PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE102006004154A1 30.08.2007
Titel Verfahren zur Provirusinduktion
Anmelder Wagner, Christina, Dr.rer.nat., 07745 Jena, DE
Erfinder Wagner, Christina, Dr.rer.nat., 07745 Jena, DE
DE-Anmeldedatum 25.02.2006
DE-Aktenzeichen 102006004154
Offenlegungstag 30.08.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 30.08.2007
IPC-Hauptklasse C12N 7/02(2006.01)A, F, I, 20060703, B, H, DE
Zusammenfassung Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Provirusinduktion durch Cyclosporin A und Tacrolimus in latent virusinfizierten Zellpopulationen und -verbänden mit dem Ziel, infizierte Zellen mit Virusprotein zu markieren und Viren herstellen zu lassen.
Provirusinduktion latent infizierter Zellpopulationen durch Calcineurin-Inhibitoren ist ein eigenständiges und neuartiges Verfahren, das Anwendung im humantherapeutischen Bereich finden kann.
Latente Virusinfektionen stellen in lebensbedrohenden Erkrankungen wie HIV/Aids die Quelle für neue Viren und lassen trotz HAART keine Heilung zu. Calcineurin-Inhibitoren können in allen latent infizierten Zellen den lytischen Zyklus auslösen, der zur Bildung von viralen Nukleinsäuren und Proteinen führt. Über das HLA-Immunsystem werden diese Zellen markiert, von T-Zellen zur Apoptose getrieben, von Makrophagen phagozytiert und, ohne entzündliche Cytokine freizusetzen, rückstandsfrei entsorgt. Zelluläre und virale Nukleinsäuren werden dabei durch Endonukleasen zerstört und eine Neuinfektion durch Transfektion verhindert. Die Anwendung der Medikamente Cyclosporin A und Tacrolimus, in Therapiekonzepte eingebunden, kann deshalb zur Heilung lebensbedrohender viraler Erkrankungen wie HIV/Aids, B- und T-Zelllymphome, Multiple Sklerose oder lebenseinschränkender Erkrankungen wie Rheumatische Arthritis beitragen. Provirusinduktion bietet weiter die Möglichkeit, latente Virusinfektionen durch Virusbildung nachzuweisen, diese Viren virologisch ...

Beschreibung[de]

In der Zeit stetig steigender Infektionskrankheiten mit retroviraler Ursache wie HIV/Aids-Erkrankungen und Adulter T-Zellleukämie beim Menschen und den Entsprechungen bei Tieren kristallisiert sich ein Problem besonders heraus. Das sind die latent in den Zellen des menschlichen oder tierischen Genoms integrierten Proviren. Proviren sind ein essentielles Zwischenstadium des retroviralen Generationszyklus. Es ist dadurch charakterisiert, dass die retrovirale Nukleinsäure virale m-RNA durch das virale Enzym Reverse Transkriptase in virale DNA umgeschrieben und durch das Enzym Integrase in die menschliche DNA integriert wird und dort ständig verbleibt. Wird das zelluläre Genom bei der Zellvermehrung transkripiert, wird gleichzeitig auch die ProvirusDNA mit transkripiert. Es entstehen nach Transkription der ProvirusDNA virale m-RNA Moleküle, die gleichzeitig die virale Nukleinsäure und parallel dazu die Matritze für die Virusproteinbildung an zellulären Ribosomen darstellen. Die virale m-RNA und die viralen Proteine schließen sich in einem Prozess, der self assembly genannt wird, zu intakten und infektiösen Viruspartikeln zusammen, die bei Retroviren über die Zelloberfläche freigesetzt werden. Damit beginnt ein neuer Infektionszyklus, der wieder über das Provirusstadium in einer anderen neuinfizierten Zelle führt.

Die infizierten Zellpopulationen und Zellverbände sind prinzipiell nicht in der Lage, ihre zelleigene DNA auf integrierte ProvirusDNA zu scannen und und ProvirusDNA zu detektieren. Einmal integrierte ProvirusDNA bleibt ein Leben lang in der infizierten Zelle erhalten und wird sogar, in Keimzellen versteckt, auf die nächste Generation übertragen. So genannte Humane Endogene Retroviren (NERV) werden als Auslöser vieler Autoimmunkrankheiten diskutiert (11).

Viruserkrankungen und menschliches und tierisches Immunsystem haben sich über die Evolution parallel entwickelt. Deshalb existiert im Immunsystem ein Teil, das sogenannte HLA-System (Haupthistokompatibilitätskomplex), das auf intrazelluläre Parasiten wie Viren spezialisiert ist. Voraussetzung für den Erkennungsprozess intrazellulär vorhandener Viren ist die Virusproteinbildung. Virale Proteine werden wie zelluläre Proteine im Proteasom der Zelle in Peptide gespalten. Zelluläre Proteine, die speziell diese Viruspeptide anhand ihrer Epitope erkennen und binden, sind die sogenannten MHC-I Proteine (major histocompatibility complex). Sie werden genetisch in den HLA-Genen von Tier und Mensch kodiert. Die HLA-Genprodukte sind verantwortlich für die Erkennung, Komplexierung und Präsentation der viralen Peptide an der Zelloberfläche der infizierten Zelle. Mit anderen Worten, sie markieren eine virusinfizierte Zelle dann, wenn Virusproteine und davon abgeleitet, Viruspeptide gebildet werden.

Diese Markierung aus Viruspeptid/MHC-I-Proteinkomplex auf der Zelloberfläche der virusinfizierten Zelle ist das Target von CD8+ T-Lymphozyten. Sie erkennen und binden den Marker und senden der infizierten Zelle ein Selbstmordsignal. Daraufhin schrumpft die Zelle, Endonukleasen zerstören virale und zelluläre Nukleinsäuren einschließlich der Nukleinsäure des Provirus. Die bei dem Prozess der Apoptose aus der Zelle gebildeten apoptotischen Partikel werden von Makrophagen, den Fresszellen des Immunsystems, aufgenommen und dabei rückstandsfrei und ohne Entzündungen auszulösen, entsorgt.

Der natürliche Abwehrmechanismus des HLA Systems bei Mensch und Tier funktioniert sehr effektiv. Wenn dieser Mechanismus durch eine von Außen hervorgerufene substanzinduzierte Provirusinduktion provoziert und ausgelöst werden könnte, würde eine Anwendung in der Therapie viraler Erkrankungen möglich werden.

Stand der Technik

Es ist bekannt, dass experimentell in latent mit EBV (Epstein-Barr Virus) infizierten Zellkulturen durch Zusatz von TBA (12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate), n-Butyrat oder Phorbolester der lytische Zyklus von Epstein-Barr-Viren induziert werden kann (1). Dieses Verfahren wird im Labor verwendet. Die hierfür eingesetzten Chemikalien sind nicht für den Einsatz am Menschen zugelassen.

Es ist weiterhin bekannt, dass ein direkter Zusammenhang zwischen Cyclosporin A- Behandlung in Zellkulturen von EBV infizierten B-Lymphozyten und deren Tumorigenität besteht, der auch experimentell nachgewiesen wurde (7, 8).

Bekannt ist weiter das Auftreten von Posttransplantlymphoproliferativen Erkrankungen (PTLDs) sowohl von EBV (2, 3, 4, 5) als auch von HTLV-1 (Humaner T Zell-Leukämie Virus) (6) verursachten Erkrankungen nach Transplantationen. Die Entstehung von PTLDs wird ursächlich mit der Anwendung von Cyclosporin A und Tacrolimus als Immunsuppressiva in Zusammenhang gebracht und das suppremierte Immunsystem für die Reaktivierung viraler Infektionen verantwortlich gemacht.

Calcineurin-Inhibitoren werden auf Grund ihrer Eigenschaften als Cancerogene eingestuft (10). Ein direkter Zusammenhang mit dem Umschalten vom Latenzstadium in den lytischen Zyklus durch Cyclosporin A und Tacrolimus wurde bisher jedoch nicht diskutiert. Calcineurin-Inhibitoren sind häufige, in Menschen eingesetzte Medikamente, die vor allem als Immunsuppressiva zur Unterdrückung der Abstoßungsreaktionen nach Transplantationen oder Autoimmunerkrankungen angewendet werden.

Auf Grund der nachgewiesenen Wirksamkeit von Calcineurin-Inhibitoren, latente Virusinfektionen in virulente Virusinfektionen mit Freisetzen von infektiösen Viren zu transformieren, kann dieser Effekt gezielt provoziert und für Markierungszwecke latent infizierter Zellen ausgenutzt werden.

Aufgabe der Erfindung

Die Erfindung betrifft latent virusinfizierte Zellpopulationen und Zellverbände, deren Virus oder Virusnukleinsäuren normalerweise unerkannt von Zellgeneration zu Zellgeneration weitergegeben und in Abhängigkeit vom Immunstatus und Umweltbedingungen auch nach sehr langer Inkubationszeit sporadisch reaktiviert werden können. Das in der Erfindung beschriebene Verfahren dient dazu, in allen latent virusinfizierten Zellpopulationen und Zellverbänden systematisch den lytischen Zyklus der Virusvermehrung auszulösen, um Virusnukleinsäuren und Virusproteine gleichzeitig in allen infizierten Zellpopulationen und Zellverbänden herstellen zu lassen.

Die Aufgabe der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet,

  • 1. den Prozess der Proteinmarkierung latent virusinfizierter Zellpopulationen und Zellverbände zu sichern, um eine Vernichtung markierter Zellen durch das Immunsystem zu ermöglichen und
  • 2. die Bausteine Virusproteine und Virusnukleinsäuren zu intakten und infektiösen Viruspartikeln in der betroffenen Zelle zusammen fügen zu lassen, um die gebildeten kompletten Viren ihrerseits mit virologischen Methoden untersuchen zu können und Rückschlüsse auf die Ursache von Erkrankungen zuzulassen. Das können Tumorerkrankungen oder neurodegenerative Erkrankungen sein, deren Ethiologie bisher unbekannt ist.

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu beschreiben, mit dessen Hilfe gezielt latente Virusinfektionen aktiviert und zur Virusnukleinsäure- und Virusproteinbildung gebracht werden, um neue Viren zu produzieren. Es ist dabei unerheblich, ob es sich um bekannte oder unbekannte Virusinfektionen handelt und ob tierische oder menschliche Zellpopulationen oder Zellverbände davon betoffen sind.

Das Verfahren der substanzinduzierte Provirusinduktion latent virusinfizierter Zellpopulationen und Zellerbände durch die Calcineurin-Inhibitoren Cyclosporin A und Tacrolimus hat das Ziel,

  • 1. die Transkription der ProvirusDNA in virale m-RNA und nachfolgend auch die Virusproteinbildung auszulösen und dadurch die infizierte Zelle sicher als Virusantigen-tragend zu markieren, um die Vernichtung Antigen- tragender Zellen durch CD8+ T-Lymphozyten und Apoptose zu ermöglichen und
  • 2. die Bildung kompletter und infektiöser Viren zu garantieren, unabhängig davon, ob es sich um bekannte oder unbekannte Viren handelt. Das Verfahren der substanzinduzierte Provirusinduktion durch Calcineurin-Inhibitoren ist in Medizin, Tiermedizin und bei Xenotransplantationen anzuwenden, um komplette Viren zu erhalten und bietet

    2.1. die Möglichkeit. latent vorhandene Virusinfektionen überhaupt zu erkennen z.B. Zoonosen in transgenen Zellpopulationen oder Zellverbänden und

    2.2. die ethiologische Ursache von Tumoren und neurodegenerative Erkrankungen als viral verursacht festzustellen oder

    2.3. eine latente Virusinfektion als Ursache der Erkrankung auszuschließen und

    2.4. gebildete Viruspartikel zu isolieren, anzureichern und mit virologischen Methoden zu analysieren.

Substanzinduziere Provirusinduktion durch die Calcineurin-Inhibitoren Cyclosporin A und Tacrolimus ist ein neues und eigenständiges Verfahren zur gezielten Induktion der Transkription von ProvirusDNA, das in neuartigen Therapieverfahren zur Heilung lebensbetrohender Erkrankungen wie HIV/Aids, T-und B-Zelllymphome, Multiple Sklerosis und lebenseinschränkenden Erkrankungen wie Rheumatische Arthritis ausgenutzt werden kann, wenn zusätzlich durch Medikamente wie HAART (highly active antiretroviral therapy) oder Ganciclovir das self assempy der Viren (Retroviren oder EBV) gehemmt wird.

Die Apoptose infiziert markierter Zellen führt nicht zu Entzündungen der umgebenden Zellpopulation, weil der gesamte Inhalt einer infizierten Zelle phagozytiert und nicht durch Zelllyse freigesetzt wird. Intrazellulär enthaltene proinflammatorische Cytokine werden im Unterschied zur Lyse der Zelle (Antikörpererkennung, Komplementweg) bei der Zellvernichtung durch Apoptose nicht ausgeschieden.

Ausführungsbeispiele

  • 1. Durch Zusatz des Calcineurin-Inhibitors Cyclosporin A in einer Konzentration von 250-750 ng/ml zu menschlichen oder tierischen Zellpopulationen oder Zellverbänden einschließlich transgenen Zellpopulationen oder Zellverbänden über einen längeren Zeitraum führt zur Induktion des Virulenzstadiums latent vorhandener Virusinfektionen, gekennzeichnet dadurch, das virale m-RNA und Virusproteine gebildet werden, die experimentell nachweisbar sind. Die Bildung freier und infektiöser Viren kann im Falle unbekannter Virusinfektionen erwünscht sein, weil die entstehenden Viren mikrobiologisch untersucht werden können und Auskunft über die Ethiologie z.B. einer Erkrankung geben.
  • 2. Der Zusatz des Calcineurin-Inhibitors Tacrolimus (9) in einer Konzentration von 10-20ng/ml zu menschlichen und tierischen Zellpopulationen oder Zellverbänden einschließlich transgenen Zellpopulationen und Zellverbänden über einen längeren Zeitraum zur Induktion des lytische Zyklus latent vorhandener Virusinfektionen führt. Die Bildung von viraler mRNA und von Virusproteinen kann experimentell nachgewiesen werden. Die Freisetzung intakter und infektiöser Viren kann im Falle von unbekannten Virusinfektionen erwünscht sein und zur mikrobiologischen Untersuchung der Viren führen. Ein Rückschluss auf die Ethiologie einer Erkrankung ist somit gegeben.
  • 3. Der Zusatz von Calcineurin-Inhibitoren Tacrolimus (10-20 ng/ml) oder Cyclosporin A zu Zellpopulationen oder Zellverbänden in einer Konzentration von 250-750 ng/ml führt zur Provirusinduktion, gekennzeichnet durch die Bildung von viraler mRNA und Virusprotein, die experimentell nachgewiesen werden können. Die Bildung intakter Viren kann bei bekannten Virusinfektionen durch geeignete Hemmstoffe wie Protease-Inhibitoren zusätzlich unterbunden werden, gekennzeichnet dadurch, dass zwar eine Virus mRNA-Bildung und eine Viruspolyproteinbildung stattfindet- aber keine kompletten Viruspartikel gebildet werden und die Infektionskette damit unterbrochen wird. Ziel diese Manipulation ist die Markierung virusinfizierter Zellen mit Viruspeptid/MHC-1 Proteinkomplexen ohne eine Virusvermehrung zuzulassen, die eine Erkennung und zielgerichtete Vernichtung durch CD8+ T-Lymphozyten des Immunsystems erlauben.

Literaturnachweis

  • 1. Gradoville L., Kwa D., El-Guindy A. and Miller G., 2002: J Virol. 76(11):5612-26. Protein kinase C-independent activation of Epstein-Barr lytic cycle.
  • 2. Tsao L., Draoua H.Y., Mansukhani M., Bhagat G. and Alobeid B., 2004: Mod Pathol. 17(1):125-30. EBV-associated, extranodal NK-cell lymphoma, nasal type of breast, after heart transplantation.
  • 3.. Timms J.M., Bell A., Flavell J.R., Murray P.G., RickInson A.B., Traverse-Glehen A., Berger F. and Delecluse H.J., 2003: Lancet. 361(9353):217-23. Target cells of Epstein-Barr-virus (EBV)-positive posttransplant lymphoproliferative disease: similarities to EBV-positive Hodgkin's lymphoma.
  • 4. Chuhjo T.. Yachie A., Kanegane H., Kimura H., Shiobara S. and Nakao S., 2003: Am J Hematol. 72(4):255-8. Epstein-Barr virus (EBV)-associated post-transplantation lymphoproliferative disorder simultaneously affecting both B and T cells after allogeneic bone marrow transplantation.
  • 5. Tanner J.E. and Menezes J., 1994: Blood 84(11):3956-64. Interleukin-6 and Epstein-Barr virus induction by cyclosporine A: potential role in lymphoproliferative disease.
  • 6. Toro C., Benito R., Aguilera a., Bassani S., Rodrigeguez C., Calderon E., Caballero E., Alvarez P., Garcia J., Rodriguez-Iglesias M., Guelar A., del Romero J. and Soriano V.; HTLV Spanish Study Group., 2005: Infection with human T lymphotropic virus type I in organ transplant donors and recipients in Spain. J Med Virol. 76(2):268-70.
  • 7. Chen C. Johnston TD, Reddy KS, Merrick JC, Mastrangelo M, Ranjan D., 2001. J Surg Res. 100(2):166-70.Cyclosporine directly causes oxidative stress and promotes Epstein-Barr virus transformation of human B cells.
  • 8. Chen C. Reddy KS, Johnston TD, Khan TT, Ranjan D., 2003. J Surg Res. Aug; 113(2) :228-33. Vitamin E inhibits cyclosporin A and H2O2 promoted Epstein-Barr virus (EBV) transformation of human B cells as assayed EBV oncogenic LMP1 expression.
  • 9. Schuller S, Wiederkehr JC, Coelho-Lemos IM, Avilla SG, Schultz C., 2005. Transplant Proc. Mar; 37(2) :1151-2. Daclizumab induction therapy assoziated with Tacrolimus-MMF has better outcome compared with Tacrolimus-MMF alone in pedriatric living donor liver transplantation.
  • 10. Andre N., Roquelaure B. and J. Conrath, 2004. Molecular effects of cyclosporine and oncogenesis: a new model. Med.Hypotheses.63(4):647-52.
  • 11. Belshaw R.. Katzourakis A., Paces J., Burt A. and Tristem M., 2005: High copy number endogenous retrovirus families is associated with copying mechanisms in addition to reinfection. Mol Biol Evol. 22(4):814-7.


Anspruch[de]
Der Patentanspruch bezieht sich auf das Verfahren zur Provirusinduktion, gekennzeichnet dadurch, dass der Zusatz der Calcineurin-Inhibitoren Cyclosporin A oder Tacrolimus zu latent virusinfizierten Zellpopulationen oder Zellverbände von Tieren, transgenen Tieren und Menschen eine Virusnukleinsäure- und Virusproteinbildung auslöst, in deren Folge intakte und infektiöse Viruspartikel entstehen.






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com