Larven von Oreochromis niloticus wurden während des letzten Stadiums der Dottersackphase in die für die Experimente vorgesehene Anlage eingesetzt, eine Hälterungsanlage.

Zur Aufzucht der Larven wurde ein Süßwasserdurchflußsystem aufgebaut. Während der gesamten Versuchszeit wurden konstante Raumtemperatur (26 ± 1,4°C liegt im Optimalbereich dieser Fischart) und Lichtverhältnisse (12 h/Tag Beleuchtungsdauer, mit einer Lichtintensität von 1400 Lux, gemessen an der Wasseroberfläche) gewährleistet.

Die Anlage bestand aus hellgrauen, quaderförmigen Hälterungsbecken (ca. 184 dm³ Gesamtvolumen) aus Kunststoff (HDPE, Polyethylen hoher Dichte). Als Hochtank diente ein kleineres, gleichförmiges HDPE-Becken (ca. 67 dm³ Gesamtvolumen). Die Auslaufrohre (PVC, Polyvinylchlorid) befanden sich bei den Hälterungbecken 21 cm, beim Hochtank 9 cm über dem Beckenboden, so daß das Wasservolumen der gefüllten Becken ca. 94 dm³ bzw. 49 dm³ betrug. Um ein Entkommen der Larven zu verhindern, war die Ablauföffnung mit Gaze (335 &mgr;m Porenweite) bespannt. Das Wasser wurde im Hochtank vorgeheizt und über individuell regulierbare Zuläufe (Klemmen an den Zulaufschläuchen) den Larvenbecken dicht über der Wasseroberfläche zugeleitet. In jedem Becken wurde ein Belüfterstein (Kieselgurausströmer, 5 × 2,5 cm), der durch einen Schlauch an die zentrale Luftversorgung des Hauses angeschlossen war, auf schwache Belüftung eingestellt. Die Beleuchtung erfolgte durch zwei parallel zueinander angeordnete Leuchtstoffröhren, die ca. 50 cm über der Wasseroberfläche angebracht waren und sich über alle drei Versuchsbecken erstreckten. Der Wasserdurchfluß war in allen Becken gleich eingestellt und betrug 0,3 dm³/Min.

Die stündliche Wassererneuerungsrate betrug somit 19% des jeweiligen Beckenvolumens (94 dm³).

Die Verteilung der Larven auf die einzelnen Becken erfolgte so, daß die Brut unterschiedlicher Elterntiere nicht untereinander vermischt wurde. Drei Gruppen wurden miteinander verglichen: Larven, die mit lebendem Zooplankton (Artemia), Trockenbrutfutter (kommerzielles Forellenbrutfutter), oder Trockenbrutfutter angereichert mit PHA gefütter wurden.

Die Fütterung begann am Morgen nach der Besetzung der Hälterungsbecken. In dieser Arbeit wurden die Artemia-Nauplien (Lebendfutter) zweimal (10:30, 16:30), die Trockenfuttermittel dreimal täglich verabreicht (10:30, 14:30, 16:30), so daß alle Futtermittel ad libitum zur Verfügung standen.

Als Lebendfutter dienten Nauplien von Artemia salina. Die Erbrütung des Lebendfutters erfolgte in zwei Imhoff-Glastrichtern (1 dm³ Wasservolumen); die Einstellungen der abiotischen Faktoren, sowie die abgewogene Menge an Cysten entsprachen den Angaben des Herstellers für maximale Ausbeute. Pro Glastrichter wurde alle zwei Tage ein neuer Brutansatz gestartet.

Um einen kontinuierlichen Nachschub zu gewährleisten, wurden die zwei Trichter jeweils um 1 Tag versetzt befüllt. Nach 48 Stunden wurden die Nauplien in kaltem Nordseewasser bei guter Durchlüftung bis zur Fütterung (maximal 6 Stunden) gehältert. Der Inhalt eines Erbrütungsbehälters wurde innerhalb eines Tages verfüttert. Dies entsprach 3 Nauplien pro ml Beckenvolumen.

An die mit Trockenfutter ernährten Larvengruppen wurde täglich 10% ihres Gewichtes verfüttert. Als Trockenfutter wurde Forellenbrutfutter (Trouvit pro aqua^® Brut 000, MILKIVIT, TROUW NUTRITION DEUTSCHLAND GMBH, Burgheim) in Form von Granulat mit einer Korngröße von 0,4–0,6 mm eingesetzt.

Zur Berechnung der täglichen Rationen wurde in regelmäßigen Abständen das mittlere Naßgewicht von 10–20 Larven mit Hilfe einer Feinwaage (Sartorius, Genauigkeit bei 0–42g: 5 Stellen nach dem Komma) ermittelt. 10% dieses Mittelwertes multipliziert mit der verbliebenen Anzahl an Larven im jeweiligen Becken, ergab die abzuwiegende Futtermenge pro Tag.

Für die Gruppe mit dem angereicherten Trockenfutter, wurde das Forellenbrutfutter mit salzfreiem Phytohemagglutinin PHA-P (SIGMA-ALDRICH, Art. Nr. L-8754, lyophilisiert) vermischt. Die Verabreichung des Lectins (0,004 g/d PHA-P) erfolgte nur bei der ersten Tagesfütterung (10:30). Forellenbrutfutter und PHA-P wurden dazu in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß auf der Feinwaage abgewogen und auf dem Schüttler (Vortex) gründlich durchmischt.

Die Probennahme erfolgte stets morgens vor der ersten Fütterung. Von jeder Futtergruppe wurden täglich mit einer Glaspipette 20 Larven zusammen mit etwas Beckenwasser in Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt, wobei die maximale Anzahl pro Reaktionsgefäß 10 Larven betrug. Die Larven wurden sofort bei –70°C schockgefroren, um eine enzymatische Aktivität bzw. Veränderung zu unterbinden. An jedem Meßtag wurde die zur Aufarbeitung bestimmte Anzahl an Eppendorf-Reaktionsgefäßen, die mit Larven gefüllt waren, aus der Tiefkühltruhe in eine mit Eis gefüllte Plastikwanne gelegt und so bei ca. 0°C langsam zum Auftauen gebracht. Die einzelnen Larven wurden mit destilliertem Wasser gespült.

Ein Binokular (WILD, M5A, 141499) diente zur Überprüfung der Vollständigkeit des Darmtraktes, sowie zur Bestimmung der Totallänge (TL) mit Hilfe eines eingebauten Meßokulars (sechsfache Vergrößerung: 25 Teilstriche = 4 mm). Anschließend wurde jede Larve in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und mit 500 &ggr;&mgr;l TRIS-HCL-Puffer (0,1 Molar, pH 8,00) homogenisiert. Der 0,1 molare Puffer wurde mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan (C₄H₁₁NO₃, MERCK, Art. Nr. 8382), Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl₂ × 2H₂O, MERCK, Art. Nr. 2382) und deionisiertem Wasser angesetzt. Die Einstellung auf den gewünschten pH-Wert erfolgte mit 32%iger Salzsäure. Die Homogenisierung erfolgte bei den Proben aus dem ersten Versuch mit einem Mikropistill für Eppendorf-Reaktionsfäße. Für die Proben aus dem zweiten Versuch wurde am hinteren Ende des Mikropistills ein batteriebetriebener Motor (Pellet Pestle^® Motor, KONTES GLASS COMPANY) angebracht, der die Homogenisierungszeit wesentlich verkürzte. Die Reaktionsgefäße mit den „Rohhomogenaten" wurden dann in einer Kühlzentrifuge (Minifuge T, HERAKEUS) bei –2°C und einer Drehzahl von 6000/Min. eine Stunde lang zentrifugiert.

Die Messung der Trypsinaktivität erfolgte fluoreszenzphotometrisch. Durch den Einsatz eines für dieses Enzym hochspezifischen Substrates, das an ein fluoreszierendes Molekül gekoppelt ist, konnte die katalytische Aktivität des Enzyms als Anstieg der Fluoreszenz pro Zeiteinheit gezielt bestimmt werden. Dieser ist proportional zur Trypsinmenge im Homogenat. Als synthetisches Substrat diente Na-benzoyl-L-arginin-4-methyl-coumarinyl-7-amid (Z-Arg-MCA × HCl, BACHEM, I-1130, Lagerung bei –20°C). Es handelt sich hier um ein synthetisches Amid, das an dem Fluoreszenzchromophoren 4-methyl-coumarinyl-7-amid gekoppelt ist und vom Trypsin am Arginin spezifisch gespalten wird.

Bei der zur Messung der CCK-Konzentration angewendeten Methode handelt es sich um ein Bioassaysystem zur Erfassung biologisch aktiver Formen von Cholecystokinin (CCK). Das Prinzip der Messung basiert auf der sekretionsauslösenden Eigenschaft von CCK auf isolierte Azinuszellen. Aus dem Rattenpankreas gewonnene Azini sezernieren in Abhängigkeit von der CCK-Konzentration Amylase. Indem die Spezifität dieses Enzyms zu einem synthetischen Substrat genutzt wird, kann seine katalytische Aktivität gemessen werden. Als synthetisches Substrat wird 5-Ethyliden-(G₇)-PNP (PNP = p-Nitrophenol, G = Glucose) verwendet. Die quantitative Bestimmung der Amylase erfolgte photometrisch mittels eines Kit-Tests (Amyl, ROCHE).

Es konnte erstmalig eine Interaktion zwischen der Trypsinaktivität und der CCK-Konzentration bei Fischlarven gezeigt werden. Durch den Zusatz von Phytohaemagglutinin (einschließlich seiner Untereinheiten) zum Fischfutter, konnte eine Steigerung der CCK-Konzentration und konstante Trypsinaktivitäten von Fischlarven erzielt werden. Der Auftritt von negativen Effekten von PHA konnte in Bezug auf Wachstum, Überlebensraten und Trypsinogenaktivierung ausgeschlossen werden. Vergleichbares Längen- und Gewichtswachstum zwischen allen untersuchten Gruppen.