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Dokumentenidentifikation DE102006015272A1 04.10.2007
Titel Spektralfilter-Set für LED-basierte Mikroskopbeleuchtungen
Anmelder Carl Zeiss MicroImaging GmbH, 07745 Jena, DE
Erfinder Nolte, Andreas, Dr., 37124 Rosdorf, DE
DE-Anmeldedatum 01.04.2006
DE-Aktenzeichen 102006015272
Offenlegungstag 04.10.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 04.10.2007
IPC-Hauptklasse G02B 21/00(2006.01)A, F, I, 20060401, B, H, DE
IPC-Nebenklasse G02B 21/06(2006.01)A, L, I, 20060401, B, H, DE   G01N 21/64(2006.01)A, L, I, 20060401, B, H, DE   
Zusammenfassung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Spektralfilter-Set zur effektiven Durchführung von Fluoreszenzuntersuchungen.
Das Spektralfilter-Set für LED-basierte Mikroskopbeleuchtungen besteht aus einem im Beleuchtungsstrahlengang des Mikroskops angeordneten Anregungsfilter (1), einem Strahlteiler (2) zur Einkopplung des Anregungslichts in den Abbildungsstrahlengang und einem im Abbildungsstrahlengang angeordneten Emissionsfilter (3). Das Anregungsfilter (1) ist hierbei als Bandpassfilter, der Strahlteiler (2) spektralselektiv mit einem Transmissionsbereich außerhalb des Bandpassbereiches des Anregungsfilters (1) und das Emissionsfilter (3) mit einem dem Emissionsspektrum entsprechenden Transmissionsbereich ausgebildet, wobei durch Anpassung an die LED-basierte Mikroskopbeleuchtung Anregungsfilter (1') mit einer höheren Transmission und einer steileren Flanke im Durchlassbereich sowie geringeren Anforderungen an die optische Dichte im Sperrbereich und Emissionsfilter (3') mit einer hohen optischen Dichte im Bereich der Beleuchtungsstrahlung verwendet werden.
Die vorgeschlagene Lösung ist zwar insbesondere für Mikroskope zur Durchführung von Fluoreszenzuntersuchungen vorgesehen, kann jedoch auch verwendet werden, um Licht einer ohnehin schon schmalbandigen Beleuchtungsquelle zusätzlich einzugrenzen und/oder störende Lichteffekte zu unterdrücken.

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Spektralfilter-Set für LED-basierte Mikroskopbeleuchtungen, insbesondere zur effektiven Durchführung von Fluoreszenzuntersuchungen.

Nach dem Stand der Technik bestehen bekannte Fluoreszenzeinrichtungen an Lichtmikroskopen aus einer Lichtquelle, die in der Regel ein multispektrales, kontinuierliches Spektrum (Xenonlampen – XBO) oder ein Linienspektrum (Quecksilberhöchstdrucklampen – HBO) hoher Intensität emittiert, einem Auflichtstrahlengang mit Anregungsfilter, einem Strahlteiler, zur Einkopplung des Anregungslichts in den Abbildungsstrahlengang und einem Emissionsfilter im Abbildungsstrahlengang. Die Durchlass- und Sperrbereiche von Anregungsfilter, Strahlteiler und Emissionsfilter sind so angelegt, dass mit dem ausgewählten Spektralbereich der Lichtquelle eine möglichst effiziente Anregung und Detektion eines oder mehrerer Fluorophore stattfindet.

Die im Beleuchtungsstrahlengang positionierten Anregungsfilter haben eine möglichst hohe Transmission für die Wellenlängen, welche die Fluoreszenz anregen, wobei insbesondere längenwellige Strahlung zurückgehalten wird. Die im Abbildungsstrahlengang positionierten Sperrfilter haben hingegen eine hohe Transmission für die energieärmeren, längeren Wellenlängen des Fluoreszenzlichts, wobei insbesondere das energiereiche Anregungslicht möglichst vollständig eliminiert wird. Die verwendeten Filter haben somit die Aufgabe, die erwünschten Wellenlängen voll durchzulassen und die unennrünschten möglichst vollständig zu sperren. Erschwerend ist hierbei, dass die Intensitäten von Anregungslichts und Emissionslicht sehr unterschiedlich ist. Während das Anregungslicht hoher Intensität vom mikroskopischen Bild fernzuhalten ist, muss das intensitätsarme Emissionslicht möglichst vollständig ankommen.

Dazu müssen die Anregungsfilter alle anderen als den gewünschten Wellenlängenbereich effizient unterdrücken, wozu eine sehr hohe optische Dichte (OD > 5) im Sperrbereich notwendig. Gleiches gilt für den Sperrbereich von Strahlteiler und Emissionsfilter. Gleichzeitig müssen die Filter möglichst steile Flanken haben, damit die Wellenlängenbereiche von Anregung und Emission optimal genutzt werden können.

Filter die diese Voraussetzungen hinsichtlich der optischen Dichte und der Flankensteilheit erfüllen sind in ihrer Herstellung sehr aufwendig und teuer. Andererseits führt aber eine zu geringe optische Dichte zum sogenannten „Durchschlagen" von nicht erwünschten Wellenlängen auf die Probe und den Detektor. Eine zu geringe Flankensteilheit bei spektral dicht benachbarten Filtern kann zu Überschneidungen im Durchlassbereich, dem sogenannten „Cross-talk" führen, wodurch es zum Übersprechen von Anregungslicht in das Band des Emissionslichts kommt. Das Fluoreszenzbild verliert dadurch an Kontrast und durch Falschlicht entstehen Artefakte im Bild.

Um ein möglich kontrastreiches Fluoreszenzbild zu erhalten ist es zwar möglich die Intensität der Beleuchtungslichtquelle zu erhöhen, allerdings führt dies auch zu einer Erhöhung der Intensität in den Sperrbereichen und somit zu einer Verschlechterung des Signal/Rausch-Verhältnisses im Bild und zu einer Begrenzung bei der Belichtungszeit.

Ein möglich kontrastreiches Fluoreszenzbild erhält man, wenn die im Mikroskop verwendeten Linsen, Filter und Immersionsflüssigkeiten zum einen über keine Eigenfluoreszenz verfügen und zum anderen die für Fluoreszenz geeigneten Objektive bis in den nahen UV-Bereich eine hohe Transmission aufweisen.

Da die im Präparat angeregte Fluoreszenz in alle Richtungen abgestrahlt wird, ist es besonders wichtig, möglicht viel davon "einzusammeln". Dazu werden Objektive mit einem großen Öffnungswinkel verwendet. Mit einer verdoppelten Apertur des Objektivs kann etwa viermal mehr Fluoreszenzlicht einfangen werden. Durch den zusätzlichen Einsatz von Immersionsflüssigkeiten, insbesondere Öl lassen sich zusätzliche Lichtverluste durch Lichtreflexe an den Oberflächen beseitigen.

Nach dem Stand der Technik sind bereits LED-basierte Beleuchtungseinheiten für Mikroskope bekannt, bei denen eine Wellenlängenselektion durch dichroitische Strahlteiler und/oder Filter erfolgt.

So beschreibt die US 6,154,282 A eine LED-basierte Beleuchtungseinheit für Fluoreszenz- und Phosphoreszenz-Mikroskope, bei der das von den LED's emittierte Licht über dichroitische Strahlteiler in den Strahlengang eingekoppelt wird. Weiterhin ist auch hier die Verwendung von Filtern für die Selektion der Anregungs- und Emissionswellenlängen vorgesehen. Durch entsprechende Auswahl der zum Ausstrahlen eines Anregungslichtes innerhalb eines vorgewählten Wellenlängenbandes fähigen Beleuchtungsquelle kann diese an die Eigenschaften des Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzfarbstoffes in der Probe angepasst werden.

Mit dieser Lösung wird eine Belichtungseinheit zur Anregung von Fluoreszenz und/oder Phosphoreszenz zur Verfügung gestellt, die eine lange Lebensdauer hat und verhältnismäßig preiswert ist. Außerdem ist eine Intensitätsmodulation der Belichtungsquelle ohne mechanische Blenden und/oder optische Filter möglich.

In der US 4,852,985 A1 wird eine Beleuchtungseinheit für Mikroskope beschrieben, bei der als Beleuchtungsquelle mehrere LED's bzw. LED-Arrays verwendet werden. Die Einkopplung des von den monochromen LED's emittierten Lichtes dreier unterschiedlicher Wellenlängen in den optischen Strahlengang erfolgt über Strahlteiler, wobei die verschiedenfarbigen Lichtanteile übereinander gekoppelt werden. Dabei sind alle gleichfarbig emittierenden LED's zu Gruppen zusammengefasst und in einer zu einer Kondensorlinse des Mikroskops konjugierten Ebene, konzentrisch zur optischen Achse der Beleuchtungsvorrichtung angeordnet.

Mit der hier beschriebenen Lösung wird eine Belichtungseinheit zur Verfügung gestellt, mit der verschiedene Beleuchtungsarten, wie Hellfeld-, Dunkelfeld- und Schräglichtbeleuchtung sowie ringförmige Beleuchtungen für mikroskopische Anwendungen auf einfache Art realisiert werden können.

Bei dem in der JP 7333516 A beschriebenen Fluoreszenzmikroskop wird eine Probe von mehreren Lichtquellen, die Anregungslicht einer über dichroitische Spiegel separierten Wellenlänge emittieren, beleuchtet. Das von der Probe ausgehende Fluoreszenzlicht wird ebenfalls wellenlängenmäßig separiert und detektiert. Durch die wellenlängenmäßige Aufspaltung des Fluoreszenlichtes, bei gleichzeitiger Herausfilterung des Anregungslichtes, können Fluoreszenzbilder hoher Helligkeit erzeugt werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Eigenschaften der Filter derart an die Lichtquelle bzw. das Emissionslicht anzupassen, dass durch eine hohe Flankensteilheit und Transmission in den Durchlassbereichen und eine ausreichende optische Dichte in den Sperrbereichen Fluoreszenzbilder mit hohem Kontrast und verbessertem Signal/Rausch-Verhältnis erzeugt werden können.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Weiterbildungen und Ausgestaltungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.

Obwohl die vorgeschlagene Lösung eines Spektralfilter-Sets für LED-basierte Mikroskopbeleuchtungen insbesondere für Mikroskope zur Durchführung von Fluoreszenzuntersuchungen vorgesehen ist, wäre eine Verwendung auch dort sinnvoll, wo das Licht einer ohnehin schon schmalbandigen Beleuchtungsquelle zusätzlich eingegrenzt werden soll und/oder um störende Lichteffekte durch Fremdlicht zu unterdrücken.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher beschrieben. Dazu zeigen

1: den grafischen Verlauf der Transmission über der Wellenlänge für ein Spektralfilter-Sets bei multispektraler Beleuchtung,

2: den grafischen Verlauf der Transmission über der Wellenlänge für ein Spektralfilter-Sets bei LED-basierter Beleuchtung,

3: ein inverses Fluoreszenzbild und den Grauwerteverlauf für eine multispektral beleuchtete Probe und

4: ein inverses Fluoreszenzbild und den Grauwerteverlauf für eine schmalbandig beleuchtete Probe.

Bei dem erfindungsgemäßen, aus einem im Beleuchtungsstrahlengang des Mikroskops angeordneten Anregungsfilter, einem Strahlteiler zur Einkopplung des Anregungslichts in den Abbildungsstrahlengang und einem im Abbildungsstrahlengang angeordneten Emissionsfilter bestehenden Spektralfilter-Set für LED-basierte Mikroskopbeleuchtungen zur Durchführung von Fluoreszenzuntersuchungen, ist das Anregungsfilter als Bandpassfilter, der Strahlteiler spektralselektiv, mit einem Transmissionsbereich außerhalb des Bandpassbereiches des Anregungsfilters und das Emissionsfilter mit einem, dem Emissionsspektrum entsprechenden Transmissionsbereich ausgebildet. Dabei können insbesondere durch Anpassung an die LED-basierte Mikroskopbeleuchtung Anregungsfilter mit einer höheren Transmission und einer steileren Flanke im Durchlassbereich, sowie geringeren Anforderungen an die optische Dichte OD im Sperrbereich und Emissionsfilter mit einer hohen optischen Dichte OD im Bereich der Beleuchtungsstrahlung verwendet werden.

Von der LED-basierten Mikroskopbeleuchtung wird Licht mit einer Bandbreite von etwa 10nm bis 100nm, vorzugsweise 30–50nm abgestrahlt. Aus diesem Licht mit bereits sehr schmaler Bandbreite wird mit Hilfe eines als Bandpassfilter ausgelegtes Anregungsfilters unerwünschtes Restlicht herausgefiltert, so dass das Lichtband der Mikroskopbeleuchtung nur noch eine Breits von etwa 20–40 nm aufweist.

Diese sehr schmalbandige Beleuchtungsstrahlung wird über den im Abbildungsstrahlengang angeordneten spektralselektiven Strahlteiler in diesen eingekoppelt und auf die zu untersuchende Probe geleitet. Der spektralselektive Strahlteiler weist dazu einen Transmissionsbereich außerhalb des Bandpassbereiches des Anregungsfilters auf.

In der Probe wird durch die als Anregungsstrahlung dienende schmalbandige Beleuchtungsstrahlung Fluoreszenz ausgelöst. Diese Fluoreszenzstrahlung geringer Intensität wird über den Transmissionsbereich des spektralselektiven Strahlteiler auf eine Bildausgabeeinheit, die ein Detektor und/oder ein Okular sein kann, abgebildet.

Von der Probe wird allerdings nicht nur Fluoreszenzstrahlung emittiert, sondern auch Beleuchtungsstrahlung reflektiert. Die reflektierte Beleuchtungsstrahlung ist aus dem Abbildungsstrahlengang zu eliminieren um auf der Bildausgabeeinheit ein reines Fluoreszenzbild zu erhalten. Dazu wird im Abbildungsstrahlengang ein Emissionsfilter angeordnet, dessen Sperrbereich auf die Beleuchtungsstrahlung abgestimmt ist und dessen optische Dichte OD im gesamten Bereich der Beleuchtungsstrahlung hoch ist.

Dazu zeigt 1 den grafischen Verlauf der Transmission über der Wellenlänge für ein Spektralfilter-Set bei multispektraler Beleuchtung. Hierbei wird von der Mikroskopbeleuchtung eine multispektrale Beleuchtung in Form eines kontinuierlichen bzw. Linienspektrums abgestrahlt. Da hierbei ein kontinuierliches bzw. Linienspektrum gleicher oder ähnlicher Intensität gleichzeitig abgestrahlt wird, müssen alle nicht erwünschten Wellenlängen auch hier durch ein Anregungsfilter unterdrückt werden. Allerdings sind die Anforderungen an dessen Sperrbereich durch die zu unterdrückenden, intensitätsreichen Wellenlängen doch recht hoch.

Da von einem Anregungsfilter alle anderen als der gewünschte Wellenlängenbereich effizient unterdrückt werden soll, ist in dessen Sperrbereich eine sehr hohe optische Dichte von OD > 5 notwendig. Gleiches gilt hierbei für den Strahlteiler und das Emissionsfilter.

In 1 ist der grafische Verlauf der Transmission für das Anregungsfilter 1, den Strahlteiler 2 und das Emissionsfilter 3 bei multispektraler Beleuchtung dargestellt. Das von der Beleuchtungsquelle abgestrahlte, multispektrale Licht wird durch das Anregungsfilter 1 auf die Wellenlängen des Transmissionsbereiches 4 eingeschränkt. Für das Anregungsfilter 1 bestehen entsprechend hohe Anforderungen an die optische Dichte OD in den Sperrbereichen 5 und 6 unter- und oberhalb des Transmissionsbereiches 4. Durch die Darstellung eines Spektralbereiches von 300–750nm soll die erforderliche hohe Flankensteilheit für das Anregungsfilter 1 hervorgehoben werden. Je schmaler dieser Bereich ist, desto steiler muss die Flankensteilheit des Filters ausgeprägt sein.

Der sehr komplexe, schichtenweise Aufbau eines für das Anregungsfilter 1, den Strahlteiler 2 und auch das Emissionsfilter 3 für multispektrale Beleuchtung kann dazu führen, dass auch außerhalb der definierten Transmissionsbereiche Lichtdurchlässe auftreten. Im Transmissionsverlauf des Strahlteilers 2 zeigt 1 dazu einen undefinierten Durchlassbereich 7, der sich mit unter nicht vermeiden lässt.

2 zeigt hingegen den grafischen Verlauf der Transmission über der Wellenlänge für ein Spektralfilter-Sets bei LED-basierter Beleuchtung.

Hierbei wird von der LED-basierter Mikroskopbeleuchtung ein schmalbandiges Beleuchtungsspektrum (440–540nm) mit einer Bandbreite von 100nm abgestrahlt. Von dem als Bandpassfilter mit einer Bandbreite von etwa 40nm ausgelegten Anregungsfilter wird nur das unerwünschte Restlicht herausgefiltert. Durch Anpassung an die LED-basierte Mikroskopbeleuchtung hat das Anregungsfilter eine höhere Transmission und eine steilere Flanke im Durchlassbereich, sowie geringeren Anforderungen an die optische Dichte OD im Sperrbereich

Auch hier wird diese sehr schmalbandige Beleuchtungsstrahlung über den im Abbildungsstrahlengang angeordneten spektralselektiven Strahlteiler in diesen eingekoppelt und auf die zu untersuchende Probe geleitet. Der spektralselektive Strahlteiler weist dazu einen Transmissionsbereich außerhalb des Bandpassbereiches des Anregungsfilters auf.

Von der Probe wird Fluoreszenzstrahlung emittiert und Beleuchtungsstrahlung reflektiert. Um die reflektierte Beleuchtungsstrahlung aus dem Abbildungsstrahlengang zu eliminieren wird auch hier ein Emissionsfilter angeordnet, dessen Sperrbereich auf die Beleuchtungsstrahlung abgestimmt ist und dessen optische Dichte OD im Bereich der Beleuchtungsstrahlung hoch ist, jedoch in den anderen Sperrbereichen geringer sein kann.

Die somit selektierte Fluoreszenzstrahlung geringer Intensität wird über den Transmissionsbereich des spektralselektiven Strahlteiler auf eine Bildausgabeeinheit, die ein Detektor und/oder ein Okular sein kann, abgebildet.

Die grafische Darstellung gemäß 2 zeigt den Verlauf der Transmission für das Anregungsfilter 1', den Strahlteiler 2' und das Emissionsfilter 3' bei schmalbandiger LED-basierter Beleuchtung. Das von der Beleuchtungsquelle abgestrahlte, ohnehin schon schmalbandige Licht wird durch das Anregungsfilter 1' nur noch geringfügig auf die Wellenlängen des Transmissionsbereiches 4' eingeschränkt. Zur Verdeutlichung ist hierzu auch das von der LED-basierter Beleuchtungsquelle abgestrahlte Spektrum 8' dargestellt. Für das Anregungsfilter 1' bestehen hierbei nur in den Sperrbereichen 9' und 10' unter- und oberhalb des Transmissionsbereiches 4' entsprechend hohe Anforderungen an die optische Dichte OD. In den restlichen Sperrbereichen 5' und 6' sind die Anforderungen an die optische Dichte OD wesentlich geringer. Durch die wesentlich geringeren Anforderungen an die optische Dichte OD in den Sperrbereichen kann die Flankensteilheit erhöht und gleichzeitig der komplexe, schichtenweise Aufbau vereinfacht werden.

Um die Vorteile der vorgeschlagenen Lösung zu verdeutlichen zeigt die 3a das Fluoreszenzbild einer zu untersuchen Probe und 3b den zugehörigen Verlauf der Grauwerte entlang der in 3a dargestellten diagonalen Linie von links oben nach rechts unten. In dem vorliegenden Fall wurde die Probe mit einer multispektralen Quecksilberhöchstdrucklampe (HBO) bestrahlt. Zum Einsatz kam weiterhin ein übliches Spektralfilter-Set zur Blockung der nicht erwünschten Wellenlängen.

Im übrigen zeigen die 3a und 3b Bilder der Microtuboli von Zellen, die mit einem fluoreszierenden Farbstoff angefärbt sind. Mikrotubuli sind zum einen ein wesentlicher Bestandteil des Cytoskeletts und somit für Gestalt und Form der Zelle verantwortlich und zum anderen sind sie wichtig für die intrazelluläre Organisation, den Transport von Vesikeln, das Positionieren von Organellen und für die Chromosomen-Trennung während der Kernteilung.

Im Vergleich dazu zeigt die 4a das Fluoreszenzbild der gleichen zu untersuchen Probe und 4b den zugehörigen Verlauf der Grauwerte ebenfalls entlang der in 4a dargestellten diagonalen Linie, wobei hier die Probe mit einer schmalbandigen LED-basierten Mikroskopbeleuchtung bestrahlt wurde. Zur Blockung der nicht erwünschten Wellenlängen kam hier das erfindungsgemäße Spektralfilter-Set zum Einsatz.

Die in 3a und 4a dargestellten Fluoreszenzbilder der zu untersuchenden Probe wurden unter sonst gleichen Bedingungen und unter Verwendung der gleichen Bildausgabeeinheit in Form einer digitalen Kamera aufgenommen.

Es ist zu erkennen, dass der Grauwertebereich in 4b etwa 1,5-mal so groß ist wie der in 3b. Daraus ergibt sich ein wesentlich deutlicheres Fluoreszenzbild, da der Hintergrund schwärzer ist und Strukturen besser adaptieren und voneinander unterschieden werden können.

Mit dem erfindungsgemäßen Spektralfilter-Set für LED-basierte Mikroskopbeleuchtungen wird eine Lösung zur Verfügung gestellt, mit dem kontrastreiche Fluoreszenzbilder mit verbessertem Signal/Rausch-Verhältnis erzeugt werden können.

Während bei multispektralen Lichtquellen alle nicht erwünschten Wellenlängen unterdrückt werden müssen und die dafür erforderlichen Anforderungen an die entsprechenden Filter sehr hoch sind, können bei der vorgeschlagenen technischen Lösung Filter mit weit geringeren Anforderungen verwendet werden.

Von der LED-basierten Mikroskopbeleuchtung kann jedes beliebige Spektrum als sehr schmalbandiges Band abgestrahlt werden, da die LED's einzeln ansteuer- und regelbar sind. Durch die LED-basierten Mikroskopbeleuchtung wird somit nur Anregungslicht der gewünschten Farbe in den Fluoreszenzstrahlengang eingekoppelt und das Anregungsfilter dient lediglich dazu, unerwünschtes Restlicht aus dem LED-Spektrum herauszufiltern. Dadurch sind die Anforderungen an die optische Dichte OD des Anregungsfilters entsprechend geringer. Da durch das Anregungsfilter kein Licht hoher Intensität herausgefiltert werden muss, sind wesentlich längere Belichtungszeiten von bis zu 20 Sekunden möglich, ohne dass es zu thermischen Reaktionen am Anregungsfilter kommt. Außerdem ist der Falsch- und Streulichtanteil im Fluosrezenzbild wesentlich geringer als bei der Verwendung multispektraler Lichtquellen in Verbindung mit herkömmlichen Filtersätzen.

Aufgrund dessen wurde es möglich für LED-basierte Mikroskopbeleuchtungen insbesondere Anregungsfilter zu entwickeln, die eine höherer Transmission und Flankensteilheit aufweisen und somit eine wesentlich effektivere Einkopplung von Anregungslicht ermöglichen, was wiederum zu kontrastreichen und rauschärmeren Fluoreszenzbilder führt.

Die LED-Filtersätze mit ihren geringeren Anforderungen an die optische Dichte (OD) im Sperrbereich sind leichter mit einer hohen Transmission im Durchlassbereich und einer steileren Flanke herzustellen, als das bei vergleichbaren herkömmlichen Filtersätzen der Fall ist, da die Zahl der Schichten kleiner ist. Daher sind die LED-Filtersätze weniger aufwendig und kostengünstiger herstellbar.


Anspruch[de]
Spektralfilter-Set für LED-basierte Mikroskopbeleuchtungen zur Durchführung von Fluoreszenzuntersuchungen, bestehend aus einem im Beleuchtungsstrahlengang des Mikroskops angeordneten Anregungsfilter (1), einem Strahlteiler (2) zur Einkopplung des Anregungslichts in den Abbildungsstrahlengang und einem im Abbildungsstrahlengang angeordneten Emissionsfilter (3), bei dem das Anregungsfilter (1) als Bandpassfilter, der Strahlteiler (2) spektralselektiv, mit einem Transmissionsbereich außerhalb des Bandpassbereiches des Anregungsfilters (1) und das Emissionsfilter (3) mit einem, dem Emissionsspektrum entsprechenden Transmissionsbereich ausgebildet sind, wobei durch Anpassung an die LED-basierte Mikroskopbeleuchtung Anregungsfilter (1') mit einer höheren Transmission und einer steileren Flanke im Durchlassbereich, sowie geringeren Anforderungen an die optische Dichte OD im Sperrbereich und Emissionsfilter (3') mit einer hohen optischen Dichte OD im Bereich der Beleuchtungsstrahlung verwendet werden. Spektralfilter-Set nach Anspruch 1, bei dem eine LED-basierte Mikroskopbeleuchtung verwendet wird, von der Licht mit einer Bandbreite von etwa 10nm bis 100nm, vorzugsweise 30–50nm abgestrahlt wird. Spektralfilter-Set nach mindestens einem der Ansprüche 1 und 2, bei dem ein Anregungsfilter (1') verwendet wird, um unerwünschtes Restlicht aus dem Lichtband Mikroskopbeleuchtung herauszufiltern, wobei der Bandpass eine Breits von etwa 40 m aufweist. Spektralfilter-Set nach mindestens einem der vorgenannten Ansprüche, bei dem ein Emissionsfilter (3') verwendet wird, dessen Sperrbereich auf die Beleuchtungsstrahlung abgestimmt ist und dessen optische Dichte OD im Bereich der Beleuchtungsstrahlung hoch und in den anderen Sperrbereichen geringer ist.






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