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Dokumentenidentifikation DE102006011277A1 13.09.2007
Titel Laser-Scanning-Mikroskop und Laser-Scanning-Mikroskopierverfahren
Anmelder Carl Zeiss MicroImaging GmbH, 07745 Jena, DE
Erfinder Bublitz, Daniel, Dr., 07743 Jena, DE;
Westphal, Peter, Dr., 07743 Jena, DE
Vertreter GEYER, FEHNERS & PARTNER (G.b.R.), 80687 München
DE-Anmeldedatum 10.03.2006
DE-Aktenzeichen 102006011277
Offenlegungstag 13.09.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 13.09.2007
IPC-Hauptklasse G02B 21/00(2006.01)A, F, I, 20060310, B, H, DE
IPC-Nebenklasse G01N 21/64(2006.01)A, L, I, 20060310, B, H, DE   
Zusammenfassung Es wird bereitgestellt ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Beleuchtungsmodul (BM), das einen ersten linienförmigen und einen davon beabstandeten zweiten linienförmigen Abschnitt (A1, A2, A3, A4) einer zu untersuchenden Probe (26) mit Laserstrahlung unterschiedlicher Wellenlänge beleuchtet, wobei in jedem Abschnitt (A1-A4) aufgrund einer Wechselwirkung der Laserstrahlung mit der Probe (26) Probenstrahlung erzeugt wird, mit einem Scanmodul (27), das eine Relativbewegung zwischen der Laserstrhlung zur Beleuchtung der Abschnitte (A1-A4) und der Probe (26) quer zu den linienförmigen Abschnitten (A1-A4) bewirkt, und mit einem Detektionsmodul (DM), das eine erste Detektionseinheit (D1) sowie einen ortsauslösenden Detektor (38, 44) aufweist, wobei die erste Detektionseinheit (D1) die linienförmigen Abschnitte (A1-A4) derart örtlich getrennt konfokal erfaßt, das für jeden Abschnitt (A1-A4) ein linienförmiges Probenstrahlenbündel erzeugt wird, das jeweils mittels dem Detektor (38, 44) örtlich aufgelöst detektiert wird.

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft ein Laser-Scanning-Mikroskop sowie ein Laser-Scanning-Mikroskopierverfahren, die insbesondere zur Detektion von Fluoreszenzstrahlung geeignet sind.

Für die fluoreszenzmikroskopische Vermessung sind verschiedene Detektionsprinzipien bekannt. So kann beispielsweise ein Laserstrahl punktförmig auf die Probe fokussiert und das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht durch eine Pinhole-Blende örtlich gefiltert und mit einem nachgeordneten, nicht ortsauflösenden Detektor registriert werden. Nachteilig ist hierbei jedoch, daß zum einen viele bewegliche Teile (zwei Scanner zur Ablenkung des fokussierten Laserstrahls über die gesamte Probe) verwendet werden müssen, was die Standzeit begrenzt. Ferner wird die Farbstoffanregung durch die sehr hohe Spitzenintensitäten im Fokus leicht gesättigt, so daß dies eine obere Grenze der maximalen Geschwindigkeit zur Erfassung eines örtlich aufgelösten Fluoreszenzbildes der Probe setzt. Des weiteren tritt auch die Schwierigkeit auf, daß eine starke Ausbleichung der Farbstoffe auftritt.

Die Probe kann mit einer linienförmig fokussierten Laserstrahlung beleuchtet werden, wobei diese Beleuchtungslinie dann über die Probe gescannt wird, um ein Bild der gesamten Probe zu erhalten. Die Detektion erfolgt beispielsweise mit einem CCD- oder CMOS-Zeilendetektor. Licht aus anderen Ebenen wird bei diesem Verfahren bevorzugt konfokal unterdrückt. Wenn man jedoch mehrere Farbstoffe in der Probe hat, die mit verschiedenen Laserwellenlängen angeregt werden müssen, so muß die Probe entweder mehrfach mit jeweils einer der Anregungswellenlängen vermessen werden, oder man regt die Fluoreszenz gleichzeitig mit allen Anregungslaserlinien an und detektiert das von allen Linien angeregte Licht spektral. Bei der ersten Alternative führt dies zu einer höheren Meßzeit. Bei der zweiten Alternative kann man nicht unterscheiden, welche Fluoreszenzstrahlung von welcher Laserstrahlung erzeugt wurde.

Es ist auch möglich, die Probe flächig zu beleuchten und mit einem ortsauflösenden Detektor zu vermessen. Spektrale Informationen können aber nur seriell gewonnen werden. Um eine konfokale Unterdrückung zu erreichen, müssen weitere aufwendige Maßnahmen ergriffen werden, so daß dieses Verfahren insgesamt nur für Proben mit wenigen Farbstoffen geeignet ist.

Ausgehend hiervon ist es Aufgabe der Erfindung, ein Laser-Scanning-Mikroskop sowie ein Laser-Scanning-Mikroskopierverfahren bereitzustellen, das einen möglichst einfachen Aufbau aufweist und hohe Meßgeschwindigkeiten ermöglicht.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Beleuchtungsmodul, das einen ersten linienförmigen und einen davon beabstandeten zweiten linienförmigen Abschnitte einer zu untersuchenden Probe mit Laserstrahlung unterschiedlicher Wellenlängen beleuchtet, wobei in jedem Abschnitt aufgrund einer Wechselwirkung der Laserstrahlung mit der Probe Probenstrahlung erzeugt wird, mit einem Scanmodul, das eine Relativbewegung zwischen der Laserstrahlung zur Beleuchtung der Abschnitte und der Probe quer zu den linienförmigen Abschnitten bewirkt, und mit einem Detektionsmodul, das eine erste Detektionseinheit sowie einen ortsauflösenden Detektor umfaßt, wobei die erste Detektionseinheit die linienförmigen Abschnitte derart örtlich getrennt konfokal erfaßt, daß für jeden Abschnitt ein linienförmiges Probenstrahlenbündel erzeugt wird, das jeweils mittels des Detektors örtlich aufgelöst detektiert wird.

Da das Laser-Scanning-Mikroskop (bevorzugt gleichzeitig) zwei linienförmige Abschnitte beleuchtet und diese (bevorzugt gleichzeitig) örtlich getrennt konfokal erfassen kann, ist es möglich, die Probenstrahlung sowohl nach Emissionswellenlängen als auch nach Anregungswellenlängen (bevorzugt gleichzeitig) getrennt zu detektieren. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn Fluoreszenzstrahlung von mehreren Farbstoffen, die in die Probe eingebracht sind, detektiert werden sollen. So ist es insbesondere möglich, zwei bis acht verschiedene Farbstoffe in der Probe zu separieren und deren Mengenverhältnisse zu bestimmen. Es müssen nur die entsprechende Anzahl von linienförmigen Abschnitten, die voneinander beabstandet sind, mit Laserstrahlung unterschiedlicher Wellenlänge beleuchtet und entsprechend konfokal detektiert werden.

Um ein örtlich aufgelöstes Bild der detektierten Probenstrahlung zu erhalten, kann mittels des Scanmoduls lediglich die Probe relativ zu der Laserstrahlung bewegt werden. Dies kann beispielsweise mit einem herkömmlichen x-y-Probentisch eines Mikroskops realisiert werden. Es muß also nur ein bewegliches Teil vorgesehen werden, um das gewünschte Bild zu erhalten. Dies vereinfacht den Aufbau, senkt die Herstellungskosten und führt zu hohen Standzeiten.

Die Probenstrahlung der linienförmigen Abschnitte kann mittels des Detektors gleichzeitig detektiert werden, so daß die Detektionsgeschwindigkeit erhöht werden kann.

Das Detektionsmodul kann eine zweite Detektionseinheit aufweisen, die die von der ersten Detektionseinheit kommenden Probenstrahlenbündel jeweils quer zur linienförmigen Ausdehnung spektral aufspaltet, wobei der Detektor bei der Detektion der Probenstrahlenbündel jeweils zumindest eine spektral aufgespaltene Wellenlänge örtlich ausgelöst detektiert. Damit kann man eine sehr hohe spektrale Auflösung bei der Detektion erreichen.

Das Beleuchtungsmodul kann mehr als zwei voneinander beabstandete, linienförmige Abschnitte mit Laserstrahlung unterschiedlicher Wellenlängen befeuchtet. Insbesondere können beispielsweise drei bis zehn Abschnitte gleichzeitig beleuchtet und auch detektiert werden.

Die erste Detektionseinheit kann zur örtlich getrennten konfokalen Erfassung eine Spaltblende aufweisen, die für jeden Abschnitt einen linienförmigen Spalt enthält. Mit einer solchen Spaltblende kann man in einfacher Art und Weise die gewünschte konfokale Detektion realisieren.

Das Beleuchtungsmodul kann zur Beleuchtung jedes Abschnitts die jeweilige Laserstrahlung linienförmig auf oder in die Probe fokussieren. Bevorzugt liegt quer zur Erstreckungsrichtung eine beugungsbegrenzte Fokussierung vor, um eine möglichst gute konfokale Detektion zu erzielen.

Das Beleuchtungsmodul kann insbesondere noch so ausgebildet sein, daß die Fokustiefe in der Probe veränderbar ist. Dadurch ist es möglich, verschiedene optische Schnitte in unterschiedlichen Probentiefen durchzuführen.

Die linienförmigen Abschnitte verlaufen bevorzugt parallel zueinander. Dies erleichtert den Aufbau des Beleuchtungs- sowie des Detektionsmoduls.

Das Detektionsmodul kann als Probenstrahlung insbesondere die durch die Laserstrahlung angeregte Fluoreszenzstrahlung detektieren.

Das Scanmodul kann mindestens einen Scanner-Spiegel (z.B. drehbarer Ablenkspiegel) aufweisen, der die Laserstrahlung für die Abschnitte simultan über die Probe lenkt. Mittels des bzw. der Scanner-Spiegel wird die Relativbewegung teilweise oder vollständig bewirkt. Wenn die Laserstrahlung linienförmig fokussiert wird, erfolgt die Ablenkung bevorzugt quer (insbesondere senkrecht) zur linienförmigen Ausdehnung der linienförmig fokussierten Laserstrahlung.

Das Detektionsmodul kann einen Filter enthalten, der aus der Probenstrahlung (also vor der konfokalen Erfassung) und/oder aus den Probenstrahlenbündeln (also nach der konfokalen Erfassung) die Wellenlängen der Laserstrahlung herausfiltert. Damit können z.B. bei der Detektion von Fluoreszenzstrahlung als Probenstrahlung die häufig unerwünschten Anregungswellenlängen herausgefiltert werden.

Der ortsauflösende Detektor ist insbesondere ein flächiger, ortsauflösender Detektor. Er kann beispielsweise als CMOS- oder als CCD-Detektor ausgebildet sein.

Ferner kann der Detektor als linienförmiger, ortsauflösender Detektor ausgebildet sein, wobei in diesem Fall die zweite Detektionseinheit bevorzugt eine dem Detektor vorgeschaltete Ablenkeinheit enthält, die den gewünschten Teil des spektral aufgespaltenen Probenstrahlenbündels auf den Detektor lenkt. Die Ablenkeinheit kann beispielsweise ein drehbar gelagerter Ablenkspiegel sein.

Zur spektralen Aufspaltung der Probenstrahlenbündel kann die zweite Detektionseinheit beispielsweise ein Ablenkprisma, ein Gitter oder auch ein sonstiges optisches bzw. dispersives Element enthalten, das die gewünschte spektrale Aufspaltung durchführt.

Das Beleuchtungsmodul kann eine Laserquelle zur Erzeugung der Laserstrahlung mit den unterschiedlichen Wellenlängen enthalten.

Ferner kann das Beleuchtungsmodul eine Abbildungseinheit umfassen, die die Abschnitte mit linienförmig fokussierten Laserstrahlenbündel beleuchtet. Die Abbildungseinheit ist insbesondere so ausgebildet, daß die Fokustiefe in der Probe verstellbar und einstellbar ist.

Ferner kann das Beleuchtungsmodul zur Erzeugung der Laserstrahlenbündel die Laserstrahlung durch eine Spaltblende transmittieren, die für jeden zu beleuchtenden Abschnitt einen transmissiven Spalt aufweist, wobei die einzelnen Spalte voneinander beabstandet sind.

Das Mikroskop kann ferner noch eine Steuereinheit umfassen, die zur Steuerung des Mikroskops dient. Die Steuereinheit ist insbesondere so ausgebildet, daß die beschriebenen Funktionen des Laser-Scanning-Mikroskops realisiert werden können.

Ferner kann das Mikroskop noch ein Auswertemodul umfassen, dem die Daten des Detektors zugeführt sind. Das Auswertemodul erzeugt aus diesen Daten dann die gewünschten (bevorzugt ortsaufgelösten) Bilder der Probenstrahlung.

Das Scanmodul kann bewirken, daß die Probe in einem Flüssigkeitsstrom so geführt wird, daß sie zumindest einen Beitrag zur Relativbewegung liefert. Ein weiterer Beitrag zur Relativbewegung kann beispielsweise mittels eines bewegbaren Probentisches oder eines Ablenkspiegels in dem Scanmodul erfolgen. Natürlich kann die Relativbewegung auch vollständig mittels des Flüssigkeitsstroms erzielt werden.

Das Laser-Scanning-Mikroskop kann somit als bildgebendes Zytometer bzw. bildgebendes Flow-Zytometer weitergebildet werden.

Wenn die Laserstrahlung linienförmig fokussiert wird, kann das Scanmodul so ausgebildet werden, daß der Flüssigkeitsstrom in einer Objektebene des Mikroskops senkrecht zur linienförmigen Ausdehnung der linienförmig fokussierten Laserstrahlung fließt.

Die Aufgabe wird ferner gelöst durch ein Laser-Scanning-Mikroskopierverfahren, bei dem ein erster linienförmiger und ein davon beabstandeter zweiter linienförmiger Abschnitt einer zu untersuchenden Probe (bevorzugt gleichzeitig) mit Laserstrahlung unterschiedlicher Wellenlänge beleuchtet wird, wobei in jedem Abschnitt aufgrund einer Wechselwirkung der Laserstrahlung mit der Probe Probenstrahlung erzeugt wird, und bei dem die linienförmigen Abschnitte (bevorzugt gleichzeitig) derart örtlich getrennt konfokal erfaßt werden, daß für jeden Abschnitt ein linienförmiges Probenstrahlenbündel erzeugt wird, das jeweils in linienförmiger Ausdehnung örtlich aufgelöst detektiert wird.

Mit diesem Verfahren ist es möglich, die Probenstrahlung spektral selektiv und selektiv nach Anregungswellenlängen zu detektieren.

Bei dem Verfahren können die Probenstrahlenbündel vor der Detektion jeweils quer zur linienförmigen Ausdehnung spektral aufgespalten werden und kann jeweils zumindest eine spektral augespaltene Wellenlänge örtlich aufgelöst detektiert werden.

Insbesondere bei der Detektion von Fluoreszenzstrahlung führt dies zu dem Vorteil, daß mehrere Farbstoffe spektral aufgelöst sowie spektral selektiv nach Anregungswellenlänge gleichzeitig detektiert werden können.

Bei dem Verfahren kann zur Beleuchtung jedes Abschnitts die jeweilige Laserstrahlung linienförmig auf oder in die Probe fokussiert werden. Dies führt zu einer besseren konfokalen Unterdrückung.

Insbesondere werden zueinander parallel verlaufende linienförmige Abschnitte beleuchtet. Dies erleichtert die Detektion der Probenstrahlung.

Insbesondere wird als Probenstrahlung durch die Laserstrahlung angeregte Fluoreszenzstrahlung detektiert.

Die örtlich aufgelöste Detektion kann linienförmig oder auch flächig durchgeführt werden. Wenn sie linienförmig durchgeführt wird, kann insbesondere ein linienförmiger, ortsauflösender Detektor vorgesehen werden, dem eine Ablenkeinheit vorgeschaltet ist, die den gewünschten Teil des spektral aufgespaltenen Probenstrahlenbündels auf den Detektor lenkt.

Für örtlich getrennte konfokale Erfassung kann insbesondere eine Spaltblende eingesetzt werden, die für jeden Abschnitte einen linienförmigen Spalt enthält. Dies führt zu einer ausgezeichneten konfokalen Unterdrückung der Probenstrahlung.

Ferner kann auch zur Beleuchtung der Abschnitte eine Spaltblende eingesetzt werden, die für jeden zu beleuchtenden Abschnitt einen transmissiven Spalt aufweist, wobei die einzelnen Spalte voneinander örtlich beabstandet sind.

Bei dem Verfahren kann eine Relativbewegung zwischen der Laserstrahlung zur Beleuchtung der Abschnitte und der Probe quer zur Erstreckungsrichtung der linienförmigen Abschnitte durchgeführt werden.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung beispielhalber noch näher erläutert. Es zeigen:

1 eine schematische Ansicht einer ersten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops;

2 eine Draufsicht der Spaltblende 17 von 1;

3 eine Draufsicht der beleuchteten Probe 26 von 1;

4 eine Draufsicht der Spaltblende 30 von 1;

5 eine Draufsicht des Detektors 38 von 1;

6 eine schematische Darstellung der Intensitätsverteilung der ersten Zeile 39 des Detektors 38 von 5;

7 eine zweite Ausführungsform des erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops,

8 eine schematische Ansicht einer zweiten Ausführungsform der Laserquelle 1, und

9 eine dritte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops.

Bei der in 1 gezeigten Ausführungsform umfaßt das Laser-Scanning-Mikroskop eine Laserquelle 1, die vier Laser 2, 3, 4, 5 sowie für jeden Laser 25 eine Lichtleitfaser 6, 7, 8, 9 enthält. Die Laser 25 erzeugen Laserstrahlung mit unterschiedlichen Wellenlängen, hier Laserstrahlung im UV-Bereich sowie blaue, grüne und rote Laserstrahlung, die in die Lichtleitfasern 69 eingekoppelt wird und an den den Lasern 14 abgewandten Enden als Laserstrahlenbündel 10, 11, 12, 13 mit im wesentlichen rundem Strahlquerschnitt und gaußförmiger Intensitätsverteilung abgegeben wird.

Den Lichtleitfasern 69 ist eine Linse 15, ein diffraktiv-optisches Element 16 sowie eine Spaltblende 17 nachgeordnet. Die Linse 15 bildet die aus den Fasern 69 austretenden Laserstrahlenbündel auf die Blende 17 ab. Das diffraktiv-optische Element 16 übernimmt dabei die Funktion einer Powell-Linse bzw. Powell-Spiegels, so daß die einzelnen Laserstrahlenbündel 1013 in der Ebene der Blende 17 jeweils einen linienförmigen Querschnitt aufweisen, der sich hier jeweils senkrecht zur Zeichenebene erstreckt. Gleichzeitig bewirkt das diffraktiv-optische Element 16, daß die Laserstrahlenbündel 1013 in der Ebene der Blende 17 ein annähernd homogenes Intensitätsprofil aufweisen.

Die Blende 17 weist, wie in der Draufsicht von 2 schematisch dargestellt ist, vier transmissive Bereiche 18, 19, 20 und 21 auf, auf die die linienförmigen Laserstrahlenbündel 1013 treffen und somit durch die Blende 17 hindurchtreten können. Die Bereiche 1821 sind bevorzugt jeweils als Spalt bzw. Schlitz ausgebildet und die restlichen Bereiche der Blende sind für die Laserstrahlung absorbierend und/oder reflektiv. Am Ort der Blende 17 liegen somit örtlich beabstandete, linienförmige Laserstrahlenbündel mit unterschiedlicher Wellenlänge vor, nämlich eine UV-Beleuchtungslinie (Spalt 18), eine blaue Beleuchtungslinie (Spalt 19), eine grüne Beleuchtungslinie (Spalt 20) sowie eine rote Beleuchtungslinie (Spalt 21).

Um eine konvergente Kugelwelle (hier die aus den Fasern 69 austretenden Laserstrahlenbündel 1013) auf einen Spalt (hier Spalte 1821 der Blende 17) mit einem diffraktiv-optischen Element abzubilden, wird herkömmlicher Weise ein spezielles eindimensionales diffraktives Profil verwendet. Da die Wirkung des diffraktiv-optischen Elements jedoch von der Wellenlänge der Strahlung abhängt, weist das hier verwendete diffraktiv-optische Element 16 in der zweiten Dimension ein sich kontinuierlich veränderndes und an die Wellenlänge angepaßtes Profil auf, so daß es für die Laserstrahlenbündel 1013 mit den unterschiedlichen Wellenlängen, die nebeneinander auf das diffraktiv-optische Element 16 treffen, optimal geeignet ist. Man kann beispielsweise in der zweiten Dimension ein lineare Skalierung des Profils des diffraktiv-optischen Elements vorsehen.

Die durch die Blende 17 transmittierten Laserstrahlenbündel 1013 werden mittels einer der Blende 17 nachgeordneten ersten Tubuslinse 22 nach unendlich abgebildet, durchlaufen einen Anregungsfilter 23 (z.B. einen Plasmafilter), der zur Herausfilterung unerwünschter Nebenmoden der Laser 14 dient, und werden dann über einen Teilerwürfel 24 und ein Objektiv 25 auf die zu untersuchende Probe 26 fokussiert, die auf einem Probentisch 27 liegt. Zur Vereinfachung der Darstellung ist nach der Blende 17 nur noch die Ausbreitungsrichtung der Laserstrahlenbündel 1013 sowie der nachher noch beschriebenen Probenstrahlung eingezeichnet. Somit wird die Probe 26 mit vier linienförmig fokussierten Laserstrahlenbündel 1013 beleuchtet, wobei die linienförmig fokussierten Laserstrahlenbündel 1013 parallel zueinander ausgerichtet und voneinander beabstandet sind. Es werden somit auf bzw. in der Probe 26, je nach Fokussierung mittels des Objektivs 25, linienförmige und voneinander beabstandete Abschnitte A1, A2, A3, A4 der Probe 26 beleuchtet, wie dies in der schematischen Draufsicht auf die Probe in 3 gezeigt ist.

Der Probentisch 27 ist, wie durch den Doppelpfeil P in 1 und 3 angedeutet ist, in einer Richtung quer zur Erstreckungsrichtung der linienförmig auf oder in die Probe fokussierten Laserstrahlenbündel 1013 bewegbar, so daß die Probe 26 relativ zum Beleuchtungsmuster M, das durch die vier auf oder in der Probe 26 linienförmig fokussierten Laserstrahlenbündel 1013 gebildet ist, bewegt werden kann. Die Laserstrahlenbündel 1013 werden somit mit einem Beleuchtungsmodul BM, das hier die Laser 14, die Lichtleitfasern 69, die Linse 15, das diffraktiv-optische Element 16, die Blende 17, die erste Tubuslinse 22, den Filter 22, den Teilerwürfel 24 sowie das Objektiv 25 enthält, auf oder in die Probe 26 fokussiert und dienen in dem hier beschriebenen Ausführungsbeispiel dazu, in der Probe Fluoreszenzlicht (Probenlicht) anzuregen.

Das so erzeugte Fluoreszenzlicht wird mittels des Objektivs 25 nach unendlich abgebildet und durchläuft den Teilerwürfel 24 sowie einen dem Teilerwürfel 24 nachgeordneten Detektionsfilter 28 (z.B. einen Notch-Filter), der die Anregungswellenlängen eliminieren soll. Das Probenlicht durchläuft dann eine zweite Tubuslinse 29, die es auf eine zweite Spaltblende 30 abbildet, die gleich ausgebildet ist wie die Spaltblende 17 und schematisch in Draufsicht in 4 gezeigt ist.

Somit trifft das vom UV-Laserstrahlenbündel 10 angeregte Fluoreszenzlicht auf den ersten Spalt 31. Das vom blauen Laserstrahlenbündel 11 angeregte Fluoreszenzlicht trifft auf den zweiten Spalt 32, das vom grünen Laserstrahlenbündel 12 angeregte Fluoreszenzlicht trifft auf den dritten Spalt 33 und das vom roten Laserstrahlenbündel 13 angeregte Fluoreszenzlicht trifft auf den vierten Spalt 34. In dieser Weise wird das Fluoreszenzlicht der einzelnen beleuchteten Abschnitte A1–A4 örtlich getrennt derart konfokal erfaßt, daß für jeden Abschnitt A1–A4 ein linienförmiges Probenstrahlbündel erzeugt wird. Alle linienförmigen Probenstrahlenbündel sind zueinander parallel und wiederum voneinander beabstandet und enthalten entlang der Linienrichtung die entsprechende spektrale Information vom zugeordneten Ort im entsprechenden Abschnitt A1–A4 der Probe. Das Objektiv 25, der Teilerwürfel 24, der Filter 28, die zweite Tubuslinse 29 sowie die Blende 30 bilden eine erste Detektionseinheit D1.

Die durch die Blende 30 transmittierten Probenstrahlenbündel werden mittels einer ersten Detektorlinse 35 nach unendlich abgebildet, dann mittels einem nachgeschalteten Prisma 36 quer zur linienförmigen Erstreckungsrichtung spektral aufgespalten und mit einer dem Prisma 36 nachgeordneten zweiten Detektorlinse 37 auf einen flächigen, ortsauflösenden CMOS-Sensor 38 (Detektor) abgebildet. Die Detektorlinsen 35, 37 und das Prisma 36 bilden eine zweite Detektionseinheit D2, die zusammen mit der ersten Detektionseinheit D1 und dem Sensor 38 das Detektionsmodul DM des Mikroskops bilden

Der CMOS-Sensor 38 ist in einer schematischen Draufsicht in 5 gezeigt, wobei jedes Pixel als Quadrat dargestellt ist. In dem hier gezeigten Beispiel umfaßt der Sensor 38 zur Vereinfachung der Darstellung acht Zeilen (x-Richtung) und zwölf Spalten (y-Richtung). Der Sensor 38 ist so ausgerichtet, daß die linienförmige Erstreckung der Probenstrahlenbündel mit der y-Richtung zusammenfällt, so daß entlang der x-Richtung die spektrale Aufspaltung stattfindet.

In 6 ist die Intensitätsverteilung I der ersten Zeile 39 des Sensors 38 schematisch dargestellt. Unter der Annahme, daß der Detektionsfilter 28 die Anregungsstrahlung nicht komplett unterdrücken kann, liegen die größten Intensitäten jeweils bei der Wellenlänge der Anregungsstrahlungen und sind hier mit r, g, b sowie UV für die rote, grüne, blaue Wellenlänge bzw. die UV-Wellenlänge gekennzeichnet. An jede Anregungsstrahlung schließt sich durch die spektrale Aufspaltung (hier nach rechts) das Spektrum der jeweiligen Fluoreszenzstrahlung 40, 41, 42, 43 an. Es ist somit möglich, die Probe 26 gleichzeitig mit allen gewünschten Anregungswellenlängen (hier vier) anzuregen und die Fluoreszenz spektral sowie nach Anregungswellenlänge aufzulösen. Da die Probe 26 linienförmig beleuchtet und konfokal linienförmig detektiert wird, kann jeweils der entsprechende Abschnitt A1–A4 der Probe 26 örtlich aufgelöst entlang der Erstreckungsrichtung der Abschnitte A1–A4 detektiert werden. Durch die Bewegung des Probentisches 27 entlang des Doppelpfeils P wird dann eine streifenförmige Abtastung der Probe 26 ermöglicht, so daß ein Bild der Fluoreszenzstrahlung der Probe zusammengesetzt werden kann.

Der CMOS-Sensor 38 kann vorteilhaft dazu genutzt werden, nur die Spalten (x-Koordinate) auszulesen, die der zu detektierenden Fluoreszenzstrahlung entsprechen. Damit ist eine schnelle Auswertung möglich.

Ferner können vorteilhaft einzelne Spalten zusammengeschaltet und zusammen ausgelesen werden, was auch als Hardwarebinning bezeichnet wird. Damit kann die spektrale Auflösung der Detektion verändert und eingestellt werden.

Alternativ ist es möglich, das Prisma 38 gegen ein anderes Prisma auszuwechseln, das ein anderes Dispersionsverhalten aufweist, so daß bei gleichem Ablenkwinkel mittels des Prismas unterschiedliche spektrale Auflösungen vorliegen.

Bei der beschriebenen Ausführungsform des Laser-Scanning-Mikroskops wird vorteilhaft nur ein Minimum an bewegten Teilen benötigt, hier nur der Probentisch 27. Da das Mikroskop mit einem einzigen Scan über den zu untersuchenden Probenbereich die gesamte spektrale Information der Probe 26 als Funktion der Anregungs- und Detektionswellenlänge vermessen kann, eignet sich das Mikroskop auch sehr gut für die Realisierung eines schnellen, bildgebenenden Flow-Zytometers.

Wenn man dreidimensionale Probenbilder erzeugen will, wird die Probe 26 mehrfach mit unterschiedlichen Fokustiefen der linienförmig fokussierten Laserstrahlenbündel 1013 abgescannt.

In 7 ist eine Abwandlung der Ausführungsform von 1 gezeigt, wobei gleiche Bauelemente bzw. Bauteile mit gleichen Bezugszeichen bezeichnet sind und zu deren Beschreibung auf die obigen Ausführungen verwiesen wird. Im Unterschied zu der in 1 gezeigten Ausführungsform weist die Ausführungsform von 7 keinen flächigen, ortsauflösenden Sensor, sondern einen linienförmigen ortsauflösenden Sensor 44 (also ein eindimensional auflösender Sensor und keinen zweidimensional auflösenden Sensor wie bei 1) auf, der sich hier senkrecht zur Zeichenebene erstreckt. Zwischen der zweiten Detektorlinse 37 und dem Sensor 44 ist ein um eine senkrecht zur Zeichenebene verlaufenden Drehachse drehbarer Ablenkspiegel 45 angeordnet, der aus der spektralen Aufspaltung der linienförmigen Probenstrahlenbündel die Linie mit der gewünschten, zu detektierenden Wellenlänge auf den Sensor 44 lenkt. Damit können bei dieser Ausführungsform die einzelnen Linien nur zeitlich nacheinander detektiert werden.

In 8 ist eine Abwandlung der Laserquelle 1 sowie der nachgeordneten Optik bis zur Spaltblende 17 schematisch dargestellt. Auch hier sind gleiche Elemente wie bei der Ausführungsform von 1 mit gleichen Bezugszeichen bezeichnet und zu deren Beschreibung wird auf die obigen Ausführungen verwiesen. Die Laserstrahlenbündel 10, 11, 12 und 13 werden mit Hilfe der Linsen 46, 47, 48 und 49 kollimiert und mittels einem Umlenkspiegel 50 sowie drei dichroitischer Spiegel 51, 52 und 53 zu einem gemeinsamen Laserstrahlenbündel 55 überlagert. Das überlagerte Laserstrahlenbündel wird mittels eines Gitters 55 in Abhängigkeit der Wellenlängen in vier Teilstrahlenbündel aufgespalten, die dann mittels der Linse 15 und dem diffraktiv-optischen Element 16 auf die Spaltblende 17 als vier Laserstrahlenbündel mit linienförmigem Querschnitt und nahezu homogener Intensitätsverteilung treffen. Der weitere Strahlverlauf ist wie bei den in 1 bzw. 7 gezeigten Ausführungsform.

Statt des Prismas 36 zur spektralen Aufspaltung der Probenstrahlenbündel kann auch ein Gitter oder jedes andere dispersive optische Element verwendet werden, um die gewünschte spektrale Aufspaltung zu erzielen.

Die Filter 23 und 28 sind jeweils etwas zur optischen Achse geneigt, um den Einfluß von unerwünschten Reflexionen an den Filtern zu minimieren. Die Filter 23 und 28 können auch weggelassen werden.

In einer Abwandlung der Ausführungsformen von 1 und 7 wird das Prisma 36 durch ein Prisma mit korrigierter Dispersion ersetzt, das somit nur die gewünschte Umlenkung der Probenstrahlenbündel und keine spektrale Aufspaltung durchführt. Es kann auch ein Umlenkspiegel statt des Prismas 36 vorgesehen werden. Das Prisma 36 kann auch vollständig entfallen. In diesem Fall müssen lediglich die dem Prisma 36 nachfolgenden Optikelemente so angeordnet werden, daß die Probenstrahlenbündel immer noch auf den Detektor 38, 44 treffen.

In diesem Fall ist es bevorzugt, daß zumindest der Filter 28 vorgesehen ist, um die Wellenlängen der anregenden Laserstrahlung herauszufiltern. Ferner ist es auch möglich, unmittelbar vor dem Detektor 38, 44 einen entsprechenden Filter vorzusehen. Beispielsweise kann ein sogenannter Kammfilter verwendet werden.

In 9 ist eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops gezeigt. Diese weitere Ausführungsform unterscheidet sich von der ersten Ausführungsform von 1 im wesentlichen durch die Art, wie die linienförmig fokussierten Laserstrahlenbündel 10 bis 13 über die Probe 26 bewegt werden. Die gleichen Elemente wie bei der in 1 gezeigten Ausführungsform tragen daher bei der Darstellung in 9 die gleichen Bezugszeichen und zu deren Beschreibung wird auf die obigen Ausführungen verwiesen. Der Unterschied zwischen beiden Ausführungsformen zeigt sich nach dem Objektiv 25, das nun die Laserstrahlenbündel 10 bis 13 in eine Zwischenbildebene 56 abbildet. Der Zwischenbildebene 56 sind eine Tubuslinse 57, ein Scannerspiegel 58 sowie ein Scanobjektiv 59 in dieser Reihenfolge nachgeordnet, die zusammen eine Scaneinheit 60 bilden. Die Probe 28 liegt auf einem Probentisch 61.

Der Scannerspiegel 58 ist drehbar, wie durch den Pfeil S1 angedeutet ist, so daß die Laserstrahlenbündel 10 bis 13 quer zu ihrer linienförmigen Ausrichtung über die Probe 26 geführt werden können, wie durch den Doppelpfeil S2 angedeutet ist. Die Relativbewegung zwischen dem Laserstrahlenbündel 10 bis 13 und der Probe 26 erfolgt hier somit aufgrund der Drehung des Scannerspiegels 60. Daher muß der Probentisch 61 nicht bewegbar sein. Natürlich ist es möglich, auch einen bewegbaren Probentisch vorzusehen und gegebenenfalls die Bewegung des Probentisches 61 zusammen mit der Scaneinheit 60 zur Ablenkung der Laserstrahlenbündel 10 bis 13 zu nutzen.


Anspruch[de]
Laser-Scanning-Mikroskop

mit einem Beleuchtungsmodul (BM), das einen ersten linienförmigen und einen davon beabstandeten zweiten linienförmigen Abschnitt (A1, A2, A3, A4) einer zu untersuchenden Probe (26) mit Laserstrahlung unterschiedlicher Wellenlänge beleuchtet, wobei in jedem Abschnitt (A1–A4) aufgrund einer Wechselwirkung der Laserstrahlung mit der Probe (26) Probenstrahlung erzeugt wird,

mit einem Scanmodul (27; 60), das eine Relativbewegung zwischen der Laserstrahlung zur Beleuchtung der Abschnitte (A1–A4) und der Probe (26) quer zu den linienförmigen Abschnitten (A1–A4) bewirkt,

und mit einem Detektionsmodul (DM), das eine erste Detektionseinheit (D1) sowie einen ortsauflösenden Detektor (38, 44) aufweist,

wobei die erste Detektionseinheit (D1) die linienförmigen Abschnitte (A1–A4) derart örtlich getrennt konfokal erfaßt, das für jeden Abschnitt (A1–A4) ein linienförmiges Probenstrahlenbündel erzeugt wird, das jeweils mittels des Detektors (38, 44) örtlich aufgelöst detektiert wird.
Mikroskop nach Anspruch 1, bei dem das Detektionsmodul (DM) eine zweite Detektionseinheit (D2) aufweist, die die von der ersten Detektionseinheit (D1) kommenden Probenstrahlenbündel jeweils quer zur linienförmigen Ausdehnung spektral aufspaltet, wobei mittels des Detektors (38, 44) bei der Detektion der Probenstrahlenbündel zumindest eine spektral aufgespaltene Wellenlänge örtlich aufgelöst detektiert wird. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, bei dem die erste Detektionseinheit (D1) zur örtlich getrennten konfokalen Erfassung eine Spaltblende (30) aufweist, die für jeden Abschnitt (A1–A4) einen linienförmigen Spalt (31, 32, 33, 34) enthält. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, bei dem das Beleuchtungsmodul (BM) zur Beleuchtung jedes Abschnittes (A1–A4) die jeweilige Laserstrahlung linienförmig auf oder in die Probe (26) fokussiert. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, bei dem die linienförmigen Abschnitte (A1–A4) zueinander parallel sind. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, bei dem das Scanmodul (60) einen Scanner-Spiegel (58) aufweist, der die Laserstrahlung für die einzelnen Abschnitte simultan über die Probe (26) lenkt. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, bei dem das Detektionsmodul (DM) als Probenstrahlung durch die Laserstrahlung angeregte Fluoreszenzstrahlung detektiert. Mikroskop nach Anspruch 7, bei dem das Detektionsmodul (DM) einen Filter (28) aufweist, der aus der Probenstrahlung und/oder den Probenstrahlenbündel die Wellenlängen der Laserstrahlung herausfiltert. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, bei dem der Detektor (38, 44) die Probenstrahlenbündel gleichzeitig detektiert. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem der Detektor als linienförmiger Detektor (44) ausgebildet ist und die zweite Detektionseinheit (D2) eine dem Detektor (44) vorgeschaltete Ablenkeinheit (45) enthält, die den gewünschten Teil des spektral aufgespaltenen Probenstrahlenbündels auf den Detektor (44) lenkt. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, bei dem das Beleuchtungsmodul (BM) eine Laserquelle (1) zur Erzeugung der Laserstrahlung mit den unterschiedlichen Wellenlängen enthält. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, bei dem das Beleuchtungsmodul zur Erzeugung der Laserstrahlenbündel die Laserstrahlung durch eine Spaltblende (17) transmittiert, die für jeden zu beleuchtenden Abschnitt einen transmissiven Spalt (18, 19, 20, 21) aufweist. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, bei dem das Beleuchtungsmodul (BM) eine Abbildungseinheit (22, 25) umfaßt, die die Abschnitte (A1–A4) mit linienförmig fokussierten Laserstrahlenbündel beleuchtet. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, bei dam das Scanmodul bewirkt, daß die Probe (26) in einem Flüssigkeitsstrom geführt wird, um einen Beitrag zur Relativbewegung zu liefern. Laser-Scanning-Mikroskopierverfahren, bei dem ein erster linienförmiger und ein davon beabstandeter zweiter linienförmiger Abschnitt einer zu untersuchenden Probe mit Laserstrahlung unterschiedlicher Wellenlänge beleuchtet wird, wobei in jedem Abschnitt aufgrund einer Wechselwirkung der Laserstrahlung mit der Probe Probenstrahlung erzeugt wird, die linienförmigen Abschnitte derart örtlich getrennt konfokal erfaßt werden, daß für jeden Abschnitt ein linienförmiges Probenstrahlenbündel erzeugt wird, das jeweils in linienförmige Ausdehnung örtlich aufgelöst detektiert wird. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die Probenstrahlenbündel vor der Detektion jeweils quer zur linienförmigen Ausdehnung spektral aufgespalten werden und jeweils zumindest eine spektral aufgespaltene Wellenlänge örtlich aufgelöst detektiert wird.






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