und enthalten unterschiedliche Anteile an Biomasse. Die Schüttdichte liegt bei 200 bis 800 kg/m³, insbesondere bei ca. 400–700 kg/m³. Die Additive sind gut rieselfähig und lagerstabil.

Wird die Biomasse abgetrennt, werden im allgemeinen weitere, zum Beispiel während der Fermentation zugesetzte anorganische Feststoffe entfernt. Daneben enthält das erfindungsgemäße Additiv zumindest den überwiegenden Teil der in der Fermentationsbrühe gelöst vorliegenden, weiteren gebildeten oder zugesetzten, insbesondere organischen Stoffe, soweit sie nicht durch geeignete Verfahren abgetrennt wurden.

Zu diesen Stoffen gehören organische Nebenprodukte, die von den bei der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen neben der D-Pantothensäure erzeugt und ausgeschieden werden. Dazu zählen L-Aminosäuren, aus der Gruppe L-Methionin, L-Lysin, L-Valin, L-Threonin, L-Alanin oder L-Tryptophan, insbesondere L-Valin. Dazu gehören weiterhin organische Säuren, die eine bis drei Carboxylgruppen tragen wie zum Beispiel Essigsäure, Milchsäure, Citronensäure, Apfelsäure oder Fumarsäure. Schließlich gehören dazu auch Zucker wie zum Beispiel Trehalose. Diese Verbindungen sind insofern gegebenenfalls erwünscht, als sie die nutritive Wertigkeit des Additivs verbessern.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Futtermittel-Additiven, dadurch gekennzeichnet, daß

• a) die Chloridionen-Konzentration im Produktionsfermenter < 300 mg/l ist,
• b) man aus einer durch Fermentation gewonnenen D-Pantothensäure-haltigen Fermentationsbrühe, gegebenenfalls vollständig oder teilweise, die Biomasse und/oder einen Teil der weiteren Bestandteile abtrennt,
• c) man die so erhaltene Lösung bzw. Brühe gegebenenfalls mit dem Hydroxid oder Oxid eines Erdalkali- oder Alkalimetalls versetzt,
• d) man das gemäß a) oder b) erhaltene Gemisch gegebenenfalls auf konzentriert und
• e) man es auf geeignete Weise trocknet und
• f) man durch geeignete Maßnahmen ein rieselfähiges D-Pantothensäure und/oder deren Salze in einer Menge von 20 bis 80 Gew.-% (Trockenmasse) enthaltendes Tierfuttermittel-Additiv mit einer Korngrößenverteilung von 200 bis 2000 &mgr;m gewinnt.

Bevorzugt ist das Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Futtermittel-Additiven, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) aus einer durch Fermentation gewonnenen D-Pantothensäure-haltigen Fermentationsbrühe, gegebenenfalls vollständig oder teilweise, die Biomasse und/oder einen Teil der Bestandteile abtrennt,
• b) das so erhaltene Gemisch gegebenenfalls aufkonzentriert und
• c) das Ammoniumpantothenat enthaltende Futtermittel-Additiv durch geeignete Maßnahmen in eine rieselfähige Form überführt und
• d) durch geeignete Maßnahmen ein rieselfähiges Tierfuttermittel-Additiv mit einer Korngrößenverteilung von 20 bis 2000 &mgr;m gewinnt.

Bevorzugt ist auch das Verfahren zur Herstellung von Tierfuttermittel-Additiven mit einem Gehalt an D-Pantothensäure und/oder deren Salzen ausgewählt aus der Gruppe Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Magnesium- oder Calciumsalz im Bereich von 20 bis 80 Gew.-% (Trockenmasse) aus Fermentationsbrühen, gekennzeichnet durch die Schritte

• a) gegebenenfalls Entfernen von Wasser aus der Fermentationsbrühe (Aufkonzentration),
• b) Entfernen der während der Fermentation gebildeten Biomasse in einer Menge von ≥ 0 bis 100%,
• c) gegebenenfalls Zusatz von einem oder mehreren Hydroxiden oder Oxiden eines Erdalkali- oder Alkalimetalls zu den gemäß a) und b) erhaltenen Fermentationsbrühen, wobei die Menge der zugesetzten Verbindungen so bemessen ist, daß deren Gesamtkonzentration im Tierfuttermittel-Additiv im Bereich von 20 bis 80 Gew.-% liegt, und
• d) Gewinnung des Tierfuttermittel-Additivs in der gewünschten Pulver- oder bevorzugt Granulatform.

Man gewinnt das erfindungsgemäße Tierfuttermittel-Additiv aus der Fermentationsbrühe gegebenenfalls nach Zusatz von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen und gegebenenfalls nach Zusatz von organischen oder anorganischen Hilfsstoffen durch

• a) Trocknen und Kompaktieren oder
• b) Sprühtrocknen oder
• c) Sprühtrocknen und Granulieren oder
• d) Sprühtrocknen und Aufbaugranulieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform stellt man eine D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltende Fermentationsbrühe her, bei der

• a) die Fermentation in einem im wesentlichen chloridfreien Medium abläuft,
• b) man die erhaltene Fermentationsbrühe, gegebenenfalls nach Abtrennung der Biomasse und Aufkonzentrierung, trocknet, kompaktiert, sprühtrocknet, sprühgranuliert oder granuliert oder auf einen Träger aufzieht oder in eine stabilisierende Matrix einbettet.

Geeignet für das erfindungsgemäße Verfahren sind Fermentationsbrühen, die unter Verwendung von zur Produktion von D-Pantothensäure geeigneten Mikroorganismen gewonnen werden und D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthalten. Bei den Salzen handelt es sich im allgemeinen um das Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Magnesium- oder Calciumsalz.

Bei den Mikroorganismen kann es sich um Pilze oder Hefen, wie zum Beispiel Debaromyces castellii, oder Gram-positive Bakterien zum Beispiel der Gattung Corynebacterium oder Gram-negative Bakterien, wie zum Beispiel die der Familie Enterobacteriaceae, handeln. Bei der Familie der Enterbacteriaceae ist besonders die Gattung Escherichia mit der Art Escherichia coli zu nennen. Innerhalb der Art Escherichia coli sind die sogenannten K-12-Stämme wie zum Beispiel die Stämme MG1655 oder W3110 (Neidhard et al.: Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washington D. C.)) oder der Escherichia coli Wildtypstamm IFO3547 (Institut für Fermentation, Osaka, Japan) und davon abgeleitete Mutanten zu nennen. Unter den aus IFO3547 hergestellten Stämmen zeichnen sich wiederum FV5069/pFV31 (EP-A-0 590 857) und FV5069/pFV202 (WO 97/10340) aus. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen.

Die oben beschriebenen Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im Batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im Fed-Batch-Verfahren (Zulaufverfahren) oder Repeated-Fed-Batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der D-Pantothensäure-Produktion kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Mikroorganismen genügen. Das Fermentationsmedium ist im wesentlichen frei von chloridhaltigen Bestandteilen. Erfindungsgemäß beträgt die Chloridionen-Konzentration im Produktionsfermenter < 300 mg/l, vorzugsweise < 200 mg/l und ganz besonders bevorzugt < 150 mg/l. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie zum Beispiel Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie zum Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie zum Beispiel Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies Vorstufen der D-Pantothensäure wie Aspartat, &bgr;-Alanin, Ketoisovalerat, Ketopantoinsäure oder Pantoinsäure und gegebenenfalls deren Salze zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur Kontrolle des pH-Wertes werden Ammoniak oder Ammoniakwasser oder andere basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Calciumhydroxid eingesetzt. Werden saure Verbindungen zur Kontrolle des pH-Werts benötigt, so können zweckmäßigerweise Phosphorsäure oder Schwefelsäure eingesetzt werden. Zur direkten Darstellung des Calciumsalzes der Pantothensäure setzt man während der Fermentation Calciumhydroxid in Form einer wäßrigen Suspension ein. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden werden dem Medium gegebenenfalls geeignete selektiv wirkende Stoffe, zum Beispiel Antibiotika, hinzugefügt. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen wie zum Beispiel Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich die Maximalmenge an D-Pantothensäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Die so erhaltenen Fermentationsbrühen haben üblicherweise eine Trockenmasse von 7,5 bis 25 Gew.-% und enthalten 2 bis 20 Gew.-% D-Pantothensäure. Besonders vorteilhaft sind solche Fermentationsverfahren, bei denen die D-Pantothensäure zu mindestens 20 Gew.-% in der Trockenmasse nach Beendigung der Fermentation vorliegt. Vorteilhaft ist außerdem auch, wenn die Fermentation zumindest am Ende, vorteilhaft jedoch über mindestens 30% der Fermentationsdauer zuckerlimitiert gefahren wird. Das heißt, daß während dieser Zeit die Konzentration an verwertbarem Zucker im Fermentationsmedium auf ≥ 0 bis 3 g/l gehalten bzw. abgesenkt wird.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Additive werden die D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Fermentationsbrühen vorzugsweise zunächst durch bekannte Separationsmethoden wie zum Beispiel Zentrifugation, Filtration, Dekantieren oder eine Kombination hieraus vollständig oder zum Teil von der Biomasse befreit. Es ist erfindungsgemäß jedoch auch möglich, die Biomasse gänzlich in der Fermentationsbrühe zu belassen. Anschließend wird die auf diese Weise erhaltene Suspension vorzugsweise auf maximal 60 Gew.-% Trockenmasse aufkonzentriert und beispielsweise mit Hilfe eines Sprühtrockners oder einer Gefriertrocknungsanlage zu einem Pulver aufgearbeitet. Anschließend wird dieses Pulver durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-Verfahren in ein gröberkörniges, gut rieselfähiges, lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt überführt. Vorteilhaft bei der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen organischen oder anorganischen Hilfsstoffen, beziehungsweise Trägern wie Stärke, Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen Stoffen, wie sie üblicherweise in der Lebensmittel- oder Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-, oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikaten oder Stearaten.

Alternativ kann das Produkt aber auch auf einen in der Futtermittelverarbeitung bekannten und üblichen organischen oder anorganischen Trägerstoff wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken, Zucker oder dergleichen aufgezogen und/oder mit üblichen Verdickungs- oder Bindemitteln stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817) beschrieben.

Die erfindungsgemäßen neuen D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden festen Produkte, die man nach dem oben beschriebenen Verfahren herstellen kann, enthalten 20–80 Gew.-% und vorzugsweise 30–75 Gew.-% D-Pantothensäure. Sie enthalten im allgemeinen anorganische Bestandteile in einer Menge von 2,5–25 Gew.-% und gegebenenfalls organische Nebenprodukte in einer Menge von > 0 bis 30 Gew.-%. Der Gehalt an Biotrockenmasse beläuft sich auf ≥ 0 bis 35 Gew.-%. Der Wassergehalt ist bevorzugt < 5 Gew.-%.

Die erfindungsgemäßen neuen D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Produkte, die man nach den oben beschriebenen Verfahren herstellt, zeichnen sich durch eine Korngrößenverteilung von 20 &mgr;m bis 2000 &mgr;m, vorzugsweise 50 &mgr;m bis 800 &mgr;m und besonders bevorzugt 150 &mgr;m bis 600 &mgr;m aus. Der Feinststaubanteil (< 10 &mgr;m) liegt bei ca. 0 Gew.-% bis 10 Gew.-%, bevorzugt bei ca. 0 Gew.-% bis 5 Gew.-%. Das Produkt wird als Futtermittel-Additiv eingesetzt.

Die Konzentration an D-Pantothensäure kann mit bekannten Verfahren (Velisek; Chromatographic Science 60, 515–560 (1992)) bestimmt werden.

Die Korngrößenverteilung kann mit Methoden der Laserbeugungsspektrometrie durchgeführt werden. Die entsprechenden Methoden sind im Lehrbuch zur „Teilchengrößenmessung in der Laborpraxis" von R. H. Müller und R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996), oder im Lehrbuch „Introduction to Particle Technology" von M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons (1998), beschrieben.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Zu diesem Zweck wurden Versuche mit dem D-Pantothensäure produzierenden Stamm Escherichia coli 5069/pFV31 durchgeführt, der als FERM-BP 4395 gemäß Budapester Vertrag beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology in 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki (Japan), hinterlegt ist (EP-A-0590857).

Die Messungen wurden an einem Laserbeugungsspektrometer vom Typ Cilas 920 der Firma Quanto Chrome (Odelzhausen, Deutschland) durchgeführt. Die Auswertung der Meßergebnisse erfolgte nach der Vorschrift der Deutschen Industrienorm DIN 66141 zur Darstellung der Korngrößenverteilung.

Eine Probe von Escherichia coli FV5069/pFV31 wurde auf LBG-Agar ausgestrichen, der mit 50 &mgr;g pro ml Ampicillin supplementiert worden war. Diese Agarplatten-Kultur wurde 17 Stunden bei 37°C inkubiert und dann im Kühlschrank bei +4°C aufbewahrt. Ausgewählte Einzelkolonien wurden anschließend in LBG-Bouillion weiter vermehrt. LBG-Bouillion hat folgende Zusammensetzung: 10 g/l Pepton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl und 1 g/l Glucose. LBG-Agar enthält zusätzlich 12 g/l Agar. Vorgefertigte Zubereitungen können von der Firma Gibco/BRL (Paisley, Schottland, Großbritanien) als LB Broth Base oder LB-Agar bezogen werden. Nach Zusatz von 1 g/l Glucose erhält man dann die angegebenen Medien. Kulturen von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeyerkolben enthalten waren, wurden 16 Stunden bei 37°C und 180 U/min auf einem ESR-Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert. Im Anschluß wurde die Zellsuspension auf einer Zentrifuge vom Typ J-6B der Firma Beckmann (Hannover, Deutschland) 15 Minuten bei 4000 U/min abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 10 ml LBG-Medium, das mit 20% Glycerin supplementiert worden war, resuspendiert, in 10 Aliquots je 1 ml unter sterilen Bedingungen abgefüllt und bei –70°C eingefroren. Diese Kulturen wurden als „master"-Zellbank (master cell bank) verwendet.

Für die Herstellung einer Arbeitszellbank (working cell bank) wurde LBG-Medium, das mit 50 &mgr;g/ml Ampicillin supplementiert worden war, in 10-ml-Portionen auf 100-ml-Erlenmeyerkolben verteilt und anschließend mit 100 &mgr;l der oben beschriebenen „master"-Zellbank beimpft. Die Inkubation erfolgte über einen Zeitraum von 16 Stunden bei 37°C und 180 U/min auf einem ESR-Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz).

Nach der Inkubation wurde die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer der Firma Dr. Lange (Berlin, Deutschland) bei einer Meßwellenlänge von 660 nm bestimmt. Sie betrug 3,5. Anschließend wurde die Zellsuspension in sterilen 30-ml-Polyethylenröhrchen der Firma Greiner (Frickenhausen, Deutschland) unter sterilen Bedingungen abgefüllt und bei 2500 U/min 15 Minuten mit einer Zentrifuge vom Typ J-6B der Firma Beckmann (Hannover, Deutschland) abzentrifugiert. Die abgetrennte Biomasse wurde in 10 ml LBG-Medium, das mit 20% Glycerin supplementiert worden war, resuspendiert. Im Anschluß wurde die Zellsuspension in 500-&mgr;l-Portionen in 1 ml sterilen Röhrchen der Firma Nalgene (New York, U.S.A.) unter sterilen Bedingungen abgefüllt und bei –70°C eingefroren. Die auf diese Weise hergestellten Konserven wurden als Arbeitszellbank (working cell bank) verwendet.

Zur Herstellung einer Calcium-D-pantothenat-haltigen Fermentationsbrühe wurde die Arbeitszellbank zunächst in einer Schüttelkolbenkultur vermehrt und diese zur Beimpfung eines Vorfermenters verwendet. Die Kultur des Vorfermenters wurde zur Beimpfung des Produktionsfermenters verwendet.

Für die Schüttelkolbenkultur wurde das SKA-Medium verwendet (Tabelle 1). Dieses SKA-Medium wurde folgendermaßen zubereitet: In einem 1-l-Becherglas wurden 7,0 g (NH₄)₂SO₄, 0,5 g KH₂PO₄, 1,0 g K₂HPO₄, 0,5 g MgSO₄·7H₂O, 0,01 g MnSO₄·H₂O, 0,001 g ZnSO₄·7H₂O, 0,005 g Fe₂(SO₄)₃ und 20 g Maisquellwasser abgewogen, das zuvor mit 25%iger Ammoniaklösung auf pH 6,8 eingestellt worden war, und anschließend mit destilliertem Wasser auf 825 g aufgefüllt. Diese Maisquellwasser-haltige Salzlösung wurde im Autoklaven 20 Minuten bei 121°C sterilisiert. Weiterhin wurde eine Lösung aus 25 g Glucose und 0,002 g Thiamin·HCl mit destilliertem Wasser auf 125 g aufgefüllt und durch Filtration sterilisiert. 10 g CaCO₃ wurden in einem 100-ml-Kolben abgewogen und im Autoklaven 20 Minuten bei 123°C sterilisiert. Durch Vereinigung der beiden oben genannten Komponenten mit der Maisquellwasser-haltigen Salzlösung wurde das Medium SKA erhalten.

Dieses Medium SKA wurde in 12,5-ml-Portionen auf 100-ml-Erlenmeyerkolben verteilt und anschließend mit 0,5 ml einer Zellsuspension beimpft. Als Zellsuspension wurde eine mit steriler physiologischer Kochsalzlösung 1:100 verdünnte Konserve der Arbeitszellkultur verwendet. Die Inkubation erfolgte über einen Zeitraum von 20 Stunden bei 32°C und 150 U/min auf einem RC-1-TK-Inkubator der Firma Infors AG (Bottmingen, Schweiz). Die im Anschluß daran bestimmte optische Dichte bei einer Meßwellenlänge von 660 nm (OD 660) betrug 12,5.

Zur Inokulierung von 20 kg des Vorkulturmediums A1-102, das in einem 42-l-Rührreaktorfermenter der Firma Bioengineering (Wald, Schweiz, Modell LP-42) enthalten war, wurden 0,5 ml des SKA-Mediums 1:100 verdünnt und 50 ml dieser Suspension in den Fermenter zugegeben. Das Vorkulturmedium A1-102 enthielt die in Tabelle 2 aufgeführten Bestandteile. Die Kultur wurde 15,5 Stunden bei einer Temperatur von 37°C, einer volumenspezifischen Belüftung von 0,5 Volumen/Volumen/Minute (vvm), einem Sauerstoffpartialdruck von 20% der Luftsättigung und einem pH von 6,5 bis zum Erreichen einer OD 660 von 11,3 kultiviert.

Zur Inokulierung von 5830 g des Hauptkulturmediums M1-380, das in 14-l-Rührreaktorfermentern der Firma B. Braun (BBI, Deutschland, Melsungen, Modell Biostat E/ED) enthalten war, wurden 423 ml der zweiten Vorkultur in Medium A1-102 zugegeben. Das Hauptkulturmedium M1-380 enthielt die in Tabelle 3 aufgeführten Bestandteile. Die Kultur wurde zunächst 6,5 Stunden bei einer Temperatur von 37°C, einer volumenspezifischen Belüftung von 0,75 vvm, einer minimalen Rührung von 400 U/min und einem pH von 6,5 bis zum Erreichen einer OD 660 von 18,6 und einem Sauerstoffpartialdruck von 2% der Luftsättigung kultiviert. Die Kultur wurde anschließend weitere 41 Stunden bei einer Temperatur von 37°C, einem Sauerstoffpartialdruck von 2% der Luftsättigung und einem pH-Wert von 6,0 bis zum Erreichen einer OD 660 von 66,8 kultiviert. Nach einer Fermentationszeit von 13 Stunden wurde &bgr;-Alanin in einer Konzentration von 152,7 g in 570 ml H₂O über einen Zeitraum von 34,5 Stunden zugefüttert. Nach einer Fermentationszeit von 21,5 Stunden wurde eine zehnprozentige Ca(OH)₂-Lösung über einen Zeitraum von 26 Stunden zur pH-Statisierung zudosiert. 3,43 kg des Mediums M2-257 mit einer Glucose-Konzentration von 650,8 g/l und einer Thiamin·HCl-Konzentration von 35,7 mg/l wurde innerhalb von 41 Stunden zugefüttert.

Anschließend wurden die optische Dichte (OD) mit einem Digitalphotometer vom Typ LP1W der Firma Dr. Bruno Lange GmbH (Berlin, Deutschland) bei einer Meßwellenlänge von 660 nm und die Konzentration an gebildeter D-Pantothensäure mittels HPLC (Hypersil APS2 5 &mgr;m, 250 × 5 mm, RI-Detektion) bestimmt.

In der Fermentationsendprobe wurde nach 70,0 Stunden eine Calcium-D-pantothenat-Konzentration von 49,7 g/l, gemessen als D-Pantothensäure, festgestellt.

Der Gehalt an D-Pantothensäure wurde mit Hilfe einer HPLC-Anlage (HPLC = Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie) vom Typ M321 der Firma Knauer (Berlin, Deutschland) mittels RI-Detektion (Brechungsindex-Detektion) unter Verwendung einer Hypersil-APS2-Aminophase mit einer Korngröße von 5 &mgr;m bestimmt.

Aus einer Calcium-D-pantothensäure-haltigen Fermentationsbrühe, die nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellt worden war und etwa 4,9 Gew.-% D-Pantothensäure enthielt, wurde zunächst die Biomasse abgetrennt. Hierzu wurden 90 l der oben genannten Fermentationsbrühe durch Querstromfiltration mit einer 0,22-&mgr;m-Mikrofiltrationsmembran in einer Filtrationsanlage CERAFLO MSP005756 der Firma Millipore (Bad Homburg, Deutschland) abfiltriert.

Anschließend wurde die so behandelte Brühe dann unter Vakuum bei 40–80°C in einem Rotationsverdampfer (Rotavapor R-152 der Firma Büchi, Schweiz) auf einen Flüssigkeitsanteil von etwa 30% Trockengehalt eingeengt. Die so eingeengte Brühe wurde anschließend zur Darstellung des Calciumsalzes der D-Pantothensäure sprühgetrocknet. Hierzu wurde ein Technikumssprühtrockner der Firma Niro (Kopenhagen, Dänemark) vom Typ NIRO Minor mit Zerstäuberscheibe (120 mm Durchmesser; 135 m/s Umlaufgeschwindigkeit) bei einer Eingangstemperatur von 175°C, einer Ausgangstemperatur von 80°C und einem Trocknungsgasdurchsatz von 525 m³/h eingesetzt. Zum besseren Produktaustrag wurde dem Trocknungsgasstrom Sipernat 22 der Firma Degussa-Hüls AG (Frankfurt am Main, Deutschland) als Pulverhilfsmittel in einem Verhältnis von 5 Gew.-%, bezogen auf Trockenmasse des Konzentrats, zugesetzt.

Das so hergestellte Calcium-D-pantothenat-haltige Produkt besaß einen D-Pantothensäure-Gehalt von 48,5 Gew.-%, war rieselfähig und hatte eine Schüttdichte von 460 kg/m³ bei einer mittleren Korngröße von 34 &mgr;m.

Ein Calcium-D-pantothensäure-haltiges staubförmiges Produkt, das nach dem Verfahren von Beispiel 2 hergestellt worden war und etwa 48,5 Gew.-% D-Pantothensäure enthielt und eine mittlere Korngröße von 34 &mgr;m hatte, wurde mit einem Walzenkompaktor mit Zigarrenwalzen (Pharmapaktor der Firma BEPEX vom Typ L200/50 P) mit einer Preßkraft von 40–90 Newton kompaktiert. Die Drehzahl der Walzen betrug hierbei 10 Umdrehungen pro Minute. Das so auf diese Weise hergestellte Kompaktat wurde anschließend in Zerkleinersieben auf eine Korngrößenverteilung von 200 bis 400 &mgr;m gebrochen. Die Ausbeute in den einzelnen Kornfraktionen ist in Tabelle 5 zusammengefaßt.

Das Kompaktat zeichnete sich durch einen deutlich geringeren Feinstaubanteil und ein wesentlich verbessertes Fließverhalten im Vergleich zum pulverförmigen Ausgangsprodukt aus.

Die Fraktion „Mittlere Korngröße" wurde durch Siebung isoliert und stellt das Produkt dar. Das auf diese Weise hergestellte Produkt hatte einen Gehalt von ca. 40,7 Gew.-%, gemessen als D-Pantothensäure, und besaß eine Schüttdichte von 630 kg/m³.

Calcium-D-pantothensäure-haltiges pulverförmiges Produkt, welches nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren durch Sprühtrocknung aus einer Calcium-D-pantothensäure-haltigen Fermentationslösung hergestellt worden war, wurde anschließend durch Aufsprühen einer bestimmten Menge Wasser in einem Wirbelschichtgranulator weiter verarbeitet.

Hierzu wurden 300 g des nach Beispiel 2 hergestellten staubförmigen Calcium-D-pantothensäure-haltigen Produkts in einer Laborwirbelschichtanlage der Firma Aeromatics Niro (Kopenhagen, Dänemark) vorgelegt. Bei einer Wirbelschichttemperatur von 50°C und einer Abgastemperatur von 30°C wurde über eine Düsenvorrichtung 3 g Wasser pro Minute eingesprüht. Die Wirbelgastemperatur lag bei 70–80°C. Die Korngrößenverteilung des auf diese Weise hergestellten Produkts ist in Tabelle 6 dargestellt.

Der bestimmte Gehalt, gemessen als D-Pantothensäure, betrug 38,1 Gew.-%. Das Produkt war nahezu staubfrei. Die Schüttdichte betrug 310 kg/m³. Das Produkt war sehr gut rieselfähig.

Ein Calcium-D-pantothensäure-haltiges pulverförmiges Produkt, welches nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren durch Sprühtrocknung aus einer Calcium-D-Pantothensäure-haltigen Fermentationslösung hergestellt worden war, wurde in einem anderen Versuch durch Aufsprühen einer bestimmten Menge an konzentrierter Lösung an Calcium-D-pantothenat mit einem Trockenmassengehalt von etwa 50 Gew.-% in einem Wirbelschichtgranulator weiter verarbeitet.

Hierzu wurden 1000 g des nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellten staubförmigen Calcium-D-Pantothensäure-haltigen Produkts in einer diskontinuierlich arbeitenden Laborwirbelschichtanlage der Firma Glatt (Binzen, Deutschland) vorgelegt. Bei einer Wirbelschichttemperatur von ca. 40–45°C und einer Zulufttemperatur von ca. 80°C wurden über eine Düsenvorrichtung ca. 5 g des oben beschriebenen Konzentrats pro Minute in die Laborwirbelschichtanlage eingesprüht. Die Korngrößenverteilung des auf diese Weise hergestellten Produkts ist in Tabelle 7 dargestellt.

Der bestimmte Gehalt, gemessen als D-Pantothensäure, betrug 38,9 Gew.-%. Das Produkt war nahezu staubfrei. Die Schüttdichte betrug 400 kg/m³.

Nach dem hier beschriebenen oder einem anderen Sprüh-, Fließbett-, Rühr- oder Mischverfahren wird das D-Calcium-pantothenat-haltige oder D-Pantothensäure-haltige Konzentrat auf andere übliche organische oder anorganische Träger- oder Hilfsstoffe wie Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken, Zucker oder dergleichen gesprüht und gegebenenfalls unter Einsatz von Binde-, Gelier- oder anderen Formulierungshilfsmitteln granuliert.

Aus einer Calcium-D-pantothensäure-haltigen Fermentationsbrühe, die nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellt worden war und etwa 4,9 Gew.-% D-Pantothensäure enthielt, wurde zunächst die Biomasse abgetrennt. Hierzu wurden 90 l der oben genannten Fermentationsbrühe durch Querstromfiltration mit einer 0,22-&mgr;m-Mikrofiltrationsmembran in einer Filtrationsanlage CERAFLO MSP005756 der Firma Millipore (Bad Homburg, Deutschland) abfiltriert.

Anschließend wurde die so behandelte Brühe dann unter Vakuum bei 40–80°C in einem Rotationsverdampfer (Rotavapor R-152 der Firma Büchi, Schweiz) auf einen Flüssigkeitsanteil von etwa 50 Gew.-% Trockengehalt eingeengt. Das so hergestellte Calcium-D-pantothensäure-haltige Konzentrat mit einem D-Pantothensäure-Gehalt von 28,8 Gew.-% wurde dann zur Bildung eines freifließenden Granulats mit Hilfe eines Vakuumtrockners (Typ VT130, Gebrüder Lödige Maschinenbau GmbH, Paderborn, Deutschland) mit einer Kieselsäure (Sipernat 22 der Firma Degussa-Hüls AG, Frankfurt, Deutschland) vermischt. Zunächst wurden 15 kg der Kieselsäure (Sipernat 22 der Firma Degussa-Hüls AG, Frankfurt, Deutschland) im Vakuumtrockner (Typ VT130, Gebrüder Lödige Maschinenbau GmbH, Deutschland) vorgelegt und dann 39,0 kg des oben hergestellten Calcium-D-pantothensäure-haltigen Konzentrats mit einer Rate von 2,0 kg pro Minute unter einem Vakuum von 200 mbar zugegeben, wobei das zu vermischende Material eine Temperatur von 45°C aufwies und die Rührerleistung 120 U/min (Umdrehungen pro Minute) betrug. Dann wurde unter Erhöhung des Vakuums auf 50 mbar noch 15 Minuten weitergemischt. Das so hergestellte Calcium-D-pantothensäure-haltige Granulat wurde dann in einem Vibrationswirbelschichttrockner (Escher-Wyss, Linden, Deutschland) mit einer Wirbelschichtoberfläche von 0,3 m² bei einer Schichttemperatur von 65°C und einem Trocknungsgasdurchsatz von 270 Nm3/Stunde auf einen Restfeuchtigkeitsgehalt von weniger als 2 Gew.-% getrocknet. Die mittlere Korngrößenverteilung des Produkts ist in Tabelle 8 dargestellt.

Der bestimmte Gehalt, gemessen als D-Pantothensäure, betrug 32,6 Gew.-%. Das Produkt war nahezu staubfrei. Die Schüttdichte betrug nach der Trocknung 650 kg/m³.

Nach dem hier beschriebenen oder einem anderen Sprüh-, Fließbett-, Rühr- oder Mischverfahren kann das D-Calcium-pantothenat-haltige oder D-Pantothensäure-haltige Konzentrat auf andere übliche organische oder anorganische Träger- oder Hilfsstoffe wie Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken, Zucker oder dergleichen gesprüht und gegebenenfalls unter Einsatz von Binde-, Gelier- oder anderen Formulierungshilfsmitteln granuliert werden.